Summary
Præsenteres her er en protokol for prøvetagning af menneskelig placenta villøs væv efterfulgt af isolering af cytotrophoblasts for primære cellekultur. Behandling af trophoblasts med TNFα sammenfatter betændelse i fede intrauterin miljøet og letter opdagelsen af molekylære mål reguleret af betændelse i placenta med maternel fedme.
Abstract
Maternel fedme er forbundet med en øget risiko for negative perinatal resultater, der er sandsynligvis medieret af kompromitterede placenta funktion, der kan henføres til, i en del, dysregulering af autophagy. Afvigende ændringer i udtryk af autophagy lovgivere i placenta fra fede graviditeter kan reguleres af inflammatoriske processer forbundet med både overvægt og graviditet. Beskrevet her er en protokol for prøvetagning af villøs væv og isolation af villøs cytotrophoblasts fra sigt menneskelige placenta for primære cellekultur. Dette efterfølges af en metode til at simulere den inflammatoriske milieu i fede intrauterin miljøet ved at behandle primære trophoblasts fra lean graviditeter med tumor nekrose faktor alfa (TNFα), en proinflammatoriske cytokin, der er forhøjet i fedme og graviditet. Ved gennemførelse af den protokol, der er beskrevet her, er det fundet at eksponering for eksogene TNFα regulerer udtryk for Rubicon, en negativ regulator af autophagy, i trophoblasts fra lean graviditeter med kvindelige fostre. Mens en række biologiske faktorer i det fede intrauterin miljøet opretholde potentiale til at modulere kritiske veje i trophoblasts, er denne ex vivo system især nyttig til at bestemme hvis udtryk mønstre observerede i vivo i menneskelige placenta med maternel fedme er et direkte resultat af TNFα signalering. I sidste ende, denne tilgang giver mulighed for at analysere de regulerende og molekylære konsekvenser af inflammation forbundet med maternel fedme på autophagy og andre kritiske cellular veje i trophoblasts, der har potentiale til at påvirke placenta funktion.
Introduction
Fedme er en inflammatorisk tilstand kendetegnet af kronisk lav-grade inflammation, stammer fra overskydende fedtvæv og næringsstoftilgængelighed. I fedme, er proinflammatoriske cytokiner forhøjet i metaboliske væv og systemisk cirkulation. En robust krop beviser har vist at TNFα betydeligt er forhøjet i fastsættelsen af fedme med implikationer i insulinresistens og metabolisk dysfunktion1. Aktivering af TNFα bidrager også til sygdom patogenese i sygdomme som kræft og autoimmunitet, hvilket gør det til et attraktivt terapeutiske mål2.
Betændelse i fedme er forværret af graviditeten, også en proinflammatoriske tilstand3,4. Det har tidligere vist sig at placenta TNFα indhold stiger med moderens overvægt i graviditeter med kvindelige fostre. Derudover hæmmer TNFα behandling mitokondrie respiration i kvindelige men ikke mandlige trofoblast celler, hvilket tyder på at TNFα er involveret i reguleringen af placenta metabolisme i en seksuelt dimorfe måde5. Maternel fedme er forbundet med en øget forekomst af en lang række komplikationer under graviditet, herunder dødfødsel, med mandlige fostre er de mest modtagelige3,6,7,8 . På grund af sin centrale rolle ved maternel-føtal grænsefladen, kan ændringer i den funktionelle kapacitet af moderkagen i fede intrauterin miljøet som svar på inflammatoriske signalering spille en vigtig rolle i mægle resultaterne af fede graviditeter.
Cytotrophoblasts og syncytiotrophoblasts i den villøs væv af moderkagen er kritisk for endokrine signalering og næringsstoffer og ilt udveksling mellem mor og udviklende foster9. Forstyrrelser i den funktionelle kapacitet af villøs cytotrophoblasts (herefter benævnt trophoblasts) kan bringe fostrets sundhed og udvikling. Denne protokol beskriver en metode for prøveudtagning af villøs væv fra menneskelige sigt moderkagen af dissekere væk chorion og basal pladerne sammen med en optimeret procedure til isolering af trophoblasts for primære cellekultur. Denne protokol er afledt af etablerede metoder der involverer Enzymatisk nedbrydning af villøs væv til at frigive celler fra den ekstracellulære matrix efterfulgt af differential tæthed centrifugering at isolere trophoblasts10, 11,12. Denne protokol detaljer indflyvningen, primære trophoblasts fra placenta fra lean graviditeter er behandlet med kultur medier suppleret med TNFα at simulere en komponent af den inflammatoriske milieu forbundet med maternel fedme. Endelig er en enkel procedure for høst samlede cellelysater fra TNFα-behandlede trophoblasts efterfulgt af Western blotting for at registrere ændringer i genekspression beskrevet.
Mens denne model ikke sammenfatte obesogenic i utero miljøet i sin helhed, giver det et kontrolleret system, der gør det muligt at analysere det enkelte bidrag af TNFα-medieret betændelse i trophoblasts' svar på maternel fedme. Denne model giver både mulighed for at opdage eller bekræfte molekylære mål direkte reguleret af TNFα signalering i trophoblasts samt gør det muligt at teste, om ændringer i gen expression mønstre observeret i vivo i placenta med moderens fedme kan være et resultat af TNFα-medieret betændelse.
Metoden beskrevet her blev implementeret for at teste effekten af TNFα-medieret betændelse på reguleringen af autophagy i menneskelige trophoblasts. Trophoblasts fra fede graviditeter med mandlige fostre udstille forstyrret autophagic omsætning eller autophagosome modning13. Et protein kaldet Rubicon (Kør domæne protein Beclin1-interagere og cystein-rige indeholdende), som er lokaliseret til lysosomer og sene endosomes, har været for nylig beskrevet som en "bremse" i autophagic omsætning proces fordi det fungerer som en negativ regulator autophagosome modning14,15. Rubicon er et sjældent eksempel på et protein, der tilbageholder autophagy, hvilket gør det til et værdifuldt terapeutiske mål. Meget lidt information er tilgængelig om patofysiologiske betydning af Rubicon, bortset fra sine roller i medfødte immun reaktion på mikrober16,17 og cardiomyocyte beskyttelse18. Ved hjælp af protokollen beskrevet her, er det fundet, at Rubicon er upregulated i kvindelige primære trophoblasts reaktion på behandling med stigende koncentrationer af TNFα op til 250 pg/mL. Regulering af Rubicon kan spille en rolle i hvordan kvindelige fostre billetpris bedre end mænd i graviditeter med maternel fedme. Recapitulating inflammation forbundet med maternel fedme ex vivo ved at udsætte menneskelige trophoblasts til eksogene TNFα giver en platform for at studere virkningerne af det fede intrauterin miljøet om regulering af kritiske veje i trophoblasts og i forlængelse heraf placenta funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
efterbyrd blev indsamlet fra arbejdskraft og levering enhed på University Hospital under en protokol, der er godkendt af institutionelle anmeldelse Board of Oregon Health and Science University i Portland, Oregon, med informeret samtykke fra den patienter.
1. samling af placenta væv
- forberedelse
Bemærk: alt udstyr, der møder væv skal være steril.- Sterilisere dissekere udstyr ved autoklavering for 60 min ved 121 ° C.
- Bruge personlige værnemidler (PPE): lab frakker/kjoler/scrubs, handsker og maske med en ansigtsskærm eller beskyttelsesbriller.
- Igen på vandbadet og sat til 37 ° C.
- Varme to 50 mL konisk rør, hvert indeholdende 25 mL af komplette medier (Iscove ' s ændret Dulbecco ' s Medium suppleret med 10% FBS og 1% Penicillin/Streptomycin, tabel 3) i et 37 ° C vandbad.
- Med informeret patientsamtykke, opnå en moderkage umiddelbart efter kejsersnit levering.
- Blive fortrolig med moderkagen. Navlestrengen er indsat i fostrets side (chorion plade) og blodkar kan ses udstrålende ud fra navlestrengen indsættelsesstedet. Den modsatte side er moderens side, eller basale plade. Det omfatter decidua og strukturer, der indeholder fartøj træer, kaldet kimbladene.
- Prøvetagning af villøs væv
Bemærk: villøs væv bør udtages fra moderkagen snarest muligt efter levering, helst i 30 min eller mindre.- Med den chorion plade opad, punktafgifter 2-3 fuld-tykkelse sektioner (ca 2,5 cm x 2,5 cm i størrelse) 2-3 cm fra periferien af moderkagen på tilfældige, ved hjælp af pincet og saks ( figur 1A).
Bemærk: Undgå dele af moderkagen, der vises unormale (dvs. hvid forkalkninger). - Trim væk chorion og basal pladerne og de store blodkar.
- Placerer den resulterende villøs væv ( figur 1B, ca 80-120 g samlede) i varme komplet media og begynder trofoblast isolering inden for 30 min efter prøveudtagningen.
Bemærk: Nogle downstream assays og programmer er berørt af længden af latenstid mellem levering, prøveudtagning og trofoblast isolation. Det er bedst at holde disse perioder så kort som muligt og konsekvent mellem isolering. - Ved hjælp af de teknikker, der beskrives i trin 1.2.1 - 1.2.2, prøve 5 tilfældige 1 cm x 1 cm sektioner af villøs væv fra over moderkagen (herunder center).
- Skær hver 1 cm x 1 cm villøs vævsprøve i 4-5 mindre stykker (ca 30 mg hver), sted i 2 mL microcentrifuge rør, og flash fryse i flydende Nielsen 2. Opbevares ved-80 ° C til brug i senere analyser.
- Med den chorion plade opad, punktafgifter 2-3 fuld-tykkelse sektioner (ca 2,5 cm x 2,5 cm i størrelse) 2-3 cm fra periferien af moderkagen på tilfældige, ved hjælp af pincet og saks ( figur 1A).
2. Isolering af Trophoblasts fra villøs væv
- forberedelse
Bemærk: bruge sterilt udstyr og udføre procedurer, der involverer celler i en laminar flow hætte.- Tø fire frosne tæthed gradienter (tabel 1, se tabel over de basale forsyninger, reagenser, og udstyr, supplerende materiale) ved 4 ° C natten før moderkagen ankommer.
Bemærk: Alternativt tæthed gradienter kan være lavet på dagen for isolation. - Tur på centrifuge og sæt til 20 ° C.
Bemærk: Alle centrifugering trin er på maksimal acceleration og deceleration, medmindre andet er angivet. - Forbered 1 x HEPES-buffered saltopløsning (HBSS) suppleret med Ca + 2 og Mg + 2 (tabel 3).
- Varme trypsin til 37 ° C.
- Fortyndes DNase til ca 2720 kilounits/mL i sterilt suppleret HBSS.
- Varm 50 mL af nyfødte kalveserum (NCS) til 37 ° C.
- Varme komplet media til 37 ° C.
- Varme indefrysning medier (90% FBS, 10% DMSO, tabel 3) til 37 ° C.
Forsigtighed: DMSO er giftigt og skal håndteres med handsker. - Forbered fordøjelsen buffer (tabel 2 og 3) ved at blande 308 mL suppleret HBSS, 50 mL Trypsin (3751.7 BAEE enheder/mL), og 0,5 mL af DNase (379.4 kilounits/mL) i en steril flaske.
Bemærk: Den omtrentlige tid, der kræves til at isolere cellerne fra villøs væv er 7 h.
- Tø fire frosne tæthed gradienter (tabel 1, se tabel over de basale forsyninger, reagenser, og udstyr, supplerende materiale) ved 4 ° C natten før moderkagen ankommer.
- Behandling af villøs væv
- skylles hvert stykke af villøs væv i en 50 mL konisk slange fyldt med stuetemperatur phosphat bufferet saltvand (PBS). Gentag og erstatte PBS som nødvendigt, indtil den overskydende blod er fjernet (PBS skyl bliver lys rød eller pink når vævet er skylles grundigt).
- Placer villøs vævet i en steril petriskål og fjerne så mange blodkar som muligt ved at skrabe forsigtigt ud af villøs bløddele fra de fartøjer, der anvender et objektglas.
- Fint hakkekød den resulterende villøs væv ved hjælp af saks.
- Villøs væv fordøjelse og rå Isolation af Trophoblasts
- overføre hakket villøs væv til en steril flaske med fordøjelsen løsning ifølge de beregnede mængder baseret på den specifikke aktivitet af trypsin og DNase (165 mL, tabel 2).
- Efter 35 min inkubation i et 37 ° C vandbad med rysten på 70 omdrejninger pr. minut (rpm), vippe fordøjelsen flasken på sin side og tillade denikke stykker af væv til at bosætte sig i bunden af flasken. Omhyggeligt udarbejde supernatanten med serologisk pipette, undgå de udlignede væv.
- Dispensere supernatanten gennem en 100 µm celle si ligeligt mellem 50 mL konisk rør.
Bemærk: For at spare tid, er det tilrådeligt at begynde andet fordøjelsen ved at tilføje fordøjelsen løsning (110 mL, tabel 2) til de resterende afgjort væv og genoptage inkubation, som beskrevet i trin 2.3.2. - Forsigtigt layer 3-5 mL NCS nedenunder anstrengt supernatanten ved langsomt udlevering fra en serologisk pipette i bunden af røret. En menisken mellem anstrengt supernatanten (indeholdende trophoblasts) og NCS bør være synlige ( figur 2A).
- Centrifugeres analysere over NCS ved 1250 x g i 15 min. ved 20 ° C. Den resulterende pellet vil omfatte røde blodlegemer i det nederste-mest lag efterfulgt af et hvidt lag indeholdende trofoblast celler ( figur 2B).
- Gentag trin 2.3.2 - 2.3.5 for hver af de anden og tredje digestions (tilføje 110 mL og 83.5 m, henholdsvis, af fordøjelsen løsning til flaske af væv, tabel 2).
- Når alle analysere har været centrifugeres, resuspend hver pellet i 5 mL varm komplet media, og derefter samle suspensionerne.
- Split cellesuspension ligeligt mellem to 50 mL koniske rør og centrifugeres ved 1250 x g i 15 min. ved 20 ° C.
- Forsigtigt fjerne supernatanten og resuspend hver celle pellets i 6 mL varm complETE media.
- Tæthed centrifugering
- opdele cellesuspension ligeligt mellem fire tæthed gradienter (3 mL) af langsomt og omhyggeligt lagdeling cellesuspension på toppen tæthed gradienter med en overførsel pipette.
- Centrifugeres tæthed gradienter på 1250 x g i 20 min. ved 20 ° C med minimum acceleration og deceleration. Dette skal producere skelnes bands af aflejret celler (tabel 4).
- Langsomt og forsigtigt fjerne de øverste lag af tæthed gradient medier (DGM), indtil den uigennemsigtige felterne trofoblast celler (mellem 35-50% DGM) er nået (tabel 4).
- Overføre trofoblast bands i to 50 mL koniske rør og fyld op med varm komplet media.
- Forsigtigt invertere rør 3 - 6 gange at blande og centrifugeres ved 1250 x g i 15 min. ved 20 ° C.
- Fjern supernatanten og resuspend hver celle pellet i 5 mL varm komplet media. Kombinerer celle suspensioner og tælle levedygtige celler ved hjælp af en hemocytometer og Trypan blå (eller foretrukne celle tælle metode).
- Tælle celler med en Hemocytometer
- blande cellesuspension af pipettering op og ned med en serologisk pipette eller forsigtigt invertere røret flere gange.
- Kombinere lige dele cellesuspension og Trypan blå (dvs. 20 µL hver) i en separat tube og bland forsigtigt.
- Incubate for 1-2 min. ved stuetemperatur.
- Forsigtigt afkald på 15-20 µL af celle-Trypan blå blanding mellem coverslip og hemocytometer og tillader cellerne at udbrede på tværs af nettet af kapillaritet.
- Tæller levedygtige celler (døde celler vil være plettet dybblå) i hver af de fire 4 x 4 kvadranter med en tally counter. Anvender et system med tæller for at sikre celler ikke tælles med mere end én gang (dvs. ikke tælle celler, der rører bunden eller venstre grænser).
Bemærk: Hver 4 x 4 kvadrant bør indeholde mellem 50-150 celler. For få eller for mange celler kan føre til en over- eller undervurdering af celle nummer. - Gennemsnit cellen total tæller fra hver af de 4 x 4 kvadranter, ganges med 10 4, og derefter multipliceres med fortyndingsfaktoren (cellesuspension til Trypan blå) for at beregne antallet af celler pr. mL.
- Mangedoble antallet af celler pr. mL af den samlede mængde af cellesuspension til at beregne det samlede celle udbytte.
Bemærk: Ca 100 millioner celler forventes fra isolering starter med 80-120 g villøs væv.
- Plating celler
- plade 3 millioner celler/brønd (3.3 x 10 5 celler pr. cm 2) i en 6-godt plade (2 mL af suspension pr. brønd) og forsigtigt klippe frem og tilbage og side til side for at jævnt distribuere cellerne.
Bemærk: Trophoblasts kræver vævskultur behandlet plader til at overholde korrekt. En éncellelag af celler er forpligtet til at fremme syncytialization. - Forlade de forgyldte celler i laminar flow hood for ca. 30 min. at tillade celler at jævnt distribuere, bosætte sig og begynde at holde sig til bunden af brøndene inden de lægges i rugemaskine.
- Kultur celler i op til 72 timer (med daglige medieændringer) i et 37 ° C kuvøse med 5% CO 2 og 95% luftfugtighed.
Bemærk: Undersøge trophoblasts under et mikroskop på 10-20 x hver 24 h af kultur. Trophoblasts formere sig ikke og kan ikke være passaged. I løbet af 72 h af kultur, de runde individuelle trophoblasts fuse til at danne en syncytium ( figur 3A og B).
- plade 3 millioner celler/brønd (3.3 x 10 5 celler pr. cm 2) i en 6-godt plade (2 mL af suspension pr. brønd) og forsigtigt klippe frem og tilbage og side til side for at jævnt distribuere cellerne.
- Frysning celler
- Pellet ubrugt celler ved centrifugering ved 1250 x g i 10 min. ved 20 ° C.
- Opsug så mange medier som muligt fra toerstoffet.
- Resuspenderes i frysning medier (tabel 3).
- Fryse alikvoter ved-80 ° C i en indefrysning container fyldt med 100% isopropanol. Overføre de frosne delprøver til flydende N 2 den følgende dag til langtidsopbevaring.
Bemærk: Celler kan være kulturperler efter frysning.
- Optøning celler
- fjerne en alikvot af frosne celler og tø i et 37 ° C vandbad mens hvirvlende. Fjerne alikvot fra vandbadet, lige før det er helt optøet til en flydende.
- Overfør straks optøede cellerne til en 15 ml konisk slange. Begynder langsommere i første omgang, der tilsættes 10 mL af komplette medier med intermitterende blanding.
- Vend røret flere gange for at blande.
- Der centrifugeres ved 200 x g i 10 min. ved 20 ° C.
- Opsug supernatanten og resuspenderes i 2-5 mL varm komplet media.
- Tælle celler og plade som tidligere beskrevet.
3. Behandling af primær Trophoblasts med TNFα, samling af cellelysater og Western Blotting
- forberedelse
- varme komplet media til 37 ° C.
- Gøre en 10 µg/mL bestand af TNFα i komplet media og opbevares ved-20 ° C indtil klar til brug.
- Gøre en 1 µg/mL arbejde status over TNFα i komplet media når du er klar til at behandle cellerne. Seriel fortyndes TNFα arbejder materiel til 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL og 125 pg/mL i komplet media.
Bemærk: TNFα koncentrationen af 10 4 pg/mL er moderat cytotoksiske. Justering af TNFα koncentrationer testet vil afhænge af de nærmere enkeltheder i de ønskede downstream applikationer.
- Behandling af celler med TNFα
- efter 24 timer af kultur, Aspirér dyrkningsmedier fra cellerne og Erstat med 2 mL af TNFα suppleret medier pr. brønd på 6-godt plader (mindst to brønde pr. behandling og køretøj kontrol).
- Efter 24 timer af TNFα-eksponering (48 h kultur), erstatte TNFα suppleret medier med komplet media.
- Høst celler og Total Protein
- 72 h kultur (24 h forbi fjernelse af TNFα), Aspirér medier, forsigtigt skyl celler med stuetemperatur PBS og tilsættes 80 µL af is kold Radioimmunoprecipitation analyse Buffer (RIPA) indeholdende frisk tilføjet protease og fosfatase hæmmere (tabel 3) direkte til hver brønd.
- Fjerne celler fra pladen med en celle skraber. Overføre cellerne til en 1,5 mL microcentrifuge tube, pooling brønde i behandlingsgrupper.
- Lyse celler af vortexing rør på high for mindst tre intervaller af 15 s.
- Ruger celler ved 4 ° C med vuggende i 15 min.
Bemærk: Alternativt, efter trin 3.3.3., cellerne kan være inkuberes i isbad i 15 min med intermitterende agitation ved at bladre til rør, vortexing, eller pipettering op og gøreWN. - Gentag trin 3.3.3.
- Centrifugeres rør på 10.000 x g i 5 min. ved 4 ° C til pellet celleaffald.
- Overførsel supernatanten (indeholdende cellulære protein) til en ny 1,5 mL microcentrifuge rør og opbevares ved-80 ° C.
Bemærk: Protokollen kan være stoppet her og genoptages på et senere tidspunkt. Det er tilrådeligt at gøre flere delprøver af cellulære proteiner prøver at undgå flere fryse-tø cykler. - Bestemmelse af total proteinkoncentration af en foretrukne metode, for eksempel en bicinchoninic acid test (BCA, se tabel over de basale forsyninger, reagenser, og udstyr, supplerende materiale).
- SDS-PAGE og Western Blotting til Rubicon eller Protein af interesse
Bemærk: Følg Western blotting protokoller ifølge producenten ' s instruktioner ved hjælp af en foretrukne laboratorium.- Belastning mellem 20-40 µg af total protein i prøvebuffer (tabel 3) pr. brønd på en 12% acrylamid gel. Adskille proteiner af SDS-PAGE i kører buffer (tabel 3).
- Våd-overførsel proteiner fra gel til en polyvinylidene xenondifluorid (PVDF) membran ifølge producenten ' s vejledning i overførsel buffer (tabel 3).
- Ruger membran i 5% mælkepulver i Tris-Buffered saltvand med 0,1% Tween 20 (TBST, tabel 3) i mindst 1 time ved stuetemperatur med vuggende.
- Ruger membranen i en Rubicon primære antistof (se tabel over de basale forsyninger, reagenser, og udstyr, supplerende materiale) på 1: 500 i 1% mælkepulver i TBST natten over ved 4 ° C med vuggende.
- Forsigtigt vaske membran 3 x 5 min. i TBST og 1 x 5 min. i TBS ved stuetemperatur med vuggende.
- Ruger membran i 1: 2000 - 1:5000 sekundær antistof (HRP-linked eller foretrukne synlige konjugat, se tabel over de basale forsyninger, reagenser, og udstyr, supplerende materiale) i 5% mælkepulver i TBST i mindst 1 time ved stuetemperatur med rokkende.
- Gentag vask proceduren beskrevet taktfast 3.4.5 og visualisere skamplet med en passende visualisering (dvs. kemiluminescens) substrat på et billedbehandlingssystem.
- Gentag vask proceduren beskrevet taktfast 3.4.5 og sonde membran for β-actin eller en foretrukne lastning kontrol ifølge producenten ' s instruktioner.
- På foretrukne billede analyse software, analysere udtrykket af Rubicon af manuel kvantificering af absorbans (band intensiteter), subtraktion af baggrundsabsorbansen og normalisering tilsvarende lastning styre band intensiteter. Udføre statistiske analyser som hensigtsmæssigt at teste for statistisk signifikante ændringer i protein niveauer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sigt menneskelige placenta fra lean (pre-graviditet body mass index (BMI) < 25) mødre med ukompliceret graviditeter transporterer kvindelige afkom blev indsamlet og stikprøven inden for 15 minutter af levering af kejsersnit (ikke arbejde). Placenta blev undersøgt for fravær af forkalkninger og typiske udvikling: vejer mellem 300-600 g med navlestrengen og membraner fjernet, runde form, mellem 15-25 cm i diameter, og navlestrengen indsat i midten af den moderkagen. Villøs væv var dissekeret fra basal og chorion pladerne i 2-3 prøver fra på tværs af moderkagen (figur 1), hvilket giver ca. 100 g villøs væv som udgangspunkt materiale til primære trofoblast isolation. Inden for 20 minutter af prøveudtagning villøs væv, at isolere primære trophoblasts procedure blev startet som beskrevet her, hvilket giver mellem 0,8 - 1 x 108 levedygtige celler. Cellerne var seedede i 6-og kultur plader med en tæthed på 3 x 106 (3.3 x 105 celler pr. cm2). Efter 24 timer af kultur, cellerne blev undersøgt under et mikroskop for vedhæftede og ordentlig trofoblast morfologi blev bekræftet (enkelte runde celler). Kultur medier blev erstattet med komplet medier indeholdende en række koncentrationer af TNFα mellem 125-104 pg/mL, således at mindst to brønde var inkluderet pr. koncentration og køretøj kontrol (komplet media kun).
Tyve-fire timer efter TNFα-behandling (48 h kultur), blev alle TNFα medier erstattet med komplet media. Ingen mærkbar celledød blev observeret på grund af behandling med TNFα ved koncentrationer på eller under 103 pg/mL. Behandling med 104 pg/mL TNFα var moderat cytotoksiske og cytotoksiske virkninger af denne TNFα koncentration bevares ikke, når medierne blev ændret, som det fremgår af laktat Dehydrogenase (LDH) assays (data ikke vist). På 72 h i kultur, blev cellerne undersøgt for syncytialization under et mikroskop. Immuncytokemi for syncytialization og fibroblast forurening afsløret relativt ren isolation af trophoblasts (figur 3). Cellulære lysates er høstet efter den protokol, der er beskrevet her, giver mellem 3-8 µg/µL af total protein pr. forberedelse som bestemt ved en BCA assay (data ikke vist). Western blot analyse i cellelysater fra kvindelige trophoblasts behandlet med TNFα viste en opregulering af Rubicon udtryk i svar til koncentrationer af TNFα op til 250 pg/mL og efterfølgende downregulation af Rubicon udtryk på TNFα koncentrationer større end 250 pg/mL (fig. 4A og B, 104 pg/mL udelukket fra analyse baseret på cytotoksiske virkninger). Rubicon er ligeledes markant upregulated i flash-frosset villøs væv biopsier fra placenta fra fede graviditeter med kvindelige fostre i forhold til lean kontrol, som det fremgår af Western blot analyse (figur 4 c og D, n = 6 placenta pr. BMI klasse, ANOVA, P < 0,05).
| Koncentration (%) | 90% DGM (ml) | 1 x HBSS (ml) | Lagtykkelse (ml) |
| 4 x gradient | 4 x gradient | Samlede 34,5 ml | |
| 70 | 14 | 4 | 4.5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7,33 | 4,67 | 3 |
| 50 | 3.34 | 2,67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (13,5 ml mark) |
| 40 | 5.33 | 6,67 | 3 |
| 35 | 4,67 | 7,33 | 3 (19,5 ml mark) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2,67 | 9.33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10.67 | 3 |
Tabel 1. Specifikationer for at gøre tæthed gradienter for tæthed centrifugering af primære Trophoblasts.
Fra venstre mod højre, angiver kolonnen, en tæthed gradient medie (DGM, se tabel over de basale forsyninger, reagenser, og udstyr, supplerende materiale) koncentration udtrykt som procenter af DGM i HBSS. Kolonne 2 angiver mængden af DGM mens kolonne tre angiver omfanget af HBSS kræves for at gøre den passende procentdel af DGM løsning. Søjle 4 angiver volumen skal føjes til 50 mL konisk røret at bygge gradient, begyndende med den mest tætte lag.
| Trypsin | HBSS | DNase | ||
| Fordøjelsen | (samlede aktivitet; BAEE enheder) | volumen (ml) | (samlede aktivitet; Kunits) | Samlede volumen /digestion |
| 1 | 619037 (23.01 ml) | 141.76 ml | 62594 (0.230 ml) | 165 ml |
| 2 | 412691 (15.34 ml) | 94.51 ml | 41729 (0.154 ml) | 110 ml |
| 3 | 313270 (11.65 ml) | 71.74 ml | 31676 (0,116 ml) | 83.5 ml |
| I alt | 1345000 (50 ml) | 308 ml | 136000 (0,5 ml) | 358.5 ml |
Tabel 2. Specifikationer for udarbejdelsen af fordøjelsen løsning for primære trofoblast Isolation baseret på den specifikke aktivitet af DNase og Trypsin.
Fra venstre mod højre, den første kolonne angiver antallet af digestions, den anden kolonne angiver trypsin aktivitet kræves pr. fordøjelse, den tredje kolonne angiver den samlede mængde af suppleres med HBSS at blive tilføjet til den passende fordøjelse, den fjerde kolonne angiver DNase aktivitet kræves pr. fordøjelsen, og den sidste kolonne angiver mængden af fordøjelsen løsning væretilføjet til placenta væv for passende fordøjelsen.
| HBSS (suppleret med Ca+ 2 og Mg+ 2) | Prøvebuffer |
| 10% 10 x HBSS | 90% 4 X Laemmli farvestof |
| 1.26 mM CaCl2 (anhyd.) | 10% 2-Mercaptoethanol |
| 0,80 mM MgSO4 (anhyd.) | |
| 20.77 mM HEPES | |
| pH til 7.4 med 10N NaOH Gøre volumen op til 1 L med steril ddH2O Sterile filter i en steril flaske |
|
| Komplet Media | Kører Buffer |
| Fjerne 11% v/v IMDM | 25 mM Tris Base |
| Tilføje 10% v/v FBS | 190 mM glycin |
| Tilføj 1% 10.000 U/mL Penicillin/Streptomycin (100 U/mL endelig) | 0,1% SDS |
| pH til 8,3 | |
| Frysning medier | |
| 90% v/v FBS | Overføre Buffer |
| 10% v/v DMSO | 25 mM Tris |
| 190 mM glycin | |
| Fordøjelsen Buffer | 20% methanol |
| 50 mL Trypsin (26,900 BAEE enheder/mL) | pH til 8,3 |
| 0,5 mL DNAse (272,000 K enheder/mL) | |
| Bringe til 358.5 ml i suppleres med HBSS | TBS |
| 20 mM Tris | |
| RIPA Buffer | 150 mM NaCl |
| 25 mM Tris-HCl | pH-værdien til 7,6 |
| 5 mM EDTA | |
| 150 mM NaCl | TBST |
| 0,1% SDS | TBS med 0,1% Tween 20 |
| 0,5% natrium deoxycholate | |
| 1% Triton X-100 | |
| 1 tablet af protease/fosfatase hæmmer pr. 10 ml RIPA Buffer |
Tabel 3. Løsninger kræves for Isolation og kultur af primære Trophoblasts efterfulgt af Western Blotting.
| % DGM | ml mark | Celletype |
| 10 | 31,5-34,5 | Snavs |
| 20 | 28.5-31,5 | |
| 30 | 22,5-28,5 | |
| 35 | 19,5-22.5 | Trophoblasts |
| 40 | 16,5-19,5 | |
| 45 | 13,5-16,5 | |
| 50 | 10.5-13,5 | Lymfocytter |
| 55 | 7,5-10,5 | |
| 60 | 4,5-7.5 | Røde blodlegemer |
| 70 | Under 4,5 |
Tabel 4. Bundfældning af Trophoblasts ved tæthed centrifugering.
Fra venstre mod højre, den første kolonne angiver procentdelen af DGM (tabel 1), den anden kolonne angiver mL mark hvor den tilsvarende andel af DGM er fundet på en 50 mL konisk slange, og den tredje kolonne angiver, hvilken celle type sedimenter på den tilsvarende andel af DGM og mL mark på en 50 mL konisk slange. Trophoblasts sediment mellem 50-35% DGM, danner forskellige uigennemsigtige bands. Indsamling DGM over eller under dette interval medfører kontaminering af celleaffald og andre celletyper såsom lymfocytter.
Figur 1. Villøs væv er isoleret fra det sigt menneskelige Placenta fjerner chorion og Basal plader.
A) med chorion pladen (føtal side) vender opad, en fuld tykkelse prøve er skåret ud fra moderkagen. B) en prøve af villøs væv er opnået ved at fjerne de chorion og basal plader. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Centrifugering af celler i fordøjelsen løsning over nyfødte kalveserum resulterer i en flerlaget celle Pellet.
A) nyfødt kalveserum (NCS) er lagdelt nedenunder cellesuspension i digest løsning i en 50 mL konisk slange. B) centrifugering af (A) resulterer i en flerlaget celle pellet. Det nederste lag er dybt i rød farve og består af røde blodlegemer. Laget ovenfor omfatter trophoblasts og er hvide eller beige farve. Ovenfor trofoblast er lag NCS efterfulgt af fordøjelsen løsning (supernatanten) til toppen af røret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Immunocytological analyse af Syncytialization og Fibroblast indhold i primære menneskelige trofoblast kulturer.
A) repræsentativt billede af Cytokeratin-7 (red) i cytotrophoblasts efter 24 timer af kultur. B) repræsentativt billede af Cytokeratin-7 (red) i syncytiotrophoblasts efter 72 h kultur viser multinucleated masser af celler, der har smeltet. C) repræsentativt billede af Vimentin (red) i syncytiotrophoblasts efter 72 h af kultur. Billeder blev erhvervet på et fluorescerende mikroskop med DAPI (blå) nukleare kontrastfarve. Visualiseret ved 10 X forstørrelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Regulering af Rubicon udtryk som svar på TNFα-behandling i kvindelige Trophoblasts og endogene Rubicon udtryk i villøs væv fra Lean Versus fede graviditeter med kvindelige fostre.
Primære trophoblasts fra sigt placenta fra lean mødre med sunde graviditeter transporterer en kvindelig fosteret blev isoleret og behandlet med 125, 250, 500, 103, og 104 pg/mL TNFα (eller køretøj kontrol). A) repræsentant Western skamplet for Rubicon i kvindelige trofoblast lysates behandlet med TNFα. Β-actin blev brugt som en loading kontrol. B) Rubicon udtryk i respons på TNFα-behandling hos kvindelige trophoblasts var kvantificeres fra Western blotting og normaliseret til β-actin. Værdier er gennemsnitlig Rubicon udtryk pr. TNFα koncentration ± S.E. i n = 3 placenta. C) Western blotting til Rubicon i hele væv lysates fra flash frosset biopsier af villøs væv fra lean versus fede graviditeter med kvindelige fostre (F1-F12). Laktat dehydrogenase A (LDHA) blev brugt som en loading kontrol. D) Rubicon udtryk i Western blotting fra (C) var kvantificeres og normaliseret til LDHA. Værdier er gennemsnitlig Rubicon udtryk pr. BMI klassificering ± S.E. i n = 6 placenta pr. BMI klasse (ANOVA, * P < 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Moderkagen, ansvaret for at regulere vækst af fosteret, udstiller kompromitteret funktion i den fede miljø6. Trods de høje metaboliske krav af trophoblasts udstille placenta med maternel fedme dysfunktionelle mitokondrie respiration6,19. Ændringer i placenta stofskifte kan bidrage til den øgede forekomst af komplikationer og uønskede føtal resultater observeret i fede graviditeter3,6,7. Autophagy er også kompromitteret i placenta med maternel fedme. Placenta fra fede graviditeter med mandlige fostre Vis dysfunktionelle autophagic flux som det fremgår af ophobning af autophagosomes13. Opretholdelse af optimal autophagic flux er kritisk for cellulære homøostase og defekte autophagy i placenta med maternel fedme kan spille en vigtig rolle i mægle de negative resultater forbundet med fede graviditeter.
De præcise årsagen(med) af kompromitterede placenta funktionen udstillet i maternel fedme er ikke vel forstået og kan have deres oprindelse i inflammatoriske signalering. Både fedme og graviditet er proinflammatoriske stater, der er karakteriseret ved forhøjede niveauer af cirkulerende TNFα1,4,20,21. TNFα er en aktivator af autophagy22,23og kan formidle ændringer i autophagic flux i placenta fra fede graviditeter. TNFα er almindeligt anvendt til at undersøge virkningerne af betændelse på celler, især i forbindelse med kræft2. Protokollen præsenteres her tilpasser denne fremgangsmåde for at studere virkningerne af fedme-relaterede inflammation på den funktionelle kapacitet af placenta ved at behandle primære trophoblasts med eksogene TNFα i kultur.
Denne protokol består af fire hovedkomponenter: prøvetagning af villøs væv fra moderkagen, dyrkning af primære trophoblasts fra villøs væv, kultur af primære trophoblasts efterfulgt af TNFα behandling og indsamling af samlede cellulære lysates efterfulgt af Western blot analyse til at måle udtryk for en de(n) af interesse. For at isolere ren trophoblasts, er det kritisk at chorion og basal pladerne grundigt er dissekeret fra villøs vævet under prøveudtagning af moderkagen (figur 1B). Det er også bydende nødvendigt, at villøs væv er behandlet i tide (dvs. inden for 30 minutter af levering). Denne protokol beskriver i detaljer brug af tre trin, fordøjelsen, hver varig 35 minutter, for at frigive trophoblasts fra den ekstra cellulære matrix af villøs væv. Længerevarende digestions risikere skader celler ved trypsinization af celle overflade proteiner. Øge antallet af fordøjer øger ikke mærkbart det endelige udbytte af levedygtige trophoblasts. Men, faldende tid og antallet af digestions vil resultere i nedsat celle udbytter (Simon, Bucher og Maloyan, ikke-offentliggjorte data). Denne protokol producerer pålideligt ca 100 millioner celler fra 80-120 gram villøs væv.
Der er variation i antallet af adskilte trofoblast bands observeret på tæthed gradienter mellem isolering. For at undgå forurening fra andre celletyper, er det vigtigt at strengt indsamle felterne indeholdende trophoblasts på tæthed farveforløb (tabel 4). Protokollen detaljeret her er optimeret fra tidligere etablerede metoder, der giver forholdsvis ren trophoblasts med mindre end 5% forurening fra andre celler typer10,11,12. Yderligere rensning kan opnås ved valg af positive eller negative24. Men denne tilgang løber risikoen for at reducere udbyttet af levedygtige trophoblasts. Andre analyse af Cytokeratin-7 i primære trophoblasts isoleret ved hjælp af den procedure, der er præsenteret her efter 24 versus 72 h kultur tid har bekræftet, at cellerne undergik syncytialization som det fremgår af tilstedeværelsen af multinucleated celle masserne på 72 h, hallmark begivenhed i levetiden for en trofoblast (figur 3A og B). Derudover afslørede andre analyse af Vimentin i primære trophoblasts kulturperler for 72 h meget få kontaminerende fibroblaster (figur 3 c). Henblik på rutine, kan renheden af trophoblasts overvåges i kultur af simple morfologiske vurdering. På 24 h tid, kultur dominerer runde individuelle cytotrophoblasts kultur. Cytotrophoblasts gennemgår syncytialization efter 72 h af kultur, hvilket resulterer i klumper af sammenvoksede celler. Den mest almindelige kontaminerende celletype fundet i denne kultur er fibroblast eller endotel celle, der er aflange og polygonal form, henholdsvis. Disse funktioner kan følges nogenlunde ved hjælp af en lyse mikroskop.
Behandling af primær trophoblasts med TNFα giver et kontrolleret system, der gør det muligt at måle effekten af TNFα signalering om regulering af kritiske veje i trophoblasts. Der er naturligvis andre faktorer end TNFα overvægtige mødre miljø i vivo , kan være ansvarlig for modulerende trofoblast funktion. Dette omfatter, men er ikke begrænset til hormonale signaler, hyperlipidæmi, og et væld af andre proinflammatoriske faktorer25. Kombinationer af forskellige behandlinger vil yderligere sammenfatte fede intrauterin miljøet ex vivo i en mere fysiologisk præcis måde. Koncentrationerne af eksogene TNFα bruges til at behandle trophoblasts i denne protokol langt overstiger de typisk cirkulerer i vivo. Serumkoncentrationer er blevet rapporteret at nå 20 ng/mL eller højere i visse betændelsestilstande26. For at opnå en målbar reaktion af nuværende laboratoriemetoder (dvs. Western blotting), er det nødvendigt at forstærke TNFα koncentrationer for at afsløre ændringer i genekspression og veje af interesse. Disse svar kan findes i vivo i mindre omfang. Dog kunne de ikke desto mindre betydeligt påvirke funktionen af trophoblasts. Udsætter trophoblasts for høje koncentrationer af TNFα risikerer at producere artefakter i genekspression og pathway analyser, som kan være rodfæstet i cytotoksiske virkninger. Moderat cytotoksicitet blev observeret i trophoblasts udsat for 104 pg/mL TNFα suppleret medier til 24 h, som det fremgår af LDH cytotoksicitet assays (data ikke vist). Koncentrationer på eller under 103 pg/mL TNFα dog ikke producere nogen mærkbar celledød.
Test TNFα koncentrationer på mindre intervaller og/eller der er lavere end beskrevet her kan bedst følges op af kvantitativepolymerase kædereaktion (qPCR) for gen expression analyse, en teknik velegnet til påvisning af små ændringer i genekspression. Mens qPCR tester specifikt gen expression niveauer på transkriptionel niveau, registrerer Western blotting de endelige niveauer af proteinprodukter, der formentlig findes til at udføre deres cellulære opgaver. Ved hjælp af både analytiske teknikker sammen er en kraftfuld metode til bestemmelse af virkningerne af TNFα behandling på reguleringen af gen expression niveauer samt med hensyn til fastlæggelse af, om ændringer i udtryk niveauer er et resultat af transcriptional, post-Transcriptional, eller posttranslationelle forordning. Inflammatorisk stress kan påvirke trofoblast adfærd, morfologi og syncytialization. Herunder morfologiske vurderinger (dvs. immuncytokemi) Foruden molekylære analytiske tilgange vil give en mere omfattende analyse af virkningerne af TNFα eksponering på trofoblast sundhed. Justering af TNFα koncentrationer testet og downstream assays efter eksperimentel krav er tilrådeligt.
Ved at gennemføre protokollen beskrevet her, er TNFα-medieret betændelse fundet at upregulate Rubicon udtryk i menneskets trophoblasts fra lean graviditeter med kvindelige fostre. Western blotting til Rubicon i trofoblast lysates afslørede to forskellige bands nær og over den forventede molekylvægt af 140 kDa (figur 4A). Der er beviser for, at den lavere band er uspecifikke (PD047 anti-Rubicon pAb, MBL dataark, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). Trophoblasts hunnens demonstreret evnen til at upregulate udtryk for Rubicon svar på TNFα behandling af koncentrationer op til 250 pg/mL. Ved koncentrationer højere end dette, Rubicon udtryk niveau faldt tilbage mod baseline (ubehandlet kontrol) og endda nedenfor (figur 4B, n = 3). I betragtning af at behandle trophoblasts fra lean graviditeter med TNFα simulerer betændelse i fede intrauterin miljøet, er dette resultat et supplement til den konstatering, at Rubicon er betydeligt upregulated i flash-frosset villøs væv biopsier fra placenta fra fede graviditeter med kvindelige fostre i forhold til lean kontrolelementer (figur 4 c og D, ANOVA, n = 6 per BMI klasse, P < 0,05).
Mens autophagic flux ikke synes at afvige i trophoblasts fra fede graviditeter med kvindelige fostre i forhold til lean kontrolelementer, udstille trophoblasts fra fede graviditeter med mandlige fostre aktivering af dannelse og ophobning af autophagosomes 13. Rubicon er en negativ regulator af autophagy, hvor det virker til at standse autophagosome-lysosomet fusion27. Kvindelige trophoblasts kan upregulate udtryk for Rubicon som en kompenserende eller beskyttende mekanisme mod TNFα-medieret inflammation, som kan aktivere autophagy22, tillader dem at opretholde lean-lignende autophagic flux i fastsættelsen af maternel fedme. Dette svar i moderkagen kan spille en rolle i hvordan kvindelige fostre billetpris bedre end mænd i de fede intrauterin miljøet. Modellering af inflammatoriske milieu forbundet med maternel fedme ex vivo gennem behandling af primær menneskelige trophoblasts med TNFα giver en platform for at studere virkningerne af det fede intrauterin miljøet om regulering af kritiske veje i trophoblasts. Om ændring af denne protokol med nye og kombinatorisk behandlinger rettet mod recapitulating overvægtige mødre miljøet vil give en spændende avenue for at studere virkningerne af maternel fedme på placenta funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne takke kvinder, som har doneret deres placenta for denne undersøgelse. Vi takker også arbejdskraft og Leveringsafdelingen på OHSU og mødres og føtal Research Team for at koordinere indsamling af placenta. Vi er taknemmelige for Eric Wang, Ph.D., og Kelly Kuo, MD støtte og hjælpe med eksperimentelle metoder og optimering.
Dette arbejde blev finansieret af NIH HD076259A (AM) og AHA GRNT29960007 (AM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
References
- Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
- van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
- Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
- Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
- Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
- Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
- Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
- Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
- Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
- Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
- Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
- Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
- Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
- Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
- Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
- Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
- Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
- Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
- Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
- Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
- Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
- Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
- Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
- Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
- Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).
