Summary
قدم هنا بروتوكول لأخذ عينات أنسجة فيلوس المشيمة البشرية متبوعاً بعزل سيتوتروفوبلاستس لثقافة الخلية الأولية. معاملة trophoblasts مع TNFα يجمل التهاب في البيئة داخل الرحم يعانون من السمنة المفرطة، ويسهل اكتشاف أهداف جزيئية ينظمها التهاب في المشيمة مع السمنة الأمهات.
Abstract
بدانة الأمهات يرتبط بزيادة خطر الإصابة بنتائج الفترة المحيطة بالولادة الضارة التي يرجح أن لعبت دور الوسيط فيها وظيفة المشيمية الخطر الذي يمكن أن يعزى إلى، في جزء منه، التقلبات أوتوفاجي. التغيرات الشاذة في التعبير عن أوتوفاجي المنظمين في المشيمة من الحمل يعانون من السمنة المفرطة قد ينظمها التحريضية العمليات المرتبطة بالسمنة والحمل. الموصوفة هنا بروتوكول لأخذ عينات أنسجة فيلوس وعزله فيلوس سيتوتروفوبلاستس من المشيمة البشرية مصطلح لثقافة الخلية الأولية. ويعقب ذلك طريقة لمحاكاة الوسط التحريضية في البيئة داخل الرحم السمنة بعلاج تروفوبلاستس الأولى من الحمل الهزيل مع سيتوكين proinflammatory التي هي مرتفعة في السمنة وعامل نخر الورم ألفا (TNFα)، الحمل. من خلال تنفيذ البروتوكول الموصوفة هنا، تبين أن التعرض للخارجية TNFα ينظم التعبير عن خطوة جريئة، منظم سلبية من أوتوفاجي، في تروفوبلاستس من الحمل الهزيل مع الأجنة الإناث. بينما تحتفظ مجموعة متنوعة من العوامل البيولوجية في البيئة داخل الرحم يعانون من السمنة المفرطة يمكن أن تعدل المسارات الحرجة في تروفوبلاستس، هذا النظام السابقين فيفو مفيدة بشكل خاص لتحديد إذا كان التعبير أنماط الملحوظ في فيفو في المشيمة البشرية مع الأمهات السمنة نتيجة مباشرة للإشارات TNFα. وفي نهاية المطاف، هذا النهج يتيح الفرصة لتحليل النتائج المترتبة على التنظيمية والجزيئية لالتهاب المرتبطة بالسمنة الأمهات أوتوفاجي وأخرى مسارات الخلوية حاسمة في تروفوبلاستس التي لها القدرة على التأثير وظيفة المشيمة.
Introduction
السمنة حالة التهاب تتميز بالتهاب مزمن منخفض التخصيب، النابعة من الأنسجة الدهنية الزائدة وتوافر المغذيات. في السمنة، السيتوكينات proinflammatory مرتفعة في الأنسجة الأيضية وكذلك عناصره في الدورة الدموية. وقد أظهرت مجموعة قوية من الأدلة أن TNFα إلى حد كبير مرتفعة في الإعداد للسمنة مع الآثار في مقاومة الأنسولين والخلل الأيضي1. كما يساهم تنشيط TNFα إمراضية المرض في ظروف مثل السرطان والمناعة الذاتية، مما يجعل هدف علاجي جذاباً2.
ويتفاقم التهاب في السمنة قبل الحمل، وأيضا proinflammatory دولة3،4. لقد ثبت سابقا أن المشيمة TNFα المحتوى يزيد مع أديبوسيتي الأم في الحمل مع الأجنة الإناث. وعلاوة على ذلك، يمنع العلاج TNFα التنفس المتقدرية في الخلايا تروفوبلست الإناث ولكن ليس من الذكور، مما يوحي بأن TNFα تشارك في تنظيم الأيض المشيمية في ديمبرافيك جنسياً نحو5. بدانة الأمهات يرتبط بازدياد نسبة الإصابة بمجموعة متنوعة من مضاعفات أثناء الحمل، بما في ذلك حالات الاملاص، مع الأجنة الذكور يجري الأكثر عرضه3،،من67،8 . بسبب دورها الرئيسي في الواجهة الأم الجنين، التغيرات في القدرة الوظيفية للمشيمة في البيئة داخل الرحم السمنة استجابة لإشارات تحريضية قد تلعب دوراً مهما في التوسط لنتائج الحمل يعانون من السمنة المفرطة.
سيتوتروفوبلاستس وسينسيتيوتروفوبلاستس في الأنسجة فيلوس المشيمة حاسمة بالنسبة لإشارات الغدد الصماء وتبادل المغذيات والأكسجين بين الأم و الجنين النامي9. اضطرابات في القدرة الوظيفية في فيلوس سيتوتروفوبلاستس (يشار إليه فيما يلي trophoblasts) قد تعرض للخطر صحة الجنين والتنمية. يصف هذا البروتوكول وسيلة لأخذ عينات أنسجة فيلوس من المشيمة البشرية مصطلح بتشريح بعيداً من لوحات المشيمة والقاعدية جنبا إلى جنب مع إجراء أمثل لعزل تروفوبلاستس لثقافة الخلية الابتدائية. يتم اشتقاق هذا البروتوكول من المنهجيات المحددة التي تنطوي على الهضم الأنزيمي فيلوس الأنسجة لتحرير الخلايا في المصفوفة خارج الخلية متبوعاً بالطرد المركزي كثافة التفاضلية لعزل تروفوبلاستس10، 11،12. تفاصيل البروتوكول هذا نهج الذي تعامل trophoblasts الأولية من مشيمة من الحمل الهزيل مع وسائط الثقافة تستكمل مع TNFα محاكاة عنصر واحد من الوسط التحريضية المرتبطة بالسمنة الأمهات. وأخيراً، يرد وصف إجراءات بسيطة لحصاد ليساتيس خلية الإجمالي من تعامل TNFα trophoblasts تليها الغربية النشاف للكشف عن التغييرات في التعبير الجيني.
حين الخص هذا النموذج لا أوبيسوجينيك البيئة في الرحم في مجملها، يوفر نظام الخاضعة للرقابة أن يسمح أحد لتحليل خارج مساهمة فردية من التهاب بوساطة TNFα trophoblasts ' وردا على بدانة الأمهات. هذا النموذج يتيح الفرصة لاكتشاف أو تأكيد الأهداف الجزيئية التي تنظم مباشرة مما يشير إلى TNFα في تروفوبلاستس على حد سواء، فضلا عن يسمح أحد لاختبار ما إذا كانت التغيرات في أنماط التعبير الجيني لوحظت في فيفو في مشيمة مع الأمهات السمنة قد تكون نتيجة لالتهاب بوساطة TNFα.
تم تنفيذ النهج المذكور هنا لاختبار أثر وساطة TNFα التهاب على تنظيم أوتوفاجي في تروفوبلاستس البشرية. تروفوبلاستس من الحمل السمنة مع معرض الأجنة الذكور تعطل دوران أوتوفاجيك، أو أوتوفاجوسومي نضوج13. بروتين يسمى خطوة جريئة (تشغيل المجال البروتين التفاعل Beclin1 والغنية سيستين يحتوي على)، الذي هو مترجم إلى ليسوسوميس واندوسوميس الراحل، ومؤخرا وصفت بأنها "فرامل" في عملية دوران أوتوفاجيك لأنه يعمل كصورة سلبية منظم أوتوفاجوسومي نضوج14،15. في الواقع، هو خطوة جريئة مثال نادرة من البروتين الذي يقيد أوتوفاجي، مما يجعلها هدفا قيماً علاجية. يتوفر سوى القليل من المعلومات حول أهمية الفيزيولوجية المرضية لخطوة جريئة، باستثناء دورها في الاستجابة المناعية الفطرية للميكروبات16،17 وكارديوميوسيتي حماية18. باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا، أنها وجدت أن خطوة جريئة من أوبريجولاتيد في تروفوبلاستس الابتدائي الإناث في الاستجابة للعلاج مع زيادة تركيزات TNFα ما يصل إلى 250 بيكوغرام/مل. تنظيم خطوة جريئة قد تلعب دوراً في كيفية تشويه الأجنة أجرة أفضل من الذكور في حالات الحمل مع السمنة الأمهات. أتصدى التهاب المرتبطة بالسمنة الأمهات السابقين فيفو بتعريض البشرية تروفوبلاستس إلى TNFα خارجية توفر منبرا لدراسة أثر البيئة داخل الرحم يعانون من السمنة المفرطة بشأن تنظيم المسارات الحرجة في trophoblasts واستطراداً، وظيفة المشيمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
مترافق جمعت من وحدة تسليم مستشفى الجامعة والعمل تحت بروتوكول أقرته المؤسسية استعراض المجلس لولاية أوريغون للصحة والعلوم في جامعة في بورتلاند، أوريغون، مع الموافقة المستنيرة من المرضى.
1-"جمع الأنسجة المشيمية"
- إعداد
ملاحظة: يجب أن تكون جميع المعدات التي واجه الأنسجة عقيمة.- تعقيم المعدات تشريح بالتعقيم لمدة 60 دقيقة في 121 درجة مئوية.
- استخدام معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية): مختبر يدعك/المعاطف/العباءات وقفازات وقناع مع درع وجه أو نظارات.
- بدوره في حوض ماء ومجموعة إلى 37 درجة مئوية.
- الحارة اثنين 50 مل الأنابيب المخروطية، كل 25 مل تحتوي على وسائط كاملة (Iscove ' s دولبيكو التعديل ' المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS و 1% s البنسلين/ستربتوميسين، الجدول 3) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
- مع موافقة المريض مستنيرة، الحصول على المشيمة الفور بعد الولادة بالعملية القيصرية.
- أصبحت مألوفة مع المشيمة. يتم إدراج الحبل السري على الجانب الجنين (لوحة المشيمة) ويمكن رؤية الأوعية الدموية يشع خارجاً من موقع الإدراج الحبل السري. الجانب الآخر هو جانب الأمهات، أو لوحة القاعدية. وتتضمن أوروبية والهياكل التي تحتوي على أشجار السفينة، ودعا كوتيليدونس-
- أخذ عينات الأنسجة فيلوس
ملاحظة: ينبغي أخذ عينات الأنسجة فيلوس من المشيمة بعد التسليم، يفضل أن تكون في 30 دقيقة أو أقل وقت ممكن.- مع لوحة المشيمة التي تواجه صعودا، الرسوم 2-3 كامل-سمك المقاطع (حوالي 2.5 سم × 2.5 سم في الحجم) 2-3 سم من محيط المشيمة في عشوائية، باستخدام الملقط، والمقص ( الشكل 1A).
ملاحظة: تجنب أجزاء من المشيمة التي تبدو غير طبيعية (أي أبيض تكلسات)- - تقليم بعيداً لوحات المشيمة والقاعدية والأوعية الدموية الكبيرة أي.
- مكان الأنسجة فيلوس الناتجة عن ذلك ( الشكل 1B، حوالي 80-120 غ المجموع) في وسائل الإعلام كاملة الحارة وتبدأ العزلة تروفوبلست داخل 30 دقيقة لأخذ العينات-
ملاحظة: بعض الاختبارات النهائية والتطبيقات تتأثر بطول فترة الكمون بين التسليم وأخذ العينات، وعزل تروفوبلست. فمن الأفضل إبقاء هذه الفترات قصيرة كما ممكناً ومتسقا بين العزلة. - باستخدام التقنيات الموضحة في الخطوات 1.2.1-1.2.2، عينة 5 أقسام عشوائية 1 × 1 سم من نسيج فيلوس عبر المشيمة (بما في ذلك المركز)-
- قص كل عينة الأنسجة فيلوس 1 سم × 1 سم إلى 4-5 قطع أصغر (حوالي 30 ملغ كل)، وضع في أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل، وفلاش تجميد في سائل ن 2. مخزن في-80 درجة مئوية لاستخدامها في تحليل لاحق.
- مع لوحة المشيمة التي تواجه صعودا، الرسوم 2-3 كامل-سمك المقاطع (حوالي 2.5 سم × 2.5 سم في الحجم) 2-3 سم من محيط المشيمة في عشوائية، باستخدام الملقط، والمقص ( الشكل 1A).
2. عزل تروفوبلاستس من "الأنسجة فيلوس"
- إعداد
ملاحظة: استخدام معدات معقمة وتنفيذ الإجراءات التي تنطوي على خلايا في غطاء الاندفاق الصفحي. التدرجات كثافة المجمدة أربع- ذوبان الجليد (الجدول 1، انظر جدول الإمدادات الأساسية، والمواد الكاشفة، والمعدات، والمواد التكميلية) في 4 درجات مئوية في الليلة التي سبقت وصول المشيمة.
ملاحظة: بدلاً من ذلك، كثافة التدرجات يمكن إجراء اليوم من العزلة. - بدوره على أجهزة الطرد المركزي ومجموعة إلى 20 درجة مئوية.
ملاحظة: جميع الخطوات الطرد المركزي في أقصى تسارع وتباطؤ، ما لم يحدد خلاف ذلك- - تحضير 1 × مخزنة حبيس الملح الحل (حبس) تستكمل مع Ca + 2 و Mg + 2 (الجدول 3)-
- التربسين الحارة إلى 37 درجة مئوية.
- "الدناز تمييع" لحوالي 2720 كيلونيتس/مل في العقيمة تستكمل حبس.
- دافئ 50 مل من مصل العجل الوليد (NCS) إلى 37 درجة مئوية.
- الحارة وسائط كاملة إلى 37 درجة مئوية.
- الحارة تجميد وسائل الإعلام (90% FBS، 10% [دمس]، الجدول 3) إلى 37 درجة مئوية.
تنبيه: [دمس] سامة ويجب أن تعالج مع القفازات. - الهضم إعداد المخزن المؤقت (الجدول 2 و 3) بخلط مل 308 من استكمال حبس، 50 مل التربسين (3751.7 بيي وحدة/مل)، و 0.5 مل الدناز (379.4 كيلونيتس/mL) في زجاجة معقمة.
ملاحظة: هو الوقت التقريبي المطلوب لعزل الخلايا من الأنسجة فيلوس 7 h.
- ذوبان الجليد (الجدول 1، انظر جدول الإمدادات الأساسية، والمواد الكاشفة، والمعدات، والمواد التكميلية) في 4 درجات مئوية في الليلة التي سبقت وصول المشيمة.
- تجهيز "الأنسجة فيلوس"
- شطف كل قطعة من الأنسجة فيلوس في أنبوب 50 مل مخروطية مليئة بالفوسفات درجة حرارة الغرفة مخزنة المالحة (PBS). كرر ويحل محل برنامج تلفزيوني كاللازمة حتى تتم إزالة الدم الزائد (شطف برنامج تلفزيوني سيكون الضوء الأحمر أو الوردي عندما الأنسجة هي تشطف جيدا)-
- مكان الأنسجة فيلوس في طبق بتري معقم وإزالة العديد من الأوعية الدموية ممكن بلطف كشط قبالة فيلوس الأنسجة اللينة من السفن باستخدام شريحة مجهر.
- فرم ناعما الأنسجة فيلوس الناتجة باستخدام مقص.
- فيلوس الأنسجة الهضم وعزل النفط الخام من تروفوبلاستس
- بنقل الأنسجة فيلوس مفروم إلى زجاجة معقمة مع الحل الهضم وفقا لوحدات التخزين محسوب استناداً إلى نشاط معين من التربسين والدناز (165 مل، الجدول 2). إمالة الزجاجة الهضم على جانبها
- بعد 35 دقيقة من الحضانة في حمام مائي 37 درجة مئوية مع الهز في ثورات 70 في الدقيقة (لفة في الدقيقة)، والسماح للقطع عسر الهضم من الأنسجة تسوية في الجزء السفلي من الزجاجة. رسم بعناية حتى المادة طافية مع ماصة مصلية، تجنب الأنسجة المستقرين.
- الاستغناء عن المادة طافية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر التساوي بين أنابيب مخروطية 50 مل.
ملاحظة: توفيرا للوقت، من المستحسن أن تبدأ الثانية تسوى الهضم عن طريق إضافة الحل الهضم (110 مل، الجدول 2) إلى بقية الأنسجة واستئناف الحضانة كما هو موضح في الخطوة 2.3.2. - بلطف طبقة 3-5 مل من سي إس تحت المادة طافية المتوترة بصرفها ببطء من ماصة مصلية في الجزء السفلي من الأنبوب. ينبغي أن يكون غضروف بين المادة طافية المتوترة (التي تحتوي على تروفوبلاستس) والنيجيرية مرئية ( الشكل 2A).
- الطرد في supernatants المركزي على سي إس في غ س 1,250 لمدة 15 دقيقة في 20 درجة مئوية. وستشمل بيليه الناتجة عن خلايا الدم الحمراء في الطبقة السفلي-معظم تليها طبقة بيضاء تحتوي على خلايا تروفوبلست ( الشكل 2)-
- كرر الخطوات 2.3.2-2.3.5 لكل من ديجيسشنز الثانية والثالثة (إضافة 110 مل و 83.5 م، على التوالي، حل الهضم لزجاجة الأنسجة، الجدول 2).
- مرة واحدة قد تم طرد جميع سوبيرناتانتس، ريسوسبيند كل بيليه في 5 مل من وسائل الإعلام كاملة دافئة، وثم تجميع أن الإيقاف.
- تقسيم تعليق خلية التساوي بين اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1,250 س ز لمدة 15 دقيقة في 20 درجة مئوية.
- إزالة المادة طافية بلطف وريسوسبيند كل من الكريات خلية في 6 مل كومبل الحارةوسائط ات-
- كثافة استخدام الطرد المركزي
- تقسيم تعليق خلية التساوي بين أربعة كثافة التدرجات (3 مل في كل) ببطء وعناية طبقات تعليق خلية أعلى كثافة التدرجات مع بيبيت نقل-
- الطرد المركزي التدرجات الكثافة في 1,250 س ز لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع الحد الأدنى من التسارع والتباطؤ. وهذا ينبغي أن تنتج نطاقات مميزة من الخلايا رسابة (الجدول 4).
- ببطء وبعناية إزالة الطبقات العليا من كثافة وسائل الإعلام التدرج (محكمة أمن الدولة) حتى يتم التوصل إلى band(s) غير شفاف يحتوي على خلايا تروفوبلست (بين 35-50% DGM) (الجدول 4).
- تحويل العصابات تروفوبلست إلى اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل وملء مع وسائل الإعلام كاملة دافئة.
- برفق عكس أنابيب 3-6 مرات لخلط والطرد المركزي في 1,250 س ز لمدة 15 دقيقة في 20 درجة مئوية. إزالة المادة طافية
- وريسوسبيند كل خلية بيليه في 5 مل من وسائل الإعلام كاملة دافئة. الجمع بين تعليق خلية، وحساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام هيموسيتوميتير وتريبان الأزرق (أو خلية المفضل عد الأسلوب).
- عد الخلايا مع هيموسيتوميتير
- مزيج تعليق خلية بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع بيبيت مصلية أو برفق عكس الأنبوبة عدة مرات.
- الجمع بين أجزاء متساوية من تعليق خلية وتريبان الأزرق (أي 20 ميليلتر كل) في أنبوب منفصل وتخلط بلطف.
- إينكوباتي لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- برفق الاستغناء عن 15-20 ميليلتر من الخلية-تريبان الأزرق خليط ما بين ساترة وهيموسيتوميتير وتسمح للخلايا لنشرها عبر الشبكة بعمل شعري.
- عد خلايا قابلة للحياة (وسوف تكون الخلايا الميتة الملون أزرق) في كل من الأرباع الأربعة 4 × 4 مع عداد تالي. تستخدم نظاما للعد لضمان لا يتم حساب الخلايا أكثر من مرة (أي لا عد الخلايا التي تعمل باللمس أو الحدود اليسرى السفلي).
ملاحظة: يجب أن تحتوي على كل رباعي 4 × 4 بين 50-150 الخلايا. خلايا كثيرة جداً أو قليلة جداً يمكن أن يؤدي إلى التقليل من عدد الخلايا أو أكثر. - ضرب متوسط الخلية إجمالي التهم من كل من الأرباع 4 × 4، 10 4، ومن ثم قم بضرب معامل التخفيف (تعليق خلية تريبان الأزرق) لحساب عدد الخلايا كل مل.
- تضاعف عدد الخلايا كل مل بالحجم الإجمالي لتعليق خلية لحساب العائد خلية الإجمالي-
ملاحظة: من المتوقع حوالي 100 مليون الخلايا من العزلة بدءاً من 80-120 غ أنسجة فيلوس.
- الخلايا تصفيح
- لوحة 3 مليون خلايا/البئر (3.3 × 10 5 خلايا كل سم 2) في لوحة 6-جيدا (2 مل تعليق كل بئر) ولطف الصخور ذهابا وإيابا وجنبا إلى جانب لتوزيعها بالتساوي الخلايا.
ملاحظة: تتطلب Trophoblasts لوحات زراعة الأنسجة المعالجة إلى التقيد بشكل صحيح. مطلوب أحادي الطبقة خلايا لتعزيز سينسيتياليزيشن. - ترك الخلايا مطلي في هود الاندفاق الصفحي لحوالي 30 دقيقة السماح بتوزيع بالتساوي، وتسوية، والبدء في الانضمام إلى الجزء السفلي من الآبار قبل وضع في الحاضنة الخلايا.
- خلايا الثقافة لتصل إلى 72 ح (مع التغيرات اليومية في وسائل الإعلام) في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO 2 و 95% رطوبة.
ملاحظة: دراسة تروفوبلاستس تحت مجهر في 10-20 x كل 24 ساعة للثقافة. تتكاثر لا تروفوبلاستس ولا باساجيد. خلال 72 ساعة من الثقافة، الصمامات trophoblasts الفردية جولة لتشكيل سينسيتيوم ( الشكل 3 ألف وباء).
- لوحة 3 مليون خلايا/البئر (3.3 × 10 5 خلايا كل سم 2) في لوحة 6-جيدا (2 مل تعليق كل بئر) ولطف الصخور ذهابا وإيابا وجنبا إلى جانب لتوزيعها بالتساوي الخلايا.
- تجميد خلايا
- بيليه الخلايا غير المستخدمة بالطرد المركزي في 1,250 س ز لمدة 10 دقائق في 20 درجة مئوية.
- نضح وسائل الإعلام قدر ممكن من بيليه.
- بيليه في تجميد وسائل الإعلام (الجدول 3) ريسوسبيند-
- تجميد مختبرين في-80 درجة مئوية في تجميد حاوية مليئة بالكحول 100%. نقل مختبرين المجمدة للسائل ن 2 وفي اليوم التالي للتخزين على المدى الطويل.
ملاحظة: يمكن استزراع الخلايا بعد تجميد.
- ذوبان الخلايا
- إزالة قاسمة الخلايا المجمدة وذوبان الجليد في حمام مائي 37 درجة مئوية بينما يحوم. إزالة قاسمة من حمام الماء فقط قبل قد إذابة تماما لسائل-
- نقل الخلايا المذابة فورا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. بدأ يتباطأ في البداية، أضف 10 مل وسائط كاملة مع خلط متقطعة.
- قلب الأنبوبة عدة مرات لخلط-
- أجهزة الطرد المركزي في 200 غ س لمدة 10 دقائق في 20 درجة مئوية.
- نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 2-5 مل من وسائل الإعلام كاملة دافئة.
- عد الخلايا ولوحة كما تم وصفه سابقا-
3. علاج Trophoblasts الأولية مع TNFα ومجموعة من الخلايا ليساتيس، والغربية النشاف
- إعداد
- الحارة وسائط كاملة إلى 37 درجة مئوية.
- جعل رصيد 10 ميكروغرام/مل من TNFα في وسائل الإعلام كاملة ومخزن في-20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام- جعل
- 1 ميكروغرام/مل العامل رصيد TNFα في وسائل الإعلام كاملة عندما تكون جاهزاً لعلاج الخلايا. المسلسل تضعف الأسهم العامل TNFα إلى 10 4 بيكوغرام/مل 3 10 بيكوغرام/مل، 500 بيكوغرام/مل، 250 بيكوغرام/مل و 125 بيكوغرام/مل في وسائل الإعلام كاملة-
ملاحظة: تركيز TNFα 10 4 بيكوغرام/مل اعتدال السامة للخلايا. التكيف لتركيزات TNFα اختبار سيتوقف على تفاصيل التطبيقات النهائية المرجوة.
- علاج الخلايا مع TNFα
- بعد 24 ساعة ثقافة، نضح وسائط الثقافة من الخلايا واستبدال مع 2 مل TNFα تستكمل وسائل الإعلام الواحدة وكذلك على لوحات 6-جيدا (الآبار اثنين على الأقل للعلاج والمركبات التحكم)-
- بعد 24 ح TNFα-التعرض (48 ح للثقافة)، استبدال وسائل الإعلام TNFα تكملة مع وسائل الإعلام كاملة-
- حصاد الخلايا والبروتين الكلي
- بعد 72 ساعة ثقافة (24 ح في الماضي إزالة TNFα)، نضح وسائط الإعلام وشطف الخلايا مع درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني بلطف وإضافة ميليلتر 80 من الجليد الباردة الإنزيم راديويمونوبريسيبيتيشن المخزن المؤقت (RIPA) التي تتضمن طازجة إضافة مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (الجدول 3) مباشرة لكل بئر.
- إزالة الخلايا من اللوحة مع كاشطة لخلية. نقل الخلايا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، تجميع الآبار داخل مجموعات العلاج.
- الخلايا من فورتيكسينج الأنابيب في عالية لفترات ثلاث على الأقل من 15 س.
- احتضان الخلايا عند 4 درجة مئوية مع هزاز ل 15 دقيقة
ملاحظة: بدلاً من ذلك، بعد الخطوة 3.3.3.، يمكن المحتضنة الخلايا في الثلج لمدة 15 دقيقة مع الانفعال المتقطع خلال يسددها الأنبوب، فورتيكسينج، أو بيبيتينج يصل وهلwn. - كرر الخطوة 3.3.3.
- الطرد المركزي هذه الأنابيب في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية بيليه الحطام الخلوية.
- نقل المادة طافية (التي تحتوي على البروتين الخلوي) إلى 1.5 مل الجديدة ميكروسينتريفوجي الأنبوبة ومخزن في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن إيقاف هنا البروتوكول واستأنفت في وقت لاحق. من المستحسن جعل مختبرين عدة عينات البروتين الخلوي لتجنب دورات تجميد أذاب متعددة. - تحديد تركيز البروتين الكلي بطريقة مفضلة، مثل مقايسة حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي، انظر جدول الإمدادات الأساسية، والمواد الكاشفة، والمعدات، والمواد التكميلية)-
- الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والغربية النشاف لخطوة جريئة أو البروتين الفائدة
ملاحظة: "الغربية اتبع" النشاف بروتوكولات وفقا للشركة المصنعة ' s تعليمات استخدام نظام مختبر مفضل.- تحميل بين 20-40 ميكروغرام من البروتين الكلي في المخزن المؤقت للعينة (الجدول 3) كل بئر على اكريلاميد 12% جل. فصل البروتينات بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة في تشغيل المخزن المؤقت (الجدول 3)-
- الرطب ونقل البروتينات من الجل لغشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s في نقل المخزن المؤقت (الجدول 3).
- احتضان الغشاء في مسحوق الحليب 5% في "تريسبوفيريد المالحة" مع 0.1% 20 توين (تبسة، الجدول 3) على الأقل 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز.
- احتضان الغشاء في جسم الأولية خطوة جريئة (انظر جدول الإمدادات الأساسية، والمواد الكاشفة، والمعدات، والمواد التكميلية) في 1: 500 1% مسحوق الحليب في تبسة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع هزاز.
- برفق يغسل الغشاء 3 x 5 دقيقة في تبست و 1 × 5 دقائق في تبس في درجة حرارة الغرفة مع هزاز.
- احتضان الغشاء في 1:2000-بينها جسم الثانوي (المتقارن مرئية مرتبطة ببرنامج الصحة الإنجابية أو المفضلة، انظر جدول الإمدادات الأساسية، والمواد الكاشفة، والمعدات، والمواد التكميلية) في 5% مسحوق الحليب في تبسة على الأقل 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز.
- تصور وصمة عار مع الركازة (أي تشيميلومينيسسينت) تصور مناسب على نظام تصوير وكرر الإجراء الغسيل المذكورة في الخطوة 3.4.5.
- كرر الإجراء الغسيل المذكورة في الخطوة 3.4.5 والتحقيق الغشاء β أكتين أو عنصر تحكم تحميل مفضل وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s-
- في البرنامج تحليل الصور المفضلة، تحليل التعبير من خطوة جريئة بالقياس الكمي اليدوي لامتصاص (كثافة الفرقة)، مراقبة الطرح لامتصاص الخلفية، والتطبيع لتحميل المقابلة كثافات الفرقة. إجراء التحليلات الإحصائية حسب الاقتضاء لاختبار تغييرات يعتد به إحصائيا في مستويات البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مصطلح مشيمة الآدمي من العجاف (مؤشر كتلة الجسم قبل الحمل (BMI) < 25) جمعت الأمهات ذوات الحمول غير المصحوبة بمضاعفات حمل ذرية الإناث وأخذ عينات منها خلال 15 دقيقة الولادة بالعملية القيصرية (لا العمل). وبحثت في المشيمة لعدم وجود تكلسات والتنمية النموذجية: وزنها بين 300-600 غرام مع الحبل السري والأغشية إزالتها، جولة في الشكل، بين 15-25 سم في القطر، وإدراجها في المنتصف الحبل السري المشيمة. وكان تشريح الأنسجة فيلوس بعيداً عن الصفائح القاعدية والمشيمة في 2-3 عينات من عبر المشيمة (الشكل 1)، مما أسفر عن حوالي 100 غرام أنسجة فيلوس كابتداء من المواد لعزل تروفوبلست الأولية. خلال 20 دقيقة من أخذ عينات الأنسجة فيلوس، بدأت إجراءات لعزل trophoblasts الأولية كما هو موضح هنا، الغلة بين 0.8-1 × 108 خلايا قابلة للحياة. كان المصنف الخلايا في لوحات الثقافة 6-جيدا في كثافة 3 × 106 (3.3 × 105 خلايا كل سم2). بعد 24 ساعة ثقافة، تم فحص الخلايا تحت مجهر للمرفق وأكدت مورفولوجيا تروفوبلست السليم (الفردية جولة الخلايا). وسائل الإعلام ثقافة استعيض بالكامل الوسائط التي تحتوي على سلسلة من تركيزات TNFα بين 125-104 بيكوغرام/مل حتى أن اثنين على الأقل من الآبار تم تضمينها كل تركيز ومراقبة المركبات (وسائط كاملة فقط).
أربعة وعشرون ساعات عقب TNFα-العلاج (48 ح للثقافة)، استعيض عن جميع TNFα الإعلام مع وسائل الإعلام كاملة. ولوحظ موت الخلية ملموس لا سبب العلاج مع TNFα في تركيزات في أو أقل من3 10 بيكوغرام/مل. المعاملة مع 104 بيكوغرام/مل TNFα السامة للخلايا معتدل والآثار السامة للخلايا لهذا التركيز TNFα لا تزال قائمة بعد أن تم تغيير الوسائط كما يتضح من "نازعة لاكتات" (رابطة حقوق الإنسان) فحوصات (البيانات لا تظهر). 72 ح للثقافة، الخلايا التي بحثت عن سينسيتياليزيشن تحت مجهر. وكشف إيمونوسيتوتشيميستري سينسيتياليزيشن وتلوث تنتجها الخلايا الليفية العزلة نقي نسبيا من تروفوبلاستس (الشكل 3). كانت تحصد ليساتيس الخلوية وفقا للبروتوكول هو موضح هنا، الغلة بين 3-8 ميكروغرام/ميليلتر من البروتين الكلي لإعداد كما يحددها مقايسة اتفاق التعاون الأساسي (البيانات لا تظهر). الغربية لطخة تحليل في ليساتيس الخلية من الإناث تروفوبلاستس تعامل مع TNFα أظهرت upregulation التعبير خطوة جريئة في استجابة لتركيزات TNFα ما يصل إلى 250 بيكوغرام/مل واللاحقة downregulation التعبير خطوة جريئة بتركيزات TNFα أكبر من 250 بيكوغرام/مل (الشكل 4 أ ، وب،4 10 بيكوغرام/مل استبعادها من التحليل القائم على الآثار السامة للخلايا). وبالمثل، خطوة جريئة بدرجة كبيرة أوبريجولاتيد في خزعات الأنسجة فيلوس المجمدة فلاش من مشيمة من الحمل السمنة مع الأجنة الإناث مقارنة بضوابط العجاف كما يتضح من تحليل لطخة غربية (الشكل 4 و D، n = 6 مشيمة كل مؤشر كتلة الجسم الطبقة، ANOVA، ف < 0.05).
| تركيز (%) | 90% محكمة أمن الدولة (ml) | x HBSS 1 (ml) | سمك الطبقة (ml) |
| 4 x التدرج | 4 x التدرج | مل 34.5 مجموع | |
| 70 | 14 | 4 | 4.5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7.33 | 4.67 | 3 |
| 50 | 3.34 | 2.67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (13.5 مل علامة) |
| 40 | 5.33 | 6.67 | 3 |
| 35 | 4.67 | 7.33 | 3 (19.5 مل علامة) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2.67 | 9.33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10.67 | 3 |
الجدول 1. مواصفات لجعل كثافة التدرجات لكثافة استخدام الطرد المركزي من تروفوبلاستس الأولية.
من اليسار إلى اليمين، تعيين عمود واحد الكثافة المتدرجة وسائط الإعلام (محكمة أمن الدولة، انظر الجدول الإمدادات الأساسية، والمواد الكاشفة، والمعدات، والمواد التكميلية) تركيز معبراً عنه بنسبة مئوية من محكمة أمن الدولة في هبس. العمود الثاني يحدد حجم محكمة أمن الدولة بينما الأعمدة الثلاثة تحدد حجم حبس المطلوبة لجعل النسبة المئوية الملائمة لحل محكمة أمن الدولة. أربع العمود تعيين وحدة التخزين المراد إضافتها إلى أنبوب 50 مل المخروطية لبناء التدرج، بدءاً بطبقة أكثر كثافة.
| التربسين | حبس | الدناز | ||
| الهضم | (مجموع النشاط؛ وحدات بيي) | الحجم (مل) | (مجموع النشاط؛ كونيتس) | الحجم الإجمالي /digestion |
| 1 | 619037 (23.01 مل) | مل 141.76 | 62594 (0.230 مل) | 165 مل |
| 2 | 412691 (15.34 مل) | مل 94.51 | 41729 (0.154 مل) | 110 مل |
| 3 | 313270 (11.65 مل) | مل 71.74 | 31676 (0.116 مل) | مل 83.5 |
| المجموع | 1345000 (50 مل) | مل 308 | 136000 (0.5 مل) | مل 358.5 |
الجدول 2. مواصفات لإعداد حل الهضم لعزل تروفوبلست الأولية استناداً إلى نشاط معين من الدناز والتربسين.
من اليسار إلى اليمين، العمود الأول يحدد عدد ديجيسشنز، العمود الثاني يحدد النشاط التربسين المطلوبة في الهضم، والعمود الثالث يحدد الحجم الكلي لحبس المكملة لإضافتها لهضم المناسبة، العمود الرابع تحدد النشاط الدناز المطلوبة في الهضم، والعمود الأخير تحدد حجم الحل الهضم لتكونإضافة إلى الأنسجة المشيمية لهضم المناسبة.
| هبس (تستكمل مع Ca+ 2 و Mg+ 2) | المخزن المؤقت للعينة |
| 10% 10 x HBSS | 90% 4 X Laemmli الصبغة |
| 1.26 مم كاكل2 (عنيد.) | 10% 2-ميركابتوثانول |
| 0.80 مم MgSO4 (عنيد.) | |
| مم 20.77 حبيس | |
| pH إلى 7.4 مع 10N هيدروكسيد الصوديوم جعل وحدة تخزين ما يصل إلى 1 لتر مع ddH2O العقيمة تصفية العقيمة في زجاجة معقمة |
|
| وسائط كاملة | المخزن المؤقت قيد التشغيل |
| إزالة 11% v/v إيمدم | قاعدة تريس 25 مم |
| إضافة 10% v/v FBS | 190 مم جليكاين |
| إضافة 1% U/mL 10,000 البنسلين/ستربتوميسين (100 U/mL النهائي) | 0.1 الحزب الديمقراطي الصربي % |
| درجة الحموضة إلى 8.3 | |
| تجميد وسائل الإعلام | |
| 90% v/v FBS | نقل المخزن المؤقت |
| 10% v/v [دمس] | 25 مم تريس |
| 190 مم جليكاين | |
| المخزن المؤقت الهضم | 20% ميثانول |
| 50 مل التربسين (وحدات بيي 26,900/mL) | درجة الحموضة إلى 8.3 |
| 0.5 مل الدناز (وحدات ك 272,000/mL) | |
| جلب لمل 358.5 في هبس المكملة | TBS |
| 20 مم تريس | |
| المخزن المؤقت للمعهد الملكي | 150 مم كلوريد الصوديوم |
| 25 مم تريس-HCl | درجة الحموضة إلى 7.6 |
| 5 مم يدتا | |
| 150 مم كلوريد الصوديوم | تبسة |
| 0.1 الحزب الديمقراطي الصربي % | TBS مع توين 0.1% 20 |
| 0.5 ديوكسيتشولاتي الصوديوم % | |
| 1% Triton X-100 | |
| 1 حبة من مثبطات البروتياز/الفوسفاتيز كل 10 مل ريبا المخزن المؤقت |
الجدول 3. الحلول المطلوبة للعزلة والثقافة Trophoblasts الابتدائي تليها "الغربية النشاف".
| % DGM | مارك مل | نوع الخلية |
| 10 | 31.5-34.5 | الحطام |
| 20 | 28.5 31.5 | |
| 30 | 22.5 28.5 | |
| 35 | 19.5-22.5 | تروفوبلاستس |
| 40 | 16.5-19.5 | |
| 45 | 13.5 16.5 | |
| 50 | 10.5-13.5 | الخلايا اللمفية |
| 55 | 7.5-10.5 | |
| 60 | 4، 5-7، 5 | خلايا الدم الحمراء |
| 70 | أدناه 4.5 |
الجدول 4. ترسب تروفوبلاستس بكثافة استخدام الطرد المركزي.
تحديد العمود الأول من اليسار إلى اليمين، النسبة المئوية لمحكمة أمن الدولة (الجدول 1)، ويحدد العمود الثاني علامة مل حيث تم العثور على النسبة المئوية المقابلة لمحكمة أمن الدولة في أنبوب 50 مل مخروطية، والعمود الثالث يحدد ما هي الخلية نوع الرواسب في النسبة المئوية المقابلة لمحكمة أمن الدولة ومل علامة على أنبوب مخروطي 50 مل. تروفوبلاستس الرواسب بين محكمة أمن الدولة 50-35 في المائة، تشكيل عصابات كامد متميزة. جمع DGM أعلى أو أسفل هذا النطاق سيؤدي إلى تلوث الحطام الخلوية وسائر أنواع الخلايا مثل الخلايا الليمفاوية.
الشكل 1. يتم عزل الأنسجة فيلوس من "المشيمة البشرية عبارة" عن طريق إزالة المشيمية والصفائح القاعدية.
A) مع لوحة المشيمة (الجانب الجنين) التي تواجه صعودا، عينة سمك كامل هو اقتطعت من المشيمة. ب) يتم الحصول على عينة من الأنسجة فيلوس بإزالة لوحات المشيمة والقاعدية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 2. الطرد المركزي خلايا في "حل الهضم" على "مصل العجل الوليد" يؤدي "بيليه خلية متعددة الطبقات".
A) مصل العجل الوليد (سي إس) الطبقات تحت تعليق خلية في حل الخلاصة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. ب) الطرد المركزي (أ) ينتج بيليه خلية متعددة الطبقات. الطبقة الأسفل في عمق اللون الأحمر ويتكون من خلايا الدم الحمراء. الطبقة المذكورة أعلاه تشمل trophoblasts وأبيض أو بيج في اللون. أعلاه تروفوبلست هو طبقة سي إس تليها حل الهضم (طافية) إلى الجزء العلوي من الأنبوب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3. تحليل إيمونوسيتولوجيكال سينسيتياليزيشن ومحتوى تنتجها الخلايا الليفية في الثقافات تروفوبلست البشرية الأساسية.
A) صورة تمثيلية سيتوكيراتين-7 (أحمر) في سيتوتروفوبلاستس بعد 24 ساعة ثقافة. ب) صورة تمثيلية سيتوكيراتين-7 (أحمر) في سينسيتيوتروفوبلاستس بعد 72 ساعة ثقافة يبين الجماهير مولتينوكليتيد من الخلايا التي قد تنصهر فيها. ج) صورة تمثيلية فيمنتين (أحمر) في سينسيتيوتروفوبلاستس بعد 72 ساعة ثقافة. الصور تم الحصول عليها في مجهر فلوري مع كونتيرستين النووية DAPI (أزرق). تصور في 10 X التكبير. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. تنظيم التعبير خطوة جريئة في استجابة للعلاج TNFα في تروفوبلاستس الإناث والتعبير الذاتية خطوة جريئة في الأنسجة فيلوس من الهزيل مقابل الحمل السمنة مع الأجنة الإناث.
تروفوبلاستس الابتدائي من مشيمة الأجل من الأمهات العجاف مع الحمل صحية تحمل جنين أنثى كانت معزولة وتعامل مع 125، 250، 500، 103، و 104 بيكوغرام/مل TNFα (أو التحكم بالسيارة). A) وصمة عار الغربية الممثل لخطوة جريئة في ليساتيس تروفوبلست الإناث تعامل مع TNFα. Β-أكتين استخدمت كعنصر تحكم تحميل. ب) التعبير خطوة جريئة ردا على المعاملة TNFα في trophoblasts الإناث كان كمياً من البقع الغربية وتطبيعها على β-أكتين. القيم هي التعبير خطوة جريئة يعني كل TNFα تركيز ± المطران في n = 3 مشيمة. ج) الغربية اسطوانات يقوم على خطوة جريئة في الأنسجة كله ليساتيس من فلاش المجمدة خزعات نسيج فيلوس الهزيل مقابل الحمل السمنة مع الأجنة الإناث (F1-F12). واستخدمت كعنصر تحكم تحميل نازعة لاكتات A (لدها). د) روبيكون اسطوانات يقوم التعبير في الغرب من (ج) وكان كمياً وتطبيعها على لدها. القيم هي التعبير خطوة جريئة يعني كل تصنيف مؤشر كتلة الجسم ± المطران في n = 6 مشيمة كل فئة مؤشر كتلة الجسم (ANOVA، * ف < 0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المشيمة، المسؤولة عن تنظيم نمو الجنين، يسلك الدالة الشبهة في البيئة السمنة6. على الرغم من مطالب الأيضية العالية تروفوبلاستس، يحمل مشيمة مع السمنة الأمهات التنفس المتقدرية مختلة6،19. التغييرات في استقلاب المشيمة قد تسهم في ازدياد نسبة الإصابة بالمضاعفات والنتائج الضائرة الجنين في الحمل السمنة3،،من67. أوتوفاجي هو أيضا يتعرض للخطر في مشيمة مع السمنة الأمهات. مشيمة من الحمل السمنة مع الأجنة الذكور تظهر التمويه أوتوفاجيك مختلة كما يتضح ذلك من تراكم أوتوفاجوسوميس13. الحفاظ على التدفق الأمثل أوتوفاجيك حاسم بالنسبة للتوازن الخلوية وأوتوفاجي المعيبة في مشيمة مع السمنة الأمهات قد تلعب دوراً مهما في التوسط للنتائج السلبية المرتبطة بالحمل يعانون من السمنة المفرطة.
الأسباب الدقيقة وظيفة المشيمية الشبهة في السمنة الأمهات ليست مفهومة جيدا ويجوز لها أصولها في إشارة تحريضية. السمنة والحمل هي proinflammatory الدول التي تتميز بمستويات مرتفعة من تعميم TNFα1،4،،من2021. TNFα هو منشط أوتوفاجي22،23ويجوز التوسط التغيرات في تدفق أوتوفاجيك في المشيمة من الحمل يعانون من السمنة المفرطة. TNFα يستخدم عادة لدراسة آثار التهاب في الخلايا، ولا سيما في سياق السرطان2. البروتوكول المعروضة هنا تتكيف مع هذا النهج لدراسة آثار الالتهابات المتصلة بالسمنة على القدرة الوظيفية للمشيمة بعلاج trophoblasts الأولية مع TNFα خارجية في الثقافة.
هذا البروتوكول ويتكون من أربعة عناصر رئيسية: أخذ عينات من الأنسجة فيلوس من المشيمة، عزل trophoblasts الأولية من الأنسجة فيلوس، ثقافة trophoblasts الأساسي متبوعاً بالعلاج TNFα، وجمع من مجموع ليساتيس الخلوية التي تليها الغربية لطخة تحليل لقياس التعبير عن protein(s) للفائدة. لعزل trophoblasts نقية، من الأهمية بمكان أن الصفائح القاعدية والمشيمة هي تشريح دقيق بعيداً عن الأنسجة فيلوس خلال أخذ عينات المشيمة (الشكل 1B). من المحتم أيضا أن الأنسجة فيلوس تتم معالجتها في الوقت مناسب (أي في غضون 30 دقيقة الولادة). تفاصيل هذا البروتوكول استخدام ثلاث خطوات الهضم، دائم كل 35 دقيقة، بالإفراج عن تروفوبلاستس من المصفوفة الخلوية إضافية من الأنسجة فيلوس. خطر ديجيسشنز أطول الخلايا الضارة التي تريبسينيزيشن الخلية البروتينات السطحية. زيادة عدد الملخصات لا ملحوظ زيادة العائد النهائي من تروفوبلاستس قابلة للحياة. إلا أن تناقص الوقت وعدد ديجيستيونس سيؤدي إلى الخلية تناقص الغلة (سيمون وبوشر مالويان، بيانات غير منشورة). وتنتج هذا البروتوكول موثوق بها حوالي 100 مليون خلايا من 80-120 جرام من الأنسجة فيلوس.
وهناك تقلب في عدد عصابات تروفوبلست مميزة يحتفل في التدرجات كثافة بين العزلة. لتجنب التلوث الناجم عن أنواع الخلايا الأخرى، من المهم أن دقة جمع band(s) التي تحتوي على تروفوبلاستس على التدرج الكثافة (الجدول 4). البروتوكول بالتفصيل هنا هو الأمثل من الأساليب المحددة سابقا التي تسفر عن trophoblasts نقي نسبيا مع أقل من 5% أنواع التلوث من خلية أخرى10،،من1112. ويمكن تحقيق تنقية أخرى بالتحديد الإيجابية أو السلبية24. غير أن هذا النهج ينطوي على خطر تخفيض عائد تروفوبلاستس قابلة للحياة. تحليل Immunocytochemical سيتوكيراتين-7 في تروفوبلاستس الأولية المعزولة باستخدام الإجراء المعروضة هنا بعد 24 مقابل 72 ساعة وقت الثقافة أكد أن الخلايا وخضع سينسيتياليزيشن كما يتضح من وجود خلية مولتينوكليتيد الجماهير في 72 ساعة، حدثاً السمة مميزة في عمر تروفوبلست (الشكل 3 ألف وباء). وعلاوة على ذلك، كشف تحليل immunocytochemical فيمنتين في الابتدائي trophoblasts مثقف ح 72 الليفية تلويث قليلة جداً (الشكل 3). للأغراض الروتينية، يمكن رصد نقاء trophoblasts في ثقافة التقييم المورفولوجي بسيطة. في 24 ساعة وقت الثقافة، جولة cytotrophoblasts فردية تهيمن على الثقافة. الخضوع سيتوتروفوبلاستس سينسيتياليزيشن بعد 72 ساعة من الثقافة، أسفر عن كتل من الخلايا تنصهر فيها. هو نوع الخلية تلويث الأكثر شيوعاً وجدت في هذه الثقافة تنتجها الخلايا الليفية أو خلية بطانية، التي ممدود والمضلع في الشكل، على التوالي. يمكن رصد هذه الميزات تقريبا باستخدام مجهر مشرق.
علاج trophoblasts الأولية مع TNFα يوفر نظام الخاضعة للرقابة التي يسمح أحد لقياس تأثير TNFα الإشارات في تنظيم المسارات الحرجة في تروفوبلاستس. وبطبيعة الحال، هناك عوامل أخرى بخلاف TNFα في بيئة الأمهات يعانون من السمنة المفرطة في فيفو التي قد تكون مسؤولة عن تحوير وظيفة تروفوبلست. هذه تتضمن ولكن لا تقتصر على الإشارات الهرمونية والدهون ومجموعة كبيرة من العوامل proinflammatory الأخرى25. وسوف الخص تركيبات من العلاجات المختلفة كذلك البيئة داخل الرحم السمنة السابقين فيفو بطريقة دقيقة أكثر من الناحية الفسيولوجية. تركيزات TNFα خارجية تستخدم لعلاج تروفوبلاستس في هذا البروتوكول الآن تتجاوز تلك المتداولة عادة في فيفو. تركيزات مصل قد تم الإبلاغ عنها تصل إلى 20 نانوغرام/مليلتر أو أعلى في بعض الظروف التحريضية26. للحصول على استجابة يمكن قياسها بالطرق المختبرية الحالية (النشاف أي الغربية)، من الضروري تضخيم تركيزات TNFα للكشف عن التغييرات في التعبير الجيني ومسارات للفائدة. قد توجد هذه الاستجابات في فيفو بدرجة أقل. بيد أنها يمكن أن ذلك يؤثر بشكل ملحوظ وظيفة تروفوبلاستس. تعريض تروفوبلاستس لتركيزات عالية من TNFα ينطوي على خطر إنتاج التحف في التعبير الجيني وتحليل المسار الذي قد يكون متأصلاً في الآثار السامة للخلايا. سيتوتوكسيسيتي المعتدل لوحظ في trophoblasts يتعرضون ل pg/mL4 10 TNFα تستكمل وسائل الإعلام عن ح 24 كما يتضح من رابطة حقوق الإنسان سيتوتوكسيسيتي فحوصات (البيانات لا تظهر). ومع ذلك، لم تسفر التركيزات في أو أسفل 103 بيكوغرام/مل TNFα أي موت الخلية ملموس.
الاختبار تركيزات TNFα عند فواصل زمنية أصغر و/أو التي هي أدنى مما هو موضح هنا قد تكون أفضل يتبعه الكميةتفاعل البوليميراز المتسلسل (qPCR) لتحليل التعبير الجيني، وتقنية مناسبة تماما لاكتشاف التغيرات الصغيرة في التعبير الجيني. بينما qPCR الاختبارات على وجه التحديد لمستويات التعبير الجيني على المستوى النسخي، النشاف الغربية يكشف المستويات النهائية لمنتجات البروتين التي يفترض أن تتوفر لأداء هذه المهمة (المهام) الخلوية. باستخدام كلا من التقنيات التحليلية في الاقتران نهج قوية لتحديد أثر المعاملة TNFα على تنظيم مستويات التعبير الجيني كذلك أما بالنسبة لتحديد ما إذا كانت التغييرات في مستويات التعبير نتيجة النسخي، تنظيم بوستترانسكريبشونال، أو بوستترانسلاشونال. قد يؤثر الإجهاد التحريضية السلوك تروفوبلست ومورفولوجيا وسينسيتياليزيشن. بما في ذلك تقييمات المورفولوجية (أي إيمونوسيتوتشيميستري) بالإضافة إلى النهج التحليلي الجزيئية سيوفر إجراء تحليل أكثر شمولاً لتأثيرات التعرض TNFα تروفوبلست الصحية. التكيف لتركيزات TNFα فحوصات المختبرة والمصب وفقا لمطالب التجريبية من المستحسن.
من خلال تنفيذ البروتوكول الموصوفة هنا، وجد التهاب بوساطة TNFα upregulate التعبير خطوة جريئة في تروفوبلاستس البشرية من الحمل الهزيل مع الأجنة الإناث. غرب النشاف لخطوة جريئة في تروفوبلست ليساتيس كشف شريطين متميزة القرب وأعلاه الوزن الجزيئي المتوقعة من 140 كاتشين (الشكل 4 أ). وهناك أدلة تشير إلى أن الشريط السفلي غير محددة (pAb "خطوة جريئة" لمكافحة PD047، ورقة بيانات MBL، http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). تروفوبلاستس الإناث أثبتت قدرتها على التعبير عن خطوة جريئة في الاستجابة للعلاج TNFα من تركيزات تصل إلى 250 بيكوغرام/مل أوبريجولاتي. بتركيزات أعلى من هذا، التعبير خطوة جريئة مستويات انخفض مرة أخرى نحو خط الأساس (عنصر تحكم غير المعالجة) وحتى أدناه (الشكل 4 باء، n = 3). نظراً لأن علاج تروفوبلاستس من الحمل الهزيل مع TNFα تحاكي التهاب في البيئة داخل الرحم يعانون من السمنة المفرطة، هذه النتيجة مكملة لاستنتاج مفاده أن خطوة جريئة بدرجة كبيرة أوبريجولاتيد في خزعات الأنسجة فيلوس المجمدة فلاش من مشيمة من الحمل السمنة مع الأجنة الإناث مقارنة بضوابط العجاف (n و D، ANOVA،الرقم 4 = 6 كل فئة مؤشر كتلة الجسم، ف < 0.05).
بينما لا يبدو التمويه أوتوفاجيك تختلف في تروفوبلاستس من الحمل السمنة مع الأجنة الإناث مقارنة بضوابط الهزيل، تروفوبلاستس من الحمل السمنة مع الأجنة الذكور يحمل تنشيط تكوين وتراكم أوتوفاجوسوميس 13-خطوة جريئة منظم سلبية من أوتوفاجي، حيث يعمل على وقف أوتوفاجوسومي-يحلول الانصهار27. Trophoblasts الإناث قد upregulate التعبير عن خطوة جريئة كآلية تعويضية أو الوقائية ضد التهاب TNFα بوساطة، التي يمكن تنشيط أوتوفاجي22، يسمح لهم بالحفاظ على الجريان الهزيل مثل أوتوفاجيك في تحديد بدانة الأمهات. هذا الرد في المشيمة قد تلعب دوراً في كيفية تشويه الأجنة أجرة أفضل من الذكور في البيئة داخل الرحم يعانون من السمنة المفرطة. النمذجة الوسط الالتهابات المرتبطة بالسمنة الأمهات السابقين فيفو من خلال علاج trophoblasts البشرية الأولية مع TNFα يوفر منبرا دراسة آثار البيئة داخل الرحم يعانون من السمنة المفرطة بشأن تنظيم المسارات الحرجة في تروفوبلاستس. تعديل هذا البروتوكول مع علاجات جديدة وتوافقية ترمي حظيا بالبيئة الأمهات يعانون من السمنة المفرطة وسوف توفر سبيلاً مثيرة لدراسة آثار السمنة الأمهات على وظيفة المشيمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون النساء الذين تبرعوا مشيمة لهذه الدراسة. ونشكر أيضا بتسليم إدارة OHSU والأم والجنين من فريق البحث والعمل لتنسيق جمع مشيمة. نحن ممتنون لاريك وانغ، دكتوراه، وكيلي كو، العضو المنتدب للدعم والمساعدة بطرق تجريبية والتحسين.
تم تمويل هذا العمل من قبل HD076259A المعاهد الوطنية للصحة (صباحا) واها GRNT29960007 (ص).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
References
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
- Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
- Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
- Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
- Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
- Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
- Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
- Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
- Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
- Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
- Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
- Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
- Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
- Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
- Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
- Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
- Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
- Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).
