Summary
本文介绍了一种用于人胎盘绒毛组织的取样方法, 其次是分离细胞原代细胞培养。滋养治疗 TNFα重述炎症在肥胖的宫内环境和促进发现的分子靶调控的炎症在胎盘孕产妇肥胖。
Abstract
孕产妇肥胖与不良围产期结局的风险增加有关, 可能是由胎盘功能受损引起的, 部分原因是自噬的失调。肥胖妊娠胎盘中自噬调节因子表达的异常变化可能由与肥胖和妊娠有关的炎症过程调节。这里描述的是一个协议的绒毛组织和绒毛细胞的分离, 从一项人类胎盘的原代细胞培养。其次是一种方法模拟的炎症环境, 在肥胖的宫内环境中, 治疗原发性滋养从精妊娠与肿瘤坏死因子α (TNFα), 一个促炎细胞因子, 是升高的肥胖和怀孕.通过这里所描述的协议的实施, 发现暴露于外源性 TNFα调节了滋养的表达, 这是一种自噬的负调节, 来自于女性胎儿的精益妊娠。虽然在肥胖的宫内环境中的各种生物因素保持了在滋养中调节关键通路的潜能, 这个ex 体内系统特别适用于确定表达模式是否观察到了体内在人类胎盘中, 孕产妇肥胖是 TNFα信号的直接结果。最终, 这种方法提供了一个机会来分析与母体肥胖有关的炎症的调控和分子影响, 对滋养的自噬和其他重要的细胞通路有可能影响胎盘功能。
Introduction
肥胖是一种炎症状态, 其特点是慢性低度炎症, 来源于过量的脂肪组织和养分的供应。在肥胖症中, 促炎细胞因子在代谢组织中升高, 并在循环系统中具有系统性。一个强有力的证据显示, TNFα在肥胖的设置中显著升高, 而胰岛素抵抗和代谢功能障碍的影响是1。活化 TNFα也有助于疾病的发病机制, 如癌症和自身免疫, 使其成为一个有吸引力的治疗目标2。
肥胖的炎症是由妊娠加重的, 也是一个炎症状态3,4。以前的结果表明, 胎盘 TNFα的含量随着孕产妇的肥胖而增加。此外, TNFα治疗抑制雌性而非雄性滋养层细胞的线粒体呼吸, 表明 TNFα参与了以性二方式调节胎盘代谢的作用5。孕产妇肥胖与妊娠期间各种并发症的发病率增加有关, 包括死胎, 男性胎儿最易受感染3,6,7,8.由于其在母体-胎儿界面的关键作用, 在肥胖宫内环境中胎盘功能的变化对炎症信号的反应可能在调节肥胖妊娠结局中起重要作用。
细胞和合体在胎盘的绒毛状组织是关键的内分泌信号和营养和氧气交换之间的母亲和发育的胎儿9。绒毛细胞 (以下简称滋养) 功能能力的紊乱可能危及胎儿的健康和发育。本协议描述了一种从人类足月胎盘中提取绒毛组织的方法, 通过剥离绒毛膜和基底板, 以及一个优化的分离滋养原细胞培养的程序。该协议是从建立的方法, 涉及酶消化的绒毛组织, 释放细胞从胞外基质后, 差密度离心分离滋养10, 11,12。本议定书详细介绍了一种方法, 其中主要滋养来自胎盘从精益怀孕的治疗与培养基辅以 TNFα, 以模拟一个组成部分的炎症环境与孕产妇肥胖。最后, 本文介绍了一种从 TNFα处理后的滋养中提取总细胞裂解的方法, 并对其进行了探讨, 以检测基因表达的变化。
虽然此模型不重述致在子宫内环境中的整体, 但它提供了一个受控系统, 允许您解析 TNFα介导的炎症在滋养的反应中的个人贡献孕妇肥胖症这个模型既提供了发现或确认分子靶点的机会直接调控的 TNFα信号在滋养, 并且允许一个测试, 如果基因表达模式的变化观察到的在体内在胎盘与母体肥胖可能是 TNFα介导的炎症的结果。
本文所介绍的方法是为了测试 TNFα介导的炎症对人类滋养自噬的调节作用。滋养从肥胖怀孕与男性胎儿陈列被打乱的噬转交, 或者 autophagosome 成熟13。一种称为卢比的蛋白质 (运行域蛋白 Beclin1-interacting 和富含半胱氨酸的含), 这是本地化的溶酶体和晚期体, 最近被描述为 "刹车" 在噬的周转过程中, 因为它的功能作为一个负autophagosome 成熟的调节器14,15。事实上, 卢比是抑制自噬的一个罕见的例子, 它使它成为一个有价值的治疗目标。很少有关于卢比的病理生理学意义的信息, 除了它在先天免疫应答微生物16、17和心肌细胞保护18中的作用。使用这里描述的协议, 它发现, 卢比是上调在女性原发性滋养的反应, 以增加浓度的 TNFα高达 250 pg/毫升的治疗。在孕产妇肥胖时, 对卢比的调节可能会影响女性胎儿的体重。综述炎症与孕产妇肥胖相关前体通过暴露人滋养外源性 TNFα提供了一个平台, 研究肥胖宫内环境对关键通路调节的影响滋养和延伸, 胎盘功能。
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Protocol
胎盘是根据俄勒冈州波特兰健康和科学大学机构审查委员会批准的一项议定书从大学医院的劳动和分娩单位收集的, 并征得患者.
1. 胎盘组织的收集
- 准备
注: 所有遇到组织的设备都必须是无菌的。- 用灭菌在121和 #176 上对解剖设备进行消毒60分钟; C.
- 使用个人防护设备 (PPE): 实验室大衣/长袍/磨砂、手套和面罩, 戴口罩或护目镜.
- 打开水浴并设置为37和 #176; C.
- 暖两个50毫升圆锥管, 每个包含25毫升的完整介质 (Iscove 和 #39; s 修饰的 Dulbecco 和 #39; s 培养基补充 10% FBS 和1% 青霉素/链霉素, 表 3 ) 在37和 #176; C 水浴.
- 经患者知情同意后, 在剖宫产分娩后立即获得胎盘.
- 熟悉胎盘。脐带插入胎儿侧 (绒毛膜板), 血管可以从脐带插入部位放射出来。另一侧是母方, 或基板。它包括含有血管树的蜕膜和结构, 称为子叶.
- 绒毛状组织的取样 注: 绒毛组织应在分娩后尽快从胎盘中取样, 最好在30分钟或更少的情况下。
- 与绒毛膜板朝上, 消费2-3 全部分 (约2.5 厘米 x 2.5 厘米大小) 2-3 厘米, 从周围的胎盘随机, 使用镊子和剪刀 ( 图 1A ).
注意: 避免部分胎盘出现异常 (即白色钙化). - 修剪掉绒毛膜和基底板以及任何大型血管.
- 将产生的长柔毛组织 ( 图 1B , 大约 80-120 g 总计) 放入温暖完整的介质中, 并在取样30分钟内开始滋养层隔离.
注意: 某些下游的化验和应用受到分娩、取样和滋养层隔离之间的潜伏期长短的影响。最好将这些期间尽可能短, 并在隔离之间保持一致. - 使用步骤 1.2.1-1.2.2 中描述的技术, 从胎盘 (包括中心) 的5随机 1 cm x 1 厘米的绒毛状组织切片中取样.
- 将每个 1 cm x 1 厘米长柔毛组织样本切成4-5 小块 (大约30毫克), 在2毫升离心管中放置, 并在液体 N 中闪烁冻结 2 。存储在-80 和 #176; C 供以后分析使用.
- 与绒毛膜板朝上, 消费2-3 全部分 (约2.5 厘米 x 2.5 厘米大小) 2-3 厘米, 从周围的胎盘随机, 使用镊子和剪刀 ( 图 1A ).
2。从绒毛组织中分离滋养的研究
- 准备
注: 使用无菌设备并执行涉及层流罩中细胞的程序。- 解冻四冻结密度渐变 ( 表 1 , 请参阅4和 #176 的基本耗材、试剂和设备、辅助材料的表); C 在胎盘到达前的前一天晚上.
注意: 或者, 可以在隔离的当天进行密度渐变. - 打开离心机并设置为20和 #176; C.
注: 除另有规定外, 所有离心步骤均达到最大加速度和减速. - 准备 1x HEPES 缓冲盐溶液 (HBSS), 辅以 Ca +2 和 Mg +2 ( 表 3 ).
- 温热胰蛋白酶到37和 #176; C.
- 稀释 dnasei 到大约 2720 kilounits/毫升在无菌补充 HBSS.
- 暖50毫升新生小牛血清 (非华语) 到37和 #176; C.
- 将完整介质预热到37和 #176; C.
- 热冷冻介质 (90% FBS, 10% 亚砜, 表 3 ) 到37和 #176; C.
警告: 亚砜是有毒的, 必须用手套处理. - 准备消化缓冲 ( 表2和 3 ), 混合308毫升的补充 HBSS, 50 毫升的胰蛋白酶 (3751.7 BAEE 单位/毫升), 和0.5 毫升的 dnasei (379.4 kilounits/毫升) 在一个无菌瓶.
注意: 从绒毛组织中分离细胞所需的大约时间是 7 h.
- 解冻四冻结密度渐变 ( 表 1 , 请参阅4和 #176 的基本耗材、试剂和设备、辅助材料的表); C 在胎盘到达前的前一天晚上.
- 处理长柔毛组织
- 在50毫升锥形管中冲洗每一片绒毛状组织, 填充室温磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。重复和更换 pbs 的必要, 直到多余的血液被删除 (pbs 冲洗将是浅红色或粉红色时, 组织是彻底冲洗).
- 将长柔毛组织放置在无菌培养皿中, 并通过显微镜滑动将柔软的长柔毛组织从血管中取出, 以尽可能多地去除血管.
- 用剪刀将产生的长绒毛组织精细剁碎.
- 将切碎的绒毛状组织转移到无菌瓶中, 并根据胰蛋白酶的具体活动量计算出消化液。和 dnasei (165 毫升, 表 2 ).
- 在37和 #176 中孵育35分钟后; C 水浴与晃动在70转每分钟 (rpm), 倾斜消化瓶在它的边和允许未消化的片断组织在瓶的底部安定。小心地用血清吸管把上清液抽出, 避免被固定的组织.
- 将上清通过100和 #181; m 单元格过滤器均匀地放在50毫升锥形管之间.
注意: 为了节省时间, 建议在第二次消化时加入消化液 (110 毫升, 表 2) 到剩余的固定组织和恢复孵化, 如步骤2.3.2 所述. - 轻轻地从试管底部的血清吸管中缓慢地分配 3-5 毫升的无张力上清液。在被劳损的上清 (含滋养) 和非控制性之间的半月板应该是可见的 ( 图 2A ).
- 在 1250 x g 上离心清, 15 分钟在20和 #176; C。由此产生的颗粒将包括在最下层层的红细胞, 其次是含有滋养层细胞的白细胞 ( 图 2B ).
- 对第二和第三个消解重复步骤 2.3.2 2.3.5 (分别添加110毫升和83.5 米, 用于组织瓶的消化液, 表 2 ).
- 一旦所有清都被离心, 重每个小球在5毫升的温暖完整的媒体, 然后将悬浮在一起.
- 将两个50毫升圆锥管和离心机在 1250 x g 之间平均拆分15分钟, 在20和 #176 处分离细胞悬浮液.
- 在6毫升温热详情中, 轻轻移除上清和重每一个细胞小球等媒体.
- 将单元悬浮均匀地划分为四密度渐变 (每3毫升), 通过缓慢而仔细地分层在密度渐变顶部的单元悬浮, 并传递吸管.
- 离心密度梯度在 1250 x g 为 20 min 在20和 #176; C 以极小的加速度和减速。这将产生可区分的沉淀单元格带 ( 表 4 ).
- 在包含滋养层细胞的不透明带 (35 至 #160;-50% 副总经理) 到达 ( 表 4 ) 之前, 慢慢小心地移除密度梯度介质的顶端图层.
- 将滋养层带入两个50毫升锥形管中, 并用完整的热介质填充.
- 轻轻翻转管 3-6 倍, 混合和离心在 1250 x g 为15分钟, 在20和 #176; C.
- 在5毫升的温热完整介质中清除上清和重每个细胞颗粒。结合细胞悬浮和计数可行的细胞使用例和台盼蓝 (或优选的细胞计数法).
- 的单元格, 通过移的血清吸管或通过轻轻地反转管数次, 将细胞悬浮液混合在一起.
- 将单元悬浮和台盼蓝等相等部分 (即20和 #181; L) 分别放入一个单独的管中, 然后轻轻混合.
- 室温孵育 1-2 分钟.
- 轻轻地免除 15-20 和 #181; 在片和例之间的细胞-台盼蓝混合物的 L, 并允许细胞通过毛细管作用在网格中扩散.
- 计数活细胞 (死细胞将被染色深蓝色) 在每一个四 4 x 4 象限的计数器。采用计数系统, 以确保单元格不会多次计数 (即不计算触及底部或左侧边界的单元格).
注: 每 4 x 4 象限应包含 50-150 单元格。太少或太多的细胞会导致细胞数量的过度或低估. - 平均每个 4 x 4 象限中的单元格计数, 乘以 10 4 , 然后乘以稀释因子 (单元悬浮到台盼蓝) 来计算每毫升的细胞数.
- 将每个 mL 的单元格数乘以单元悬浮的总体积, 以计算总的细胞产量.
注: 约1亿细胞预计从隔离开始与80-120 克的绒毛组织.
- 板300万单元格/井 (3.3 x 10 5 单元每 cm 2 ) 在6井板 (2 毫升每井) 和轻轻地来回晃动和两侧均匀分布的细胞.
注意: 滋养需要组织培养处理过的钢板才能正确粘附。需要一个单层细胞来促进 syncytialization. - 将层流罩中的镀膜细胞保持约30分钟, 使细胞均匀分布、沉淀, 并开始附着在井底, 然后放入孵化器. 在37和 #176 中为多达 72 h (每日媒体更改) 的区域性单元格. C 孵化器与 5% CO 2 和95% 湿度.
注意: 在显微镜下检查滋养每24小时 10 20x 的培养基。滋养不增殖, 不能传代。在 72 h 文化的过程中, 圆的个体滋养保险丝形成一个合 ( 图 3A 和 B ).
- 将未使用的单元格离心为 1250 x g, 10 分钟在20和 #176; C.
- 从颗粒中吸出尽可能多的介质.
- 在冻结介质中重颗粒 ( 表 3 ).
- 将等分冻结在-80 和 #176; C 在一个装满100% 异丙醇的冷冻容器中。将冻结的等分到第二天的液体 N 2 进行长期存储.
注意: 冷冻后细胞可以培养.
- 删除分的冻结单元格, 并在37和 #176 中进行解冻; 漩涡中的水浴。将分从水浴中取出, 然后再将其完全解冻到液体中.
- 立即将解冻的细胞转移到15毫升的锥形管上。开始放慢, 增加10毫升的完整媒体间歇混合.
- 反转管多次混合.
- 200 x g 离心10分钟在20和 #176; C.
- 在 2-5 毫升的温完整介质中吸出上清和重颗粒.
- 按前面所述计算单元格和板数.
3。肿瘤坏死因子和 #945 治疗原发性滋养, 细胞裂解的收集, 和西部印迹
- 准备
- 热完整介质到37和 #176; C.
- 制作10和 #181; 在完整的媒体和存储在-20 和 #176; 直到准备好使用.
- 制作1和 #181; 当准备好治疗细胞时, 在完整的培养基中, TNF 和 #945 的工作存量;连续稀释 TNF 和 #945; 工作库存到 10 4 pg/毫升, 10 3 pg/毫升, 500 pg/毫升, 250 pg/毫升, 和 125 pg/毫升在完整的媒体.
注: TNF 和 #945; 浓度 10 4 pg/毫升是适度的细胞毒。TNF 和 #945 的调整; 浓度测试将取决于所需的下游应用程序的具体情况.
- 处理具有 tnf 和 #945 的单元格;
- 在培养 24 h 后, 从细胞中吸取培养基, 用2毫升的 tnf 和 #945 代替; 每口6孔板上的补充介质 (每种处理和车辆至少两个井)控件).
- 经过 24 h 的 tnf 和 #945;-暴露 (48 h 文化), 取代 tnf 和 #945; 补充媒体与完整的媒介.
- 在培养72小时后 (24 小时后清除 TNF 和 #945;), 吸液培养基, 用室温 PBS 轻轻冲洗细胞, 并添加80和 #181; 冰冷 Radioimmunoprecipitation 测定缓冲 (帕), 含有新鲜添加的蛋白酶和磷酸酶抑制剂 ( 表 3 ), 直接对每个井.
注: 或者, 在步骤3.3.3 后, 细胞可以在冰上孵育15分钟, 通过弹管, 涡流, 或移的间歇搅拌
注意: 协议可以在这里停止并在以后恢复。建议多等分细胞蛋白样品, 避免多次冻融循环.
注意: 根据制造商和 #39 的指示使用优选的实验室系统, 遵循西方印迹协议。
- 在20-40 和 #181 之间加载; 在12% 丙烯酰胺凝胶上, 每井的样品缓冲 ( 表 3 ) 中的总蛋白 g。通过 SDS 页分离蛋白质 ( 表 3 ). 根据制造商和 #39 在传输缓冲区中的说明 ( 表 3 ), 将凝胶中的蛋白质转到聚偏氟 (PVDF) 膜上.
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Representative Results
足月人胎盘从精益 (前身体质量指数 (BMI) 和 #60; 25) 在分娩后15分钟内采集和取样产妇, 并进行剖宫产 (无分娩)。胎盘检查没有钙化和典型的发展: 体重之间的300-600 克与脐带和膜移除, 圆形, 在 15-25 厘米直径, 和脐带插入中间胎盘.从胎盘 (图 1) 的2-3 样本中分离出基部和绒毛膜板的绒毛组织, 产生约100克的绒毛组织作为初级滋养层隔离的起始材料。在取样长柔毛组织的20分钟内, 分离原滋养的过程就开始了, 这里描述的是 0.8-1 x 108存活的细胞。细胞在6井文化板材被播种了在密度 3 x 106 (3.3 x 105细胞每 cm2)。经过24小时的培养, 细胞被检查在显微镜下的依恋和适当的滋养层形态学确认 (单个圆形细胞)。培养基被完全介质所取代, 其中含有一系列浓度的 TNFα在 125-104 pg/毫升之间, 因此至少有两口井包括每浓度和车辆控制 (仅限于完整介质)。
二十四小时后 TNFα处理 (48 h 文化), 所有 TNFα媒体被替换为完全媒介。没有观察到明显的细胞死亡, 由于治疗 TNFα在浓度或低于 103 pg/毫升。治疗与 104 pg/毫升 TNFα是适度的细胞毒和这种 TNFα浓度的细胞毒性作用没有坚持后, 媒体改变, 如证明乳酸脱氢酶 (LDH) 化验 (数据没有显示)。在72小时的培养基中, 在显微镜下检查细胞 syncytialization。syncytialization 和成纤维细胞污染的免疫组织化学显示滋养的相对纯净的隔离 (图 3)。细胞裂解被收获根据这里描述的协议, 屈服在3-8 µg/µL 的总蛋白的每准备由一个定量测定 (未显示的数据)。TNFα治疗女性滋养细胞裂解的免疫印迹分析显示, 在 TNFα浓度的反应中, 下调的浓度为 250 pg/毫升, 随后 TNFα的卢比表达量为上调。超过 250 pg/毫升 (图 4A 和 B, 104 pg/ml 排除在基于细胞毒性作用的分析之外)。同样, 在从胎盘的肥胖妊娠与精益控制相比, 上调在闪光冷冻绒毛组织活检中的卢比是显著的, 如西方印迹分析 (图 4C 和 D, n = 6每个 BMI 类, 方差分析, P 和 #60 的胎盘; 0.05)。
| 浓度 (%) | 90% 副总经理 (毫升) | 1x HBSS (毫升) | 层厚 (毫升) |
| 4x 渐变 | 4x 渐变 | 共34.5 毫升 | |
| 70 | 14 | 4 | 4。5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7.33 | 4.67 | 3 |
| 50 | 3.34 | 2.67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (13.5 毫升标记) |
| 40 | 5.33 | 6.67 | 3 |
| 35 | 4.67 | 7.33 | 3 (19.5 毫升标记) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2.67 | 9.33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10.67 | 3 |
表1。主要滋养密度离心密度梯度的制作规范。
从左到右, 第一列指定密度梯度介质 (副总经理, 见表的基本用品, 试剂, 和设备, 补充材料) 集中表示为副总经理在 HBSS 的百分比。第二列指定副总经理的数量, 而列三指定了使副总经理解决方案的适当百分比所需的 HBSS 量。四列指定要添加到 50 mL 锥形管中以生成渐变的卷, 从最稠密的层开始。
| 胰蛋白酶 | HBSS | dnasei | ||
| 消化 | (活动总数;BAEE 单位) | 容积 (毫升) | (活动总数;Kunits) | 总容积 /消化 |
| 1 | 619037 (23.01 毫升) | 141.76 毫升 | 62594 (0.230 毫升) | 165毫升 |
| 2 | 412691 (15.34 毫升) | 94.51 毫升 | 41729 (0.154 毫升) | 110毫升 |
| 3 | 313270 (11.65 毫升) | 71.74 毫升 | 31676 (0.116 毫升) | 83.5 毫升 |
| 总 | 1345000 (50 毫升) | 308毫升 | 136000 (0.5 毫升) | 358.5 毫升 |
表2。根据 dnasei 和胰蛋白酶的特异活性, 制备原发滋养层分离的消化液的规范。
从左到右, 第一列指定消解的数量, 第二列指定每个消化所需的胰蛋白酶活性, 第三列指定为适当的消化添加的补充 HBSS 的总体积,第四列指定每个消化所需的 dnasei 活动, 最后一列指定消化溶液的体积添加到胎盘组织中进行适当的消化。
| HBSS (补充与 Ca+2和 Mg+2) | 示例缓冲区 |
| 10% 10x HBSS | 90% 4X Laemmli 染料 |
| 1.26 mM CaCl2 (anhyd) | 10% 2-基 |
| 0.80 mM MgSO4 (anhyd) | |
| 20.77 毫米 HEPES | |
| pH 值为 7.4, 10N 氢氧化钠 使体积高达1升与无菌 ddH2O 无菌过滤器成无菌瓶 |
|
| 完整的媒体 | 运行缓冲区 |
| 删除11% 伏/v IMDM | 25毫米三垒 |
| 添加 10% v/v FBS | 190毫米甘氨酸 |
| 添加 1% 1万 u/毫升青霉素/链霉素 (100 u/毫升最终) | 0.1% SDS |
| pH 值为8。3 | |
| 冷冻介质 | |
| 90% 伏/伏 FBS | 传输缓冲区 |
| 10% 伏/五甲基亚砜 | 25毫米三 |
| 190毫米甘氨酸 | |
| 消化缓冲 | 20% 甲醇 |
| 50毫升胰蛋白酶 (26900 BAEE 单位/毫升) | pH 值为8。3 |
| 0.5 毫升 dnasei (27.2万 K 单位/毫升) | |
| 带到358.5 毫升补充 HBSS | tbs |
| 20毫米三 | |
| 帕缓冲区 | 150毫米氯化钠 |
| 25毫米三盐酸 | pH 值为7。6 |
| 5毫米 EDTA | |
| 150毫米氯化钠 | TBST |
| 0.1% SDS | TBS 与0.1% 吐温20 |
| 0.5% 胆酸钠 | |
| 1% 海卫 X-100 | |
| 每10毫升帕缓冲剂1片蛋白酶/磷酸酶抑制剂 |
表3。主要滋养的分离和培养所需的溶液, 其次是印迹。
| 副总经理 | ml 标记 | 单元格类型 |
| 10 | 31.5-34。5 | 碎片 |
| 20 | 28.5-31。5 | |
| 30 | 22.5-28。5 | |
| 35 | 19.5-22。5 | 滋养 |
| 40 | 16.5-19。5 | |
| 45 | 13.5-16。5 | |
| 50 | 10.5-13。5 | 淋巴细胞 |
| 55 | 7.5-10。5 | |
| 60 | 4.5-7。5 | 血红细胞 |
| 70 | 4.5 以下 |
表4。密度离心法沉淀滋养。
从左到右, 第一列指定副总经理的百分比 (表 1), 第二列指定了在50毫升圆锥管上找到副总的相应百分比的 ml 标记, 第三列指定了什么单元格类型的沉积物在50毫升锥形管上的副总经理和 ml 标记的相应百分比。滋养沉积在 50-35% 副副总之间, 形成明显的不透明带。在这一范围内或下面收集副副产物会导致细胞碎片和其他细胞类型如淋巴细胞的污染。
图1。绒毛组织被分离从期限人的胎盘通过去除绒毛膜和基板。
a)与绒毛膜板 (胎侧) 正面朝上, 从胎盘中切除一个完整的厚度样本。B)通过除去绒毛膜和基底板来获得绒毛组织的样本。请单击此处查看此图的较大版本.
图2。消化液中的细胞在新生小牛血清中的离心会产生多层细胞颗粒。
a)新生小牛血清 () 在50毫升锥形管的消化液中, 在细胞悬浮液的下面分层。B)离心 (a) 产生多层细胞颗粒。最底层的层深红色, 由红血球组成。上面的图层包括滋养, 颜色为白色或米色。在滋养层之上, 是在管的顶端, 然后是消化液 (上清)。请单击此处查看此图的较大版本.
图3。原发性人滋养层培养物中 Syncytialization 和成纤维细胞含量的免疫分析。
A) Cytokeratin-7 (红色) 在细胞24小时后的代表性图像。B) Cytokeratin-7 (红色) 在合体 72 h 后的代表性图像显示核大量的细胞融合。C)波形 (红色) 在合体72小时后的代表性图像。图像是在荧光显微镜下获得的, DAPI (蓝色) 核 counterstain。10X 放大倍率可视化。请单击此处查看此图的较大版本.
请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
胎盘, 负责调节胎儿的生长, 在肥胖环境中表现出损害性功能6。尽管滋养的代谢要求很高, 但母体肥胖的胎盘表现出功能失调的线粒体呼吸6,19。胎盘代谢的变化可能有助于增加并发症的发病率和不良胎儿结局观察到肥胖怀孕3,6,7。在母体肥胖的胎盘中, 自噬也会受到损害。胎盘从肥胖怀孕与男性胎儿显示功能失调的噬通量证明通过积累的体13。维持最佳的噬通量是关键的细胞稳态和有缺陷的自噬在胎盘与母体肥胖可能发挥重要作用, 调解不良结局与肥胖怀孕。
在母体肥胖症中表现出的胎盘功能受损的确切原因尚不清楚, 可能源于炎症信号。肥胖和妊娠都是炎症状态, 其特征是循环 TNFα1、4、20、21。TNFα是一种自噬的激活剂22,23, 并可能调节胎盘中的噬通量的变化, 从肥胖怀孕。TNFα通常用于研究炎症对细胞的影响, 特别是在癌症的情况下2。在这里提出的协议适应这一方法研究的影响, 肥胖相关的炎症对胎盘的功能能力, 通过治疗原滋养与外源性 TNFα的文化。
该协议包括四主要组成部分: 从胎盘绒毛组织的取样, 从绒毛组织分离的原滋养, 原滋养的培养, 其次是 TNFα治疗, 并收集总细胞裂解其次免疫印迹分析法测定蛋白质表达的兴趣。为了隔离纯滋养, 至关重要的是, 绒毛膜和基底板在胎盘取样 (图 1B) 中从绒毛状组织中彻底剥离。还必须及时地处理绒毛组织 (即在分娩后30分钟内)。本议定书详述了三消化步骤的使用, 每一个持续35分钟, 以释放滋养从额外的细胞基质的长柔毛组织。长消解通过 trypsinization 细胞表面蛋白破坏细胞的风险。增加摘要的数量并没有明显增加可行的滋养的最终收益率。然而, 减少消解的时间和数量将导致细胞产量下降 (西蒙, 肉, 和 Maloyan, 未发布的数据)。这个协议可靠地生产大约1亿个细胞从 80-120 克长柔毛组织。
在隔离之间的密度梯度上观察到的不同滋养层带的数量有变异性。为了避免其他细胞类型的污染, 在密度梯度 (表 4) 中严格收集含有滋养的带是很重要的。此处详述的协议是从以前建立的方法中进行优化的, 它们从其他单元格类型10、1112中产生相对纯净的滋养。进一步纯化可以通过正负选择24实现。然而, 这种方法有降低可行滋养产量的风险。Cytokeratin-7 在原滋养中的免疫细胞化学分析在24和 72 h 的培养时间后, 这里所提出的程序证实了 syncytialization 核细胞质量的存在在72小时, 在滋养层的寿命中的一个标志性事件 (图 3A 和 B)。此外, 72 小时培养的原滋养中波形的免疫细胞化学分析发现极少污染成成纤维 (图 3C)。为了常规的目的, 滋养的纯度可以通过简单的形态学评估在文化中进行监测。在 24 h 文化时间, 圆的个体细胞控制文化。细胞经过72小时的 syncytialization 培养后, 形成融合细胞团簇。在这种培养中发现的最常见的污染细胞类型是成纤维细胞或内皮细胞膜, 分别拉长和多边形。这些特性可以用明亮的显微镜进行粗略的监测。
治疗原发性滋养与 TNFα提供了一个控制系统, 允许一个测量的影响, TNFα信号的调节关键通路在滋养。自然, 在肥胖产妇环境中, 除了 TNFα外, 还有其他因素在体内, 可能负责调节滋养层功能。这些包括但不限于荷尔蒙信号, 高脂血症, 和许多其他促炎因素25。不同的治疗组合将进一步重述肥胖的宫内环境前体以更加生理学的准确的方式。本协议中用于治疗滋养的外源 TNFα的浓度远远超过通常在体内循环的。血清浓度已报告达到 20 ng/毫升或更高的某些炎症条件26。为了获得现有的实验室方法 (即西方印迹) 的可测量的反应, 有必要扩大 TNFα浓度, 以揭示基因表达的变化和兴趣的途径。这些响应可能在较小的范围内存在在体内。然而, 它们仍可能对滋养的功能产生重大影响。暴露滋养高浓度的 TNFα运行的风险, 在基因表达和通路分析, 可能植根于细胞毒性效应的人工制品。在滋养中观察到 104 pg/mL TNFα补充培养基的细胞毒性, 如 LDH 细胞毒性测定 (未显示数据)。然而, 浓度在或低于 103 pg/毫升 TNFα没有产生任何可观的细胞死亡。
测试 TNFα浓度在更小的间隔和/或低于这里描述可能是最好的跟进数量聚合酶链反应 (qPCR) 用于基因表达分析, 这一技术很适合于检测基因表达的微小变化。虽然 qPCR 专门测试基因表达水平的转录水平, 西方印迹检测的最终水平的蛋白质产品, 可能可以执行他们的细胞任务 (s)。同时使用这两种分析技术是确定 TNFα治疗对基因表达水平调节的影响的有力方法, 同时也是为了确定表达水平的变化是否是转录的结果,后, 或修饰规则。炎症应激可影响滋养层的行为、形态学和 syncytialization。包括形态学评估 (即免疫细胞化学), 除了分子分析方法, 将提供更全面的分析 TNFα暴露对滋养层健康的影响。根据试验要求对 TNFα浓度进行了调整, 并进行了下游测定。
通过执行这里描述的协议, TNFα介导的炎症被发现上调的卢比表达的人滋养从精益怀孕与女性胎儿。在滋养层裂解的西部印迹显示两个不同的波段附近和高于预期的分子量 140 kDa (图 4A)。有证据表明, 较低的波段是非特异性的 (PD047 反卢比 pAb, MBL 数据表, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/？pcd=PD027#u-pub)。女性的滋养表现出上调表达的能力, 以回应 TNFα治疗浓度高达 250 pg/毫升。在高于此的浓度下, 卢比表达式水平降低到基线 (未经处理的控制), 甚至低于 (图 4B, n = 3)。鉴于治疗滋养从精益妊娠与 TNFα模拟炎症在肥胖的宫内环境, 这一结果是互补的发现, 卢比是显着上调在闪光冷冻绒毛组织活检从胎盘从肥胖怀孕与女性胎儿相比, 精益控制 (图 4C 和 D, 方差分析, n = 6 每 BMI 类, P & #60; 0.05)。
虽然噬通量似乎没有区别滋养从肥胖怀孕与女性胎儿相比, 精益控制, 滋养从肥胖怀孕与男性胎儿表现出活化的形成和积累的体13. 卢比是自噬的负调节器, 它的作用是停止 autophagosome-溶融合27。女性滋养可能上调表达的卢比作为补偿或保护机制, 以对抗 TNFα介导的炎症, 这可以激活自噬的22, 使他们保持精益的噬通量的设置孕妇肥胖症胎盘中的这种反应可能在肥胖的宫内环境中对女性胎儿的比男性更有影响。建立与母体肥胖相关的炎症环境的模型前体通过治疗原发性人滋养的 TNFα提供了一个平台, 研究肥胖宫内环境对关键通路调节的影响滋养.通过新的和组合疗法来综述肥胖孕产妇环境来修正这一议定书, 将为研究孕产妇肥胖对胎盘功能的影响提供一个令人振奋的途径。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢那些为这项研究捐出胎盘的妇女。我们还感谢站和产妇和胎儿研究小组协调收集胎盘的劳动和分娩部。我们感谢埃里克. 王博士和凯利, 他对实验方法和优化的支持和帮助。
这项工作由 NIH HD076259A (am) 和阿哈 GRNT29960007 (am) 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
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