Summary
Presentamos es un protocolo para el muestreo de tejido velloso placentario humano seguido por el aislamiento de citotrofoblastos para el cultivo celular primario. Tratamiento de trofoblastos con TNFα recapitula la inflamación en el ambiente intrauterino obeso y facilita el descubrimiento de dianas moleculares regulados por inflamación en placentas con obesidad materna.
Abstract
Obesidad materna está asociada con un mayor riesgo de resultados perinatales adversos que son probablemente mediados por la comprometida función placentaria que puede atribuirse, en parte, la desregulación de la autofagia. Cambios aberrantes en la expresión de los reguladores de la autofagia en las placentas de embarazos obesos pueden ser regulados por procesos inflamatorios asociados con la obesidad y embarazo. Se describe aquí es un protocolo para toma de muestras de tejido velloso y aislamiento de citotrofoblastos velloso de la placenta humana de término para el cultivo celular primario. Esto es seguido por un método para simular el ambiente inflamatorio en el ambiente intrauterino obesidad por el tratamiento primarios trofoblastos de embarazos magros con el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), una citoquina proinflamatoria que está elevada en la obesidad y en embarazo. A través de la implementación del protocolo descrito aquí, se encuentra que la exposición a exógena TNFα regula la expresión de Rubicon, un regulador negativo de la autofagia en trofoblastos de la magros embarazos con fetos femeninos. Mientras que una variedad de factores biológicos en el ambiente intrauterino obeso mantienen el potencial de modular las vías críticas en trofoblastos, este sistema ex vivo es especialmente útil para determinar si los patrones de expresión observados en vivo en placentas humanas con obesidad materna son un resultado directo de la señalización de TNFα. En última instancia, este enfoque brinda la oportunidad de analizar las implicaciones reglamentarias y moleculares de inflamación asociados con la obesidad materna en autofagia y otras vías celulares críticos en trofoblastos que tienen el potencial de impacto función placentaria.
Introduction
La obesidad es un estado inflamatorio caracterizado por inflamación crónica de bajo grada, derivadas del exceso de tejido adiposo y la disponibilidad de nutrientes. En obesidad, citocinas proinflamatorias son elevados en los tejidos metabólicos así como sistémicamente en circulación. Un sólido cuerpo de evidencia ha demostrado que TNFα se eleva significativamente en el ámbito de la obesidad con implicaciones en la resistencia a la insulina y la disfunción metabólica1. Activación de TNFα también contribuye a la patogénesis de la enfermedad en condiciones como el cáncer y autoinmunidad, lo que es una diana terapéutica atractiva2.
Inflamación en la obesidad se ve agravada por el embarazo, también una proinflamatorias del estado3,4. Se ha demostrado previamente que contenido TNFα placentaria aumenta con la adiposidad materna en embarazos con fetos femeninos. Además, el tratamiento TNFα inhibe la respiración mitocondrial en células de trofoblasto femeninas pero no masculinas, lo que sugiere que TNFα está implicado en la regulación del metabolismo placentario en un dimorfismo sexual de la forma5. Obesidad materna está asociada con el aumento de la incidencia de una variedad de complicaciones durante el embarazo, incluyendo a parto muerto, con fetos masculinos, siendo los más susceptibles de3,6,7,8 . Debido a su papel clave en la interfase materno fetal, cambios en la capacidad funcional de la placenta en el ambiente intrauterino obesidad en respuesta a señales inflamatorias pueden desempeñar un papel importante en la mediación de los resultados de embarazos de obesos.
Citotrofoblastos y sincitiotrofoblastos en el tejido velloso de la placenta son críticos para la señalización endocrina y el intercambio de nutrientes y oxígeno entre la madre y el feto en desarrollo9. Alteraciones en la capacidad funcional de citotrofoblastos velloso (en lo sucesivo, trofoblastos) pueden comprometer la salud fetal y el desarrollo. Este protocolo describe un método para el muestreo de tejido velloso de la placenta de término humano por disección a las placas coriónicas y basals junto con un procedimiento optimizado para el aislamiento de trofoblastos para el cultivo celular primario. Este protocolo se deriva de metodologías establecidas que implica la digestión enzimática del tejido velloso para liberar las células de la matriz extracelular, seguido por centrifugación diferencial de densidad para aislar trofoblastos10, 11,12. Este detalles de protocolo un enfoque en que primaria trofoblastos de placentas de embarazos magros son tratados con medios de cultivo suplementados con TNFα para simular uno de los componentes del ambiente inflamatorio asociado con la obesidad materna. Por último, se describe un procedimiento simple para la recolección de lysates de la célula total de trofoblastos tratados con TNFα seguidas de Western blot para detectar cambios en la expresión génica.
Mientras que este modelo no recapitular el entorno obesogénico en el útero en su totalidad, ofrece un sistema controlado que permite analizar la contribución individual de la inflamación mediada por el TNFα ante los trofoblastos obesidad materna. Este modelo brinda la oportunidad de ambos para descubrir o confirmar dianas moleculares directamente reguladas por señalización de TNFα en trofoblastos como permite para probar si observaron cambios en los patrones de expresión génica en vivo en placentas con maternal la obesidad puede ser el resultado de la inflamación mediada por el TNFα.
El enfoque se describe aquí se implementó para probar el efecto de la inflamación mediada por el TNFα en la regulación de la autofagia en trofoblastos humanos. Trofoblastos de obesos embarazos con fetos masculinos exposición interrumpen facturación autophagic o autophagosome maduración13. Una proteína llamada Rubicón (RUN dominio proteína interacción Beclin1 y ricos en cisteína que contiene), que se localiza en los lisosomas y endosomas finales, se ha descrito recientemente como un "freno" en el proceso de autofagia facturación porque funciona como una negativa regulador de autophagosome maduración14,15. De hecho, el Rubicon es un raro ejemplo de una proteína que frena la autofagia, lo que lo convierte en un valioso objetivo terapéutico. Muy poca información está disponible sobre el significado fisiopatológico de Rubicon, excepto por sus papeles en la respuesta inmune innata a microbials16,17 y cardiomiocitos protección18. Utilizando el protocolo descrito aquí, se encuentra que el Rubicon es upregulated en trofoblastos femenino primarios en la respuesta al tratamiento con el aumento de las concentraciones de TNFα hasta 250 pg/mL. La regulación de Rubicon puede desempeñar un papel en cómo hembra fetos precio mejor que los machos en embarazos con obesidad materna. Recapitulando la inflamación asociada con la obesidad materna ex vivo exponiendo trofoblastos humanos a TNFα exógena proporciona una plataforma para estudiar el impacto del obesidad ambiente intrauterino en la regulación de las vías críticas en trofoblastos y por extensión, función placentaria.
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Protocol
la placenta se recogieron de la mano de obra y entrega de unidad en Hospital Universitario bajo un protocolo aprobado por el institucional de Junta de Oregon Health and Science University en Portland, Oregon, con el consentimiento informado de la pacientes.
1. colección de tejido placentario
- preparación de
Nota: todo el equipo que se encuentra el tejido debe ser estéril.- Esterilizar el equipo de disección en autoclave durante 60 min a 121 ° C.
- Utilizar equipo de protección personal (EPP): laboratorio capas/vestidos/exfoliantes, guantes y máscara con una careta o gafas de seguridad.
- Vuelta en baño de agua y a 37 ° C.
- Caliente dos tubos cónicos de 50 mL, cada que contiene 25 mL de medio completo (Iscove ' s Modified Dulbecco ' s suplementado con 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina, tabla 3) en un baño de agua de 37 ° C.
- Con el consentimiento informado del paciente, obtener una placenta inmediatamente después del parto por cesárea.
- Familiarizarse con la placenta. Se observan vasos sanguíneos irradiando hacia fuera desde el sitio de inserción del cordón umbilical y el cordón umbilical se inserta en el lado fetal (placa coriónica). El lado opuesto es el lado materno, o placa basal. Incluye la decidua y las estructuras que contienen árboles de vasos, llamados cotiledones.
- Toma de muestras de tejido velloso
Nota: debe ser muestreado tejido velloso de la placenta tan pronto como sea posible después del parto, preferiblemente en 30 minutos o menos.- Con la placa coriónica hacia arriba y suprimir secciones de espesor total de 2-3 (aproximadamente 2,5 cm x 2,5 cm de tamaño) 2-3 cm en de la periferia de la placenta al azar, utilizando pinzas y tijeras ( figura 1A).
Nota: Evitar partes de la placenta que aparecen anormales (es decir, blancas calcificaciones). - Recorte las placas coriónicas y basals y cualquier vasos sanguíneos grandes.
- Ponga el tejido velloso resultante ( figura 1B, total aproximadamente de 80-120 g) en medios completo calientes y empieza a aislamiento de trofoblasto dentro de 30 minutos de muestreo.
Nota: Algunas aplicaciones y ensayos posteriores son afectadas por la duración del período de latencia entre el nacimiento, muestreo y aislamiento de trofoblasto. Es mejor mantener estos períodos tan cortos como sea posible y consistente entre aislamientos. - Utilizando las técnicas descritas en los pasos 1.2.1 - 1.2.2, muestra 5 secciones al azar de 1 x 1 cm de tejido velloso a través de la placenta (incluyendo el centro).
- Corte cada muestra de tejido velloso de 1 cm x 1 cm en 4-5 trozos más pequeños (aproximadamente 30 mg cada una), colocar en tubos de microcentrífuga de 2 mL y flash freeze en líquido N 2. Tienda a-80 ° C para su uso en análisis más adelante.
- Con la placa coriónica hacia arriba y suprimir secciones de espesor total de 2-3 (aproximadamente 2,5 cm x 2,5 cm de tamaño) 2-3 cm en de la periferia de la placenta al azar, utilizando pinzas y tijeras ( figura 1A).
2. Aislamiento de trofoblastos del tejido velloso
- preparación de
Nota: utilizar material estéril y realizar procedimientos que involucran células en campana de flujo laminar.- Deshielo cuatro gradientes de densidad congelados (tabla 1, ver tabla de suministros esenciales, reactivos y equipo, material complementario) a 4 ° C la noche antes de la placenta llega.
Nota: Alternativamente, gradientes de densidad se pueden hacer en el día del aislamiento. - Vuelta en centrífuga y a 20 ° C.
Nota: Todos los pasos de centrifugación son en máxima aceleración y desaceleración a menos que se especifique lo contrario. - Prepare 1 x solución salina tamponada con HEPES (HBSS) suplementado con Ca + 2 y Mg + 2 (tabla 3).
- Tripsina caliente a 37 ° C.
- DNasa diluir a aproximadamente 2720 kilounits/mL en estéril suplido HBSS.
- Caliente 50 mL de suero de recién nacidos (NCS) a 37 ° C.
- Caliente media completa a 37 ° C.
- Caliente media congelación (90% de SBF, 10% DMSO, tabla 3) a 37 ° C.
PRECAUCIÓN: DMSO es tóxica y debe manipularse con guantes.
Buffer de - preparar la digestión (tabla 2 y 3) mediante la mezcla de 308 mL de suplido HBSS, 50 mL de tripsina (3751.7 y unidades/mL) y 0.5 mL de DNasa (379.4 kilounits/mL) en una botella estéril.
Nota: El tiempo aproximado necesario para aislar las células del tejido velloso es 7 h.
- Deshielo cuatro gradientes de densidad congelados (tabla 1, ver tabla de suministros esenciales, reactivos y equipo, material complementario) a 4 ° C la noche antes de la placenta llega.
- Procesamiento del tejido velloso
- enjuague cada pieza de tejido velloso en un tubo cónico de 50 mL llena con temperatura ambiente fosfato tampón salino (PBS). Repita y cambie el PBS como sea necesario hasta retira el exceso de sangre (enjuague de PBS será rojo claro o rosado cuando el tejido es completamente aclarado).
- Colocar el tejido velloso en una placa Petri estéril y eliminar fuera de muchos vasos sanguíneos posible raspando suavemente el tejido velloso suave de los vasos con un portaobjetos de microscopio.
- Pique finamente el tejido velloso resultante usando tijeras.
- Digestión de tejido velloso y aislamiento bruto de trofoblastos
- transferir el tejido velloso picadito a un frasco estéril con solución de digestión según los volúmenes calculados basados en la actividad específica de la tripsina y ADNasa (165 mL, tabla 2).
- Después de 35 min de incubación en baño de agua de 37 ° C con agitación a 70 revoluciones por minuto (rpm), incline la botella de la digestión a su lado y deje que las piezas no digeridas del tejido para colocar en la parte inferior de la botella. Elaborar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta serológica, evitando el tejido colocado.
- Dispensar el sobrenadante a través de un tamiz de celular 100 μm igualmente entre tubos cónicos de 50 mL.
Nota: Para ahorrar tiempo, es recomendable comenzar la segunda digestión por adición de solución de digestión (110 mL, tabla 2) para el restante colocó tejido y reasumir la incubación como se describe en el paso 2.3.2. - Capa suavemente 3-5 mL de NCS debajo el sobrenadante filtrado por dispensación lentamente de una pipeta serológica en la parte inferior del tubo. Un menisco entre el sobrenadante filtrado (que contiene los trofoblastos) y NCS debe ser visible ( figura 2A).
- Centrifugar el sobrenadante sobre NCS a 1.250 x g durante 15 min a 20 ° C. El pellet resultante incluye células de sangre rojas en la capa inferior seguida por una capa blanca que contiene las células del trofoblasto ( figura 2B).
- Repita 2.3.2 - 2.3.5 para cada uno de las segunda y terceros las digestiones (adición de 110 mL y 83,5 m, respectivamente, de solución de digestión a la botella de tejido, tabla 2).
- Todos los sobrenadantes han sido centrifugados, resuspender cada precipitado en 5 mL de medio completo caliente y luego las suspensiones de la piscina juntos.
- Partido de la suspensión de células entre dos tubos cónicos de 50 mL y centrifugar a 1.250 x g durante 15 min a 20 ° C.
- Suavemente Quite el sobrenadante y resuspender cada uno de los pellets de células en 6 mL de caliente compllos medios de comunicación ETE.
- Densidad centrifugación
- dividir la suspensión de células equitativamente entre cuatro gradientes de densidad (3 mL) por lenta y cuidadosamente acodar la suspensión de células en la parte superior de los gradientes de densidad con una pipeta de transferencia.
- Centrifugar los gradientes de densidad 1.250 x g por 20 min a 20 ° C con mínima aceleración y desaceleración. Esto debe producir bandas distinguibles de las células sedimentadas (tabla 4).
- Lentamente y con cuidado quitar las capas superiores de densidad gradiente los medios de comunicación (DGM) hasta las bandas opacas que contiene células de trofoblasto (entre 35-50% DGM) (tabla 4).
- Transferencia de las bandas de trofoblasto en dos tubos cónicos de 50 mL y llenar con medios completo calientes.
- Invertir suavemente los tubos 3 - 6 veces para mezclar y centrifugar a 1.250 x g durante 15 min a 20 ° C.
- Quite el sobrenadante y resuspender cada precipitado de células en 5 mL de medio completo caliente. Combinar las suspensiones celulares y contar las células viables usando un hemocitómetro y Trypan azul (o célula recomendado: método de conteo).
- Contar las células con un hemocitómetro
- mezcle la suspensión de células mediante pipeteo arriba y abajo con una pipeta serológica o suavemente invirtiendo el tubo varias veces.
- Combinar partes iguales de la suspensión celular y Trypan blue (es decir, 20 μl cada una) en un tubo separado y mezclar suavemente.
- Incubar durante 1-2 min a temperatura ambiente.
- Suavemente dispensar 15-20 μl de la célula-Trypan azul mezcla entre el cubreobjetos y el hemocitómetro y permitir que las células se difunden a través de la red por la acción capilar.
- Contar células viables (las células muertas se teñido azul profundo) en cada uno de los cuadrantes de cuatro 4 x 4 con un contador de cuenta. Emplear un sistema de conteo asegurar que las células no se cuentan más de una vez (es decir, no cuentan las células que tocan la parte inferior o izquierdas límites).
Nota: Cada cuadrante de 4 x 4 debe contener entre 50-150 células. Demasiados o demasiados pocos células pueden llevar a una sobre o subestimación del número de celular. - Media del recuento total de cada uno de los cuadrantes de 4 x 4, multiplicar por 10 4 y luego multiplicar por el factor de dilución (suspensión de células a azul de tripán) para calcular el número de células por mL.
- Multiplicar el número de células por mL por el volumen total de la suspensión celular para calcular el rendimiento total celular.
Nota: Se esperan aproximadamente 100 millones células de aislamientos a partir de 80-120 g de tejido velloso.
- Las células de la galjanoplastia
- placa 3 millones células/pozo (3.3 x 10 5 células por cm 2) en una placa de 6 pozos (2 mL de la suspensión por pozo) y suavemente balancee hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado para distribuir las células.
Nota: Trofoblastos requieren placas de cultivo de tejidos tratado para adherirse correctamente. Una monocapa de células es necesaria para promover la syncytialization. - Deja las células plateadas en la campana de flujo laminar durante aproximadamente 30 minutos permitir que las células para distribuir uniformemente, colocar y comienzan a adherirse a la parte inferior de los pocillos antes de colocarlos en la incubadora.
- Células en cultivo hasta 72 h (con cambios diarios de media) en una incubadora de 37 ° C con 5% CO 2 y 95% de humedad.
Nota: Examine los trofoblastos bajo un microscopio en 10-20 x cada 24 h de cultivo. Trofoblastos no proliferan y no pasados. En el transcurso de 72 h de la cultura, los trophoblasts individuales redondeos fusionan para formar un sincitio ( Figura 3A y B).
- placa 3 millones células/pozo (3.3 x 10 5 células por cm 2) en una placa de 6 pozos (2 mL de la suspensión por pozo) y suavemente balancee hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado para distribuir las células.
- Células de congelación
- Pellet sin usar las células por centrifugación a 1.250 x g durante 10 min a 20 ° C.
- Aspirar tanto los medios como sea posible de la pelotilla de.
- Resuspender el precipitado en congelación media (cuadro 3).
- Congelar alícuotas a-80 ° C en un recipiente congelación llenado de isopropanol al 100%. Transferencia las alícuotas congeladas a líquido N 2 al día siguiente para almacenamiento a largo plazo.
Nota: Las células pueden cultivarse después de congelar.
- Descongelar células
- sacar una alícuota de células congeladas y descongelar en baño de agua de 37 ° C mientras se arremolinan. Eliminar la alícuota del baño justo antes de que completamente descongelado a un líquido.
- Transferir inmediatamente las células descongeladas a un tubo cónico de 15 ml. Principio de frenar al principio, agregar 10 mL de medio completo con mezcla intermitente.
- Invertir el tubo varias veces para mezclar.
- Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 20 ° C.
- Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 2-5 mL de medios completo calientes.
- Contar las células y la placa como se ha descrito.
3. Tratamiento de Trophoblasts primaria con TNFα, colección de Lysates de la célula y Western Blotting
- preparación de
- caliente media completa a 37 ° C.
- Hacer un stock de 10 μg/mL de TNFα en los medios de comunicación completa y conservar a-20 ° C hasta que esté listo para uso.
- Hacer un 1 μg/mL bolsa de trabajo de TNFα en medios completo cuando esté listo para el tratamiento de las células. Serie diluir la acción TNFα trabajo 4 10 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL y 125 pg/mL en medios completo.
Nota: La concentración de TNFα de 10 4 pg/mL es moderadamente citotóxica. Ajuste de las concentraciones de TNFα prueba dependerá de las características específicas de las aplicaciones de bajada deseadas.
- Tratamiento de células con TNFα
- después de 24 h de cultivo, aspirar el medio de cultivo de las células y reemplazar con 2 mL de TNFα suplido medios por pozo en placas de 6 pocillos (por lo menos dos pozos por tratamiento y vehículo control).
- Después de 24 h de exposición de TNFα (48 h de la cultura), sustituir los medios de comunicación TNFα complementado con medios completo.
- Cosecha de células y proteínas totales
- después de 72 h de cultivo (24 h pasado retiro de TNFα), aspirar los medios de comunicación, enjuague suavemente las células con PBS temperatura y añadir 80 μl de frío hielo ensayo de radioinmunoprecipitación Tampón (RIPA) que contiene recién añadido inhibidores de la proteasa y fosfatasa (tabla 3) directamente a cada pocillo.
- Extraer las células de la placa con un raspador celular. Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, agrupación de pozos dentro de los grupos de tratamiento.
- Lyse las células con un vórtex los tubos en alta durante al menos tres intervalos de 15 s.
- Incubar a las células a 4 ° C con oscilación durante 15 minutos
Nota: como alternativa, después paso 3.3.3., las células pueden ser incubadas en hielo durante 15 min con agitación intermitente por sacudiendo el tubo Vortex, o pipeteando arriba yWN. - Repetir paso 3.3.3.
- Centrifugar los tubos a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C para que sedimenten la ruina celular.
- Traslado el sobrenadante (que contiene proteína celular) a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y conservar a -80 ° C.
Nota: El protocolo puede ser detenido aquí y reanudó más tarde. Es recomendable hacer varias alícuotas de las muestras de proteína celular para evitar múltiples ciclos de hielo-deshielo. - Determinar la concentración de proteínas totales por el método preferido, como un ensayo de ácido bicinchoninic (BCA, ver tabla de suministros esenciales, reactivos y equipo, material complementario).
- SDS-PAGE y Western blot para el Rubicon o proteínas de interés
Nota: seguir Western Blot protocolos según fabricante ' instrucciones mediante un sistema de laboratorio preferido. Gel- carga entre 20-40 μg de proteína total en el tampón de muestra (tabla 3) por pozo en una 12% de acrilamida. Separar proteínas por SDS-PAGE en la gestión de memoria intermedia (cuadro 3).
- Mojado-transferencia de las proteínas desde el gel a una membrana de polivinilideno difluoruro (PVDF) según el fabricante ' instrucciones en tampón de transferencia (tabla 3).
- Incubar la membrana en leche en polvo 5% en solución salina Tris-Buffered con 0,1% Tween 20 (TBST, tabla 3) durante al menos 1 h a temperatura ambiente con mecedora.
- Incubar la membrana de un anticuerpo primario de Rubicon (ver tabla de suministros esenciales, reactivos y equipo, material complementario) a 1: 500 en 1% leche en polvo en TBST durante la noche a 4 ° C con oscilación.
- Lave suavemente la membrana 3 veces, 5 minutos en TBST y 1 veces, 5 minutos en TBS a temperatura ambiente con mecedora.
- Incubar la membrana de 1: 2000 - 1: 5000 de anticuerpo secundario (conjugado visible ligados por la HRP o preferida, ver la tabla de los suministros esenciales, reactivos y equipo, material complementario) en 5% leche en polvo en TBST durante al menos 1 h a temperatura ambiente con mecedora.
- Repetir el procedimiento de lavado descrito en paso 3.4.5 y visualizar la mancha con un visualización apropiada (es decir, quimioluminiscencia) de sustrato en un sistema de proyección de imagen.
- Repetir el procedimiento de lavado descrito en paso 3.4.5 y probe la membrana para β-actina o un control de carga recomendado: según fabricante ' instrucciones s.
- En software de análisis de imagen preferida, analizar la expresión de Rubicon por cuantificación manual de absorbancia (intensidad de la banda), sustracción de absorbancia de fondo y la normalización de la carga correspondiente control de intensidad de la banda. Realizar análisis estadísticos como adecuados detectar cambios estadísticamente significativos en niveles de proteína.
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Representative Results
Término de placentas humanas de lean (índice de masa corporal antes del embarazo (IMC) < 25) las madres con embarazos sin complicaciones con descendencia femenina fueron recogidas y muestreadas a 15 minutos del parto por cesárea (no laboral). Las placentas se examinaron de la ausencia de calcificaciones y desarrollo típico: pesa entre 300-600 g con el cordón umbilical y membranas quitadas, redondo en la forma, entre 15-25 cm de diámetro y el cordón umbilical insertado en el centro de la placenta. Tejido velloso fue disecada de las placas coriónicas y basals en muestras de 2-3 de a través de la placenta (figura 1), que rinde aproximadamente 100 g de tejido velloso como material para el aislamiento primario del trofoblasto de la partida. A 20 minutos de muestreo tejido velloso, se inició el procedimiento para aislar trofoblastos primarias como se describe aquí, rindiendo entre 0.8 - 1 x 108 células viables. Las células fueron sembradas en placas de cultivo de 6 pozos a una densidad de 3 x 106 (3.3 x 105 células por cm2). Después de 24 h de cultivo, las células fueron examinadas bajo un microscopio para la fijación y morfología adecuada trofoblasto fue confirmada (individual células redondas). Los medios de cultivo fue reemplazado por medio completo que contiene una serie de concentraciones de TNFα entre 125-104 pg/mL para que al menos dos pozos fueron incluidos por la concentración y el control del vehículo (sólo media completa).
Veinticuatro horas después del TNFα-tratamiento (48 horas de cultura), todos los medios TNFα fueron substituidos por medios completo. Se observó ninguna muerte celular apreciable debido al tratamiento con TNFα en concentraciones en o por debajo de 10 pg/mL de3 . El tratamiento con 104 pg/mL TNFα era moderadamente citotóxico y los efectos citotóxicos de la concentración de TNFα persisten después de que los medios de comunicación fue cambiado según lo evidenciado por el análisis de lactato deshidrogenasa (LDH) (datos no mostrados). A las 72 h de cultivo, las células fueron examinadas para syncytialization bajo un microscopio. Inmunocitoquímica para syncytialization y la contaminación del fibroblasto reveló aislamiento relativamente puro de trofoblastos (figura 3). Lisados celulares se cosecharon según el protocolo descrito aquí, que rinde entre 3-8 μg/μl de proteínas totales por preparación según lo determinado por un ensayo BCA (datos no mostrados). Mancha blanca /negra occidental análisis en lysates de la célula de trofoblastos hembra tratados con TNFα demostró mayor un upregulation de expresión Rubicon en respuesta a concentraciones de TNFα hasta 250 pg/mL y posterior desregulación de la expresión de Rubicon en concentraciones de TNFα a 250 pg/mL (Figura 4A y B, 10 pg/mL4 excluido del análisis basado en efectos citotóxicos). Asimismo, Rubicon es significativamente upregulated en biopsias de tejido velloso flash-congeladas de placentas de obesos embarazos con fetos femeninos, comparados a los controles de inclinación como se evidencia por análisis de Western blot (figura 4 y D, n = 6 clase de placentas por BMI, ANOVA, P < 0.05).
| Concentración (%) | 90% DGM (ml) | 1 x HBSS (ml) | Espesor de la capa (ml) |
| 4 gradiente de x | 4 gradiente de x | Total 34,5 ml | |
| 70 | 14 | 4 | 4.5 |
| 60 | 8 | 4 | 3 |
| 55 | 7.33 | 4.67 | 3 |
| 50 | 3.34 | 2.67 | 3 |
| 45 | 6 | 6 | 3 (marca 13,5 ml) |
| 40 | 5.33 | 6.67 | 3 |
| 35 | 4.67 | 7.33 | 3 (marca de 19,5 ml) |
| 30 | 8 | 16 | 6 |
| 20 | 2.67 | 9.33 | 3 |
| 10 | 1.33 | 10.67 | 3 |
Tabla 1. Especificaciones para la fabricación de gradientes de densidad para la centrifugación de la densidad de trofoblastos primarias.
De izquierda a derecha, columna uno especifica medios gradiente de densidad (DGM, ver tabla de suministros esenciales, reactivos y equipo, material complementario) concentración expresada como porcentajes de la DGM en HBSS. Columna dos especifica el volumen de DGM mientras que columna tres especifica el volumen de HBSS necesaria para hacer el porcentaje adecuado de solución de la DGM. Columna cuatro especifica el volumen en el tubo cónico de 50 mL para crear el degradado, comenzando con la capa más densa.
| Tripsina | HBSS | DNasa | ||
| Digestión | (actividad total; Unidades de y) | volumen (ml) | (actividad total; Kunits) | Volumen total /digestion |
| 1 | 619037 (23,01 ml) | 141,76 ml | 62594 (0,230 ml) | 165 ml |
| 2 | 412691 (15,34 ml) | 94,51 ml | 41729 (0,154 ml) | 110 ml |
| 3 | 313270 (ml 11,65) | 71,74 ml | 31676 (0,116 ml) | 83,5 ml |
| Total | 1345000 (50 ml) | 308 ml | 136000 (0,5 ml) | 358,5 ml |
Tabla 2. Especificaciones para la preparación de la solución de digestión para el aislamiento del trofoblasto primario basado en la actividad específica de DNasa y tripsina.
De izquierda a derecha, la primera columna especifica el número de las digestiones, la segunda columna especifica la actividad de tripsina requerida por la digestión, la tercera columna especifica el volumen total de HBSS suplementado a añadir para la digestión apropiada, la cuarta columna especifica la actividad de la ADNasa requerida por la digestión, y la última columna especifica el volumen de solución de digestión queañadido en el tejido placentario para la digestión apropiada.
| HBSS (complementado con Ca+ 2 y Mg+ 2) | Tampón de muestra |
| 10% 10 x HBSS | 90% tinte de X Laemmli 4 |
| 1,26 mM CaCl2 (anhí.) | 10% 2-Mercaptoetanol |
| 0,80 mM de MgSO4 (anhí.) | |
| 20,77 mM HEPES | |
| pH a 7,4 con NaOH 10N Volumen hasta 1 L con ddH2O estéril Filtro estéril en una botella estéril |
|
| Media completa | Buffer de ejecución |
| Quitar 11% v/v IMDM | 25 mM Tris Base |
| Agregar 10% v/v FBS | 190 mM glicina |
| Agregar 1% 10.000 U/mL de penicilina/estreptomicina (100 U/mL final) | 0.1% SDS |
| pH a 8.3 | |
| Medios de congelación | |
| 90% v/v FBS | Tampón de transferencia |
| 10% v/v DMSO | 25 mM Tris |
| 190 mM glicina | |
| Tampón de digestión | 20% metanol |
| 50 mL de tripsina (26.900 y unidades/mL) | pH a 8.3 |
| 0,5 mL de DNasa (272.000 K unidades/mL) | |
| Traer a 358,5 ml en HBSS suplementado | TBS |
| 20 mM Tris | |
| Almacenador intermediario RIPA | 150 mM NaCl |
| 25 mM Tris-HCl | pH a 7,6 |
| 5 mM EDTA | |
| 150 mM NaCl | TBST |
| 0.1% SDS | TBS con 0.1% de Tween 20 |
| 0,5 desoxicolato de sodio % | |
| 1% Tritón X-100 | |
| 1 tableta de inhibidor de la proteasa/fosfatasa por 10 ml RIPA Buffer |
Tabla 3. Soluciones necesarias para el aislamiento y cultivo de trofoblastos primaria seguida por Western Blotting.
| % DGM | marca de ml | Tipo de la célula |
| 10 | 31.5-34.5 | Residuos |
| 20 | 28.5-31.5 | |
| 30 | 22.5-28.5 | |
| 35 | 19.5 22.5 | Trofoblastos |
| 40 | 16.5-19.5 | |
| 45 | 13.5-16.5 | |
| 50 | 10.5-13.5 | Linfocitos |
| 55 | 7.5-10.5 | |
| 60 | 4.5-7.5 | Células de sangre rojas |
| 70 | Por debajo de 4.5 |
Tabla 4. Sedimentación de trofoblastos por densidad centrifugación.
De izquierda a derecha, la primera columna especifica el porcentaje de DGM (tabla 1), la segunda columna especifica la marca de mL donde el porcentaje correspondiente de la DGM se encuentra en un tubo cónico de 50 mL, y la tercera columna especifica qué sedimentos de tipo celular en el porcentaje correspondiente de marca DGM y mL en un tubo cónico de 50 mL. Sedimento de trofoblastos entre DGM 50-35%, formando distintas bandas opacas. Recogida de DGM por encima o por debajo de esta gama dará como resultado contaminación de restos celulares y otros tipos de células como los linfocitos.
Figura 1. Tejido velloso es aislado de la Placenta humana término mediante la eliminación de las placas basales y coriónica.
A) con la placa coriónica (cara fetal) hacia arriba, una muestra de espesor completo es suprimida de la placenta. B) una muestra de tejido velloso se obtiene mediante la eliminación de las placas coriónicas y basals. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Centrifugación de las células en solución de digestión en suero de recién nacidos da lugar a un precipitado varias capas de células.
A) suero de recién nacido (NCS) es capas por debajo de la suspensión de células en solución de análisis en un tubo cónico de 50 mL. B) centrifugación de (A) resulta en un sedimento de varias capas celulares. La capa inferior es profundo de color rojo y consiste en glóbulos rojos. La capa superior incluye trofoblastos y es blanco o beige en color. El trofoblasto capa es NCS seguido de solución de digestión (sobrenadante) a la parte superior del tubo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Immunocytological análisis de Syncytialization y contenido de fibroblastos en cultivos de trofoblasto humano primario.
A) imagen representativa de la citoqueratina-7 (roja) en cytotrophoblasts después de 24 h de cultivo. B) imagen representativa de la citoqueratina-7 (roja) en sincitiotrofoblastos después de 72 h de la cultura muestra masas multinucleadas de células que se han fusionado. C) imagen representativa del Vimentin (rojo) en sincitiotrofoblastos después de 72 h de la cultura. Se adquirieron imágenes en un microscopio de fluorescencia con contratinción nuclear DAPI (azul). Visualizado con 10 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Regulación de la expresión de Rubicon en respuesta a tratamiento de TNFα en trofoblastos femenino y Rubicon endógena expresión en tejido velloso de Lean Versus obesidad embarazos con fetos femeninos.
Trofoblastos primarias de placentas de término de madres lean con embarazos saludables llevar un feto femenino aislados y fueron tratados con 125, 250, 500, 103y4 10 pg/mL TNFα (o el control del vehículo). A) representante Western blot de Rubicon en lisados de trofoblasto hembra tratados con TNFα. Fue utilizado β-actina como control de carga. B) expresión de Rubicon en respuesta al tratamiento de TNFα en trofoblastos femenino fue cuantificado de manchas blancas /negras occidentales y normalizado a β-actina. Los valores son expresión de Rubicon promedio por la concentración de TNFα ± S.E. en n = 3 placentas. C) Western blots de Rubicon en lisados de tejidos todo Flash frozen biopsias de tejido velloso lean versus obesidad embarazos con fetos femeninos (F1-F12). Lactato deshidrogenasa A (LDHA) fue utilizado como un control de carga. D) Rubicon expresión en Western blots de (C) fue cuantificado y normalizado a LDHA. Los valores son expresión media de Rubicon por índice de masa corporal clasificación ± S.E. en n = 6 placentas por clase IMC (ANOVA, * P < 0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La placenta, responsable de regular el crecimiento del feto, exhibe función comprometida en el ambiente obesidad6. A pesar de las altas demandas metabólicas de trofoblastos, placentas con obesidad materna presentan respiración mitocondrial disfuncional6,19. Cambios en el metabolismo placentario pueden contribuir a la mayor incidencia de complicaciones y los resultados fetales adversos observados en embarazos obesos3,6,7. La autofagia también está comprometida en placentas con obesidad materna. Placentas de obesos embarazos con fetos masculinos demuestran flujo autophagic disfuncional que se manifiesta por la acumulación de autophagosomes13. Mantener el óptimo flujo de autofagia es fundamental para la homeostasis celular y autofagia defectuosa en placentas con obesidad materna puede desempeñar un papel importante en la mediación de los efectos adversos asociados con los embarazos obesos.
La causa precisa de la función placentaria comprometida en obesidad materna no está bien entendida y puede tener su origen en la señalización inflamatoria. Obesidad y embarazo son Estados proinflamatorios que se caracterizan por niveles elevados de TNFα1,4,20,21en circulación. TNFα es un activador de autofagia22,23y puede mediar cambios en el flujo de autofagia en las placentas de embarazos obesos. TNFα se utiliza habitualmente para estudiar los efectos de la inflamación en las células, especialmente en el contexto del cáncer2. El protocolo presentado aquí adapta este enfoque para estudiar los efectos de la inflamación relacionada con la obesidad en la capacidad funcional de la placenta por tratamiento primarios trofoblastos con TNFα exógena en la cultura.
Este protocolo consta de cuatro componentes principales: muestreo del tejido velloso de la placenta, aislamiento de trofoblastos primarias del tejido velloso, cultura de trofoblastos primarias seguida de tratamiento de TNFα y colección de Lisados celulares total seguida de Mancha blanca /negra occidental análisis para medir la expresión de una proteína de interés. Para aislar el trofoblastos puros, es fundamental que las placas coriónicas y basals se disecan cuidadosamente lejos del tejido velloso durante el muestreo de la placenta (figura 1B). También es imprescindible que tejido velloso es procesada de manera oportuna (es decir, dentro de 30 minutos de la entrega). Este protocolo detalla el uso de tres pasos de digestión, cada 35 minutos de duración, para liberar el trofoblastos de la matriz extracelular del tejido velloso. Digestiones más el riesgo de dañar las células por tripsinización de proteínas de la superficie de la célula. Aumentar el número de resúmenes no apreciable aumenta el rendimiento final de trofoblastos viables. Sin embargo, disminuyendo el tiempo y el número de las digestiones se traducirá en rendimiento celular disminuida (Simon, Bucher y Maloyan, datos no publicados). Este protocolo fiable produce aproximadamente 100 millones células de 80-120 gramos de tejido velloso.
Hay variabilidad en el número de bandas de trofoblasto distinguibles en los gradientes de densidad entre aislamientos. Para evitar la contaminación de otros tipos de células, es importante recoger estrictamente las bandas que contienen trofoblastos en el gradiente de densidad (tabla 4). Se ha optimizado el protocolo detallado aquí de métodos previamente establecidos que trofoblastos relativamente puros con menos del 5% contaminación de otra célula mecanografía10,11,12. Purificación posterior se logra por selección positiva o negativa24. Sin embargo, este enfoque corre el riesgo de reducir la producción de trofoblastos viables. Análisis de immunocytochemical de citoqueratina 7 en trofoblastos primarios aislado utilizando el procedimiento presentado aquí después de 24 y 72 h de tiempo de la cultura confirmó que las células experimentaron syncytialization según lo evidenciado por la presencia de masas de células multinucleadas a las 72 h, un evento distintivo de la vida útil de un trofoblasto (Figura 3A y B). Además, análisis de immunocytochemical de vimentina en trofoblastos primarias cultivadas durante 72 h revelaron pocos fibroblastos contaminantes (figura 3). Para propósitos de rutina, la pureza de trofoblastos puede ser monitoreada en cultura de evaluación morfológica simple. A las 24 h de tiempo de la cultura, ronda los citotrofoblastos dominan la cultura. Citotrofoblastos someterse a syncytialization después de 72 h de la cultura, resultando en grupos de células fusionadas. El tipo más común de células contaminantes encontrado en esta cultura es el fibroblasto o célula endotelial, que son alargadas y poligonales en forma, respectivamente. Estas funciones pueden controlarse aproximadamente utilizando un microscopio luminoso.
Tratamiento primarios trofoblastos con TNFα proporciona un sistema controlado que permite medir el efecto de TNFα de señalización en la regulación de las vías críticas en trofoblastos. Naturalmente, hay factores que no sean de TNFα en el ambiente materno obesa en vivo que pueden ser responsables de la modulación de la función del trofoblasto. Estos incluyen pero no están limitados a las señales hormonales, hiperlipidemia y un anfitrión de otros factores proinflammatory del25. Combinaciones de diferentes tratamientos más que recapitular el ambiente intrauterino obeso ex vivo de una forma precisa más fisiológico. Las concentraciones de TNFα exógena se usa para tratar trofoblastos en este protocolo hasta ahora superan los circulando normalmente en vivo. Las concentraciones séricas se han divulgado para llegar a 20 ng/mL o superior en ciertas condiciones inflamatorias26. Para obtener una respuesta medible por métodos de laboratorio actuales (es decir, Western blotting), es necesario amplificar las concentraciones de TNFα para revelar cambios en la expresión de genes y vías de interés. Estas respuestas pueden existir en vivo en menor medida. Sin embargo, podría sin embargo impacto significativo en la función de trofoblastos. Exposición de trofoblastos a altas concentraciones de TNFα corre el riesgo de producir artefactos en la expresión génica y análisis de la vía que pueden basarse en efectos citotóxicos. Se observó citotoxicidad moderada en trofoblastos expuestos a 10 medios TNFα suplido4 pg/mL por 24 h, según lo evidenciado por ensayos de citotoxicidad LDH (datos no mostrados). Sin embargo, las concentraciones en o por debajo de 103 pg/mL TNFα no produjo ninguna muerte celular apreciable.
Prueba de las concentraciones de TNFα en intervalos más pequeños o que son inferiores a lo que se describe aquí puede ser mejor seguida cuantitativareacción en cadena de polimerasa (qPCR) para análisis de expresión génica, una técnica ideal para la detección de pequeños cambios en la expresión génica. Mientras qPCR específicamente las pruebas para los niveles de expresión génica a nivel transcripcional, Western Blot detecta los niveles finales de productos proteicos que están probablemente disponibles para llevar a cabo sus tareas celulares. Usando ambas técnicas en conjunto es un poderoso enfoque para determinar el impacto del tratamiento de TNFα en la regulación de los niveles de expresión génica así como para determinar si cambios en niveles de expresión son el resultado de transcripcional, regulación postranscripcional o poste-de translación. El estrés inflamatorio puede afectar syncytialization, morfología y comportamiento del trofoblasto. Incluyendo evaluaciones morfológicas (es decir, inmunocitoquímica) además de aproximaciones analíticas moleculares proporcionará un análisis más exhaustivo de los efectos de la exposición TNFα en la salud de trofoblasto. Ajuste de los ensayos TNFα concentraciones probados y aguas abajo según demandas experimentales es recomendable.
Implementando el protocolo descrito aquí, se encuentra inflamación mediada por el TNFα que regular al alza la expresión de Rubicon en trofoblastos humanos lean embarazos con fetos femeninos. Western blot para Rubicon en trofoblasto lisados revelaron dos vendas distintas cerca y por encima del peso molecular esperado de 140 kDa (Figura 4A). Hay pruebas que sugieren que la banda inferior es inespecífica (pAb anti-Rubicon PD047, hoja de datos MBL, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). Los trofoblastos de las hembras demostraron la capacidad que regular al alza la expresión de Rubicon en respuesta al tratamiento de TNFα de concentraciones hasta 250 pg/mL. En concentraciones superiores a esta, expresión de Rubicon disminuyó los niveles hacia la línea de base (control sin tratamiento) e incluso por debajo (Figura 4B, n = 3). Dado que el tratamiento de trofoblastos de embarazos magros con TNFα simula inflamación en el ambiente intrauterino obeso, este resultado es complementaria a la conclusión que Rubicon es significativamente upregulated en biopsias de tejido velloso flash-congeladas de placentas de obesos embarazos con fetos femeninos, comparados a los controles de inclinación (figura 4 y D, ANOVA, n = 6 por clase IMC, P < 0.05).
Mientras que el flujo de autofagia parece no diferencian en trofoblastos de obesos embarazos con fetos femeninos, comparados a los controles de inclinación, trofoblastos de obesos embarazos con fetos masculinos exhiben activación de la formación y acumulación de autophagosomes 13. Rubicon es un regulador negativo de la autofagia, donde actúa para detener la fusión de lisosomas autophagosome27. Trofoblastos femenino pueden alza la expresión de Rubicon como un mecanismo compensatorio o de protección contra la inflamación mediada por el TNFα, que puede activar la autofagia22, lo que les permite mantener el flujo autophagic lean-como en el ajuste de obesidad materna. Esta respuesta en la placenta puede desempeñar un papel en cómo hembra fetos precio mejor que los varones en el ambiente intrauterino obesidad. Modelar el ambiente inflamatorio asociado con obesidad materna ex vivo mediante tratamiento primarios trofoblastos humanos con TNFα proporciona una plataforma para estudiar los efectos del obesidad ambiente intrauterino en la regulación de las vías críticas en trofoblastos. Modificación de este protocolo con tratamientos nuevos y combinatorios dirigidos a recapitular el ambiente materno obeso proporcionará una vía interesante para estudiar los efectos de la obesidad materna en la función placentaria.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a las mujeres que donaron sus placentas para este estudio. También agradecemos el trabajo y entrega Departamento OHSU y Maternal y Fetal equipo de investigación de la coordinación de la colección de placentas. Agradecemos a Eric Wang, pH.d. y Kelly Kuo, MD por apoyo y ayuda con métodos experimentales y optimización.
Este trabajo fue financiado por los NIH HD076259A (AM) y AHA GRNT29960007 (AM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X HBSS | Gibco | 14185-052 | |
| CaCl2 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | C1016-100G | |
| MgSO4 (anhyd.) | Sigma-Aldrich | M7506-500G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Trypsin | Gibco | 15090-046 | |
| DNAse | Worthington Biochemical Corp. | LS002139 | |
| Protease/Phosphatase inhibitors | Thermofisher Scientific | 88668 | |
| Tris HCl | Invitrogen | 15506-017 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576-028 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| SDS | Fisher Scientific | BP166-600 | |
| Sodium deoxycholate. | Fisher Scientific | AAJ6228822 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco | 12440-046 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Neonatal Calf Serum (NCS) | Gibco | 26010-074 | |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140-122 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | 23-427-098 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| TNFα | Sigma-Aldrich | SRP3177-50UG | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 70013-032 | |
| K2EDTA vacutainer blood collection tubes | BD | 366450 | |
| Percoll (Density Gradient Media, DGM) | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 6 well plates | Corning | 353046 | |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural | Fisher Scientific | 22363352 | |
| Trypan Blue | Corning | 25-900-Cl | |
| Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System | Bio-Rad | 1658001FC | |
| Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad | 1658033 | |
| TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% | Bio-Rad | 1610175 | |
| Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber | Bio-Rad | 1654112 | |
| 4X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148-100ML | |
| Glycine | Bio-Rad | 1610718 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ML | |
| Instant Nonfat Dry Milk | Carnation | ||
| Rubicon (D9F7) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | 8465S | |
| Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | A2228-100UL | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7074S | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signalling Technology | 7076S | |
| SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34578 |
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