Summary
Denne protokol beskriver de forskellige teknikker, der er nødvendige for transmissions Elektron Mikroskopi herunder negative farvning, ultratynde skæring for detaljerede struktur, og immuno-guld mærkning for at bestemme positioner af specifikke proteiner i exosomes.
Abstract
Exosomes er nano-størrelse ekstracellulære vesikler udskilles af kropsvæsker og er kendt for at repræsentere kendetegn for celler, der udskiller dem. Indholdet og morfologi af de udskilles vesikler afspejler celle adfærd eller fysiologiske status, for eksempel cellevækst, migration, kavalergang og død. Exosomes' rolle kan afhænger meget af størrelse, og størrelsen af exosomes varierer fra 30 til 300 nm. Den mest udbredte metode for exosome billeddannelse er, negative farvning, mens andre resultater er baseret på Cryo-transmissions elektronmikroskopi, Scanning elektronmikroskopi og Atomic Force mikroskopi. Den typiske exosome morfologi vurderes gennem negative farvning er en VM-form, men yderligere detaljer endnu ikke er klar. En exosome godt karakteriseret gennem strukturelle undersøgelse er nødvendig især på lægelige og farmaceutiske område. Derfor bør funktion-afhængige morfologi verificeres ved elektronmikroskopi teknikker såsom mærkning et bestemt protein i den detaljerede struktur af exosome. For at overholde detaljerede struktur, blev ultratynde sektioneret og negative farvede billeder af exosomes sammenlignet. I denne protokol foreslår vi transmissions elektronmikroskopi til billeddannelse af exosomes herunder negative farvning, hele mount immuno-farvning, blok forberedelse, tynde sektion og immuno-guld mærkning.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EVs) er lipid tolagede vesikler udskilles af celler, og deres størrelse varierer mellem 30 og 300 nm. Evt blev først rapporteret i 1978, med dokumentation fra vesikler af patienter med Hodgkins sygdom1. Disse vesikler blev rapporteret til at være 40 til 120 nanometer i størrelse. I 1980, blev det rapporteret, at evt er involveret i koagulation system og trombose, dannelsen af en blodprop i et blodkar i kræft patienter2. Efter 30 år, er evt blevet rapporteret til at være en vigtig faktor til fremme af tumor invasion, immun flugt og angiogenese3. Derudover er evt funktioner blevet undersøgt som lovgivere i cellulære vekselvirkninger i områderne af inflammation, immun sygdom, neurologiske sygdomme og kræft4. Da evt indeholder specifikke biomolekyler såsom protein, mRNA og mikroRNA5, har deres mulige anvendelse i diagnostik og terapi været analyseret6,7. Evt er en kategori består af undergrupper, herunder exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, mikropartikler, promininosomes, argosomes og exosome-lignende blærer, afhængigt af deres cellulære oprindelse og biologiske funktion3. Derudover kan baseret på deres Biogenese, disse evt opdeles i microvesicles (stald microvesicles, 100-1000 nm) og exosomes (30-300 nm)8,9. Blandt disse, er exosome blevet rapporteret som en celle communicator immunrespons10, kræft11,12og infektionssygdom13.
Interesse i exosomes som en biomarkør for tidlig diagnose er hastigt stigende, og oprensning og karakterisering af exosomes skal være ledsaget med molekylær billeddannelse teknikker. Varierende størrelser og morfologier af exosomes, afhængigt af deres oprindelse og funktion14, kan være kendetegnet ved mikroskopi-teknikker med høj opløsning, som Elektron Mikroskopi. De fleste exosomes blev visualiseret ved negative farves transmissions elektronmikroskopi (TEM)15,16,17, og disse resultater er blevet bekræftet ved immunolabeling af et bestemt protein i hele mount vesikel 18. flere forskergrupper har rapporteret struktur gennem Scanning elektronmikroskopi samt Atomic Force mikroskopi19,20Cryo-TEM21,22. Men mens disse teknikker er nyttige til at studere strukturen exosome, de er ikke tilstrækkelige til at observere placeringen af specifikke proteiner placeret inde exosome. Derfor introducerede vi en protokol for imaging exosomes med et specifikt protein mærkning. Vi anvendte blok forberedelse, ultratynde afsnitsinddeling og immunfarvning for uanmeldt proteinets detaljerede placering i exosome. Dette blev sammenlignet med negative farvning og hele mount immunfarvning, som traditionelt anvendes til karakterisering af exosome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. blok forberedelse, skæring, farvning og Imaging af Exosome
- Pellet exosomes fra cellekultur supernatant af HCT116 celler ved centrifugering ved 100.000 x g i 1,5 h23. Fjern supernatanten kultur og omhyggeligt fix renset exosome pellet med 1 mL 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natrium cacodylate løsning (pH 7,0) i 1 time ved 4 ° C. 0,1 M natrium cacodylate, opløse 4,28 g cacodylic syre i 160 mL destilleret vand (DW). Justere pH til 7.4 med 0,1 M HCl derefter fyldes op til 200 mL med destilleret vand.
- Fjerne fiksativ og skyl pellets med 1 mL af 0,1 M natrium cacodylate buffer ved stuetemperatur. Gentag tre gange med hver ændring, varede 10 min.
- Efter lave prøver med 1 mL 2% Osmium dinitrogentetraoxid i 1 time ved 4 ° C.
- Fjerne fiksativ og skylles tre gange med 0,1 M natrium cacodylate buffer hver 10 min.
- Der inkuberes i 10 min. med en gradueret acetone serie (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, henholdsvis) på shaker.
- Fjerne acetone og inkuberes løsning af 3:1 acetone: lav viskositet indlejring blanding i 30 min. Exosome pellet er i røret.
- Fjern mediet og tilføje 1:1 acetone: lav viskositet indlejring blanding medium, så Inkubér i 30 min.
- Fjern mediet og tilføje 1:3 acetone: lav viskositet indlejring blanding medium, så Inkubér i 30 min.
- Fjern mediet og tilsæt 100% lav viskositet indlejring blanding og inkuberes natten over ved stuetemperatur.
- Integrere prøven i ren lav viskositet indlejring blandingen ved hjælp af indlejring mug og bages i 24 timer ved 65 ° C.
- Forberede sektioner med 60 nm tykkelse gennem en ultra-mikrotomen.
- Dobbelt-pletten med 2% uranyl acetat i 20 min. og føre citrat i 10 min.
Reynolds bly løsning, skal du tilføje 1,33 g bly nitrat og 1.76 g natrium citrat til i alt 50 mL destilleret vand. - Observere gitter under transmissions Elektron Mikroskopi på 80 kV.
- Klik på "Erhverve" og derefter klikke på "File" og "Gem som" i CCD kamerasystem under elektron mikroskop på 80 kV. Følg automatiske indstillinger for eksponeringstiden.
2. Immuno-farvning af sektioner og billeddannelse (figur 1)
- Skær 60 nm ultratynde sektioner ved hjælp af en ultra-mikrotomen og indsamle på gitteret nikkel.
- Inkuber gitre i 50 µL dråber 0,02 M Glycin til 10 min til at slukke gratis aldehyd grupper.
- Skyl i 100 μL af DW tre gange hver for 10 min. Incubate ved stuetemperatur i 1 time i PBS, som indeholder 1% BSA.
- Inkuber gitre i 50-100 µL dråber anti KRS antistof24 (1: 100 i PBS, som indeholder 0,1% BSA) i 1 time (hvis det er nødvendigt, dette trin skal udføres ved 4 ° C natten over.)
- Vask gitre med fem separate dråber (50 µL) PBS, som indeholder 0,1% BSA i 10 min.
- Overføre gitre til dråber 2nd antistoffer for 1 h (anti-kanin IgG konjugeret med 10 nm guld partikel (1: 100) i PBS, som indeholder 0,1% BSA).
- Vask gitre med fem separate dråber (50 µL) PBS, som indeholder 0,1% BSA hver 10 min.
- Dobbelt-pletten med 2% uranyl acetat i 20 min. under mørke forhold og med Reynolds bly citrat i 10 min, henholdsvis.
- Klik på "Erhverve" og derefter klikke på "File" og "Gem som" i CCD kamerasystem under en TEM på 80 kV. Eksponeringstiden fulgt automatiske indstillinger.
Figur 1: proces med forberedelse af prøver og immunfarvning. (A) dobbelt faste exosome er dehydreret og infiltreret med lav viskositet indlejring blanding harpiks. (B) harpiks indlejring. (C) ultra-tynde sektion med diamantkniven. (D) Setup for Immuno-guld mærkning. Gitre med ultratynde sektioner er sat på de flydende dråber på en parafilm, som er placeret med en våd køkkenrulle. Hver sektion er inkuberes med dråber af 50-100 µL antistof og derefter vaskes med buffer. (E) dobbelt farvning med uranyl acetat og føre citrat. Låget er dækket med aluminiumsfolie for heavy metal farvning. (F) farvning løsning fjernes med filtrerpapir. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
3. negativ farvning
- Glød-udledning tynde formvar/carbon folie belægning 200 mesh kobber EM gitre til 1 min af glød udledningen.
- Fix renset exosomes med 1 mL 2% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 5 min.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD dampe er giftige. Alt arbejde skal gøres i en ventileret stinkskab. - Indlæse 5-7 µL exosome suspension løsning på nettet og inkuberes i 1 min. Hvis koncentrationen af exosome er for høj, fortyndes koncentration til 1/2 - 1/5.
- Straks pletten med ~ 20 dråber af filtrerede 1% uranyl acetat (UA) løsning på overfladen af gitteret EM med en sprøjte.
- Fjern den overskydende UA løsning på nettet ved at kontakte gitter kanten med filtrerpapir.
- Hurtigt skylle gitter med en dråbe vand. Dette trin fjerner overskydende Farvningsopløsningen.
- Placer gitteret på bordet ved at holde med pincet, og dække gitter delvist med en kultur parabol til tørre i 10 min. under stuetemperatur.
- Gemme gitteret i en EM gitter boks for fremtidige observation af en TEM på 80 kV.
4. hele Mount for immunfarvning
- Glød-udledning filmens tynde formvar/carbon coated 200 mesh kobber EM gitre til 30 s.
- Fix renset exosomes med 1 mL 2% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 5 min.
Forsigtig: PARAFORMALDEHYD dampe er giftige. Alt arbejde skal gøres i en ventileret stinkskab. - Indlæse 5-7 µL fast exosome løsning på nettet, og der inkuberes i 5 min. Skyl med 100 µL af PBS tre gange hver i 10 min.
- Behandle gitre med 50 µL af 0,05 M Glycin til 10 min til at slukke gratis aldehyd grupper.
- Overføre gitre til et fald i blokerende buffer (PBS indeholdende 1% BSA) i 30 min.
- Inkuber gitre med 50-100 µL anti PD-L1 antistof (1: 100 i PBS, som indeholder 0,1% BSA) i 1 time (hvis det er nødvendigt, dette trin skal udføres ved 4 ° C natten over).
- Vask gitter med fem separate dråber (50 µL) PBS, som indeholder 0,1% BSA i 10 min.
- Overføre gitter til et fald på 2nd antistoffer for 1 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I øjeblikket inddeles exosomes i kategorier størrelse og form af transmissions Elektron Mikroskopi. Figur 2 viser negative farves exosome og immun-mærket exosome i hele tilslutningsstatus. Figur 3 viser sektioneret exosome og immuno-mærket exosomes efter skæring af tynde. Immuno-guld farvning af antistoffer af specifikke proteiner bruges til positivt at identificere en exosome og klassificere typerne af proteiner i exosome. Protokollen i dette papir bruger hele bjerget immunfarvning og immunfarvning med plast sektioneret exosome.
Figur 2: Negative farvning og hele mount immuno-farvning. (A) Exosome morfologi er observeret af negative farvning. Exosomes viser deres kop-formet morfologi. (B, C) Hele mount immuno-guld farvning viser placeringen af specifikke proteiner (anti-menneskelige CD274; PD-L1) i exosome. Hvide pile angiver placeringen af guld. Sorte pile angiver placeringen af baggrunden signal. (D) negativ kontrol af immunfarvning resultat. Isotype kontrol blev brugt af primære antistof i denne immunfarvning proces. Skalalinjen = 100 nm.
Figur 3: elektron Mikrograf af sektioneret exosomes. (A) Exosomes' runde form morfologi. (B) Boxed exosome ved hjælp af værktøjet "boxer" i EMAN program. (C, D) Immuno-guld mærket exosome med heavy metal farvning. Sorte pile viser, guld partikler (A-D) skala bar = 100 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel præsenterer en protokol til at observere de detaljerede exosome struktur og mærkning af dens specifikke proteiner. Negative farvning har været betragtet som den bedste metode til exosome imaging17. Denne konventionelle teknik har vist exosomes' kop-formet struktur. Men denne kop form er en form for artefakt, der kan opstå på grund af tørringsprocessen. Cryo-TEM resultater har vist, at exosomes har en perfekt kugleformet struktur i vandig opløsning25,26. Cryo-TEM-teknik er en meget kraftfuld metode til at undersøge den naturlige struktur, men det er vanskeligt at anvende metoden immuno-guld. Raso og kollegaer påpegede tørring i den konventionelle metode (hele mount-negativ farvning metode) resulterede i en kop-formet morfologi. I denne undersøgelse, standard metode til celle forberedelse (rutinemæssig EM, fiksering, dehydrering, indlejring, og skæring) blev anvendt til at reducere exosome tørring virkning. Den rutinemæssige EM benytter integrering af plast kan undgå eller reducere artefakter (ændringer i volumen og form) forårsaget af denaturering. For kemisk fiksering, blev glutaraldehyd (GA) brugt til at danne tvaerbindinger (kovalent interaktioner mellem amino grupper). Osmium dinitrogentetraoxid (OsO4) bruges normalt til fiksering af lipider samt forbedret kontrast.
I denne undersøgelse bidraget negative farvning til at bekræfte den typiske morfologi af exosomes, der er blevet rapporteret i tidligere papirer21,27,28,29. Ud over negativ farvning er blok skæring også en god metode til observation af exosomes (figur 2). Mens sektioneret billeder viste den indre struktur af exosome, viste derimod negative farves TEM hovedsageligt overfladen af exosome. I sektioneret billeder (figur 3) viste vesikler lumen struktur, der er kendt som en strukturel egenskab ved exosomes30. I denne protokol brugte vi blok afsnitsinddeling, immuno-farvning og TEM billeddannelse. Specielt, er blok skæring nyttigt til analyse på et senere tidspunkt, når billeder kan være påkrævet i forskellige forstørrelser, forskellige mikroskopi teknik og andre analyser som immuno-guld mærkning. Efter skæring kan sektioner på gitteret gemmes i boksen gitter, der kan bruges til immuno-farvning for klassificering af exosomes. For eksempel, opdaget vi kendte exosome markører14 i den isolerede exosomes at studere funktioner af exosomes.
Autoradiografi mærkning metoder har nogle tekniske problemer, herunder ingen mærkning eller høj baggrund mærkning. Når oplever ingen mærkning, anbefaler vi, kontrol af primære antistof koncentration og primære inkuberingstider. For lav koncentration af primære antistoffer, kan antistoftitrering være nyttigt at finde den optimerede immunoreactivity. Det kan også være nyttigt at øge inkuberingstider til 4 ° C natten over. Hvis koncentrationen af det primære antistof er for høj eller for Inkubationstiden er for lang ved den høje temperatur, øges derimod baggrund signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af Bio & medicinsk teknologi Development Program af National Research Foundation (NRF) & finansieres af den koreanske regering (MSIP & MOHW) (nr. 2016M3A9B6904244). Vi takker også medlemmerne af lægemiddel Bioconvergence Research Center for rensning af exosome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
- Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
- Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
- Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
- Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases? Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
- Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).
