Summary
Hier ist ein Protokoll für die Probenahme der menschlichen Plazenta Zotten Gewebe gefolgt von Isolation der Cytotrophoblasts für die primäre Zellkultur. Behandlung von Trophoblasten mit TNF rekapituliert Entzündung in der übergewichtigen intrauterine Umwelt und ermöglicht die Entdeckung von molekularen Zielstrukturen, geregelt durch eine Entzündung in der Plazenta mit mütterliche Korpulenz.
Abstract
Mütterliche Korpulenz ist verbunden mit einem erhöhten Risiko von nachteiligen perinatale Ergebnisse, die wahrscheinlich durch kompromittierte plazentaren Funktion vermittelt werden, die, im Teil, die Dysregulation der Autophagie zugeschrieben werden kann. Anomale Veränderungen in der Expression der Autophagie Regulatoren in der Plazenta von adipösen Schwangerschaften können durch entzündliche Prozesse im Zusammenhang mit Übergewicht und Schwangerschaft geregelt werden. Hier beschrieben, ist ein Protokoll zur Probenahme von Zotten Gewebe und Isolierung von Zotten Cytotrophoblasts aus der Begriff menschlichen Plazenta für primären Zellkulturen. Danach erfolgt eine Methode zur Simulation der entzündlichen Milieus in der übergewichtigen intrauterine Umwelt durch Behandlung von primären Trophoblasten von schlanken Schwangerschaften mit Tumor-Nekrose-Faktor Alpha (TNF), ein proinflammatorischen Zytokin, das bei Adipositas und in erhöht ist Schwangerschaft. Durch die Umsetzung des Protokolls, die hier beschrieben, es wird gefunden, dass Exposition gegenüber exogenen TNF reguliert die Expression von Rubicon, ein negativer Regulator der Autophagie in Trophoblasten von schlanken Schwangerschaften mit weiblichen Föten. Während eine Vielzahl von biologischen Faktoren in der übergewichtigen intrauterine Umwelt halten das Potenzial, kritische Pfade im Trophoblasten modulieren, ist dieses ex-Vivo -System besonders nützlich für die Bestimmung, wenn Ausdruck beobachteten in Vivo Muster im menschlichen Plazenta mit mütterliche Adipositas sind ein direktes Ergebnis von TNF-Signalisierung. Letztlich bietet dieser Ansatz die Gelegenheit, analysieren die Regulierungs- und molekularen Auswirkungen der Entzündung mit mütterlichen Fettleibigkeit auf Autophagie und andere kritische zelluläre Signalwege im Trophoblasten, die das Potenzial haben, beeinflussen plazentare Funktion.
Introduction
Adipositas ist eine entzündliche Zustand, gekennzeichnet durch eine chronische Entzündung der Low-Grade, aus überschüssigem Fettgewebe und Nährstoffverfügbarkeit. Bei Adipositas sind proinflammatorischen Zytokinen in metabolische Geweben sowie systemisch im Umlauf erhöht. Ein robusten Körper des Beweises hat gezeigt, dass TNF deutlich in der Umgebung von Fettleibigkeit mit Auswirkungen in Insulin-Resistenz und Stoffwechselstörungen1erhöht ist. Aktivierung von TNF trägt auch zur Pathogenese der Krankheit bei Krankheiten wie Krebs und Autoimmunität, so dass es eine attraktive therapeutisches Ziel2.
Entzündungen bei Adipositas wird durch Schwangerschaft, auch ein proinflammatorischen Zustand3,4verschärft. Es hat bisher gezeigt, dass Plazenta TNF-Inhalte mit mütterliche Adipositas bei Schwangerschaften mit weiblichen Föten erhöht. Darüber hinaus hemmt TNF Behandlung mitochondriale Atmung in weiblichen aber nicht männlichen Trophoblast Zellen, was darauf hindeutet, dass TNF beteiligt ist, bei der Regulierung der plazentaren Stoffwechsel in einem sexuell dimorphen Weise5. Mütterliche Korpulenz ist verbunden mit einer erhöhten Inzidenz von einer Vielzahl von Komplikationen während der Schwangerschaft, einschließlich Totgeburt, mit männlichen Föten wird das empfindlilchste3,6,7,8 . Aufgrund seiner Schlüsselrolle an der mütterlichen fetalen Schnittstelle können Veränderungen in der Funktionsfähigkeit der Plazenta in der übergewichtigen intrauterine Umwelt in Reaktion auf inflammatorische Signalisierung eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der Ergebnisse der übergewichtigen Schwangerschaften spielen.
Cytotrophoblasts und Syncytiotrophoblasts im Gewebe der Plazenta Zotten sind entscheidend für die endokrine Signalisierung und Nährstoff- und Sauerstoff-Austausch zwischen Mutter und entwickelnden Fötus9. Störungen in der funktionellen Kapazität der Zotten Cytotrophoblasts (nachfolgend Trophoblasten) können die fötale Gesundheit und Entwicklung gefährden. Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Probenahme von Zotten Gewebe aus der Plazenta menschlichen Begriff durch sezieren entfernt die Chorion und basale Platte sowie ein optimiertes Verfahren zur Isolierung von Trophoblasten für primären Zellkulturen. Dieses Protokoll stammt von etablierten Methoden mit enzymatischen Verdauung der Zotten Gewebe, Zellen aus der extrazellulären Matrix, gefolgt von differenziellen Dichte Zentrifugation Trophoblasten10, isolieren lassen 11,12. Dieser Protokolldetails ein Ansatz in der primären Trophoblasten von Plazenta aus magerem Schwangerschaften mit Nährmedien ergänzt mit TNF, ein Bestandteil der entzündlichen Milieu zu simulieren behandelt werden mit mütterliche Korpulenz verbunden sind. Schließlich wird ein einfaches Verfahren für die Ernte Ergebniszelle Lysates von TNF-behandelten Trophoblasten gefolgt von Western Blot zum Erkennen von Änderungen in der Genexpression beschrieben.
Während dieses Modell nicht die adipogene in Utero Umwelt in ihrer Gesamtheit rekapitulieren, bietet es ein kontrolliertes System, das es erlaubt, analysieren, der individuelle Beitrag von TNF-vermittelte Entzündung der Trophoblasten als Reaktion auf mütterliche Korpulenz. Dieses Modell bietet sowohl die Möglichkeit zu entdecken oder zu bestätigen molekulare Targets direkt TNF signalisieren in den Trophoblasten geregelt sowie kann man testen, ob Veränderungen im gen Expressionsmuster in Vivo in Plazenta mit Müttern beobachtet Fettleibigkeit kann TNF-vermittelte Entzündung führen.
Der hier beschriebene Ansatz wurde implementiert, um die Wirkung von TNF-vermittelte Entzündung über die Regulierung der Autophagie in menschlichen Trophoblasten zu testen. Trophoblasten von adipösen Schwangerschaften mit männlichen Föten Ausstellung gestört selbstverdauende Umsatz oder Autophagosome Reifung13. Ein Protein namens Rubicon (RUN Domain Protein Beclin1 Interaktion und Cystein-reiche enthält), die zum späten Endosomen und Lysosomen lokalisiert ist, hat vor kurzem beschrieben worden als "Bremse" selbstverdauende Umsatz dabei da er fungiert als eine negative Regulator der Autophagosome Reifung14,15. Rubicon ist in der Tat ein seltenes Beispiel eines Proteins, die Autophagie, zurückhält, wodurch es eine wertvolle therapeutische Ziel. Sehr wenig Informationen gibt es über die pathophysiologische Bedeutung der Rubicon, außer für seine Rolle in der angeborenen Immunantwort auf Microbials16,17 und Cardiomyocyte Schutz18. Mit dem beschriebenen Protokoll hier, wird es festgestellt, dass Rubicon hochreguliert in weiblichen primären Trophoblasten in Reaktion auf die Behandlung mit steigenden Konzentrationen von TNF bis 250 Pg/mL. Die Regulierung der Rubicon kann eine Rolle in wie weibliche Föten Tarif besser als Männer in den Schwangerschaften mit mütterliche Korpulenz spielen. Rekapitulation Entzündung mit mütterliche Korpulenz ex Vivo durch die Aufdeckung der menschlichen Trophoblasten, exogene TNF bietet eine Plattform zur Untersuchung der Auswirkungen der übergewichtigen intrauterine Umwelt zur Regulierung von kritischen Pfaden in Trophoblasten und durch Verlängerung, plazentare Funktion.
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Protocol
Placentae wurden gesammelt von Arbeits- und Liefereinheit am Universitätsklinikum unter ein Protokoll durch die institutionelle Review Board of Oregon Health and Science University in Portland, Oregon, mit Einwilligung von genehmigt die Patienten.
1. Sammlung der plazentaren Gewebes
- Vorbereitung
Hinweis: alle Geräte, die Gewebe Begegnungen muss steril sein.- Sterilisieren die sezierenden Ausrüstung durch Autoklavieren für 60 min bei 121 ° c
- Verwendung von persönlicher Schutzausrüstung (PSA): Lab Jacken/Kleider/scheuert, Handschuhe und Maske mit einem Gesichtsschutz oder Schutzbrillen.
- Schalten Sie Wasserbad und auf 37 ° c
- Warm zwei 50 mL konische Rohre, jedes mit 25 mL der komplette Medien (Iscove ' s Modified Dulbecco ' s Medium ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin, Tabelle 3) in einem 37 ° C Wasserbad.
- Mit Zustimmung des Patienten informiert, erhalten eine Plazenta sofort nach Lieferung per Kaiserschnitt.
- Machen Sie sich vertraut mit der Plazenta. Die Nabelschnur wird auf der fetalen Seite (Chorion Platte) eingefügt und Blutgefäße sind strahlenförmig von der Nabelschnur Einstichstelle erkennbar. Die gegenüberliegende Seite ist die mütterliche Seite oder die basale Platte. Freuen Sie sich auf die Decidua und Strukturen, Schiff Bäume, genannt Keimblätter enthalten.
- Sampling der Zotten Gewebe
Hinweis: Zotten Gewebe aus der Plazenta so bald wie möglich nach Lieferung, vorzugsweise innerhalb von 30 Minuten oder weniger abgetastet werden sollte.- Mit der Chorion Platte 2-3 volle dicke Abschnitte (ca. 2,5 cm x 2,5 cm Größe) Verbrauchsteuern nach oben, 2-3 cm vom Rand der Plazenta an zufällige, mit Zange und Schere ( Abbildung 1A).
Hinweis: Vermeiden Sie Teile der Plazenta, die abnorme (d.h. weiße Verkalkungen) angezeigt werden. - Trim entfernt die Chorion und basalen Platten und großen Blutgefäße.
- Das resultierende Zotten Gewebe ( Abbildung 1 b, insgesamt ca. 80-120 g) in warmen komplette Medien und Trophoblast Isolierung innerhalb von 30 min der Probenahme beginnen.
Hinweis: Einige nachgelagerten Assays und Anwendungen sind durch die Länge der Wartezeit zwischen Lieferung, Probenahme und Trophoblast Isolation betroffen. Es empfiehlt sich, diese Zeiten so kurz wie möglich und Isolationen konsistent zu halten. - Mit den Techniken beschrieben in Schritten 1.2.1 - 1.2.2, probieren 5 zufällige 1 x 1 cm Abschnitte der Zotten Gewebe aus der Plazenta (einschließlich der Mittelpunktes).
- Cut pro 1 cm x 1 cm Zotten Gewebeprobe in 4-5 kleinere Stücke (ca. 30 mg), in 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen und Flash-Einfrieren Flüssigkeit N 2. Shop bei-80 ° C für den Einsatz in späteren Analysen.
- Mit der Chorion Platte 2-3 volle dicke Abschnitte (ca. 2,5 cm x 2,5 cm Größe) Verbrauchsteuern nach oben, 2-3 cm vom Rand der Plazenta an zufällige, mit Zange und Schere ( Abbildung 1A).
2. Isolierung des Trophoblasten aus Zotten Gewebe
- Vorbereitung
Hinweis: verwenden Sie sterilen Ausrüstung und Verfahren im Zusammenhang mit Zellen in einem Laminar-Flow-Abzug führen.- Tauwetter vier gefrorene Dichtegradienten (Tabelle 1, siehe Tabelle der lebensnotwendigen Gütern, Reagenzien, und Ausrüstung, ergänzendes Material) bei 4 ° C am Vorabend die Plazenta kommt.
Hinweis: Alternativ Dichtegradienten können erfolgen am Tag der Isolation. - Turn Zentrifuge und auf 20 ° c
Hinweis: Alle Zentrifugation Schritte sind auf maximale Beschleunigung und Verzögerung, sofern nicht anders angegeben. - Vorbereiten 1 x HEPES-gepufferte Salzlösung (HBSS) ergänzt mit Ca + 2 und Mg + 2 (Tabelle 3).
- Warme Trypsin auf 37 ° c
- Verdünnen DNase, etwa 2720 Kilounits/mL in sterilen ergänzt HBSS.
- Neugeborenes Kalb Serum (NCS) auf 37 ° c warmen 50 mL
- Warm komplette Medien auf 37 ° c
- Warm einfrierende Medien (90 % FBS, 10 % DMSO, Tabelle 3) auf 37 ° c
Vorsicht: DMSO ist giftig und muss mit Handschuhen behandelt werden. - Vorbereiten Verdauung Puffer (Tabelle 2 und 3) durch das Mischen von 308 mL ergänzt HBSS, 50 mL von Trypsin (3751.7 BAEE Units/mL) und 0,5 mL DNase (379.4 Kilounits/mL) in eine sterile Flasche.
Anmerkung: Die ungefähre Zeit erforderlich, um Zellen aus Zotten Gewebe zu isolieren ist 7 h.
- Tauwetter vier gefrorene Dichtegradienten (Tabelle 1, siehe Tabelle der lebensnotwendigen Gütern, Reagenzien, und Ausrüstung, ergänzendes Material) bei 4 ° C am Vorabend die Plazenta kommt.
- Verarbeitung der Zotten Gewebe
- spülen jedes Stück der Zotten Gewebe in einem 50 mL konische Röhrchen mit Raumtemperatur Phosphat gefüllt gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Wiederholen und die PBS ggf. austauschen, bis das überschüssige Blut entfernt wird (PBS spülen werden hellrot oder rosa wenn das Gewebe gründlich gespült wird).
- Der Zotten Gewebe in eine sterile Petrischale und entfernen wie viele Blutgefäße wie möglich durch vorsichtig abkratzen der Zotten Weichgewebe aus den Gefässen mit einem Mikroskop-Objektträger.
- Das resultierende Zotten Gewebe mit einer Schere fein hacken.
- Zotten Gewebe Verdauung und grobe Isolation des Trophoblasten
- übertragen Sie das Hackfleisch Zotten Gewebe auf eine sterile Flasche mit Aufschlusslösung entsprechend der berechneten Volumen anhand der spezifischen Aktivität von Trypsin und DNase (165 mL, Tabelle 2).
- Nach 35 min Inkubation bei 37 ° C Wasserbad mit 70 Umdrehungen pro Minute (u/min), schütteln die Verdauung-Flasche auf die Seite kippen und ermöglichen die unverdaute Teile des Gewebes auf den Boden der Flasche zu begleichen. Der Überstand mit einer serologischen Pipette, Vermeidung ständige Gewebe sorgfältig auszuarbeiten.
- Verzichtet den Überstand durch ein 100 µm Zelle Sieb gleichmäßig zwischen 50 mL konische Röhrchen.
Hinweis: Um Zeit zu sparen, es empfiehlt sich, die zweite beginnen Verdauung indem Aufschlusslösung (110 mL, Tabelle 2) zu den übrigen Gewebe und Wiederaufnahme Inkubation, wie unter Punkt 2.3.2 beschrieben beigelegt. - Schicht sanft 3-5 mL NCS unter der angespannten Überstand durch den Verzicht auf langsam aus einer serologischen Pipette an der Unterseite des Rohres. Ein Meniskus zwischen den angespannten überstand (mit Trophoblasten) und NCS sollte sichtbar ( Abb. 2A).
- Zentrifugieren die Überstände über NCS 1.250 x g für 15 min bei 20 ° C. Das daraus resultierende Pellet enthalten rote Blutkörperchen in der untersten Schicht, gefolgt von einer weißen Schicht, den Trophoblast Zellen ( Abb. 2 b).
- Wiederholen Sie die Schritte 2.3.2 - 2.3.5 für jeden der die zweite und dritte Verdauung (Hinzufügen von 110 mL und 83,5 m bzw. der Aufschlusslösung bis in die Flasche des Gewebes, Tabelle 2).
- Sobald alle Überstände zentrifugiert worden, Aufschwemmen jedes Pellet in 5 mL warme komplette Medien und dann bündeln die Suspensionen zusammen.
- Teilen die Zellsuspension gleichmäßig zwischen zwei 50 mL konische Röhrchen und Zentrifuge bei 1.250 x g für 15 min bei 20 ° c
- Sanft entfernen den Überstand und Aufschwemmen jeder Zelle Pellets in 6 mL warmen kompl.ETE Medien.
- Dichte Zentrifugation
- unterteilen die Zellsuspension gleichmäßig auf vier Dichtegradienten (3 mL) durch langsam und vorsichtig Schichtung der Zellsuspension auf der Oberseite der Dichtegradienten mit einer Transferpipette.
- Zentrifugieren Dichtegradienten bei 1.250 x g für 20 min bei 20 ° C mit minimalen Beschleunigungs- und Verzögerungswerte. Dies sollte produzieren unterscheidbare Bands der sedimentierte Zellen (Tabelle 4).
- Langsam und vorsichtig entfernen der oberen Schichten der Dichte-Gradienten-Medien (DGM), bis die undurchsichtigen Bändern Trophoblast Zellen (zwischen 35-50 % DGM) (Tabelle 4) erreicht ist.
- Übertragen die Trophoblast Bands in zwei 50 mL konische Röhrchen und füllen Sie mit warmen komplette Medien.
- Sanft invertieren die Rohre 3 - 6 Mal zu mischen und Zentrifugieren bei 1.250 x g für 15 min bei 20 ° c
- Entfernen den Überstand und Aufschwemmen jede Zelle Pellet in 5 mL warme komplette Medien. Kombinieren Sie die Zellsuspensionen und zählen lebensfähige Zellen mit einem Hemocytometer und Trypan blau (oder bevorzugte Zelle Zählweise).
- Zählen Zellen mit einem Hemocytometer
- mischen die Zellsuspension durch Pipettieren oben und unten mit einer serologischen Pipettieren oder sanft invertieren das Rohr mehrmals.
- Kombinieren gleiche Teile der Zellsuspension und Trypan blau (d.h. jeweils 20 µL) in einem separaten Rohr und vorsichtig mischen.
- Für 1-2 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Sanft verzichten, 15-20 µL der Zelle-Trypan blau Mischung zwischen dem Deckglas und der Hemocytometer und erlauben die Zellen über das Raster durch Kapillarwirkung diffundieren.
- Zählen lebensfähige Zellen (abgestorbene Zellen werden tiefes blau gefärbt) in jedem der vier 4 x 4-Quadranten mit einem Stückzähler. Ein System des Zählens dafür Zellen zählen nicht mehr als einmal beschäftigen (d. h. Zellen, die die unteren bzw. linken Grenzen berühren nicht zählen).
Hinweis: Jeder 4 x 4-Quadranten sollte zwischen 50-150 Zellen enthalten. Zu wenige oder zu viele Zellen zu einer über- oder Unterschätzung der Anzahl von Zellen führen können. - Durchschnitt die gesamten Zelle zählt aus jedem der 4 x 4-Quadranten mit 10 multiplizieren 4, und multiplizieren Sie dann mit den Verdünnungsfaktor (Zellsuspension Trypan blau) zur Berechnung der Anzahl der Zellen pro mL.
- Multiplizieren Sie die Anzahl der Zellen pro mL durch das Gesamtvolumen der Zellsuspension auf die Ergebniszelle Rendite errechnen.
Hinweis: Etwa 100 Millionen Zellen sind von Isolationen, beginnend mit 80-120 g der Zotten Gewebe erwartet.
- Galvanischen Zellen
- Platte 3 Millionen Zellen/Well (3,3 x 10 5 Zellen pro cm 2) in einem 6-Well-Platte (2 mL Suspension pro Well) und sanft hin und her schaukeln und Seite an Seite, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
Hinweis: Trophoblasten erfordern Gewebekultur behandelt Platten richtig einzuhalten. Eine Monolage von Zellen ist erforderlich, um Syncytialization zu fördern. - Verlassen die vergoldeten Zellen in der Laminar-Flow-Haube für ca. 30 min erlauben Zellen gleichmäßig zu verteilen, zu begleichen und beginnen an der Unterseite der Brunnen halten vor dem Einlegen in den Inkubator.
- Kultur-Zellen bis zu 72 h (mit täglichen Medien Änderungen) in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO 2 % und 95 % Luftfeuchtigkeit.
Hinweis: Untersuchen Sie die Trophoblasten unter dem Mikroskop um 10-20 x alle 24 h Kultur. Trophoblasten nicht vermehren und passagiert werden können nicht. Im Laufe von 72 h der Kultur, der Runde einzelnen Trophoblasten verschmelzen um zu bilden ein Syncytium ( Abb. 3A und B).
- Platte 3 Millionen Zellen/Well (3,3 x 10 5 Zellen pro cm 2) in einem 6-Well-Platte (2 mL Suspension pro Well) und sanft hin und her schaukeln und Seite an Seite, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen.
- Einfrieren Zellen
- Pellet nicht verwendete Zellen durch Zentrifugation bei 1.250 x g für 10 min bei 20 ° c
- Aspirieren Sie soviel Medien wie möglich aus dem Pellet.
- Aufschwemmen das Pellet in eisigen Medien (Tabelle 3).
- Einfrieren der Aliquote bei-80 ° C in einem eiskalten Behälter gefüllt mit 100 % Isopropanol. Übertragen Sie die eingefrorenen Aliquoten auf Flüssigkeit N 2 am Folgetag für langfristige Lagerung.
Hinweis: Zellen können nach Einfrieren kultiviert werden.
- Auftauen Zellen
- ein Aliquot des gefrorenen Zellen zu entfernen und Auftauen im Wasserbad 37 ° C während wirbeln. Entfernen Sie den Aliquoten aus dem Wasserbad, kurz bevor es zu einer Flüssigkeit vollständig aufgetaut ist.
- Sofort die aufgetauten Zellen auf eine 15 ml konische Rohr übertragen. Ab Verlangsamung am Anfang 10 mL komplette Medien mit intermittierenden mischen hinzufügen.
- Schlauch mehrmals mischen zu invertieren.
- Zentrifuge bei 200 X g für 10 min bei 20 ° C.
- Aspirieren überstand und Aufschwemmen das Pellet in 2-5 mL warme komplette Medien.
- Zählen die Zellen und die Platte wie oben beschrieben.
3. Behandlung von primären Trophoblasten TNF und Sammlung der Zelle Lysates Western Blotting
- Vorbereitung
- Warm komplette Medien auf 37 ° c
- 10 µg/mL Lager TNF in komplette Medien und Store bei-20 ° C bis einsatzbereit machen.
- Machen eine 1 µg/mL arbeiten Bestand an TNF in komplette Medien, wenn Sie bereit sind, die Zellen zu behandeln. Serielle verdünnen TNF arbeiten Lager 10 4 Pg/mL, 10 3 Pg/mL, 500 Pg/mL, 250 Pg/mL und 125 Pg/mL in komplette Medien.
Hinweis: Die TNF-Konzentration von 10 4 Pg/mL ist mäßig zytotoxisch. Anpassung der TNF Konzentrationen getestet wird auf die Besonderheiten der gewünschten downstream-Anwendungen abhängen.
- Behandlung von Zellen mit TNF
- nach 24 h Kultur, Aspirieren Nährmedien aus den Zellen und ersetzen mit 2 mL TNF ergänzt Medias pro Bohrloch auf 6-Well-Platten (mindestens zwei Brunnen pro Behandlung und Fahrzeug Steuerelement).
- Nach 24 h TNF-Exposition (48 h der Kultur), ersetzen die TNF ergänzt Medien durch komplette Medien.
- Zellen ernten und Gesamt-Protein
- nach 72 h (24 h vorbei Entfernung von TNF) Kultur, aspirieren Sie Medien, sanft spülen Zellen mit Raumtemperatur PBS und 80 µL eiskalt Tests Test hinzufügen Puffer (RIPA) mit frisch hinzugefügt direkt in jede Vertiefung Protease und Phosphatase-Inhibitoren (Tabelle 3).
- Der Zellen von der Platte mit einer Zelle Spachtel entfernen. Übertragen Sie die Zellen auf einen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch, Bündelung von Brunnen in Behandlungsgruppen.
- Lyse der Zellen durch Vortexen die Rohre hoch für mindestens drei Intervalle von 15 s.
- Brüten die Zellen bei 4 ° C mit Schaukeln für 15 min.
Hinweis: Alternativ nach Schritt 3.3.3., die Zellen können für 15 min mit intermittierenden Agitation auf Eis inkubiert werden, durch streichen, Rohr, aufschütteln, oder pipettieren Sie und tunWN. - Wiederholen Sie Schritt 3.3.3.
- Zentrifugieren der Rohre bei 10.000 x g für 5 min bei 4 ° C zu Pellets Zelltrümmer.
- Übertragung der Überstand (mit zellulären Proteinen) zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und bei-80 ° c
Hinweis: Das Protokoll kann hier gestoppt und zu einem späteren Zeitpunkt wieder aufgenommen. Es ist ratsam, mehrere Aliquote des zellulären Proteinproben mehrere Gefrier-Tau-Zyklen zu vermeiden. - Gesamt-Protein-Konzentration zu bestimmen, indem Sie eine bevorzugte Methode, wie z. B. eine saure Bicinchoninic-Assay (BCA, siehe Tabelle der lebensnotwendigen Gütern, Reagenzien, und Ausrüstung, Zusatzmaterial).
- SDS-PAGE und Western Blotting für Rubicon oder Protein of Interest
Hinweis: Folgen Sie Western Blot-Protokolle nach Hersteller ' s Anweisungen mit einem bevorzugten Laborsystem.- Last zwischen 20-40 µg von Gesamtprotein im Probenpuffer (Tabelle 3) pro Bohrloch zu einem 12 % Acrylamid Gel. Trennen der Proteine durch SDS-PAGE im laufenden Puffer (Tabelle 3).
- Nass-Transfer der Proteine aus dem Gel auf eine Polyvinylidene Difluoride (PVDF) Membran laut Hersteller ' s Anweisungen im Transfer-Puffer (Tabelle 3).
- Inkubieren Sie die Membran in 5 % Milchpulver in Tris-Buffered Kochsalzlösung mit 0,1 % Tween 20 (TBST, Tabelle 3) für mindestens 1 h bei Raumtemperatur mit rockigen.
- Inkubieren Sie die Membran in eine Rubicon Primärantikörper (siehe Tabelle der lebensnotwendigen Gütern, Reagenzien, und Ausrüstung, ergänzendes Material) in 1: 500 in 1 % Milchpulver in TBST über Nacht bei 4 ° C mit rockigen.
- Vorsichtig waschen die Membran 3 x 5 min in TBST und 1 x 5 min in TBS bei Raumtemperatur mit rockigen.
- Brüten die Membran in 1: 2000 - 1: 5.000 Sekundärantikörper (HRP verknüpft oder bevorzugte sichtbar konjugiert, siehe Tabelle der lebensnotwendigen Gütern, Reagenzien, und Ausrüstung, ergänzendes Material) in 5 % Milchpulver in TBST für mindestens 1 h bei Raumtemperatur mit Rocking.
- Des Waschvorgangs im Schritt 3.4.5 beschrieben wiederholen und visualisieren Sie den Fleck mit einem geeigneten Visualisierung (d.h. Chemolumineszenz) Substrat auf ein bildgebendes System.
- Wiederholen Sie das Waschen in Schritt 3.4.5 beschrieben und die Membran für β-Aktin oder eine bevorzugte laden Kontrolle laut Hersteller Sonde ' Anweisungen s.
- Auf bevorzugte Bildanalyse-Software analysieren den Ausdruck von Rubicon durch manuelle Quantifizierung der Extinktion (Band Intensitäten), Subtraktion von Hintergrund-Absorption und Normalisierung der entsprechenden Belastung Steuern Band Intensitäten. Führen Sie statistische Auswertungen je nach Bedarf, um statistisch signifikante Änderungen im Protein-Ebene zu testen.
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Representative Results
Begriff der menschlichen Plazenta aus Lean (vor der Schwangerschaft Body-mass-Index (BMI) < 25) Mütter mit unkomplizierten Schwangerschaften tragen weibliche Nachkommen wurden gesammelt und innerhalb von 15 Minuten nach Lieferung per Kaiserschnitt (keine Arbeit) abgetastet. Die Plazenta wurden für das Fehlen von Verkalkungen und typische Entwicklung untersucht: mit einem Gewicht zwischen 300-600 g mit der Nabelschnur und Membranen entfernt, in der Form, zwischen 15-25 cm im Durchmesser und Nabelschnur eingefügt in die Mitte des runden die Plazenta. Zotten Gewebe war weg von der basalen und Chorion Platte 2-3 Proben aus über die Plazenta (Abbildung 1), ca. 100 g der Zotten Gewebe als Ausgangsmaterial für die primäre Trophoblast Isolierung nachgeben seziert. Innerhalb von 20 Minuten der Probenahme Zotten Gewebe, das Verfahren zur primären Trophoblasten isolieren begann wie beschrieben hier, nachgiebig, zwischen 0,8 - 1 x 108 entwicklungsfähigen Zellen. Die Zellen wurden in Kultur 6-Well-Platten bei einer Dichte von 3 x 106 (3,3 x 105 Zellen pro cm2) ausgesät. Nach 24 Stunden der Kultur die Zellen unter dem Mikroskop zur Befestigung untersucht wurden und ordnungsgemäße Trophoblast Morphologie (einzelne Runde Zellen) bestätigt wurde. Die Nährmedien wurde ersetzt mit kompletten Medien mit einer Reihe von Konzentrationen von TNF zwischen 125-104 Pg/mL, so dass mindestens zwei Brunnen pro Konzentration und Fahrzeugkontrolle (nur komplette Datenträger) aufgenommen wurden.
Vierundzwanzig Stunden nach TNF-Behandlung (48 h der Kultur), wurden alle TNF-Medien durch komplette Medien ersetzt. Keine nennenswerten Zelltod wurde durch die Behandlung mit TNF bei Konzentrationen an oder unter 103 Pg/mL beobachtet. Behandlung mit 104 Pg/mL TNF war mäßig zytotoxische und die zytotoxische Wirkung von dieser TNF-Konzentration nicht beibehalten, nachdem die Medien verändert wurde, wie Laktat-Dehydrogenase (LDH) Assays (Daten nicht gezeigt) belegt. Bei 72 h von Kultur wurden die Zellen auf Syncytialization unter dem Mikroskop untersucht. Immunocytochemistry für Syncytialization und Fibroblasten Kontamination zeigte relativ reines Isolierung des Trophoblasten (Abbildung 3). Zelluläre Lysates wurden gemäß dem Protokoll hier beschriebenen nachgeben zwischen 3-8 µg/µL Gesamt-Protein pro Vorbereitung durch einen BCA-Assay (Daten nicht gezeigt) geerntet. Western-blot Analyse in Zelle Lysates von weiblichen Trophoblasten behandelt mit TNF zeigte eine Hochregulation von Rubicon Ausdruck als Reaktion auf Konzentrationen von bis zu 250 Pg/mL TNF und anschließende Herabregulation der Rubicon Ausdruck bei TNF-Konzentrationen größer als 250 Pg/mL (Abb. 4A und B, 104 Pg/mL von Analyse basierend auf zytotoxische Wirkung ausgeschlossen). Rubicon ist ebenfalls deutlich hochreguliert in Blitz eingefroren Zotten Gewebebiopsien von Plazenta von adipösen Schwangerschaften mit weiblichen Föten im Vergleich zu schlanken Kontrollen wie Western-Blot Analyse belegt (Abbildung 4 und D, n = 6 Plazenta pro BMI Klasse, ANOVA, P < 0,05).
| Konzentration (%) | 90 % DGM (ml) | 1 X HBSS (ml) | Schichtdicke (ml) |
| 4 X Steigung | 4 X Steigung | Insgesamt 34,5 ml | |
| 70 | 14 | 4 | 4.5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7.33 | 4.67 | 3 |
| 50 | 3.34 | 2.67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (13,5 ml-Markierung) |
| 40 | 5.33 | 6.67 | 3 |
| 35 | 4.67 | 7.33 | 3 (19,5 ml-Markierung) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2.67 | 9.33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10,67 | 3 |
Tabelle 1. Spezifikationen für die Herstellung von Dichtegradienten für Dichte Zentrifugieren der primären Trophoblasten.
Von links nach rechts, Spalte eins gibt Dichte-Gradienten-Medien (DGM, siehe Tabelle der lebensnotwendigen Gütern, Reagenzien, und Ausrüstung, Zusatzmaterial) Konzentration ausgedrückt als Prozentsatz der DGM in HBSS. Spalte 2 gibt die Lautstärke der DGM, während Spalte drei Volumen von HBSS benötigt für die Herstellung des entsprechenden Prozentsatz der DGM-Lösung gibt. Spalte 4 gibt die Lautstärke, die 50 mL konische Rohr, Farbverlauf, beginnend mit der höchsten Dichte Schicht bauen hinzugefügt werden soll.
| Trypsin | HBSS | DNase | ||
| Verdauung | (Gesamtaktivität; BAEE Units) | Volumen (ml) | (Gesamtaktivität; Kunits) | Gesamtvolumen /Digestion |
| 1 | 619037 (23,01 ml) | 141,76 ml | 62594 (0,230 ml) | 165 ml |
| 2 | 412691 (15,34 ml) | 94,51 ml | 41729 (0,154 ml) | 110 ml |
| 3 | 313270 (11,65 ml) | 71,74 ml | 31676 (0,116 ml) | 83,5 ml |
| Insgesamt | 1345000 (50 ml) | 308 ml | 136000 (0,5 ml) | 358,5 ml |
Tabelle 2. Spezifikationen für die Vorbereitung der Aufschlusslösung für primäre Trophoblast Isolation basierend auf die spezifische Aktivität von DNase und Trypsin.
Von links nach rechts, die erste Spalte gibt die Anzahl der die Verdauung, die zweite Spalte gibt die Trypsin-Aktivität pro Verdauung benötigt, die dritte Spalte gibt das Gesamtvolumen der ergänzten HBSS für die entsprechende Verdauung hinzugefügt werden die vierte Spalte gibt die DNase-Aktivität pro Verdauung benötigt, und die letzte Spalte gibt die Lautstärke der Aufschlusslösung seinHinzu kommt der plazentaren Gewebes für die entsprechende Verdauung.
| HBSS (ergänzt mit Ca+ 2 und Mg+ 2) | Probenpuffer |
| 10 % 10 X HBSS | 90 % 4 X Laemmli Farbstoff |
| 1,26 mM CaCl2 (Anhyd.) | 10 % 2-Mercaptoethanol |
| 0,80 mM MgSO4 (Anhyd.) | |
| 20,77 mM HEPES | |
| pH auf 7,4 mit 10N NaOH Volumen bis zu 1 L mit sterilen ddH2O zu machen Sterilfilter in eine sterile Flasche |
|
| Komplette Medien | Laufenden Puffer |
| 11 % V/V IMDM entfernen | 25 mM Tris-Base |
| Fügen Sie 10 % V/V FBS | 190 mM Glycin |
| Fügen Sie 1 % 10.000 U/mL Penicillin/Streptomycin (100 U/mL Final) | 0,1 % SDS |
| pH 8.3 | |
| Einfrieren von Medien | |
| 90 % V/V FBS | Puffer zu übertragen |
| 10 % V/V DMSO | 25 mM Tris |
| 190 mM Glycin | |
| Verdauung-Puffer | 20 % Methanol |
| 50 mL Trypsin (26.900 BAEE Units/mL) | pH 8.3 |
| 0,5 mL DNAse (272.000 K Einheiten/mL) | |
| 358,5 ml in ergänzt HBSS bringen | TBS |
| 20 mM Tris | |
| RIPA Puffer | 150 mM NaCl |
| 25 mM Tris-HCl | pH bis 7.6 |
| 5 mM EDTA | |
| 150 mM NaCl | TBST |
| 0,1 % SDS | TBS mit 0,1 % Tween 20 |
| 0,5 % Natrium deoxycholate | |
| 1 % Triton x-100 | |
| 1 Tablette der Protease/Phosphatase-Inhibitor pro 10 ml Puffer RIPA |
Tabelle 3. Lösungen für Isolation und Kultur der primären Trophoblasten gefolgt von Western Blotting.
| % DGM | ml-Markierung | Zelltyp |
| 10 | 31,5-34,5 | Trümmer |
| 20 | 28,5 31,5 | |
| 30 | 22,5-28,5 | |
| 35 | 19,5-22,5 | Trophoblasten |
| 40 | 16,5-19,5 | |
| 45 | 13.5-16.5 | |
| 50 | 10,5-13,5 | Lymphozyten |
| 55 | 7.5-10.5 | |
| 60 | 4.5-7.5 | Rote Blutkörperchen |
| 70 | Unter 4.5 |
Tabelle 4. Sedimentation von Trophoblasten durch Dichte zentrifugieren.
Von links nach rechts, die erste Spalte gibt den Prozentsatz der DGM (Tabelle 1), die zweite Spalte gibt die mL-Markierung, wo der entsprechende Prozentsatz der DGM ist auf eine 50 mL konische Rohr gefunden, und die dritte Spalte gibt an, welche Zelle Typ Sedimente auf, dem entsprechenden Prozentsatz der DGM und mL Markierung auf einer 50 mL konische Rohr. Trophoblasten Sediment zwischen 50-35 % DGM, unterschiedliche undurchsichtige Banden bilden. Sammeln von DGM, oberhalb oder unterhalb dieses Bereichs führt zu Kontamination der Zelltrümmer und andere Zelltypen wie Lymphozyten.
Abbildung 1. Abseits der Zotten Gewebe ist der Begriff menschlichen Plazenta durch Entfernen der Chorion und basalen Platten.
A) mit der Chorion Platte (fetale Seite) nach oben zeigt, ist eine volle dicke Probe aus der Plazenta herausgeschnitten. B) eine Probe des Gewebes Zotten wird durch Entfernen der Chorion und basale Platte erhalten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Zentrifugation von Zellen in Aufschlusslösung über neugeborenen Kalb Serum führt zu einer vielschichtigen Zelle Pellet.
A) Neugeborenen Kälberserum (NCS) wird unter die Zellsuspension in Digest-Lösung in einem 50 mL konische Röhrchen geschichtet. B) Zentrifugation von (A) ergibt sich ein vielschichtiges Zelle Pellet. Die unterste Schicht ist tief in roter Farbe und besteht aus roten Blutkörperchen. Die darüberliegenden Ebene umfasst Trophoblasten und ist weiß oder in Farbe Beige. Oberhalb der Trophoblast ist Schicht NCS gefolgt von Aufschlusslösung (überstand) an die Spitze des Rohres. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Immunocytological Analyse der Syncytialization und Fibroblasten Inhalt in primären menschlichen Trophoblast Kulturen.
A) repräsentatives Bild von Cytokeratin-7 (rot) in Cytotrophoblasts nach 24 Stunden der Kultur. B) repräsentatives Bild von Cytokeratin-7 (rot) in Syncytiotrophoblasts nach 72 h Kultur zeigt mehrkernigen Massen von Zellen, die miteinander verschmolzen haben. C) repräsentatives Bild von Vimentin (rot) in Syncytiotrophoblasts nach 72 h der Kultur. Bilder wurden auf einem fluoreszierenden Mikroskop mit DAPI (blau) nukleare Gegenfärbung erworben. Bei 10-facher Vergrößerung visualisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Regulierung der Rubicon Ausdruck in Reaktion auf TNF-Behandlung in weiblichen Trophoblasten und endogenen Rubicon Ausdruck in Zotten Gewebe von Lean gegenüber übergewichtigen Schwangerschaften mit weiblicher Föten.
Primäre Trophoblasten vom Begriff Plazenta von schlanken Müttern mit gesunde Schwangerschaften mit einem weiblichen Fötus waren isoliert und behandelt mit 125, 250, 500, 103und 104 Pg/mL TNF (oder Fahrzeugkontrolle). A) Vertreter Western Blot für Rubicon in weiblichen Trophoblast Lysates mit TNF behandelt. Β-Aktin diente als ein Steuerelement laden. B) Rubicon Ausdruck in Reaktion auf TNF-Behandlung bei weiblichen Trophoblasten wurde von Western Blot quantifiziert und normiert auf β-Aktin. Werte sind mittlere Rubicon Ausdruck pro TNF Konzentration ± S.E in n = 3 Plazenta. C) Western blots für Rubicon im ganzen Gewebe Lysates vom Blitz eingefroren Biopsien von Zotten Gewebe aus mageren gegenüber übergewichtigen Schwangerschaften mit weiblichen Föten (F1-F12). Laktat-Dehydrogenase A (LDHA) diente als ein Steuerelement laden. D) Rubicon Ausdruck in Western von (C Blots) wurde quantifiziert und auf LDHA normalisiert. Werte sind mittlere Rubicon Ausdruck pro BMI Klassifizierung ± S.E in n = 6 Plazenta pro BMI-Klasse (ANOVA, * P < 0,05). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Plazenta, verantwortlich für die Regulierung des Wachstums des Fötus, weist auf kompromittierten Funktion in der übergewichtigen Umwelt6. Trotz der hohen metabolischen Anforderungen des Trophoblasten weisen Plazenta mit mütterliche Korpulenz dysfunktionalen mitochondriale Atmung6,19. Veränderungen im Stoffwechsel der Plazenta können zu erhöhten Inzidenz von Komplikationen und unerwünschten fetalen Ergebnisse beobachtet in fettleibig Schwangerschaften3,6,7beitragen. Autophagie ist auch in der Plazenta mit mütterliche Adipositas gefährdet. Plazenta von adipösen Schwangerschaften mit männlichen Föten zeigen dysfunktionalen selbstverdauende Fluss als durch die Anhäufung von Autophagosom13belegt. Optimale selbstverdauende Flussmittel ist entscheidend für die zelluläre Homöostase und defekte Autophagie in Plazenta mit mütterliche Korpulenz kann eine wichtige Rolle bei der Vermittlung der negative Ergebnisse mit übergewichtigen Schwangerschaften verbunden.
Die präzise Ursache(n) der kompromittierten plazentaren Funktion in mütterliche Korpulenz ausgestellt sind nicht gut verstanden und kann haben ihren Ursprung bei entzündlichen Signalisierung. Übergewicht und Schwangerschaft sind proinflammatorischen Zustände, die durch erhöhte Werte von zirkulierenden TNF1,4,20,21gekennzeichnet sind. TNF ist ein Aktivator der Autophagie22,23und Änderungen im selbstverdauende Fluss in der Plazenta von adipösen Schwangerschaften vermitteln kann. TNF wird häufig zur Untersuchung der Auswirkungen der Entzündung auf Zellen, vor allem im Zusammenhang mit Krebs2. Die hier vorgestellten Protokoll passt sich dieser Ansatz für die Untersuchung der Auswirkungen der Fettleibigkeit bedingte Entzündung auf die Funktionsfähigkeit der Plazenta durch Behandlung von primären Trophoblasten mit exogenen TNF in Kultur.
Dieses Protokoll besteht aus vier Hauptkomponenten: Probenahme von Zotten Gewebe aus der Plazenta, Isolierung der primären Trophoblasten aus Zotten Gewebe, Kultur der primären Trophoblasten gefolgt von TNF Behandlung und Sammlung der gesamten zellulären Lysates, gefolgt von Western-blot Analyse um den Ausdruck einer benutzt von Interesse zu messen. Um reine Trophoblasten zu isolieren, ist es wichtig, dass die Chorion und basalen Platten gründlich Weg von den Zotten Gewebe während der Probenahme der Plazenta (Abbildung 1 b) seziert werden. Es ist auch unerlässlich, dass die Zotten Gewebe in einer fristgerechten Weise (d. h. innerhalb von 30 Minuten nach Lieferung) verarbeitet wird. Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von drei Verdauung Schritte einer Dauer 35 Minuten Trophoblasten von der extra zellulären Matrix der Zotten Gewebe freizugeben. Längere Verdauung Risiko schädlichere Zellen durch Trypsinization der Zelle Oberflächenproteine. Erhöhung der Anzahl der Übersichten erhöhen nicht spürbar die letzte Ausbeute an lebensfähigen Trophoblasten. Verringerung der Zeit und Anzahl der Verdauung führt jedoch in verringerten Zelle Erträge (Simon Bucher und Maloyan, unveröffentlichte Daten). Dieses Protokoll produziert zuverlässig etwa 100 Millionen Zellen von 80-120 Gramm Zotten Gewebe.
Es gibt Schwankungen in der Anzahl der unterscheidbaren Trophoblast Bänder auf die Dichtegradienten zwischen Isolationen beobachtet. Zur Vermeidung von Kontamination aus anderen Zelltypen ist es wichtig, die streng die Bändern mit Trophoblasten auf der Dichtegradient (Tabelle 4) sammeln. Das Protokoll hier detailliert optimiert von vorher festgelegten Methoden, die relativ reine Trophoblasten mit weniger als 5 % Rendite Verunreinigungen durch andere Zelle Arten10,11,12. Weitere Reinigung kann durch positive oder negative Auswahl24erreicht werden. Dieser Ansatz wird jedoch das Risiko verringern die Ausbeute an lebensfähigen Trophoblasten ausgeführt. Immunocytochemical Analyse von Cytokeratin-7 in primären Trophoblasten isoliert, mit dem hier vorgestellten, nachdem 24 versus 72 h der Kulturzeit bestätigt, dass die Zellen Syncytialization erfuhr, wie Sie durch die Anwesenheit von mehrkernigen Zelle Massen Verfahren mit 72 h, ein Markenzeichen-Ereignis in der Lebensdauer einer Trophoblast (Abb. 3A und B). Immunocytochemical Analyse von Vimentin in primären Trophoblasten für 72 h kultiviert ergab darüber hinaus sehr wenige kontaminierende Fibroblasten (Abbildung 3). Für Routineaufgaben kann die Reinheit des Trophoblasten in Kultur durch einfache morphologische Beurteilung überwacht werden. Bei 24 h von Kulturzeit dominieren Runde einzelne Cytotrophoblasts die Kultur. Cytotrophoblasts unterziehen Syncytialization nach 72 h der Kultur, was zu Klumpen von verschmolzenen Zellen. Die am weitesten verbreitete ist kontaminierenden Zelle gefunden in dieser Kultur die Fibroblasten und Endothelzellen, die länglich und polygonale, bzw. sind. Diese Funktionen können etwa mit einem hellen Mikroskop überwacht werden.
Behandlung von primären Trophoblasten mit TNF bietet eine Regelstrecke, die Signalisierung über die Regulierung der kritische Pfade im Trophoblasten erlaubt, die Wirkung von TNF messen. Natürlich gibt es andere Faktoren als TNF in der übergewichtigen Müttern Umwelt in Vivo , die verantwortlich für die Modulation Trophoblast Funktion sein kann. Diese umfassen sind aber nicht beschränkt auf hormonelle Signale, Hyperlipidämie und eine Vielzahl von anderen proinflammatorischen Faktoren25. Kombinationen von verschiedenen Behandlungen werden weiter die adipösen intrauterine Umwelt Ex Vivo mehr physiologisch präziser rekapitulieren. Die Konzentrationen von exogenen TNF zur Behandlung von Trophoblasten in diesem Protokoll weit übertreffen die in der Regel in Vivoim Umlauf. Serum-Konzentrationen wurden berichtet, um 20 ng/mL erreichen oder höher bei bestimmten entzündlichen Erkrankungen26. Um eine messbare Reaktion durch aktuelle Labormethoden (d.h. Western blotting) zu erhalten, ist es notwendig, TNF-Konzentrationen um Veränderungen in der Genexpression und Wege von Interesse zeigen zu verstärken. Diese Reaktionen können in Vivo in geringerem Maße vorhanden. Allerdings könnte sie dennoch erheblich beeinträchtigen die Funktion des Trophoblasten. Trophoblasten gegenüber hohen Konzentrationen von TNF auszusetzen, läuft Gefahr, zur Herstellung von Artefakten in der Genexpression und Pfad-Analysen, die in zytotoxische Effekte verwurzelt sein können. Moderate Zytotoxizität verzeichneten Trophoblasten, 104 Pg/mL TNF ergänzt Medien für 24 h ausgesetzt wie LDH Zytotoxizität Assays (Daten nicht gezeigt) belegt. Konzentrationen an oder unter 103 Pg/mL TNF produziert nennenswerte Zelltod jedoch nicht.
TNF-Konzentrationen in kleineren Intervallen bzw. sind niedriger als die hier beschriebenen Tests kann am besten durch quantitative weiterverfolgt werdenPolymerase-Kettenreaktion (qPCR) für gen-Ausdruck-Analyse, eine Technik bestens geeignet für kleine Änderungen in der Genexpression zu erkennen. Während qPCR speziell für gen-Ausdruck-Ebenen auf transkriptioneller Ebene Tests, erkennt das westliche Beflecken das endgültige Niveau der Protein-Produkte, die vermutlich zur Verfügung, um ihre zellulären Aufgabe(n) auszuführen sind. Mit beiden analytischen Techniken in Verbindung ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Ermittlung der Auswirkungen der TNF Behandlung zur Regulierung der gen Ausdruck Ebenen ebenso wie für bestimmen, ob Änderungen im Ausdruck Niveaus der transkriptionellen resultieren, posttranskriptionale oder post-translationalen Verordnung. Entzündlichen Stress kann Trophoblast Verhalten, Morphologie und Syncytialization auswirken. Einschließlich der morphologischen Beurteilung (d.h. Immunocytochemistry) neben molekulare analytische Ansätze bieten eine umfassendere Analyse der Auswirkungen der Exposition TNF Trophoblast Gesundheit. Anpassung von TNF Konzentrationen getestet und nachgelagerten Assays nach experimentellen Anforderungen ist ratsam.
Durch die Implementierung des Protokolls, die hier beschrieben, wird TNF-vermittelte Entzündung zu Upregulate Rubicon Ausdruck im menschlichen Trophoblasten von schlanken Schwangerschaften mit weiblichen Föten gefunden. Westliche Beflecken für Rubicon in Trophoblast Lysates ergab zwei unterschiedliche Banden in der Nähe und über den erwarteten Molekulargewicht von 140 kDa (Abb. 4A). Es gibt Hinweise darauf, dass das untere Band unspezifisch ist (PD047 Anti-Rubicon pAb, MBL-Datenblatt, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). Die Trophoblasten Weibchen zeigte die Fähigkeit, Upregulate die Expression von Rubicon in Reaktion auf die Behandlung von TNF-Konzentrationen bis zu 250 Pg/mL. Bei Konzentrationen höher als dieser, Rubicon Ausdruck Ebenen sank zurück in Richtung Grundlinie (unbehandelten Kontrolle) und sogar unter (Abbildung 4 b, n = 3). Angesichts der Tatsache, dass Trophoblasten aus magerem Schwangerschaften mit TNF behandeln Entzündungen in der übergewichtigen intrauterine Umgebung simuliert, ist dieses Ergebnis auf die Feststellung, der Rubicon deutlich hochreguliert in Blitz eingefroren Zotten Gewebebiopsien von ist ergänzenden Plazenta von adipösen Schwangerschaften mit weiblichen Föten im Vergleich zu schlanken Kontrollen (Abbildung 4 und D, ANOVA, n = 6 / BMI-Klasse, P < 0,05).
Zwar selbstverdauende Fluss nicht in Trophoblasten von adipösen Schwangerschaften mit weiblichen Föten im Vergleich zu schlanken Kontrollen unterscheiden, weisen Trophoblasten von adipösen Schwangerschaften mit männlichen Föten Aktivierung von Bildung und Ansammlung von Autophagosom 13. Rubicon ist ein negativer Regulator der Autophagie, handelt es um Autophagosome-Lysosomen Fusion27Einhalt zu Gebieten. Weibliche Trophoblasten können Upregulate der Ausdruck der Rubicon als kompensatorische oder schützende Mechanismus gegen TNF-vermittelte Entzündung, die Autophagie22, Lean-wie selbstverdauende Wandel in der Einstellung zu pflegen und dadurch aktivieren können mütterliche Korpulenz. Diese Antwort in der Plazenta kann wie weibliche Föten Tarif besser als die Männchen in der übergewichtigen intrauterine Umwelt eine Rolle spielen. Modellierung der entzündlichen Milieus zugeordnet mütterliche Korpulenz ex Vivo durch Behandlung von primären menschlichen Trophoblasten mit TNF bietet eine Plattform für die Untersuchung der Auswirkungen der übergewichtigen intrauterine Umwelt zur Regulierung von kritischen Pfaden in Trophoblasten. Zur Änderung dieses Protokolls mit neuen und kombinatorische Behandlungen zur Rekapitulation der übergewichtigen Müttern Umwelt bieten eine spannende Allee um die Auswirkungen der mütterlichen Fettleibigkeit auf plazentaren Funktion zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren danken Frauen, die ihre Plazenta für diese Studie gespendet. Wir danken auch die Arbeit und Lieferung Abteilung OHSU mütterliche und fetale Research-Team für die Koordinierung der Sammlung der Plazenta. Wir sind dankbar für Eric Wang, Ph.d., und Kelly Kuo, MD für Unterstützung und helfen mit experimentellen Methoden und Optimierung.
Diese Arbeit wurde finanziert vom NIH HD076259A (morgens) und AHA GRNT29960007 (morgens).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
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