Summary
Présenté ici est un protocole d’échantillonnage de tissus humains de villosités placentaires suivie d’isolement de cytotrophoblastes pour culture de cellules primaires. Traitement des trophoblastes avec TNFα récapitule l’inflammation dans l’environnement intra-utérin obèse et facilite la découverte de cibles moléculaires réglée par l’inflammation dans les placentas avec l’obésité maternelle.
Abstract
L’obésité maternelle est associée à un risque accru de complications périnatales qui sont vraisemblablement médiés par compromis fonction placentaire qui peut être attribuée, en partie, le dérèglement de l’autophagie. Aberrants changements dans l’expression des régulateurs de l’autophagie dans le placenta de grossesses obèses pourraient être régulés par des processus inflammatoires associées à l’obésité et la grossesse. Décrit ici est un protocole d’échantillonnage du tissu villeux et isolement des villeux cytotrophoblastes du placenta humain à terme pour culture de cellules primaires. Elle est suivie d’une méthode pour simuler le milieu inflammatoire dans l’environnement intra-utérin obèse en traitant les trophoblastes primaires de grossesses maigres avec le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFα), une cytokine pro-inflammatoire qui est élevé dans l’obésité, en grossesse. En mettant en œuvre le protocole décrit ici, il est constaté que l’exposition à exogène TNFα régule l’expression de Rubicon, un régulateur négatif de l’autophagie, trophoblastes de grossesses maigres avec des foetus féminins. Alors que divers facteurs biologiques dans l’environnement intra-utérin obèse maintenir la possibilité de moduler les voies critiques trophoblastes, ce système ex vivo est particulièrement utile pour déterminer si l’expression patterns observée in vivo dans des placentas humains souffrant d’obésité maternelle sont une conséquence directe de la signalisation de TNFα. En fin de compte, cette approche permet d’analyser les implications réglementaires et moléculaires de l’inflammation associées à l’obésité maternelle sur autophagie et autres voies cellulaires critiques dans les trophoblastes qui ont le potentiel d’influencer fonction placentaire.
Introduction
L’obésité est un état inflammatoire caractérisé par une inflammation chronique bas grade, découlant de l’excès de tissu adipeux et la disponibilité des nutriments. Dans l’obésité, cytokines pro-inflammatoires sont élevées dans les tissus métaboliques ainsi que systémique en circulation. Un corps robuste de la preuve a démontré que TNFα est significativement élevée dans le cadre de l’obésité avec des implications dans la résistance à l’insuline et le dysfonctionnement métabolique1. Activation du TNFα contribue également à la pathogenèse de la maladie dans des conditions telles que le cancer et l’auto-immunité, ce qui en fait une cible thérapeutique séduisante2.
L’inflammation dans l’obésité est aggravée par la grossesse, également, un état pro-inflammatoire3,4. Il a été précédemment démontré que contenu TNFα placentaire augmente avec adiposité maternelle lors de grossesses avec des foetus féminins. En outre, traitement de TNFα inhibe la respiration mitochondriale dans les cellules trophoblastiques femelle mais pas de mâles, ce qui suggère que le TNFα est impliqué dans la régulation du métabolisme placentaire dans une manière sexuellement dimorphes5. L’obésité maternelle est associée à l’augmentation de l’incidence de diverses complications pendant la grossesse, y compris la mortinatalité, avec des foetus mâles étant les plus sensibles3,6,7,8 . En raison de son rôle clé à l’interface materno-foetale, changements dans la capacité fonctionnelle du placenta dans l’environnement intra-utérin obèse en réponse à signalisation inflammatoires peuvent jouer un rôle important dans la médiation des textes issus de grossesses obèses.
Cytotrophoblastes et syncytiotrophoblasts dans le tissu villeux du placenta sont critiques pour la signalisation endocrinienne et échange de nutriments et d’oxygène entre la mère et le développement du foetus9. Perturbations dans la capacité fonctionnelle des villeux cytotrophoblastes (ci-après dénommé trophoblastes) peuvent compromettre la santé fœtale et le développement. Ce protocole décrit une méthode de prélèvement de tissu villeux du placenta humain à terme en disséquant loin les plaques chorioniques et basales ainsi qu’une procédure optimisée pour l’isolement des trophoblastes pour culture de cellules primaires. Ce protocole est dérivé des méthodes établies concernant la digestion enzymatique des villeux tissus pour libérer les cellules de la matrice extracellulaire, suivi par centrifugation à densité différentielle pour isoler les trophoblastes10, 11,,12. Détails de ce protocole une approche dans laquelle trophoblastes primaires de placentas de grossesses maigres sont traités avec des milieux de culture additionné de TNFα pour simuler une des composantes du milieu inflammatoire associée à l’obésité maternelle. Enfin, on décrit une méthode simple pour la récolte des lysats de cellules total de trophoblastes imprégnées de TNFα suivies par Western Blot pour détecter des modifications dans l’expression des gènes.
Ce modèle ne pas récapituler l’obésogènes in utero environnement dans son ensemble, mais il assure également un système de commande qui permet d’analyser la contribution individuelle de l’inflammation induite par le TNFα en réponse du trophoblaste à obésité maternelle. Ce modèle offre les deux l’occasion de découvrir ou de confirmer des cibles moléculaires directement réglementés par la signalisation de TNFα dans les trophoblastes ainsi que permet de tester si observé des changements dans les profils d’expression génique in vivo dans les placentas avec maternelle l’obésité peut être un résultat de l’inflammation induite par le TNFα.
L’approche décrite ici a été mis en place pour tester l’effet de l’inflammation induite par le TNFα sur la réglementation de l’autophagie dans le trophoblaste humain. Trophoblaste de grossesses obèses avec des foetus mâles pièce perturbée autophagique chiffre d’affaires, ou de maturation autophagosome13. Une protéine appelée Rubicon (RUN domaine protéine interagissant avec Beclin1 et riche en cystéine contenant), qui est localisé dans les lysosomes et les endosomes tardif, a été récemment décrit comme un « frein » dans le processus autophagique chiffre d’affaires car il fonctionne comme un négatif régulateur de l’autophagosome maturation14,15. En fait, le Rubicon est un rare exemple d’une protéine qui retient l’autophagie, ce qui en fait une cible thérapeutique précieuse. Il existe très peu d’informations sur l’importance pathophysiologique de Rubicon, à l’exception de son rôle dans la réponse immunitaire innée à16,17 et cardiomyocyte protection produits microbiens18. Utilisant le protocole décrit ici, on trouve que le Rubicon est positivement en femelles trophoblastes primaires en réponse à un traitement avec des concentrations croissantes de TNFα jusqu'à 250 pg/mL. La régulation du Rubicon peut jouer un rôle dans Comment femelle foetus tarifs mieux que les hommes dans les grossesses avec l’obésité maternelle. Récapitulant l’inflammation associées à l’obésité maternelle ex vivo en exposant les trophoblastes humaines à TNFα exogène fournit une plate-forme pour étudier l’impact de l’environnement intra-utérin obèse sur la régulation des voies critiques dans trophoblaste et, par extension, la fonction placentaire.
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Protocol
placenta ont été prélevé dans le travail et l’unité de prestation à l’hôpital universitaire en vertu d’un protocole approuvé par les institutionnels Review Board of Oregon Health Science University, Portland, Oregon, avec le consentement éclairé de la les patients.
1. collection de tissu placentaire
- préparation
Remarque : tout l’équipement qui rencontre le tissu doit être stérile.- Stériliser le matériel de dissection à l’autoclave pendant 60 min à 121 ° C.
- Utiliser l’équipement de protection individuelle (EPI) : lab coats/robes/scrubs, gants et masque avec une visière ou des lunettes.
- Tour sur bain d’eau réglé à 37 ° C.
- Chauffer deux tubes conique de 50 mL, chacune contenant 25 mL de médias complet (Iscove ' s mise à jour le Dulbecco ' s additionné de 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine, tableau 3) dans un bain-marie à 37 ° C.
- Avec le consentement éclairé du patient, obtenir un placenta immédiatement après livraison par césarienne.
- Se familiarisent avec le placenta. Le cordon ombilical est inséré sur le côté foetal (la plaque) et les vaisseaux sanguins sont visibles en rayonnant à partir du site d’insertion du cordon ombilical. Le côté opposé est le côté maternel, ou la plaque basale. Il comprend les caduque et les structures qui contiennent des arbres de navire, appelé cotylédons.
- D’échantillonnage de tissus villositaire
Remarque : tissu villositaire doit être échantillonné du placenta dès que possible après l’accouchement, de préférence en 30 min ou moins.- Avec la plaque chorionique vers le haut, l’accise 2-3 sections de pleine épaisseur (environ 2,5 cm x 2,5 cm taille) 2-3 cm de la périphérie du placenta à l’aléatoire, à l’aide de pinces et ciseaux ( Figure 1 a).
Remarque : Éviter les pièces du placenta qui apparaissent anormales (c.-à-d. blanches calcifications). - Couper les plaques de gonadotrophine et basales et les gros vaisseaux sanguins.
- Placer le tissu villositaire qui en résulte ( Figure 1 b, environ 80-120 g au total) dans les médias complets chauds et commencer à isolement de trophoblaste dans les 30 minutes de l’échantillonnage.
Remarque : Certaines applications et essais en aval sont affectées par la longueur de la période de latence entre la livraison, l’échantillonnage et l’isolation de trophoblaste. Il est préférable de garder ces périodes aussi court que possible et cohérente entre les isolements. - à l’aide des techniques décrites dans les étapes 1.2.1 - 1.2.2, déguster 5 sections aléatoire de 1 cm x 1 cm de tissu villeux de partout le placenta (y compris le centre).
- Coupe chaque échantillon de tissu villeux de 1 cm x 1 cm en 4-5 petits morceaux (environ 30 mg de chaque), placez dans des tubes de microcentrifuge de 2 mL et flash gel liquide N 2. Conserver à-80 ° C pour une utilisation dans les analyses ultérieures.
- Avec la plaque chorionique vers le haut, l’accise 2-3 sections de pleine épaisseur (environ 2,5 cm x 2,5 cm taille) 2-3 cm de la périphérie du placenta à l’aléatoire, à l’aide de pinces et ciseaux ( Figure 1 a).
2. Isolement des trophoblastes du tissu villositaire
- préparation
Remarque : utiliser du matériel stérile et exécuter des procédures impliquant des cellules dans une hotte à flux laminaire.- Dégel quatre gradients de densité congelés (tableau 1, voir le tableau des fournitures essentielles, réactifs et équipements, du matériel supplémentaire) à 4 ° C la nuit avant que le placenta arrive.
Remarque : Par ailleurs, des gradients de densité peuvent être faites le jour de l’isolement. - Tour centrifugeuse et positionner à 20 ° C.
Remarque : Toutes les étapes de centrifugation sont à l’accélération et la décélération sauf indication contraire. - Préparer 1 x tampon HEPES solution saline (HBSS) additionnée de Ca + 2 et Mg + 2 (tableau 3).
- La trypsine chaude à 37 ° C.
- DNase diluer à environ 2720 kilounits/mL stérile complétée HBSS.
- Chaud 50 mL de sérum de veau nouveau-né (NCS) à 37 ° C.
- Chaud de médias complet à 37 ° C.
- Chaud gel médias (90 % FBS, 10 % DMSO, tableau 3) à 37 ° C.
Mise en garde : DMSO est toxique et doit être manipulé avec des gants.
Tampon - préparer la digestion (tableau 2 et 3) en mélangeant mL 308 de complété HBSS, 50 mL de trypsine (3751.7 BAEE unités/mL) et 0,5 mL de DNase (379,4 kilounits/mL) dans un flacon stérile.
NOTE : Le temps approximatif nécessaire pour isoler les cellules du tissu villositaire est 7 h.
- Dégel quatre gradients de densité congelés (tableau 1, voir le tableau des fournitures essentielles, réactifs et équipements, du matériel supplémentaire) à 4 ° C la nuit avant que le placenta arrive.
- Traitement du tissu villositaire
- rinçage chaque morceau de tissu villeux dans un tube conique de 50 mL rempli de température ambiante phosphate solution saline tamponnée (PBS). Répétez et remplacer les PBS que nécessaire jusqu'à ce que le sang en excès est retiré (rinçage PBS sera rouge clair ou rose quand le tissu est soigneusement rincé).
- Placer le tissu villeux dans une boîte de Petri stérile et l’enlever de nombreux vaisseaux sanguins que possible en grattant doucement au large des tissus mous villeux des vaisseaux à l’aide d’une lame de microscope.
- Hachez finement le tissu villositaire résultant à l’aide de ciseaux.
- Villositaire tissulaire Digestion et isolement brut de trophoblastes
- transférer le tissu villositaire haché dans une bouteille stérile avec la solution de digestion selon les volumes calculés basé sur l’activité spécifique de la trypsine et DNase (165 mL, tableau 2).
- Après 35 min d’incubation dans un bain d’eau de 37 ° C sous agitation à 70 tours / minute (tr/min), inclinez la bouteille de digestion de côté et laisser les morceaux non digérés de tissu pour s’installer au fond de la bouteille. Dresser soigneusement le surnageant avec une pipette sérologique, évitant le tissu sédentarisé.
- Distribuer le liquide surnageant à travers un tamis de cellule de 100 µm également entre les tubes coniques de 50 mL.
NOTE : Pour gagner du temps, il est conseillé de commencer la seconde digestion par ajouter la solution de digestion (110 mL, tableau 2) les autres se sont installés des tissus et la reprise d’incubation comme indiqué au point 2.3.2. - Couche doucement 3 à 5 mL de NCS sous le surnageant tendu en débitant lentement d’une pipette sérologique au fond du tube. Un ménisque entre le surnageant tendue (contenant des trophoblastes) et NCS devrait être visible ( Figure 2 a).
- Centrifuger les surnageants sur NCS à 1 250 x g pendant 15 min à 20 ° C. Le culot obtenu comprendra des globules rouges dans la basse couche suivie d’une couche blanche contenant les cellules trophoblastiques ( Figure 2 b).
- Répéter les étapes 2.3.2 - 2.3.5 pour chacun des digestions de deuxième et troisième (ajout de 110 mL et 83,5 m, respectivement, de solution de digestion dans le flacon de tissu, tableau 2).
- Une fois que tous les surnageants ont été centrifugés, resuspendre chaque culot dans 5 mL de médias complet chaud et puis regrouper les suspensions.
- Diviser la suspension cellulaire également entre les deux tubes conique de 50 mL et centrifuger à 1 250 x g pendant 15 min à 20 ° C.
- Délicatement retirer le surnageant et chacun des boulettes cellule resuspendre dans 6 mL de chaud complmédias d’ete.
- Densité Centrifugation
- diviser la suspension cellulaire également entre quatre gradients de densité (3 mL) par superposition de lentement et soigneusement la suspension cellulaire sur le dessus des gradients de densité avec une pipette de transfert.
- Centrifuger les gradients de densité à 1 250 x g pendant 20 min à 20 ° C avec la décélération et l’accélération minimale. Cela devrait produire des bandes distinctes de cellules sédimentées (tableau 4).
- Lentement et soigneusement, enlever les couches supérieures du média de gradient de densité (DGM) jusqu'à ce que la bande opaque contenant les cellules trophoblastiques (entre 35 et 50 % DGM) est atteint (tableau 4).
- Transférer les bandes de trophoblaste dans deux tubes conique de 50 mL et remplir avec support complet chaud.
- Inverser doucement les tubes 3 - 6 fois pour mélanger et centrifuger à 1 250 x g pendant 15 min à 20 ° C.
- Retirez le surnageant et remettre en suspension chaque culot dans 5 mL de médias complet chaud. Combiner les suspensions cellulaires et de compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre et le bleu Trypan (ou cellule préférée méthode de comptage).
- Comptage des cellules avec un hémocytomètre
- mélanger la suspension cellulaire par pipetage de haut en bas avec une pipette sérologique ou en retournant doucement le tube plusieurs fois.
- Combiner des parties égales de suspension cellulaire et le bleu de Trypan (c'est-à-dire 20 µL de chaque) dans une éprouvette et mélanger doucement.
- Laisser incuber pendant 1 à 2 min à température ambiante.
- Doucement administrer 15-20 µL de la cellule-Trypan bleu mélange entre la lamelle et l’hémocytomètre et laisser les cellules à diffuser à travers la grille par capillarité.
- Compter les cellules viables (cellules mortes seront être teintés bleu profond) dans chacun des quadrants quatre 4x4 avec un compteur de contrôle. Utiliser un système de comptage pour s’assurer que les cellules ne sont pas comptés plus d’une fois (c'est-à-dire, ne pas compter les cellules qui touchent le fond ou les limites de gauche).
Remarque : Chaque 4x4 quadrant devrait contenir entre 50 à 150 cellules. Trop peu ou trop de cellules peuvent conduire à un plus ou une sous-estimation du nombre de cellules. - Moyenne des numérations total de chacun des 4x4 quadrants, multiplier par 10 4, puis de multiplier par le facteur de dilution (suspension cellulaire au bleu de Trypan) pour calculer le nombre de cellules par mL.
- Multiplier le nombre de cellules / mL par le volume total de suspension de cellules pour calculer le rendement cellulaire totale.
NOTE : Environ 100 millions de cellules sont attendus de l’isolement à partir de 80-120 g de tissus villeux.
- Cellules de placage
- plaque de 3 millions de cellules par puits (3,3 x 10 5 cellules / cm 2) dans une plaque 6 puits (2 mL de suspension / puits) et doucement de roche en arrière et de côté à l’autre pour répartir les cellules.
NOTE : Trophoblaste exige des plaques de culture de tissus traitée d’adhérer correctement. Une monocouche de cellules est nécessaire pour promouvoir syncytialization. - Quitter les cellules plaqués dans la hotte à flux laminaire pour environ 30 mn pour permettre aux cellules de distribuer uniformément, de régler et commencent à adhérer au fond des puits avant de le placer dans un incubateur à.
- Des cellules en culture pendant 72 h (avec des variations quotidiennes de médias) dans un incubateur à 37 ° C avec 5 % CO 2 et 95 % d’humidité.
NOTE : Examiner le trophoblaste sous un microscope en 10-20 x toutes les 24 h de culture. Trophoblaste ne prolifèrent pas et ne peut pas être repiquées. Au cours des 72 h de culture, le trophoblaste ronds individuels fusible pour former un syncytium ( figures 3 a et B).
- plaque de 3 millions de cellules par puits (3,3 x 10 5 cellules / cm 2) dans une plaque 6 puits (2 mL de suspension / puits) et doucement de roche en arrière et de côté à l’autre pour répartir les cellules.
- Cellules de congélation
- cellules inutilisées de granule par centrifugation à 1 250 x g pendant 10 min à 20 ° C.
- Aspirer autant médiatique que possible de la pastille.
- Resuspendre le culot dans la congélation des médias (tableau 3).
- Geler les aliquotes à-80 ° C dans un récipient de congélation rempli avec de l’isopropanol 100 %. Transférer les aliquotes congelées à liquide N 2 le lendemain pour le stockage à long terme.
Remarque : Les cellules peuvent être cultivées après la congélation *.
- Cellules de dégel
- enlever une partie aliquote de cellules congelées et fondre dans un bain-marie à 37 ° C tout en agitant. Supprimer l’aliquote du bain-marie, juste avant il a entièrement décongelés à un liquide.
- Transférer immédiatement les cellules décongelées dans un tube conique de 15 ml. Commence à ralentir au début, ajouter 10 mL de médias complets avec mélange intermittent.
- Inverser le tube plusieurs fois pour mélanger.
- Centrifuger à 200 x g pendant 10 min à 20 ° C.
- Aspirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 2 à 5 mL de médias complet chaud.
- Compter les cellules et les plaques comme décrit plus haut.
3. Traitement des trophoblastes primaire avec TNFα, Collection de lysats cellulaires et Western Blotting
- préparation
- chaud complet médias à 37 ° C.
- Faire un stock de 10 µg/mL de TNFα dans les médias et conserver à-20 ° C jusqu’au prêt à l’emploi.
- Faire un 1 µg/mL travail stock de TNFα dans médias complet lorsqu’il est prêt à traiter les cellules. Série diluer le stock de travail TNFα à 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL et 125 pg/mL chez les médias complet.
Remarque : La concentration de TNFα de 10 4 pg/mL est modérément cytotoxique. Ajustement des concentrations TNFα dépendra les spécificités des applications en aval souhaitées.
- Traitement des cellules avec TNFα
- après 24h de culture, aspirer les milieux de culture des cellules et de remplacer par 2 mL de TNFα complétée médias / puits sur plaques 6 puits (au moins deux puits par traitement et par véhicule contrôle).
- Après 24 h de TNFα-exposition (48 h de culture), remplacez les médias TNFα complétée par média complet.
- Récolte des cellules et des protéines totales
- après 72 h de culture (24 h après l’enlèvement de TNFα), aspirer les médias, rincer doucement les cellules avec température ambiante PBS et ajouter 80 µL de glace froide immunoprécipitation Assay Tampon (RIPA) fraîchement ajouté des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase (tableau 3) directement dans chaque cupule.
- Enlever les cellules de la plaque avec un grattoir de cellules. Transférer les cellules dans un tube de microtubes de 1,5 mL, mise en commun des puits au sein des groupes de traitement.
- Lyser les cellules au vortex les tubes en haut au moins trois intervalles de 15 s.
- Incuber les cellules à 4 ° C, avec bascule pendant 15 min.
Remarque : on peut également, après étape 3.3.3., les cellules peuvent être incubés sur la glace pendant 15 minutes avec agitation intermittente en effleurant le tube, Vortex, ou pipetage vers le haut et doWN. - Répéter l’étape 3.3.3.
- Centrifuger les tubes à 10 000 x g pendant 5 min à 4 ° C pour granuler les débris cellulaires.
- Transfert le surnageant (contenant des protéines cellulaires) pour un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL et les conserver à -80 ° C.
Remarque : Le protocole peut être arrêté ici et a repris à une date ultérieure. Il est conseillé de faire plusieurs parties aliquotes d’échantillons de protéines cellulaires afin d’éviter de multiples cycles de gel-dégel. - Déterminer la concentration en protéines totales par une méthode préférée, comme un dosage d’acide bicinchoninic (BCA, voir le tableau des fournitures essentielles, réactifs et équipements, du matériel supplémentaire).
- SDS-PAGE et Western Blotting pour Rubicon ou protéines d’intérêt
Remarque : suivre Western blotting protocoles selon fabricant ' instructions s en utilisant un système de laboratoire préféré.- Charge entre 20 à 40 µg de protéines dans la solution tampon (tableau 3) / puits sur un 12 % d’acrylamide gel. Séparer des protéines par SDS-PAGE à tampon (tableau 3).
- Wet-transfert des protéines de gel à une polyvinylidène difluoride (PVDF) membrane selon fabricant ' s instructions contenues dans le tampon de transfert (tableau 3).
- Incuber la membrane dans la poudre de lait 5 % de solution Saline avec 0,1 % pendant au moins 1 h à température ambiante avec bascule de Tween 20 (TBST, tableau 3).
- Incuber la membrane dans un anticorps primaire Rubicon (voir tableau des fournitures essentielles, réactifs et équipements, du matériel supplémentaire) à 1/500 à 1 % lait en poudre dans un mélange TBST durant la nuit à 4 ° C, avec bascule.
- Laver délicatement la membrane 3 x 5 min dans un mélange TBST et 1 x 5 min au SCT à température ambiante avec bascule.
- Incuber la membrane en 1 : 2000 - 1 : 5000 anticorps secondaire (HRP-liée ou privilégiée conjugué visible, voir le tableau des fournitures essentielles, réactifs et équipements, du matériel supplémentaire) dans 5 % lait en poudre dans un mélange TBST pendant au moins 1 h à température ambiante avec Rocking.
- Répéter la procédure de lavage décrite à l’étape 3.4.5 et visualiser la tache avec un substrat de visualisation approprié (c.-à-d. par chimiluminescence) sur un système d’imagerie.
- Sonde la membrane pour β-actine ou un contrôle de chargement privilégiées selon le fabricant et de répéter la procédure de lavage décrite à l’étape 3.4.5 ' instructions de s.
- Sur le logiciel d’analyse image préférée, analyser l’expression du Rubicon par quantification manuelle de l’absorbance (intensités de bande), soustraction d’absorbance de fond, ainsi que la normalisation au chargement correspondant contrôler des intensités de bande. Effectuer des analyses statistiques selon qu’il conviendra de tester des changements statistiquement significatifs dans des niveaux de protéine.
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Representative Results
Terme des placentas humains de maigre (indice de masse corporelle de pré-grossesse (IMC) < 25) mères avec des grossesses sans complication transportant des femelles ont été recueillies et échantillonnées dans les 15 minutes de l’accouchement par césarienne (aucun travail). Les placentas ont été examinés pour l’absence de calcification et de développement typique : pesant entre 300-600 g avec le cordon ombilical et les membranes enlevés, ronde en forme, entre 15 et 25 cm de diamètre et cordon ombilical insérée dans le milieu de la placenta. Villositaire tissulaire a été disséqué loin les plaques basales et chorioniques dans 2-3 échantillons prélevés dans le placenta (Figure 1), ce qui donne environ 100 g de tissu villositaire comme matériau pour l’isolation de trophoblaste primaire de départ. À 20 minutes de prélèvement d’échantillons de tissus villeux, la procédure pour isoler les trophoblastes primaires a commencé comme décrit ici, ce qui donne entre 0,8 - 1 x 108 cellules viables. Les cellules ont été ensemencées en plaques 6 puits culture à une densité de 3 x 106 (3,3 x 105 cellules / cm2). Après 24h de culture, les cellules ont été examinées au microscope pour fixation et morphologie de trophoblaste appropriée a été confirmée (en particulier autour des cellules). Les milieux de culture a été remplacé par media complet contenant une série de concentrations de TNFα entre 125-104 pg/mL, alors qu’au moins deux puits ont été inclus par la concentration et la maîtrise du véhicule (médias seulement).
Vingt-quatre heures après le traitement de TNFα (48 h de culture), tous les médias TNFα ont été remplacés par les médias. Aucune apoptose appréciable a été observé suite à un traitement avec TNFα à concentration égale ou inférieure à 103 pg/mL. Le traitement avec 104 pg/mL TNFα était modérément cytotoxique et les effets cytotoxiques de cette concentration de TNFα n’ont pas persisté après que les médias a été changé, comme en témoignent les essais de la Lactate déshydrogénase (LDH) (données non présentées). Après 72 h de culture, les cellules ont été examinées pour syncytialization sous un microscope. Immunocytochimie pour syncytialization et la contamination des fibroblastes a révélé relativement pure isolement des trophoblastes (Figure 3). Lysats cellulaires ont été récoltés selon le protocole décrit ici, ce qui donne entre 3-8 µg/µL de protéines par préparation telle que déterminée par un essai BCA (données non présentées). Western blot analyse dans les lysats de cellules du trophoblaste femelles traitées avec TNFα ont montré une augmentation de l’expression de Rubicon en réponse à des concentrations de TNFα jusqu'à 250 pg/mL et la diminution subséquente d’expression Rubicon à des concentrations de TNFα plus à 250 pg/mL (Figure 4 a et B, 104 pg/mL, exclus de l’analyse fondée sur des effets cytotoxiques). De même, Rubicon est nettement augmentée dans les biopsies de tissus villositaire flash-congelés de placentas de grossesses obèses avec des foetus femelles par rapport aux témoins maigres comme en témoigne l’analyse par transfert Western (Figure 4 et D, n = 6 classe de placentas par BMI, ANOVA, P < 0,05).
| Concentration (%) | 90 % DGM (ml) | 1 x HBSS (ml) | Épaisseur de la couche (ml) |
| gradient de x 4 | gradient de x 4 | Ml total de 34,5 | |
| 70 | 14 | 4 | 4.5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7.33 | 4.67 | 3 |
| 50 | 3.34 | 2,67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (marque de 13,5 ml) |
| 40 | 5.33 | 6,67 | 3 |
| 35 | 4.67 | 7.33 | 3 (marque de 19,5 ml) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2,67 | 9.33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10,67 | 3 |
Le tableau 1. Spécifications pour la fabrication des Gradients de densité pour la Centrifugation de densité de trophoblastes primaires.
De gauche à droite, colonne spécifie média gradient de densité (DGM, voir le tableau des fournitures essentielles, réactifs et équipements, du matériel supplémentaire) concentration exprimée en pourcentage de la DGM dans HBSS. Colonne deux spécifie le volume de la DGM, tandis que la colonne trois spécifie le volume du HBSS requis pour rendre le pourcentage approprié de la solution de la DGM. Colonne 4 spécifie le volume à être ajouté au tube conique de 50 mL pour construire le dégradé, en commençant par la couche plus dense.
| Trypsine | HBSS | DNase | ||
| Digestion | (activité totale ; Unités de Bakara) | volume (ml) | (activité totale ; Kunits) | Volume total /digestion |
| 1 | 619037 (23,01 ml) | ml 141,76 | 62594 (0,230 ml) | 165 ml |
| 2 | 412691 (15,34 ml) | 94,51 ml | 41729 (0,154 ml) | 110 ml |
| 3 | 313270 (ml 11,65) | 71,74 ml | 31676 (0,116 ml) | 83,5 ml |
| Total | 1345000 (50 ml) | ml 308 | 136000 (0,5 ml) | 358,5 ml |
Le tableau 2. Spécifications pour la préparation de la Solution de Digestion pour isolement primaire trophoblastiques basée sur l’activité spécifique de la DNase et la trypsine.
De gauche à droite, la première colonne indique le nombre des digestions, la deuxième colonne indique l’activité trypsine requis par la digestion, la troisième colonne indique le volume total de HBSS complétée à ajouter pour la digestion appropriée, la quatrième colonne indique l’activité DNase requis par la digestion, et la dernière colonne indique le volume de solution de digestion pour êtreon ajoute le tissu placentaire pour la digestion appropriée.
| HBSS (additionné de Ca+ 2 et Mg+ 2) | Solution tampon |
| 10 % des 10 x HBSS | 90 % 4 X Laemmli colorant |
| 1,26 mM CaCl2 (anhyd.) | 10 % de 2-mercaptoéthanol |
| 0,80 mM MgSO4 (anhyd.) | |
| 20,77 mM HEPES | |
| pH à 7,4 avec NaOH 10N Rendre le volume à 1 L avec ddH2O stérile Filtres stériles dans un flacon stérile |
|
| Support complet | Tampon en cours d’exécution |
| Supprimer 11 % v/v IMDM | 25 mM Tris Base |
| Ajouter 10 % v/v FBS | 190 mM Glycine |
| Ajouter 1 % 10 000 U/mL de pénicilline/streptomycine (100 U/mL final) | 0,1 SDS % |
| pH à 8.3 | |
| Congélation des médias | |
| 90 % v/v FBS | Tampon de transfert |
| 10 % v/v DMSO | 25 mM Tris |
| 190 mM Glycine | |
| Tampon de digestion | 20 % méthanol |
| 50 mL de la trypsine (BAEE 26 900 unités/mL) | pH à 8.3 |
| 0,5 mL DNAse (K 272 000 unités/mL) | |
| Porter à 358,5 ml dans HBSS complétée | TBS |
| 20 mM Tris | |
| Mémoire tampon RIPA | NaCl 150 mM |
| 25 mM Tris-HCl | pH à 7,6 |
| 5 mM EDTA | |
| NaCl 150 mM | MÉLANGE TBST |
| 0,1 SDS % | TBS avec 0,1 % de Tween 20 |
| 0,5 désoxycholate de sodium % | |
| 1 % Triton X-100 | |
| 1 comprimé d’inhibiteur de protéase/phosphatase pour 10 ml de tampon de RIPA |
Tableau 3. Solutions requises pour l’isolement et Culture des trophoblastes primaire suivie par Western Blot.
| % DGM | marque ml | Type de cellule |
| 10 | 31.5-34,5 | Débris |
| 20 | 28,5 à 31,5 | |
| 30 | 22.5-28,5 | |
| 35 | 19.5-22,5 | Trophoblaste |
| 40 | 16,5-19,5 | |
| 45 | 13.5-16,5 | |
| 50 | 10,5 à 13,5 | Lymphocytes |
| 55 | 7.5-10.5 | |
| 60 | 4,5 à 7,5 | Globules rouges |
| 70 | Inférieure à 4,5 |
Tableau 4. Sédimentation des trophoblastes par Centrifugation de densité.
De gauche à droite, la première colonne indique le pourcentage de DGM (tableau 1), la deuxième colonne indique la marque mL où le pourcentage correspondant de la DGM se trouve sur un tube conique de 50 mL, et la troisième colonne indique quels sédiments de type cellulaire à la pourcentage correspondant de marque DGM et mL sur un tube conique de 50 mL. Sédiments de trophoblastes entre 50 et 35 % DGM, formant des bandes opaques distinctes. Collecte de DGM au-dessus ou au-dessous de cette gamme se traduira par la contamination des débris cellulaires et autres types de cellules comme les lymphocytes.
La figure 1. Tissu villositaire est isolé de la Placenta humain à terme en supprimant les chorionique et plaques basales.
A) avec la plaque chorionique (côté foetale) vers le haut, un échantillon de pleine épaisseur est excisé du placenta. B) un échantillon de tissu villositaire est obtenu en retranchant les plaques chorioniques et basales. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 2. Centrifugation des cellules dans la Solution de Digestion au sérum de veau nouveau-né se traduit par un culot cellulaire multicouche.
A) de sérum de veau nouveau-né (NCS) est placé sous la suspension cellulaire dans la solution de digestion dans un tube conique de 50 mL. B) Centrifugation de (A) se traduit par une pastille de plusieurs couches de cellules. La couche inférieure est fond de couleur rouge et se compose de globules rouges. La couche supérieure comprend des trophoblastes et est blanche ou beige en couleur. Ci-dessus le trophoblaste couche est NCS suivie de solution de digestion (surnageante) vers le haut du tube. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. Immunocytologique analyse des Syncytialization et des fibroblastes contenu dans des Cultures primaires de trophoblaste humain.
A) une image représentative des cytokératines-7 (rouge) dans les cytotrophoblastes après 24 h de culture. B) une image représentative des cytokératines-7 (rouge) en syncytiotrophoblasts après 72 h de culture montre multinucléées masses de cellules qui ont fusionné. C) une image représentative de la vimentine (rouge) en syncytiotrophoblasts après 72 h de culture. Les images ont été acquises sur un microscope à fluorescence avec contre-colorant nucléaire DAPI (bleu). Visualisé à un grossissement de 10 X. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 4. Régulation de l’Expression de Rubicon en réponse à TNFα-traitement dans les trophoblastes femelles et Expression de Rubicon endogène dans le tissu villeux de maigre par rapport aux grossesses obèses avec des foetus féminins.
Trophoblaste primaire de placentas à terme de mères maigres avec des grossesses en portant un fœtus féminins ont été isolés et traités avec 125, 250, 500,3, 10 et 104 pg/mL TNFα (ou excipient). A) représentant Western blot pour Rubicon dans les lysats de trophoblaste femelles traitées avec TNFα. Β-actine a été utilisé comme un contrôle de chargement. B) expression Rubicon en réponse à TNFα-traitement de trophoblastes femelles a été quantifiée des Western blots et normalisée à β-actine. Valeurs sont moyenne Rubicon expression par TNFα concentration ± S.E. à n = 3 placentas. C) Western blots pour Rubicon dans les lysats de tissus entiers de flash congelés des biopsies de tissu maigre par rapport aux grossesses obèses avec des foetus femelles villeux (F1-F12). Déshydrogénase de lactate A (LDHA) a été utilisé comme un contrôle de chargement. D) Rubicon expression dans Western blots de (C) a été quantifié et normalisée à LDHA. Valeurs sont moyenne Rubicon expression par IMC classification ± S.E. en n = 6 placentas par classe BMI (ANOVA, * P < 0,05). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Le placenta, responsable de la régulation de la croissance du fœtus, pièces fonction fragilisée dans l' environnement obèses6. Malgré la forte demande métabolique des trophoblastes, placentas avec l’obésité maternelle pièce dysfonctionnelle de la respiration mitochondriale6,19. Changements dans le métabolisme placentaire peuvent contribuer à l’augmentation de l’incidence des complications et des complications foetales observées chez les obèses grossesses3,6,7. Autophagie est également compromise dans les placentas avec l’obésité maternelle. Placentas de grossesses obèses avec des foetus mâles montrent des flux autophagique dysfonctionnel comme en témoigne l’accumulation des autophagosomes13. Maintenir le flux optimal de l’autophagie est critique pour l’homéostasie cellulaire et autophagie défectueux placentas avec l’obésité maternelle peut jouer un rôle important dans la médiation les résultats indésirables associés à des grossesses obèses.
L’ou les causes précise de la fonction placentaire compromise exposées dans l’obésité maternelle ne sont pas bien comprise et peuvent avoir leur origine dans la signalisation inflammatoires. L’obésité et la grossesse sont pro-inflammatoires États caractérisés par des niveaux élevés de TNFα1,4,20,21en circulation. TNFα est un activateur de l’autophagie22,23et peut négocier des changements de flux autophagique dans les placentas de grossesses obèses. TNFα est couramment utilisé pour étudier les effets de l’inflammation sur les cellules, en particulier dans le contexte du cancer2. Le protocole présenté ici s’adapte à cette approche pour étudier les effets de l’inflammation associées à l’obésité sur la capacité fonctionnelle du placenta en traitant les trophoblastes primaires avec TNFα exogène dans la culture.
Ce protocole comprend quatre composantes principales : prélèvement d’échantillons de tissus villeux du placenta, isolement des trophoblastes primaires du tissu villeux, culture de trophoblastes primaires suivie de TNFα traitement et collecte des lysats cellulaires totales, suivies par Western blot analyse pour mesurer l’expression d’un ou des protéines d’intérêt. Pour isoler les trophoblastes pures, il est essentiel que les plaques chorioniques et basales sont soigneusement disséqués loin le tissu villositaire lors de l’échantillonnage du placenta (Figure 1 b). Il est également impératif que tissu villositaire est traité dans un délai raisonnable (c'est-à-dire dans les 30 minutes de livraison). Ce protocole détaille l’utilisation des trois étapes de la digestion, 35 minutes, chacune pour libérer les trophoblastes de la matrice extra-cellulaire du tissu villeux. Des digestions plus longues risquent d’endommager les cellules par trypsinisation des protéines de surface de cellules. Augmentation du nombre de digestions n’augmente pas sensiblement le rendement final de trophoblastes viables. Toutefois, diminuant le temps et le nombre de digestions entraîneront dans la cellule une baisse des rendements (Simon, Bucher et Maloyan, données inédites). Ce protocole fiable produit environ 100 millions de cellules de 80 à 120 grammes de tissu villeux.
Il y a le nombre de bandes de trophoblaste distinguables observées sur les gradients de densité entre l’isolement de la variabilité. Pour éviter toute contamination des autres types de cellules, il est important de recueillir strictement les bandes contenant les trophoblastes sur le gradient de densité (tableau 4). Le protocole détaillé ici est optimisé de méthodes préétablies qui donnent des trophoblastes relativement purs avec moins de 5 % la contamination provenant d’autres cellules types10,11,12. Une purification plus poussée est possible par sélection positive ou négative24. Toutefois, cette approche risque de réduire le rendement des trophoblastes viables. Analyse immunocytochimique des cytokératines-7 dans les trophoblastes primaires isolées à l’aide de la procédure présentée ici après que 24 contre 72 h de temps de la culture a confirmé que les cellules ont subi des syncytialization, comme en témoigne la présence de masses de cellules multinucléées après 72 h, un événement de marque distinctive de l’espérance de vie d’un trophoblaste (figures 3 a et B). En outre, analyse immunocytochimique de vimentine dans les trophoblastes primaires mis en culture pendant 72 h a révélé très peu contaminantes fibroblastes (Figure 3). Pour les besoins courants, la pureté du trophoblaste peut être surveillée en culture par simple évaluation morphologique. Après 24 h de temps de la culture, cytotrophoblastes individuelles rondes dominent la culture. Cytotrophoblastes subissent une syncytialization après 72 h de culture, aboutissant à l’amas de cellules fusionnées. Le type de cellule contaminantes plus courant trouvé dans cette culture est le fibroblaste ou les cellules endothéliales, qui sont allongées et polygonale en forme, respectivement. Ces fonctionnalités peuvent être surveillées de près à l’aide d’un microscope lumineux.
Traitement primaire trophoblaste avec TNFα fournit un système contrôlé qui permet de mesurer l’effet du TNFα de signalisation sur la régulation des voies critiques dans les trophoblastes. Naturellement, il y a des facteurs autres que le TNFα dans l’environnement maternel obèses in vivo qui peut être responsable de la modulation fonction de trophoblaste. Ceux-ci incluent mais ne se limitent pas aux signaux hormonaux, hyperlipidémie et une foule d’autres facteurs de proinflammatory25. Combinaisons de différents traitements récapitulera davantage l' environnement intra-utérin obèses ex vivo de manière plus physiologique précise. Les concentrations de TNFα exogène utilisé pour traiter les trophoblastes dans le présent protocole loin dépassent celles habituellement circulant en vivo. Concentrations sériques ont été signalées pour atteindre 20 ng/mL ou plus élevés dans certaines maladies inflammatoires26. Pour obtenir une réponse mesurable par les méthodes actuelles de laboratoire (c.-à-d. Western Blot), il est nécessaire d’amplifier les concentrations de TNFα pour révéler des changements dans l’expression des gènes et de voies d’intérêt. Ces réponses peuvent exister in vivo dans une moindre mesure. Cependant, ils pourraient néanmoins un impact significatif la fonction du trophoblaste. Exposer les trophoblastes aux concentrations élevées de TNFα court le risque de produire des artefacts dans l’expression des gènes et des analyses de voie qui peuvent être ancrées dans des effets cytotoxiques. Cytotoxicité modérée a été observée dans les trophoblastes exposés à 104 pg/mL de milieu de TNFα complétée pendant 24 h, comme en témoignent les analyses de cytotoxicité LDH (données non présentées). Cependant, concentration égale ou inférieure à3 10 pg/mL TNFα n’a pas produit une apoptose appréciable.
Essais des concentrations de TNFα à intervalles plus petits et/ou qui sont plus faibles que celles décrites ici peuvent être mieux suivi par quantitativeréaction en chaîne par polymérase (qPCR) pour l’analyse de l’expression génique, une technique bien adaptée pour la détection de petits changements dans l’expression des gènes. Alors que qPCR teste spécifiquement pour les niveaux d’expression de gène au niveau transcriptionnel, éponger occidental détecte les concentrations finales des produits protéiques qui sont vraisemblablement disponibles pour effectuer leur tâche (s) cellulaire. En utilisant conjointement les deux techniques d’analyse est une approche puissante pour déterminer l’impact du traitement de TNFα sur la régulation des niveaux d’expression génique ainsi que pour déterminer si des changements dans les niveaux d’expression sont le résultat de la transcription, régulation post-transcriptionnelle, ou poteau-de translation. Stress inflammatoire peut avoir une incidence syncytialization, morphologie et le comportement de trophoblaste. Y compris les évaluations morphologiques (c.-à-d. immunocytochimie) en plus des méthodes d’analyse moléculaires fournira une analyse plus détaillée des effets de l’exposition TNFα sur la santé de trophoblaste. Réglage TNFα concentrations testées et en aval tests selon les demandes expérimentales est recommandé.
En implémentant le protocole décrit ici, l’inflammation induite par le TNFα se trouve à réguler positivement expression Rubicon dans les trophoblastes humaines de grossesses maigres avec des foetus féminins. Western Blot pour Rubicon à trophoblastiques lysats a révélé deux bandes distinctes, près et au-dessus du poids moléculaire prévu de 140 kDa (Figure 4 a). Il y a preuve suggérant que la bande inférieure est non spécifique (PD047 anti-Rubicon pAb, fiche de données de MBL, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). Le trophoblaste de femelles a démontré sa capacité à réguler positivement l’expression de Rubicon en réponse au traitement de TNFα des concentrations allant jusqu'à 250 pg/mL. Aux concentrations supérieures à cette, expression de Rubicon niveaux ont diminué de retour vers la ligne de base (témoin) et même ci-dessous (Figure 4 b, n = 3). Étant donné que le traitement de trophoblastes de grossesses maigres avec TNFα simule l’inflammation dans l’environnement intra-utérin obèse, ce résultat est complémentaire à la conclusion que le Rubicon est significativement augmentée dans les biopsies de tissus villositaire flash-congelés de Les placentas de grossesses obèses avec des foetus femelles par rapport aux maigres témoins (Figure 4 et D, ANOVA, n = 6 par classe de BMI, P < 0,05).
Autophagie flux ne semble pas diffèrent dans les trophoblastes de grossesses obèses avec des foetus femelles par rapport aux maigres témoins, trophoblastes de grossesses obèses avec des foetus mâles présentent l’activation de la formation et l’accumulation des autophagosomes 13. Rubicon est un régulateur négatif de l’autophagie, où il prend des mesures pour stopper l’autophagosome-lysosome fusion27. Trophoblaste femelle peut réguler positivement l’expression de Rubicon comme un mécanisme compensatoire ou de protection contre l’inflammation induite par le TNFα, qui peut activer autophagie22, ce qui leur permet de maintenir les flux autophagique lean-comme dans le cadre de obésité maternelle. Cette réponse dans le placenta peut jouer un rôle dans Comment femelle foetus tarifs mieux que les hommes dans l’environnement intra-utérin obèse. Modélisation du milieu inflammatoire associé à l’obésité maternelle ex vivo par traitement primaire humain trophoblaste avec TNFα fournit une plate-forme pour étudier les effets de l’environnement intra-utérin obèse sur la régulation des voies critiques dans trophoblaste. Modifiant le présent protocole avec des traitements nouveaux et combinatoires visant à récapitulant l’environnement maternel obèse fournira un moyen passionnant pour étudier les effets de l’obésité maternelle sur la fonction placentaire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient les femmes qui ont fait don de leur placenta pour cette étude. Nous remercions également le travail et le service de livraison au OHSU et la maternelle et fœtale recherche équipe pour coordonner la collecte des placentas. Nous sommes reconnaissants à Eric Wang, Ph.d. et Kelly Kuo, MD pour la prise en charge et aider avec les méthodes expérimentales et optimisation.
Ce travail a été financé par le NIH HD076259A (AM) et AHA GRNT29960007 (AM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
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