Summary
Dieses Protokoll beschreibt die verschiedenen Techniken für Transmissions-Elektronenmikroskopie, einschließlich negative Färbung, ultradünnen schneiden für detaillierte Struktur und Immuno-Gold um die Positionen der spezifischen Proteine in Exosomen bestimmen Kennzeichnung notwendig.
Abstract
Exosomen Nanogrösse extrazelluläre Vesikel durch Körperflüssigkeiten ausgeschieden werden und sind dafür bekannt, die Eigenschaften der Zellen dar, die sie absondern. Den Inhalt und die Morphologie der sekretierten Vesikel reflektieren Zelle Verhalten oder physiologischer Zustand, zum Beispiel Zellwachstum, Migration, Spaltung und Tod. Die Exosomen Rolle kann hoch richten sich nach Größe und die Größe der Exosomen variiert zwischen 30 und 300 nm. Die am häufigsten verwendete Methode für die Exosom Bildgebung ist negative Färbung, während andere Ergebnisse auf Cryo-Transmissions-Elektronenmikroskopie, Scanning Electron Microscopy und Atomic Force Microscopy basieren. Die typische Exosom Morphologie beurteilt durch negative Färbung ist eine Becherform, aber weitere Details sind noch nicht klar. Eine Exosom gut charakterisierten durch strukturelle Studie ist notwendig insbesondere im medizinischen und pharmazeutischen Bereich. Daher sollte Funktion-abhängige Morphologie durch Elektronenmikroskopie Techniken wie z. B. ein bestimmtes Protein in die detaillierte Struktur der Exosom Kennzeichnung bestätigt werden. Um detaillierte Struktur zu beobachten, wurden ultradünnen geschnittenen Bilder und negativ gefärbten Bilder von Exosomen verglichen. In diesem Protokoll empfehlen wir Transmissions-Elektronenmikroskopie für die Bildgebung von Exosomen einschließlich negative Färbung, ganze Berg Immuno-Färbung, Block Vorbereitung, Dünnschliff und Immuno-Gold Kennzeichnung.
Introduction
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind Lipid Bilayer Vesikel durch Zellen abgesondert, und ihre Größe schwankt zwischen 30 und 300 nm. EVs wurden erstmals im Jahr 1978 mit Beweisen aus Vesikeln von Patienten mit Morbus Hodgkin1gemeldet. Diese Vesikel wurden berichtet, dass 40 bis 120 Nanometer groß. Im Jahr 1980 wurde berichtet, dass das Gerinnungssystem und Thrombose, Bildung eines Blutgerinnsels in einem Blutgefäß im Krebs Patienten2EVs beteiligt sind. Nach 30 Jahren berichtet die EVs ein wichtiger Faktor zur Förderung Tumorinvasion, immun Flucht und Angiogenese3sein. Darüber hinaus wurden die Funktionen des EFD als Regulatoren in zellulären Interaktionen in den Bereichen von Entzündungen, Immunschwäche, neurologische Erkrankungen und Krebs4untersucht. Da EVs bestimmte Biomoleküle wie Proteine, mRNA und MicroRNA5enthalten, wurde ihre mögliche Anwendung in der Diagnostik und Therapie analysierten6,7. Elektrofahrzeuge sind eine Kategorie bestehend aus Subgruppen Exosomen, Prostasomes, Oncosomes, Dexosomes, Mikropartikel, Promininosomes, Argosomes und Exosom-wie Bläschen, abhängig von ihrer zellulären Herkunft und biologische Funktion3. Darüber hinaus können basierend auf ihrer Biogenese, diese EVs Microvesicles (Schuppen Microvesicles, 100-1000 nm) und Exosomen (30-300 nm)8,9unterteilt werden. Unter anderem wurde die Exosom als Zelle Kommunikator für Immune Antwort10, Krebs11,12, ansteckende Krankheit13berichtet.
Schnell wachsendes Interesse an den Exosomen als Biomarker für die Früherkennung und die Aufreinigung und Charakterisierung von Exosomen mit molekularen Bildgebungsverfahren einhergehen müssen. Die unterschiedlichen Größen und Morphologien von Exosomen, je nach ihrer Herkunft und Funktion14können durch Mikroskopiertechniken mit hoher Auflösung, wie z. B. Elektronenmikroskopie unterschieden werden. Die meisten Exosomen waren negativ gefärbten Transmission Electron Microscopy (TEM)15,16,17visualisiert, und diese Ergebnisse wurden durch Immunolabeling eines spezifischen Proteins im ganzen Berg Vesikel bestätigt 18. mehrere Forschergruppen haben die Struktur durch Scanning Electron Microscopy, Atomic Force Microscopy19,20und Cryo-TEM21,22berichtet. Während diese Techniken fürs Studium Exosom nützen, sind sie jedoch nicht ausreichend für die Position von bestimmten Proteinen befindet sich im Inneren die Exosom zu beobachten. Daher haben wir ein Protokoll für imaging Exosomen eines spezifischen Proteins Kennzeichnung eingeführt. Wir blockieren Vorbereitung, ultradünnen schneiden und Immunostaining für die Feststellung des Proteins detaillierte Standort in die Exosom angewendet. Dies war im Vergleich zu negative Färbung und ganze Berg Immunostaining, die traditionell zur Charakterisierung von die Exosom dient.
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Protocol
1. Block Vorbereitung, schneiden, färben und Imaging-von die Exosom
- Pellet-Exosomen von Kultur überstand HCT116 Zellen durch Zentrifugation bei 100.000 x g für 1,5 h23. Entfernen Sie die Kultur überstand und beheben sorgfältig gereinigten Exosom Pellet mit 1 mL 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M-Natrium-Cacodylate-Lösung (pH 7,0) für 1 h bei 4 ° c zu Lösen Sie für 0,1 M Natrium Cacodylate 4,28 g cacodylic Säure in 160 mL destilliertem Wasser (DW auf). Stellen Sie pH auf 7,4 mit 0,1 M HCl machen dann bis zu 200 mL mit destilliertem Wasser.
- Entfernen Sie das Fixiermittel zu und spülen Sie die Pellets mit 1 mL 0,1 M Natrium Cacodylate Puffer bei Raumtemperatur. Wiederholen Sie drei Mal mit jeder Änderung dauert 10 Minuten.
- Nach dem Beheben der Proben mit 1 mL 2 % Osmium ausgefällt für 1 h bei 4 ° c
- Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen dreimal mit 0,1 M Natrium Cacodylate Puffer alle 10 Minuten.
- 10 min mit einer Reihe von abgestuften Aceton inkubieren (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, beziehungsweise) auf den Shaker.
- Das Aceton zu entfernen und die Lösung von 3:1 Aceton: niedrige Viskosität einbetten Mischung für 30 min inkubieren. Die Exosom Kugel ist in der Röhre.
- Entfernen Sie das Medium und 1:1 Aceton: niedrige Viskosität einbetten Mischung Medium hinzufügen, dann 30 min inkubieren.
- Entfernen Sie das Medium und 1:3 Aceton: niedrige Viskosität einbetten Mischung Medium hinzufügen, dann 30 min inkubieren.
- Entfernen Sie das Medium und 100 % niedrige Viskosität Mischung einbetten und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
- Einbetten der Probenmaterials in reinen niedrigviskos Einbettung Mischung mit dem Einbetten von Form und backen für 24 h bei 65 ° C.
- Bereiten Sie Abschnitte mit 60 nm dicke durch eine Ultra-Mikrotom.
- Doppel-Fleck mit 2 % Uranyl Acetat für 20 min und führen Sie Citrat für 10 min.
Fügen Sie für Reynolds Ader Lösung 1,33 g Blei Nitrat und 1,76 g Natriumcitrat auf insgesamt 50 mL destilliertem Wasser hinzu. - Beobachten Sie das Raster unter Transmissions-Elektronenmikroskopie bei 80 kV.
- Klicken Sie auf "Acquire" und klicken Sie dann auf "Datei" und "Speichern unter" im CCD-Kamera-System unter dem Elektronenmikroskop bei 80 kV. Befolgen Sie die automatische Einstellungen für die Belichtungszeit.
(2) Immuno-Färbung des Abschnitte und Bildgebung (Abbildung 1)
- 60 nm ultradünnen Abschnitte mit einem Ultra-Mikrotom schneiden und sammeln auf dem Nickel-Gitter.
- Inkubieren Sie Netze in 50 µL Tropfen 0,02 M Glycin für 10 min kostenlos Aldehyd-Gruppen zu stillen.
- Spülen Sie mit 100 μL der DW drei Mal jeweils für 10 min Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h in PBS mit 1 % BSA.
- Inkubieren Sie Netze in 50-100 µL Tropfen anti-KRS Antikörper24 (1: 100 mit PBS-Puffer mit 0,1 % BSA) 1 h (wenn nötig, diesen Schritt bei 4 ° C über Nacht durchgeführt werden soll.)
- Waschen Sie Gitter mit fünf separaten Tropfen (50 µL) von PBS mit 0,1 % BSA für 10 min.
- Übertragen Sie Gitter auf Tropfen 2Nd Antikörper für 1 h (Anti-Kaninchen, die IgG zu 10 nm gold Teilchen (1: 100) mit PBS-Puffer mit 0,1 % BSA konjugiert).
- Wash-Grids mit fünf trennen Tropfen (50 µL) PBS mit 0,1 % BSA jede 10 Minuten.
- Doppel-Fleck mit 2 % Uranyl Acetat für 20 min unter schlechten Lichtverhältnissen und Reynold es Blei Citrat für 10 min, beziehungsweise.
- Klicken Sie auf "Acquire" und klicken Sie dann auf "Datei" und "Speichern unter" im CCD-Kamera-System unter einem TEM bei 80 kV. Belichtungszeit folgte automatische Einstellungen.
Abbildung 1: Prozess der Probenvorbereitung und Immunostaining. (A) doppelte feste Exosom ist dehydriert und mit niedriger Viskosität Einbettung Mischung Harz infiltriert. (B) Harz einbetten. (C) ultra-dünnen Abschnitt mit Diamant Messer. (D) Setup zur Kennzeichnung von Immuno-Gold. Die Netze mit den ultradünnen Abschnitten sind auf flüssigen Tröpfchen auf ein Parafilm, die mit der feuchten Papiertuch gelegt wird. Jeder Abschnitt ist mit Tröpfchen von 50-100 µL Antikörper inkubiert, dann mit Puffer gewaschen. (E) verdoppeln Sie, Färbung mit Uranyl Acetat und führen Sie Citrat. Der Deckel ist mit Alu-Folie für Heavy-Metal Färbung bedeckt. (F) die Färbelösung wird durch Filterpapier entfernt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
(3) negative Färbung
- Die dünne Formvar/Carbon Film beschichtet Kupfer 200 Mesh EM Gitter für 1 min durch Glühen Entlader Glimmentladung.
- Befestigen Sie gereinigte Exosomen mit 1 mL 2 % Paraformaldehyd (PFA) für 5 Minuten.
Achtung: Paraformaldehyd Dämpfe sind giftig. Alle arbeiten sollten in einem gelüfteten Abzug durchgeführt werden. - Laden Sie 5-7 µL Exosom Aussetzung Lösung in der Startaufstellung und 1 min inkubieren. Wenn die Konzentration der Exosom zu hoch ist, verdünnen Sie die Konzentration auf 1/2 - 1/5.
- Fleck sofort mit den ~ 20 Tropfen der gefilterten 1 % Uranyl Acetat (UA) Lösung auf die Oberfläche des Rasters EM mittels Spritze.
- Entfernen Sie die überschüssige UA-Lösung in der Startaufstellung durch Kontaktaufnahme mit den Raster-Rand mit Filterpapier.
- Schnell spülen Sie das Gitter mit einem Tropfen Wasser. Dieser Schritt wird die überschüssige Färbelösung entfernen.
- Legen Sie das Raster auf den Tisch, indem Sie mit einer Pinzette halten, und decken Sie das Netz teilweise mit einer Kulturschale für 10 min bei Raumtemperatur trocknen lassen.
- Speichern Sie das Raster in einem EM-Gitterbox für zukünftige Beobachtung durch eine TEM bei 80 kV.
(4) die ganze Halterung für Immunostaining
- Glimmentladung die dünne Formvar/Carbon Folie beschichtet 200 Mesh Kupfer EM Grids für 30 s.
- Befestigen Sie gereinigte Exosomen mit 1 mL 2 % Paraformaldehyd (PFA) für 5 Minuten.
Achtung: Paraformaldehyd Dämpfe sind giftig. Alle arbeiten sollten in einem gelüfteten Abzug durchgeführt werden. - Laden Sie 5-7 µL feste Exosom Lösung in der Startaufstellung und für 5 min. Spülen mit 100 µL PBS inkubieren Sie dreimal jeweils für 10 min.
- Netze mit 50 µL 0,05 M Glycin für 10 min kostenlos Aldehyd-Gruppen zu stillen zu behandeln.
- Netze zu einem Rückgang von blockierenden Puffer (PBS mit 1 % BSA) für 30 min zu übertragen.
- Inkubieren Sie Netze mit 50-100 µL anti-PD-L1-Antikörper (1: 100 mit PBS-Puffer mit 0,1 % BSA) 1 h (wenn nötig, diesen Schritt bei 4 ° C über Nacht durchgeführt werden soll).
- Waschen Sie Raster mit fünf separaten Tropfen (50 µL) von PBS mit 0,1 % BSA für 10 min.
- Raster zu einem Rückgang von 2Nd Antikörper für 1 h zu übertragen.
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Representative Results
Derzeit sind Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie in Größe und Form Kategorien eingeteilt. Abbildung 2 zeigt negative Exosom und immun-gekennzeichnete Exosom im ganzen Zuordnungsstatus gebeizt. Abbildung 3 zeigt geschnittenen Exosom und Immuno-gekennzeichnete Exosomen nach dünn schneiden. Immuno-Gold Färbung mit Antikörpern spezifischer Proteine wird verwendet, um positiv eine Exosom identifizieren und klassifizieren die Arten von Proteinen in die Exosom. Das Protokoll in diesem Papier verwendet ganze Berg Immunostaining und Immunostaining mit Kunststoff geschnittenen Exosom.
Abbildung 2: Negative Färbung und ganze Berg Immuno-beflecken. (A) Exosom Morphologie wird durch negative Färbung beobachtet. Exosomen zeigt ihre schalenförmigen Morphologie. (B, C) Ganzen Berg Immuno-Gold Färbung zeigt die Lage der spezifischen Protein (anti-menschlichen CD274; PD-L1) in Exosom. Weiße Pfeile zeigen die Position des Goldes. Schwarze Pfeile zeigen die Position der das Hintergrundsignal. (D) Negative Kontrolle der Immunostaining Ergebnis. Isotype Kontrolle diente Primärantikörper Immunostaining dabei. Maßstabsleiste = 100 nm.
Abbildung 3: Elektron Schliffbild der geschnittenen Exosomen. (A) Exosomen Rundform Morphologie. (B) Boxed Exosom mit dem Tool "Boxer" in EMAN Programm. (C, D) Immuno-Gold beschriftet Exosom mit Heavy Metal zu beflecken. Schwarze Pfeile zeigen die Goldpartikel (A-D) Skala bar = 100 nm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Beobachtung der detaillierten Exosom Struktur und Kennzeichnung von seiner spezifischen Proteine. Negative Färbung galt als die beste Methode für Exosom imaging-17. Diese konventionelle Technik hat Exosomen becherförmigen Struktur gezeigt. Diese Becherform ist jedoch eine Form von Artefakt, das durch die Trocknung entstehen kann. Cryo-TEM Ergebnisse haben gezeigt, dass Exosomen eine perfekt kugelförmige Struktur in wässriger Lösung25,26. Die Cryo-TEM-Technik ist eine sehr leistungsfähige Methode zur Untersuchung der natürlichen Struktur, aber es ist schwierig, die Immuno-Gold-Methode anzuwenden. Raso und Kollegen darauf hingewiesen, Trocknen bei der konventionellen Methode (ganze Berg-Negative Färbung Methode) führten eine schalenförmige Morphologie. In dieser Studie, die Standardmethode für die Handy-Vorbereitung (Routine EM, Fixierung, Dehydrierung, einbetten und schneiden) wurde angewandt, um die Exosom Trocknung Effekt zu reduzieren. Die Routine EM mit Kunststoff einbetten kann vermeiden oder reduzieren Artefakte (Änderungen in Form und Volumen) verursacht durch Denaturierung. Für chemische Fixierung wurde Glutaraldehyd (GA) für die Vernetzung (kovalente Wechselwirkungen zwischen Aminogruppen) verwendet. In der Regel wird Osmium ausgefällt (OsO4) zur Fixierung der Lipide sowie verbesserten Kontrast verwendet.
In dieser Studie negative Färbung dazu beigetragen, die typische Morphologie der Exosomen bestätigen, das Sie im vorherigen Artikel21,27,28,29gemeldet hat. Neben negativen Färbung ist Block-Schnitt auch eine gute Methode zur Beobachtung der Exosomen (Abbildung 2). Während geschnittenen Bildern die innere Struktur der Exosom zeigte, zeigte im Gegensatz dazu negativ gefärbten TEM vor allem die Oberfläche die Exosom. In geschnittenen Bildern (Abbildung 3) zeigte die Vesikel die Lumen-Struktur, die als ein strukturelles Merkmal von Exosomen30bekannt ist. In diesem Protokoll werden Block schneiden, Immuno-Färbung und TEM Bildgebung verwendet. Speziell ist die Block-Schnitt nützlich für die Analyse zu einem späteren Zeitpunkt, wenn Bilder bei verschiedenen Vergrößerungen erforderlich sind, für verschiedene Mikroskopie-Technik und für andere Analysen wie der Immuno-Gold Etikettierung. Nach schneiden, können Abschnitte in der Startaufstellung in der Gitterbox gespeichert werden, die für Immuno-Färbung für die Klassifizierung von Exosomen verwendet werden können. Z. B. erkannt wir die bekannten Exosom Marker14 in der isolierten Exosomen, die Funktionen von Exosomen studieren.
Immunogold Kennzeichnung Methoden haben einige technischen Schwierigkeiten, einschließlich keine Beschriftung oder Kennzeichnung hoher Hintergrund. Bei erleben keine Kennzeichnung, empfehlen wir die Überprüfung der primären Antikörper-Konzentration und primäre Inkubationszeiten. Bei niedrige Konzentration von primären Antikörper kann Antikörper-Titration hilfreich, um die optimierte Immunoreactivity zu finden sein. Es kann auch hilfreich, um über Nacht die Inkubationszeiten bis 4 ° C zu erhöhen sein. Im Gegensatz dazu wird die Konzentration des primären Antikörpers ist zu hoch oder die Inkubationszeit ist bei der hohen Temperatur zu lang, das Hintergrundsignal erhöht werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch die Bio & Medical Technology Development Program des National Research Foundation (NRF) & von der koreanischen Regierung finanziert (MSIP & MOHW) (Nr. 2016M3A9B6904244). Wir danken auch Mitglieder des Medicinal-Bioconvergence-Forschungszentrum für die Reinigung der Exosom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
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