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Biology

Preparazione del campione e la formazione immagine di esosomi da microscopia elettronica di trasmissione

doi: 10.3791/56482 Published: January 4, 2018

Summary

Questo protocollo descrive le varie tecniche necessarie per microscopia elettronica di trasmissione tra cui macchiatura negativa, sezionamento ultrasottile per struttura dettagliata e immuno-oro etichettatura per determinare le posizioni di specifiche proteine in esosomi.

Abstract

Gli esosomi sono vescicole extracellulari nanometriche secernute dai fluidi corporei e sono conosciuti per rappresentare le caratteristiche di cellule che secernono i loro. Il contenuto e la morfologia delle vescicole secrete riflettono comportamento delle cellule o stato fisiologico, ad esempio la crescita delle cellule, migrazione, scissione e la morte. Ruolo degli esosomi può altamente dipende dalla dimensione e la dimensione degli esosomi varia da 30 a 300 nm. Il metodo più ampiamente usato per l'imaging di esosomi è macchiatura negativa, mentre altri risultati si basano su microscopia elettronica di Cryo-trasmissione, microscopia a scansione e microscopia a forza atomica. Morfologia di esosomi tipici valutato tramite colorazione negativa è a forma di Coppa, ma ulteriori dettagli non sono ancora chiari. Un esosomi ben caratterizzati attraverso studio strutturale sono necessaria particolare in campo medico e farmaceutico. Di conseguenza, funzione dipendente dalla morfologia deve essere verificata mediante tecniche di microscopia elettronica quali etichettatura una proteina specifica in struttura dettagliata di esosomi. Per osservare la struttura dettagliata, sono state confrontate ultrasottile immagini sezionate e immagini negative macchiate di esosomi. In questo protocollo, consigliamo di microscopia elettronica di trasmissione per l'imaging di esosomi incluse macchiatura negativa intero Monte immunocolorazione, preparazione di blocco, sezione sottile ed etichettatura immuno-oro.

Introduction

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Vescicole extracellulari (EVs) sono vescicole di bilayer del lipido secernute dalle cellule e loro dimensione varia tra 30 e 300 nm. SVE in primo luogo sono stati segnalati nel 1978, con evidenza dalle vescicole di pazienti con malattia di Hodgkin1. Queste vescicole sono state segnalate per essere 40 a 120 nanometri di dimensione. Nel 1980, è stato riferito che SVE sono coinvolti nel sistema di coagulazione e trombosi, formazione di un coagulo di sangue all'interno di un vaso sanguigno nel cancro pazienti2. Dopo 30 anni, EVs sono stati segnalati per essere un fattore importante per promuovere l'invasione del tumore, fuga immune e l'angiogenesi3. Inoltre, le funzioni del SVE sono state studiate come regolatori in interazioni cellulari nelle aree di infiammazione, disturbo immunitario, malattia neurologica e cancro4. Poiché EVs contengono specifici biomolecole come proteine, mRNA e microRNA5, loro potenziale applicazione in diagnostica e terapeutica è stato analizzato6,7. SVE sono una categoria composta da sottogruppi inclusi esosomi, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticelle, promininosomes, argosomes e vescicole esosomi-come, a seconda della loro origine cellulare e funzione biologica3. Inoltre, basato sulla loro biogenesi, queste SVE possono essere diviso in microvescicole (capannone microvescicole, 100-1000 nm) ed esosomi (30-300 nm)8,9. Tra questi, l'esosomi sono stato segnalato come un comunicatore cellulare per risposta immunitaria10, cancro11,12e13di malattia infettiva.

Interesse per gli esosomi come biomarcatore per la diagnosi precoce sono in rapido aumento, e la purificazione e caratterizzazione di esosomi devono essere accompagnati con tecniche di imaging molecolare. Le varie dimensioni e morfologie di esosomi, a seconda della loro origine e funzione14, possono essere distinto mediante tecniche di microscopia ad alta risoluzione, come il microscopio elettronico. La maggior parte gli esosomi sono stati visualizzati da negativo macchiato microscopia elettronica in trasmissione (TEM)15,16,17, e questi risultati sono stati confermati da immunolabeling di una proteina specifica in intero supporto vescicola 18. diversi gruppi di ricerca hanno riferito alla struttura tramite scansione microscopia elettronica, microscopia a forza atomica19,20e Cryo-TEM21,22. Tuttavia, mentre queste tecniche sono utili per studiare la struttura di esosomi, sono insufficienti per osservare la posizione di specifiche proteine all'interno del esosomi. Pertanto, abbiamo introdotto un protocollo per l'imaging di esosomi con una proteina specifica etichettatura. Abbiamo applicato il blocco preparazione, sezionamento ultrasottile e immunostaining per accertare la posizione dettagliata della proteina nell'esosomi. Questo è stato confrontato con macchiatura negativa e tutta immunostaining di Monte, che è tradizionalmente utilizzato per la caratterizzazione dell'esosomi.

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Protocol

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1. blocco preparazione, taglio, colorazione e di Imaging dell'esosomi

  1. Pallina gli esosomi da supernatante di coltura delle cellule HCT116 mediante centrifugazione a 100.000 x g per 1,5 h23. Rimuovere il surnatante della cultura e fissare attentamente il pellet di esosomi purificata con 1 mL di 2,5% glutaraldeide in soluzione di cacodilato di sodio 0.1 M (pH 7.0) per 1 h a 4 ° C. Per 0.1 M sodio cacodilato, sciogliere l'acido cacodilico 4,28 g in 160 mL di acqua distillata (DW). Regolare il pH a 7.4 con 0.1 M HCl quindi apportare fino a 200 mL con acqua distillata.
  2. Rimuovere il fissativo e sciacquare i pellet con 1 mL di tampone cacodilato di sodio 0.1 M a temperatura ambiente. Ripetere tre volte ad ogni variazione della durata di 10 min.
  3. Post-fissare i campioni con 1 mL di 2% tetrossido di osmio per 1 h a 4 ° C.
  4. Rimuovere il fissativo e lavare tre volte con 0.1 M sodio cacodilato tampone ogni 10 min.
  5. Incubare per 10 minuti con una serie di graduali acetone (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, rispettivamente) sull'agitatore.
  6. Rimuovere l'acetone e incubare la soluzione della miscela incorporamento di 3:1 acetone: bassa viscosità per 30 min. Il pellet di esosomi è nel tubo.
  7. Rimuovere il mezzo e aggiungere mezzo di inclusione miscela di acetone 1:1: bassa viscosità, quindi incubare per 30 min.
  8. Rimuovere il mezzo e aggiungere mezzo miscela di 1:3 acetone: bassa viscosità inclusione, quindi incubare per 30 min.
  9. Rimuovere il mezzo e aggiungere 100% bassa viscosità miscela di incorporamento e incubare per una notte a temperatura ambiente.
  10. Incorporare il campione in puro a bassa viscosità incorporamento miscela usando l'incorporamento stampo e cuocere per 24 h a 65 ° C.
  11. Preparare sezioni con spessore di 60 nm attraverso un ultra-microtomo.
  12. Matrimoniale-macchia con acetato di uranile 2% per 20 min e piombo citrato per 10 min.
    Per la soluzione di piombo a Reynolds, aggiungere 1,33 g di nitrato di piombo e 1,76 g di citrato di sodio per un totale di 50 mL di acqua distillata.
  13. Osservare la griglia sotto microscopia elettronica di trasmissione a 80 kV.
  14. Fare clic su "Acquire" e quindi fare clic su "File" e "Salva con nome" nel sistema di telecamere CCD al microscopio elettronico a 80 kV. Seguire le impostazioni automatiche per il tempo di esposizione.

2. Immuno-colorazione di sezioni e Imaging (Figura 1)

  1. Tagliare 60 sezioni ultrasottili nm utilizzando un ultra-microtomo e raccogliere sulla griglia di nichel.
  2. Incubare le griglie a 50 gocce di µ l di 0,02 M glicina per 10 min placare gruppi aldeide libera.
  3. Sciacquare in 100 μL di DW tre volte ciascuno per 10 min. Incubare a temperatura ambiente per 1 h in PBS contenente BSA 1%.
  4. Incubare le griglie in 50-100 gocce µ l di anti-KRS anticorpo24 (1: 100 in PBS contenente 0,1% BSA) per 1 h (se necessario, che questo passaggio deve essere effettuato durante la notte a 4 ° C.)
  5. Lavare griglie con cinque gocce separate (50 µ l) di PBS contenente BSA 0.1% per 10 minuti ciascuno.
  6. Trasferimento griglie a gocce di 2nd anticorpo per 1 h (anti-coniglio IgG coniugato alla particella 10 nm oro (1: 100) in PBS contenente 0,1% BSA).
  7. Griglie di lavaggio con cinque separano gocce (50 µ l) di PBS contenente 0,1% BSA ogni 10 min.
  8. Matrimoniale-macchia con acetato di uranile 2% per 20 min in condizioni di buia e citrato di piombo di Reynold per 10 min, rispettivamente.
  9. Fare clic su "Acquire" e quindi fare clic su "File" e "Salva con nome" nel sistema di telecamere CCD sotto un TEM a 80 kV. Tempo di esposizione seguita impostazioni automatiche.

Figure 1
Figura 1: processo di preparazione del campione e immunostaining. (A) doppia esosomi fisso sono disidratato e infiltrato con l'incorporamento di resina miscela a bassa viscosità. (B) resina incorporamento. (C) sezione ultrasottile con lama di diamante. (D) Setup per l'etichettatura Immuno-oro. Le griglie con le sezioni ultrasottili sono messi sopra le goccioline di liquide su un parafilm, che si trova con il tovagliolo di carta bagnato. Ogni sezione è incubato con le goccioline di anticorpo di 50-100 µ l, poi lavata con un tampone. (E) doppia colorazione con acetato di uranile e citrato di piombo. Il coperchio è coperto con carta stagnola per la colorazione del metallo pesante. (F) soluzione di colorazione è rimosso dalla carta da filtro. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. colorazione negativa

  1. Le griglie di EM 200 mesh rame rivestite con film sottile formvar/carbonio per 1 min dal bagliore scaricatore effluvio.
  2. Difficoltà esosomi purificati con 1 mL di 2% paraformaldeide (PFA) per 5 min.
    Attenzione: Paraformaldeide fumi sono tossici. Tutto il lavoro dovrebbe essere fatto in una cappa ventilata.
  3. Caricare la soluzione di sospensione di 5-7 µ l esosomi sulla griglia e incubare per 1 min. Se la concentrazione di esosomi è troppo alto, diluire la concentrazione di 1/2 - 1/5.
  4. Macchia immediatamente con il ~ 20 gocce di soluzione di acetato (UA) uranile 1% filtrata sulla superficie della griglia EM con una siringa.
  5. Rimuovere la soluzione in eccesso di UA sulla griglia di partenza contattando il bordo della griglia con carta da filtro.
  6. Sciacquare rapidamente la griglia con una goccia d'acqua. Questo passaggio rimuoverà la soluzione colorante in eccesso.
  7. Posizionare la griglia sul tavolo tenendo con le pinzette e coprire la griglia parzialmente con una piastra di coltura ad asciugare per 10 min a temperatura ambiente.
  8. Conservare la griglia in una scatola di griglia EM per l'osservazione futura di un TEM a 80 kV.

4. intero supporto per Immunostaining

  1. Bagliore-Scarica il film sottile formvar/carbonio rivestito 200 mesh Rame griglie di EM per 30 s.
  2. Difficoltà esosomi purificati con 1 mL di 2% paraformaldeide (PFA) per 5 min.
    Attenzione: Paraformaldeide fumi sono tossici. Tutto il lavoro dovrebbe essere fatto in una cappa ventilata.
  3. 5-7 µ l soluzione di esosomi fisso sulla griglia di carico e incubare per 5 minuti risciacquare con 100 µ l di PBS tre volte ciascuno per 10 min.
  4. Trattamento di griglie con 50 µ l di 0,05 M glicina per 10 min placare gruppi aldeide libera.
  5. Trasferimento griglie a una goccia di tampone bloccante (PBS contenente BSA 1%) per 30 min.
  6. Incubare griglie con 50-100 µ l anti anticorpo PD-L1 (1: 100 in PBS contenente 0,1% BSA) per 1 h (se necessario, che questo passaggio deve essere effettuato durante la notte a 4 ° C).
  7. Lavare griglia con cinque gocce separate (50 µ l) di PBS contenente BSA 0.1% per 10 minuti ciascuno.
  8. Trasferimento griglia a una goccia di 2nd anticorpo per 1 h.
IgG anti-topo coniugata con particelle di oro nm 9-11 diluito a 1: 100 in PBS contenente 0,1% BSA.
  • Lavare griglia con cinque gocce separate (50 µ l) di PBS contenente BSA 0.1% per 10 minuti ciascuno. Lavare la griglia con due gocce separate (50 µ l) di DW. Eseguire la macchiatura negativa con acetato di uranile 2% come descritto da 3,4 a 3,8.
  • Conservare la griglia in una scatola di griglia EM per l'osservazione futura di un TEM a 80 kV.
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    Representative Results

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    Attualmente, gli esosomi sono classificati in categorie di forma e dimensioni da microscopia elettronica di trasmissione. La figura 2 Mostra negativo macchiato esosomi e immunitario-etichettati esosomi intero supporto dello stato. La figura 3 Mostra sezionato esosomi e immuno-etichettati esosomi dopo taglio sottile. Immuno-oro che macchia usando gli anticorpi di specifiche proteine viene utilizzato positivamente un esosomi di identificare e classificare i tipi di proteine nell'esosomi. Il protocollo in questo paper utilizza tutta Monte immunostaining e immunostaining con plastica esosomi sezionato.

    Figure 2
    Figura 2: negativo colorazione e intero Monte immunocolorazione. (A) la morfologia esosomi è osservata da macchiatura negativa. Esosomi rivela loro morfologia a forma di Coppa. (B, C) Macchiatura intero Monte immuno-oro Mostra la posizione di proteine specifiche (anti-umana CD274; PD-L1) in esosomi. Frecce bianche indicano la posizione dell'oro. Le frecce nere indicano la posizione del segnale di fondo. (D) controllo di immunostaining risultato negativo. Isotype controllo veniva utilizzato dall'anticorpo primario in questo processo di immunostaining. Barra della scala = 100 nm.

    Figure 3
    Figura 3: Micrografo elettronico di esosomi sezionati. Morfologia di forma rotonda degli esosomi (A) . (B) Boxed esosomi utilizzando lo strumento "boxer" nel programma di EMAN. (C, D) Immuno-oro etichettati esosomi con la macchiatura di metalli pesanti. Le frecce nere indicano particelle d'oro (A-D) scala bar = 100 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

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    Questo articolo presenta un protocollo per osservare la struttura di esosomi dettagliate e l'etichettatura delle sue proteine specifiche. Macchiatura negativa è stata considerata come il miglior metodo per esosomi17di imaging. Questa tecnica convenzionale ha mostrato la struttura a forma di Coppa degli esosomi. Tuttavia, questa forma di Coppa è una forma di manufatto che può verificarsi a causa del processo di essiccazione. Cryo-TEM risultati hanno mostrato che gli esosomi hanno una struttura perfettamente sferica in soluzione acquosa25,26. La tecnica di cryo-TEM è un metodo molto potente per esaminare la struttura naturale, ma è difficile applicare il metodo immuno-oro. Raso e colleghi hanno sottolineati essiccazione nel metodo convenzionale (intero Monte-negativo metodo di colorazione) ha provocato una morfologia a forma di Coppa. In questo studio, il metodo standard per la preparazione delle cellule (routine EM; fissazione, disidratazione, l'incorporamento e sezionamento) è stata applicata per ridurre l'effetto di secchezza di esosomi. La routine EM mediante inclusione di plastica può evitare o ridurre artefatti (variazioni di volume e forma) causati da denaturazione. Per il fissaggio chimico, glutaraldeide (GA) è stato utilizzato per il cross-linking (interazioni covalenti fra i gruppi amminici). Di solito, tetrossido di osmio (OsO4) viene utilizzato per la fissazione di lipidi, nonché migliorare il contrasto.

    In questo studio, macchiatura negativa ha contribuito a confermare la morfologia tipica di esosomi che sono stati segnalati in precedenti documenti21,27,28,29. Oltre alla macchiatura negativa, blocco di sezionamento è anche un buon metodo per l'osservazione degli esosomi (Figura 2). Mentre sezionato le immagini hanno mostrato la struttura interna di esosomi, in contrasto negativo macchiato TEM ha mostrato principalmente la superficie dell'esosomi. Nelle immagini sezionate (Figura 3), le vescicole hanno mostrato la struttura di lume che è conosciuta come una caratteristica strutturale di esosomi30. In questo protocollo, abbiamo utilizzato il blocco di sezionamento, immunocolorazione e TEM imaging. Appositamente, il blocco di sezionamento è utile per l'analisi in un secondo momento quando immagini possono essere richiesti a diversi ingrandimenti, per tecnica di microscopia diversi e per altre analisi come l'etichettatura immuno-oro. Dopo sezionamento, sezioni sulla griglia di partenza possono essere riposta nella casella griglia, che può essere utilizzata per immunocolorazione per la classificazione degli esosomi. Ad esempio, abbiamo rilevato il noto esosomi marcatori14 negli esosomi isolati per studiare le funzioni di esosomi.

    Immunogold etichettatura metodi hanno alcune difficoltà tecniche, tra cui nessuna etichettatura o etichettatura di alta priorità bassa. Quando non si verifica alcuna etichettatura, si consiglia di consultare la concentrazione di anticorpo primario e tempi di incubazione primaria. In caso di bassa concentrazione di anticorpi primari, titolazione di anticorpi può essere utile per trovare il immunoreactivity ottimizzato. Può anche essere utile aumentare i tempi di incubazione a 4 ° C durante la notte. Al contrario, se la concentrazione dell'anticorpo primario è troppo alta o il tempo di incubazione è troppo lungo ad alta temperatura, è possibile che il segnale di fondo sarà aumentato.

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    Disclosures

    Gli autori non hanno nulla a rivelare.

    Acknowledgments

    Questa ricerca è stata sostenuta dal Bio-& programma di sviluppo tecnologia medicale della National Research Foundation (NRF) & finanziato dal governo coreano (MSIP & MOHW) (n. 2016M3A9B6904244). Ringraziamo anche i membri del centro di ricerca Bioconvergence di medicinali per la purificazione di esosomi.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Glutaraldehyde EMS 16200
    Sodium cacodylate  EMS 12300
    Osmium tetroxide 1 g crystal EMS 19100 Use only in fume hood
    acetone JUNSEI 1B2031
    Spurr medium TED PELLA 18108
    Ultra-microtome Leica UCT
    Uranyl acetate EMS 22400 Hazardous chemical
    Lead citrate EMS 17900
    Transmission Electron Microscopy Hitachi H7600
    nickel grid EMS G200-Ni
    Copper grid EMS G200-Cu
    glycine SIGMA 022K5404
    Phosphate buffer saline SIGMA P4417
    Bovine serum albumin Aurion 25557
    1st Antibody purification in manually 
    Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody BioLegend 329710 Whole mount Immumogold
    Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl BioLegend 401202 Whole mount Immumogold (Control)
    2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle sigma G7652
    Transmission Electron Microscopy JEOL JEM2200FS
    Glow discharger JEOL JFC1100E
    Carbon grid EMS 121119
    Paraformaldehyde EMS 19210
    Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) EMS FCF200-CU
    Formvar carbon coated  Nickel Grid (200 mesh) EMS FCF200-NI

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    References

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    Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56482, doi:10.3791/56482 (2018).More

    Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56482, doi:10.3791/56482 (2018).

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