Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

En primär mänsklig trofoblaster modell för att studera effekten av Inflammation i samband med moderns fetma på reglering av autofagi i moderkakan

Published: September 27, 2017 doi: 10.3791/56484
* These authors contributed equally

Summary

Presenteras här är ett protokoll för provtagning av mänsklig placenta villösa vävnad följt av isolering av cytotrophoblasts för primär cellkultur. Behandling av trofoblaster med TNFα recapitulates inflammation i feta intrauterin miljö och underlättar upptäckten av molekylära mål regleras av inflammation i moderkakor med moderns fetma.

Abstract

Moderns fetma är associerat med en ökad risk för negativa perinatala utfall som sannolikt medieras av nedsatt placenta funktion som kan hänföras till, i del, dysreglering av autofagi. Avvikande förändringar i uttrycket av autofagi tillsynsmyndigheter i moderkakor från feta graviditeter kan regleras av inflammatoriska processer i samband med både fetma och graviditet. Beskrivs här är ett protokoll för provtagning av villösa vävnad och isolering av villösa cytotrophoblasts från termen placenta hos människa för primär cellkultur. Detta följs av en metod för att simulera den inflammatoriska miljön i feta intrauterina miljön genom att behandla primära trofoblaster från lean graviditeter med tumörnekrosfaktor alfa (TNFα), en proinflammatoriska cytokiner som är förhöjd i fetma och graviditet. Genom genomförandet av protokollet som beskrivs här, är det funnit att exponering för exogena TNFα reglerar uttrycket av Rubicon, en negativ regulator av autofagi, i trofoblaster från lean graviditeter med kvinnliga foster. Medan en mängd biologiska faktorer i den feta intrauterina miljön upprätthålla potential att modulera kritiska vägar i trofoblaster, är detta ex vivo -system särskilt användbara för att avgöra om uttryck mönster observerade i vivo i mänsklig moderkakor med moderns fetma är ett direkt resultat av TNFα signalering. Slutligen, detta tillvägagångssätt ger möjlighet att tolka ut reglerings- och molekylär konsekvenserna av inflammation i samband med moderns fetma på autofagi och andra kritiska cellulära vägar i trofoblaster som har potential att påverka placenta funktion.

Introduction

Fetma är en inflammatorisk tillstånd som kännetecknas av kronisk låggradig inflammation, följd av överskott adipose vävnad och näringsämnen tillgänglighet. Fetma, är proinflammatoriska cytokiner förhöjda i metabola vävnader samt systemiskt i omlopp. En robust mängd bevis har visat att TNFα betydligt är förhöjda i inställningen av fetma med konsekvenser i insulinresistens och metabolisk dysfunktion1. Aktivering av TNFα bidrar också till sjukdomspatogenes vid sjukdomar som cancer och autoimmunitet, vilket gör det till ett attraktivt terapeutiska mål2.

Inflammation i fetma förvärras av graviditet, också en proinflammatoriska tillstånd3,4. Det har tidigare visat att placenta TNFα innehåll ökar med moderns adiposity i graviditeter med kvinnliga foster. Dessutom hämmar TNFα behandling mitokondriell andning i kvinnliga men inte manliga trofoblaster celler, vilket tyder på att TNFα är involverad i reglering av placenta metabolism i en könsdimorfisk sätt5. Moderns fetma är associerade med den ökade förekomsten av en mängd komplikationer under graviditet, inklusive stillbirth, med manliga foster är mest mottagliga3,6,7,8 . På grund av dess nyckelroll vid maternell-fetal gränssnittet, kan förändringar i den funktionella kapaciteten hos placentan hos överviktiga intrauterina miljön svar på inflammatoriska signalering spela en viktig roll i att förmedla resultaten av feta graviditeter.

Cytotrophoblasts och syncytiotrophoblasts i villösa vävnaden av moderkakan är kritiska för endokrin signalering och näringsämnen och syre utbyte mellan mor och utveckla fostret9. Störningar i den funktionella kapaciteten av villösa cytotrophoblasts (hädanefter benämnd trofoblaster) kan äventyra fostrets hälsa och utveckling. Det här protokollet beskriver en metod för provtagning av villösa vävnad från mänskliga termen moderkakan genom att dissekera bort koriongonadotropin och basala plattorna tillsammans med en optimerad förfarande för isolering av trofoblaster för primär cellkultur. Detta protokoll härleds från etablerade metoder som involverar enzymatisk nedbrytning av villösa vävnad att släppa celler från den extracellulära matrixen följt av differentiell densitet centrifugering att isolera trofoblaster10, 11,12. Detta protokolldetaljer ett tillvägagångssätt där primära trofoblaster från moderkakor från lean graviditeter behandlas med kultur media kompletteras med TNFα att simulera en komponent i den inflammatoriska miljön förknippas med maternell övervikt. Slutligen beskrivs ett enkelt förfarande för skörd summacell lysates från TNFα-behandlade trofoblaster följt av Western blotting för att påvisa förändringar i genuttryck.

Medan denna modell inte sammanfatta fetmafrämjande i livmodern miljön i dess helhet, ger det ett kontrollerat system som gör att man kan tolka enskilda bidrag av TNFα-medierad inflammation i den trofoblaster svar på moderns fetma. Denna modell ger både möjlighet att upptäcka eller bekräfta molekylära mål direkt regleras av TNFα signalering i trofoblaster samt gör att man kan testa om förändringar i genen uttrycksmönster observerats i vivo i moderkakor med maternell fetma kan vara ett resultat av TNFα-medierad inflammation.

Den metod som beskrivs här genomfördes för att testa effekten av TNFα-medierad inflammation på regleringen av autofagi i mänskliga trofoblaster. Trofoblaster från feta graviditeter med manliga foster uppvisar störde autophagic omsättning eller autophagosome mognad13. Ett protein som kallas Rubicon (kör domän protein Beclin1-interagera och cystein-rika innehållande), som är lokaliserad till lysosomer och sena endosomes, har nyligen beskrivits som en ”broms” i processen autophagic omsättning eftersom det fungerar som en negativ regulator autophagosome mognad14,15. I själva verket är Rubicon ett sällsynt exempel på ett protein som hindrar autofagi, vilket gör det ett värdefullt terapeutiska mål. Det finns mycket lite information om patofysiologiska betydelsen av Rubicon, utom dess roller i medfödda immunsvaret mot antimikrobiella16,17 och hjärtmuskelcellen skydd18. Med hjälp av protokollet som beskrivs här, visar det sig att Rubicon är uppreglerad i kvinnliga primära trofoblaster svar på behandling med ökande koncentrationer av TNFα upp till 250 pg/mL. Regleringen av Rubicon kan spela en roll i hur kvinnliga foster fare bättre än män i graviditeter med moderns fetma. Går igenom inflammation i samband med moderns fetma ex vivo genom att exponera människors trofoblaster att exogena TNFα ger en plattform för att studera effekterna av feta intrauterina miljön på regleringen av kritiska vägar i trofoblaster och i förlängningen, placenta funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

efterbörd samlades från Labor och leverans enhet vid akademiska sjukhuset under ett protokoll som godkänts av den institutionella granskning Board of Oregon Health och Science University i Portland, Oregon, med informerat samtycke från den patienter.

1. insamling av placenta vävnad

  1. beredning
    Obs: All utrustning som möter vävnad måste vara sterila.
    1. Sterilisera dissekera utrustningen i autoklav under 60 minuter vid 121 ° C.
    2. Använd personlig skyddsutrustning (PPE): lab rockar/klänningar/scrubs, handskar och mask med ett visir eller skyddsglasögon.
    3. Slå på vattenbad och Ställ till 37 ° C.
    4. Värma två 50 mL koniska rör, varje innehållande 25 mL av komplett media (Iscove ' s ändrad Dulbecco ' s Medium kompletteras med 10% FBS och 1% Penicillin/Streptomycin, tabell 3) i 37 ° C vattenbad.
    5. Med välinformerade patientens samtycke, får en moderkaka som omedelbart efter leverans av kejsarsnitt.
    6. Bekanta med moderkakan. Navelsträngen är isatt på fostrets sida (koriongonadotropin plattan) och blodkärlen kan ses strålar ut från navelsträngen insticksstället. Motsatt sida är på moderns sida, eller basal platta. Det innehåller decidua och strukturer som innehåller fartyget träd, kallas hjärtbladen.
  2. Provtagning av villösa vävnad
    Obs: villösa vävnad bör provtas från moderkakan så snart som möjligt efter förlossningen, företrädesvis i 30 minuter eller mindre.
    1. Med koriongonadotropin plattan uppåt, punktskatter 2-3 fullhudsskador sektioner (ca 2,5 x 2,5 cm i storlek) 2-3 cm i från peripheryen av moderkakan på slumpmässiga, med pincett och sax ( figur 1A).
      Obs: Undvik delar av moderkakan som visas onormal (dvs vit förkalkningar).
    2. Klippa bort koriongonadotropin och basala plattorna och några stora blodkärl.
    3. Placera den resulterande villösa vävnaden ( figur 1B, ca 80-120 g totalt) i varma komplett media och börja trofoblaster isolering inom 30 min provtagningsmetod.
      Obs: Vissa nedströms analyser och program påverkas av längden på latens period mellan leverans, provtagning och trofoblaster isolering. Det är bäst att hålla dessa perioder så kort som möjligt och överensstämmer mellan isoleringar.
    4. Med de metoder som beskrivs i steg 1.2.1 - 1.2.2, prova 5 slumpmässiga 1 x 1 cm sektioner villösa vävnad från hela moderkakan (inklusive center).
    5. Skär varje 1 x 1 cm villösa vävnadsprov i 4-5 mindre bitar (cirka 30 mg varje), placera i 2 mL mikrocentrifugrör och flash frysa i vätska N 2. Förvaras vid-80 ° C för senare analyser.

2. Isolering av trofoblaster från villösa vävnad

  1. beredning
    Obs: Använd steril utrustning och utföra åtgärder som medför celler i en LAF.
    1. Tina fyra frysta täthetlutningar (tabell 1, se tabell av grundläggande förnödenheter, reagenser och utrustning, kompletterande material) vid 4 ° C på natten innan moderkakan anländer.
      Obs: Alternativt täthetlutningar kan göras på dagen av isoleringen.
    2. Tur på centrifug och ställa till 20 ° C.
      Obs: Alla centrifugering steg är på högsta acceleration och retardation om inget annat anges.
    3. Förbered 1 x HEPES-buffrad saltlösning (HBSS) kompletteras med Ca + 2 och Mg + 2 (tabell 3).
    4. Varma trypsin till 37 ° C.
    5. Späda DNAS ca 2720 kilounits/ml i sterilt kompletteras HBSS.
    6. Varm 50 mL nyfödd kalvserum (NCS) till 37 ° C.
    7. Värma komplett media till 37 ° C.
    8. Värma frysning media (90% FBS, 10% DMSO, tabell 3) till 37 ° C.
      Varning: DMSO är giftigt och måste hanteras med handskar.
    9. Förbered matsmältningen buffert (tabell 2 och 3) genom att blanda 308 mL kompletteras HBSS, 50 mL av Trypsin (3751.7 BAEE enheter/mL), och 0,5 mL av DNAS (379,4 kilounits/mL) i en steril flaska.
      Obs: Den ungefärliga tid som krävs för att isolera cellerna från villösa vävnad är 7 h.
  2. Bearbetning villösa vävnaden
    1. skölj varje bit villösa vävnad i en 50 mL konisk tub fylld med rumstemperatur fosfat buffrad saltlösning (PBS). Upprepa och ersätta PBS som behövs tills överflödigt blod tas bort (PBS skölj blir ljus röd eller rosa när vävnaden är noggrant sköljas).
    2. Placera villösa vävnaden i en steril petriskål och ta bort så många blodkärl som möjligt genom att försiktigt skrapa bort den villösa mjukvävnad från de fartyg som använder ett objektglas.
    3. Fint Finhacka den resulterande villösa vävnaden med hjälp av sax.
  3. Villösa vävnad matsmältningen och rå isolering av trofoblaster
    1. överföra malet villösa vävnaden till en steril flaska med matsmältningen lösning enligt de beräkna volymer baserat på specifika aktiviteten av trypsin och DNAS (165 mL, tabell 2).
    2. Efter 35 minuters inkubation i 37 ° C vattenbad med skakar på 70 varv per minut (rpm), luta flaskan matsmältningen på sin sida och låta osmälta bitar av vävnad att bosätta sig på botten av flaskan. Noggrant utarbeta supernatanten med serologiska pipett, undvika fast vävnaden.
    3. Fördela supernatanten genom en 100 µm cell SIL lika mellan 50 mL koniska rör.
      Obs: För att spara tid, är det lämpligt att påbörja andra matsmältningen genom att lägga till matsmältningen lösning (110 mL, tabell 2) de återstående bosatte sig vävnad och återuppta inkubation som beskrivs i steg 2.3.2.
    4. Lager försiktigt 3-5 mL av NCS under ansträngda supernatanten genom att långsamt fördela från en serologisk pipett på botten av röret. En menisk mellan ansträngda supernatanten (innehållande trofoblaster) och NCS bör vara synliga ( figur 2A).
    5. Centrifugera supernatanterna över NCS 1,250 x g i 15 min vid 20 ° C. Den resulterande pelleten kommer att omfatta röda blodkroppar i lagrets nedre-mest följt av vita lager som innehåller trofoblaster celler ( figur 2B).
    6. Upprepa steg 2.3.2 - 2.3.5 för var och en av de andra och tredje tumörheterogenitet (lägger 110 mL och 83,5 m, respektive av matsmältningen lösningen i flaskan av vävnad, tabell 2).
    7. När alla supernatanterna har varit centrifugeras, Återsuspendera varje pellet i 5 mL varm komplett media och sedan sammanföra upphängningarna.
    8. Split cellsuspensionen lika mellan två 50 mL koniska rör och centrifugera vid 1,250 x g i 15 min vid 20 ° C.
    9. Försiktigt avlägsna supernatanten och återsuspendera varje cell pellets i 6 mL varm komplETE media.
  4. Densitet centrifugering
    1. dela cellsuspensionen lika mellan fyra täthetlutningar (3 mL) genom att långsamt och försiktigt skikta cellsuspension på toppen av täthetlutningar med en överföring Pipettera.
    2. Centrifugera täthetlutningar vid 1,250 x g i 20 min vid 20 ° C med minsta acceleration och retardation. Detta bör ge distinguishable band av sedimenterade celler (tabell 4).
    3. Långsamt och försiktigt ta bort de översta lagrarna av täthet lutning media (DGM) tills den ogenomskinlig mottagningslägen som innehåller trofoblaster celler (mellan 35-50% DGM) nås (tabell 4).
    4. Överför trofoblaster banden till två 50 mL koniska rör och fyll med varma komplett media.
    5. Vänd försiktigt rören 3 - 6 gånger för att blanda och centrifugera 1,250 x g i 15 min vid 20 ° C.
    6. Avlägsna supernatanten och återsuspendera varje cellpelleten i 5 mL varm komplett media. Kombinera cellsuspensioner och räkna viabla celler med hjälp av en hemocytometer och Trypan blå (eller önskad cell inventeringsmetod).
  5. Räknar celler med en Hemocytometer
    1. blanda cellsuspensionen genom pipettering upp och ner med en serologisk Pipettera eller genom att försiktigt vända tuben flera gånger.
    2. Kombinera lika delar av cellsuspensionen och Trypan blå (dvs. 20 µL varje) i ett separat rör och blanda försiktigt.
    3. Inkubera i 1-2 min i rumstemperatur.
    4. Försiktigt dispensera 15-20 µL av den cell-Trypan blå blandningen mellan täckglaset och hemocytometer och låta cellerna att diffundera över nätet genom kapillärkraften.
    5. Räkna viabla celler (döda celler kommer att färgas blå) i varje av de fyra 4 x 4 kvadranterna med en tally counter. Ett system för inventering för att säkerställa celler inte räknas mer än en gång (dvs räknas inte celler som berör de nedre eller vänster avgränsningar).
      Obs: Varje 4 x 4-kvadrant bör innehålla mellan 50-150 celler. För få eller för många celler kan leda till en över- eller underskattning av antalet celler.
    6. Genomsnittet cellen Summa räknas från var och en av de 4 x 4 kvadranterna, multiplicera med 10 4, och sedan multiplicera med utspädningsfaktorn (cellsuspension till Trypan blå) för att beräkna antalet celler per mL.
    7. Multiplicera antalet celler per mL av den totala volymen av cellsuspensionen att beräkna den totala cell avkastningen.
      Obs: Cirka 100 miljoner celler väntas från isoleringar börjar med 80-120 g villösa vävnad.
  6. Plätering celler
    1. tallrik 3 miljoner celler per brunn (3,3 x 10 5 celler per cm 2) i en 6-well platta (2 mL suspension per brunn), vaggar fram och tillbaka försiktigt och sida till sida att jämnt fördela cellerna.
      Obs: Trofoblaster kräver vävnadsodling behandlade plattor att följa ordentligt. En enskiktslager av celler krävs för att främja syncytialization.
    2. Lämna guldpläterade cellerna i LAF för ca 30 min så att celler för att jämnt distribuera, kvitta och börja följa botten av brunnarna innan de placeras i ruvmaskinen.
    3. Kultur celler för upp till 72 h (med dagliga media förändringar) i en 37 ° C inkubator med 5% CO 2 och 95% luftfuktighet.
      Obs: Undersöka trofoblaster under ett Mikroskop på 10-20 x varje 24 h av kultur. Trofoblaster föröka sig inte och kan inte vara passaged. Under 72 h av kultur, de runda enskilda trofoblaster säkring för att bilda ett syncytium ( figur 3A och B).
  7. Frysning celler
    1. Pellet oanvända celler genom centrifugering vid 1,250 x g i 10 min vid 20 ° C.
    2. Sug upp så mycket media som möjligt från pelleten.
    3. Återsuspendera pelleten i frysning media (tabell 3).
    4. Frysa alikvoter vid-80 ° C i en frysning behållare fylld med 100% isopropanol. Överföra de frysta portioner till vätska N 2 följande dag för långtidsförvaring.
      Obs: Celler kan vara odlade efter frysning.
  8. Upptining celler
    1. ta bort en alikvot av frusna celler och Tina i 37 ° C vattenbad medan virvlande. Ta bort alikvoten från vattenbadet precis innan det helt har tinats till en vätska.
    2. Omedelbart överföra de upptinade cellerna till en 15 ml koniska rör. Börjar sakta först, tillsätt 10 mL av komplett media med intermittent blandning.
    3. Invertera tube flera gånger blanda.
    4. Centrifugera vid 200 x g i 10 min vid 20 ° C.
    5. Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 2-5 mL varm komplett media.
    6. Räkna celler och plattan som tidigare beskrivs.

3. Behandling av primära trofoblaster med TNFα, samling av Cell Lysates och Western Blotting

  1. beredning
    1. varma komplett media till 37 ° C.
    2. Göra en 10 µg/mL lager av TNFα i komplett media och förvaras vid-20 ° C tills klar för användning.
    3. Gör en 1 µg/mL arbetar beståndet av TNFα i komplett media när du är redo att behandla cellerna. Serial späd TNFα arbetar beståndet till 10 4 pg/mL, 10 3 pg/mL, 500 pg/mL, 250 pg/mL och 125 pg/mL i komplett media.
      Obs: TNFα koncentration 10 4 pg/mL är måttligt cytotoxiska. Justering av TNFα koncentrationer testats beror på detaljerna i önskat nedströms program.
  2. Behandling av celler med TNFα
    1. efter 24 h av kultur, aspirera kultur media från cellerna och ersätta med 2 mL TNFα kompletteras medier per brunn på 6-väl tallrikar (minst två brunnar per behandling och fordon kontroll).
    2. Efter 24 h TNFα-exponering (48 h för kultur), ersätta TNFα kompletteras medier med komplett media.
  3. Skörd celler och totalprotein
    1. efter 72 h av kultur (24 h förbi borttagning av TNFα), aspirera media, försiktigt skölja celler med rumstemperatur PBS och tillsätt 80 µL av iskall Radioimmunoprecipitation Assay Buffert (RIPA) med nyaktiverad lagt till proteas och fosfatas hämmare (tabell 3) direkt till varje brunn.
    2. Ta bort celler från plattan med en cell skrapa. Överföra cellerna till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, poolning brunnar inom behandlingsgrupperna.
    3. Lyse celler av vortexa rören på hög för minst tre intervall 15 s.
    4. Inkubera cellerna vid 4 ° C med gunga för 15 min.
      Obs: alternativt efter steg 3.3.3., cellerna kan inkuberas på is för 15 min med intermittent agitation av snärta röret, vortexa, eller pipettering upp och göraWN.
    5. Upprepa steg 3.3.3.
    6. Centrifugera rören vid 10 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C till pellet cellulära skräp.
    7. Överföring supernatanten (innehållande cellulära protein) till en ny 1,5 mL mikrocentrifug rör och förvaras vid -80 ° C.
      Obs: Protokollet kan stoppas här och återupptas vid ett senare tillfälle. Det är lämpligt att göra flera portioner av cellulära proteiner prover att undvika flera frysning-tining cykler.
    8. Bestämma totalprotein koncentration genom en rekommenderad metod, till exempel en bicinchoninic acid test (BCA, se tabell av grundläggande förnödenheter, reagenser och utrustning, kompletterande material).
  4. SDS-PAGE och Western Blotting för Rubicon eller Protein av intresse
    Obs: Följ Western blotting protokoll enligt tillverkaren ' anvisningar använder en rekommenderad laboratorium system.
    1. Belastning mellan 20-40 µg totalt protein i provet buffert (tabell 3) per brunn på en 12% akrylamid gel. Separera proteiner av SDS-PAGE i kör buffert (tabell 3).
    2. Våt-överföring av proteiner från gelen till ett polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) membran enligt tillverkaren ' anvisningar i överföring buffert (tabell 3).
    3. Inkubera membranet i 5% mjölkpulver i Tris-Buffered saltlösning med 0,1% Tween-20 (TBST, tabell 3) för minst 1 h i rumstemperatur med vaggande.
    4. Inkubera membranet i en Rubicon primär antikropp (se tabell av grundläggande förnödenheter, reagenser och utrustning, kompletterande material) på 1: 500 i 1% mjölkpulver i TBST över natten vid 4 ° C med vaggande.
    5. Försiktigt tvätta membranet 3 x 5 min i TBST och 1 x 5 min i TBS vid rumstemperatur med vaggande.
    6. Inkubera membranet i 1: 2000 - 1: 5000 sekundär antikropp (HRP-länkade eller rekommenderad synliga konjugat, se tabell av grundläggande förnödenheter, reagenser och utrustning, kompletterande material) i 5% mjölkpulver i TBST för minst 1 h i rumstemperatur med Rocking.
    7. Upprepa tvätt förfarandet i steg 3.4.5 och visualisera blot med en lämplig visualisering (dvs Kemiluminiscens) substrat på ett bildsystem.
    8. Upprepa tvätt förfarandet i steg 3.4.5 och sond membranet för β-aktin eller en rekommenderad lastning kontroll enligt tillverkaren ' anvisningar.
    9. På föredrog bild analys programvara, analysera uttrycket av Rubicon av manuell kvantifiering av absorbans (bandet stödnivåer), subtraktion av bakgrundsabsorbansen, och normalisering till motsvarande lastning styra bandet stödnivåer. Utföra statistiska analyser som lämpliga att testa för statistiskt signifikanta förändringar i proteinnivåer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Benämna mänsklig moderkakor från lean (före graviditeten BMI (Kroppsmasseindex) < 25) mödrar med okomplicerade graviditeter bär kvinnliga avkommor samlades och provtas inom 15 minuter efter leverans av kejsarsnitt (ingen arbete). Moderkakor undersöktes för avsaknad av förkalkningar och typisk utveckling: väger mellan 300-600 g med navelsträngen och membran bort, runda i formen, mellan 15-25 cm i diameter, och navelsträngen infogas i mitten av den moderkakan. Villösa vävnad var dissekerade från basal och chorionic plattorna i 2-3 prover från hela moderkakan (figur 1), vilket ger cirka 100 g villösa vävnad som utgångsmaterial för primära trofoblaster isolering. Inom 20 minuter efter provtagning villösa vävnad, förfarandet för att isolera primära trofoblaster startades som beskrivs här, vilket ger mellan 0,8 - 1 x 108 viabla celler. Cellerna var seedad i 6-väl kultur plattor på en densitet på 3 x 106 (3,3 x 105 celler per cm2). Efter 24 h av kultur, cellerna undersöktes under ett mikroskop för fastsättning och ordentlig trofoblaster morfologi bekräftades (enskilda runda celler). Kultur media ersattes med komplett media som innehåller en serie koncentrationer av TNFα mellan 125-104 pg/mL så att minst två brunnarna ingick per koncentration och kontroll av fordon (endast komplett media).

Tjugofyra timmar efter TNFα-behandling (48 h för kultur), ersattes alla TNFα medier med komplett media. Inga betydande celldöd observerades på grund av behandling med TNFα vid koncentrationer på eller under 103 pg/mL. Behandling med 104 pg/mL TNFα var måttligt cytotoxiska och de cytotoxiska effekterna av denna TNFα koncentration kvarstår inte efter media har ändrats vilket framgår av laktatdehydrogenas (LDH) analyser (inga data anges). På 72 h av kultur undersöktes celler för syncytialization under ett mikroskop. Immuncytokemi för syncytialization och fibroblast kontaminering avslöjade relativt ren isolering av trofoblaster (figur 3). Cellulär lysates skördades enligt protokollet beskrivs här, vilket ger mellan 3-8 µg/µL totala protein per förberedelse som bestäms av en BCA assay (inga data anges). Western blot analys i cell lysates från kvinnliga trofoblaster behandlas med TNFα visade en uppreglering av Rubicon uttryck i svar till koncentrationer av TNFα upp till 250 pg/mL och efterföljande nedreglering av Rubicon uttryck vid TNFα koncentrationer större än 250 pg/mL (figur 4A och B, 104 pg/mL undantas från analys utifrån cytotoxiska effekter). Likaså Rubicon är kraftigt uppreglerad i flash-fryst villösa vävnadsbiopsier från moderkakor från feta graviditeter med kvinnliga foster jämfört med lean kontroller vilket framgår av Western blot analys (figur 4 c och D, n = 6 moderkakor per BMI klass, ANOVA, P < 0,05).

Koncentration (%) 90% DGM (ml) 1 x HBSS (ml) Skiktets tjocklek (ml)
4 x övertoning 4 x övertoning Totalt 34,5 ml
70 14 4 4.5
60 8 4 3
55 7.33 4,67 3
50 3.34 2,67 3
45 6 6 3 (13,5 ml märket)
40 5.33 6,67 3
35 4,67 7.33 3 (19,5 ml märket)
30 8 16 6
20 2,67 9.33 3
10 1.33 10,67 3

Tabell 1. Specifikationer för att göra densitetsgradienter för densitet centrifugering av primära trofoblaster.
Från vänster till höger, anger kolumnen en täthet lutning media (DGM, se tabell av grundläggande förnödenheter, reagenser och utrustning, kompletterande material) koncentration uttryckt som procent av DGM i HBSS. Kolumn två anger volymen av DGM medan kolumn tre anger volymen av HBSS krävs för att göra lämpliga andelen DGM lösning. Kolumn fyra anger volymen som ska läggas till 50 mL koniska röret att bygga övertoningen, början med det tätaste lagret.

Trypsin HBSS DNAS
Matsmältningen (totala verksamhet. BAEE enheter) volym (ml) (totala verksamhet. Kunits) Totala volymen
/digestion
1 619037 (23.01 ml) 141.76 ml 62594 (0.230 ml) 165 ml
2 412691 (15.34 ml) 94.51 ml 41729 (0.154 ml) 110 ml
3 313270 (11.65 ml) 71.74 ml 31676 (0.116 ml) 83,5 ml
Totalt 1345000 (50 ml) 308 ml 136000 (0,5 ml) 358,5 ml

Tabell 2. Specifikationer för utarbetandet av matsmältningen lösning för primära trofoblaster isolering utifrån den specifika aktiviteten av DNAS och Trypsin.
Från vänster till höger, den första kolumnen anger antalet tumörheterogenitet, den andra kolumnen anger trypsin aktiviteten krävs per matsmältningen, den tredje kolumnen anger den totala volymen av kompletterade HBSS läggas för lämpliga matsmältningen, den fjärde kolumnen anger DNAS aktiviteten krävs per matsmältningen och den sista kolumnen anger volymen av matsmältningen lösning varalagt till placenta vävnaden för lämpliga matsmältningen.

HBSS (kompletteras med Ca+ 2 och Mg+ 2) Prov buffert
10% 10 x HBSS 90% 4 X Laemmli dye
1.26 mM CaCl2 (anhyd.) 10% 2-merkaptoetanol
0,80 mM MgSO4 (anhyd.)
20.77 mM HEPES
pH till 7,4 med 10N NaOH
Se volym upp till 1 L med sterila ddH2O
Sterila filter i en steril flaska
Komplett Media Kör buffert
Ta bort 11% v/v IMDM 25 mM Tris Base
Lägga till 10% v/v FBS 190 mM glycin
Tillsätt 1% 10.000 U/mL Penicillin/Streptomycin (100 U/mL slutlig) 0,1% SDS
pH-värdet till 8,3
Frysa Media
90% v/v FBS Överföra buffert
10% v/v DMSO 25 mM Tris
190 mM glycin
Matsmältningen buffert 20% metanol
50 mL Trypsin (26,900 BAEE enheter/mL) pH-värdet till 8,3
0,5 mL DNAS (272 000 K enheter/mL)
Föra till 358,5 ml i kompletterade HBSS TBS
20 mM Tris
RIPA bufferten 150 mM NaCl
25 mM Tris-HCl pH 7,6
5 mM EDTA
150 mM NaCl TBST
0,1% SDS TBS med 0,1% Tween 20
0,5% natriumdeoxikolat
1% Triton x-100
1 tablett av proteas/fosfatas hämmare per 10 ml RIPA buffert

Tabell 3. Lösningar för isolering och kultur av primära trofoblaster följt av Western Blotting.

% DGM ml-märket Celltyp
10 31,5-34,5 Skräp
20 28,5-31.5
30 22.5-28.5
35 19,5-22,5 Trofoblaster
40 16,5-19,5
45 13,5-16,5
50 10,5-13,5 Lymfocyter
55 7,5-10,5
60 4,5-7,5 Röda blodkroppar
70 Nedan 4.5

Tabell 4. Sedimentering av trofoblaster densitet centrifugering.
Från vänster till höger, den första kolumnen anger andelen DGM (tabell 1), den andra kolumnen anger mL märket där motsvarande andelen DGM finns på en 50 mL konisk tub, och den tredje kolumnen anger vilken cell typ sediment på den motsvarande andelen DGM och mL-märket på en 50 mL konisk tub. Trofoblaster sediment mellan 50-35% DGM, bildar distinkta ogenomskinlig band. Samlande DGM ovanför eller nedanför detta intervall kommer att leda till kontaminering av cellulära skräp och andra celltyper såsom lymfocyter.

Figure 1
Figur 1. Villösa vävnad är isolerade från termen placenta hos människa genom att ta bort den Chorionic och Basal plattorna.
A) med koriongonadotropin plattan (fetala sida) uppåt, Bolts full tjocklek prov från moderkakan. B) ett urval av villösa vävnad erhålls genom att ta bort de koriongonadotropin och basala plattorna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2. Centrifugering av celler i matsmältningen lösning över nyfödda kalvserum resulterar i ett Multilayered cellpelleten.
A) nyfödda kalvserum (NCS) är skiktad under cellsuspensionen i uppslutningslösningen i en 50 mL konisk tub. B) centrifugering av (A) resulterar i ett multilayered cellpelleten. Det understa lagret är djupt i röd färg och består av röda blodkroppar. Lagret ovan inkluderar trofoblaster och är vitt eller beige färg. Ovanför trofoblaster är lagret NCS följt av matsmältningen lösning (supernatanten) till toppen av röret. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3. Immunocytological analys av Syncytialization och Fibroblast innehåll i primära mänskliga trofoblaster kulturer.
A) representativ bild av Cytokeratin-7 (röd) i cytotrophoblasts efter 24 h av kultur. B) representativ bild av Cytokeratin-7 (röd) i syncytiotrophoblasts efter 72 h kultur visar Multinucleära massorna av celler som har smält. C) representativ bild av Vimentin (röd) i syncytiotrophoblasts efter 72 h av kultur. Bilder har förvärvats på ett fluorescerande Mikroskop med DAPI (blå) kärntekniska motfärg. Visualiseras vid 10 X förstoring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Reglering av Rubicon uttryck i behandlingssvaret TNFα-i kvinnliga trofoblaster och endogena Rubicon uttryck i villösa vävnad från Lean kontra feta graviditeter med kvinnliga foster.
Primära trofoblaster från termen moderkakor från lean mödrar med friska graviditeter bär en kvinnlig fetus var isolerade och behandlade med 125, 250, 500, 103, och 104 pg/mL TNFα (eller kontroll av fordon). A) representant Western blot för Rubicon i kvinnliga trofoblaster lysates behandlade med TNFα. Β-aktin användes som en lastning kontroll. B) Rubicon uttryck i behandlingssvaret TNFα-i kvinnliga trofoblaster var kvantifieras från Western blotting och normaliserade till β-aktin. Värden är medelvärdet Rubicon uttryck per TNFα koncentration ± S.E. i n = 3 moderkakor. C) Western blotting för Rubicon i hela vävnad lysates från flash frozen biopsier av villösa vävnad från lean kontra feta graviditeter med kvinnliga foster (F1-F12). Laktatdehydrogenas A (LDHA) användes som en lastning kontroll. D) Rubicon uttryck i Western blotting från (C) var kvantifieras och normaliserade till LDHA. Värden är medelvärdet Rubicon uttryck per BMI klassificering ± S.E. i n = 6 moderkakor per BMI klass (ANOVA, * P < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Placenta, ansvarar för att reglera tillväxten av fostret, uppvisar nedsatt funktion i feta miljö6. Trots de höga metaboliska krav av trofoblaster uppvisar moderkakor med moderns fetma dysfunktionella mitokondriell respiration6,19. Förändringarna i placenta metabolism kan bidra till den ökade förekomsten av komplikationer och biverkningar fostrets utfall hos överviktiga graviditeter3,6,7. Autofagi äventyras också i moderkakor med moderns fetma. Moderkakor från feta graviditeter med manliga foster visar dysfunktionella autophagic flux vilket framgår av ansamling av autophagosomes13. Att upprätthålla optimal autophagic flux är kritisk för cellulära homeostas och defekta autofagi i moderkakor med moderns fetma kan spela en viktig roll i att förmedla de negativa resultat som är associerad med feta graviditeter.

Exakta orsaken(med) av funktionen nedsatt placenta utställda i moderns fetma är inte väl förstått och kan ha sitt ursprung i inflammatoriska signalering. Både fetma och graviditet är proinflammatoriska tillstånd som karakteriseras av förhöjda nivåer av cirkulerande TNFα1,4,20,21. TNFα är en aktivator autofagi22,23och kan medla förändringar i autophagic flux i moderkakor från feta graviditeter. TNFα används vanligen för att studera effekterna av inflammation på celler, särskilt i samband med cancer2. Det protokoll som presenteras här anpassar detta tillvägagångssätt för att studera effekterna av fetma-relaterade inflammation på den funktionella kapaciteten hos moderkakan genom att behandla primära trofoblaster med exogena TNFα i kultur.

Detta protokoll består av fyra huvudkomponenter: provtagning av villösa vävnad från moderkakan, isolering av primära trofoblaster från villösa vävnad, kultur av primära trofoblaster följt av TNFα behandling och insamling av totala cellular lysates följt av Western blot analys att mäta uttrycket en proteinernas sevärdheter. För att isolera ren trofoblaster, är det viktigt att koriongonadotropin och basala plattorna är noggrant dissekeras från villösa vävnaden under provtagning av moderkakan (figur 1B). Det är också viktigt att villösa vävnad behandlas i tid (dvs. inom 30 minuter efter leverans). Detta protokoll Detaljer användning av tre matsmältningen steg, varje varaktig 35 minuter, för att släppa trofoblaster från villösa vävnad extracellulära matrisen. Långdraget tumörheterogenitet riskerar skada celler av trypsinization av cellen ytproteiner. Öka antalet smälter ökar inte nämnvärt den slutliga avkastningen av livskraftiga trofoblaster. Dock minskar den tid och antal tumörheterogenitet kommer att resultera i minskade cell avkastning (Simon, Bucher och Maloyan, opublicerade data). Detta protokoll producerar tillförlitligt ungefär 100 miljoner celler från 80-120 gram villösa vävnad.

Det finns variationer av distinguishable trofoblaster band observerats på täthetlutningar mellan isoleringar. För att undvika kontaminering från andra celltyper, är det viktigt att strikt samla den mottagningslägen som innehåller trofoblaster på täthetlutningen (tabell 4). Protokollet beskrivs här är optimerad från tidigare etablerade metoder som ger relativt rena trofoblaster med mindre än 5% förorening från andra cell typer10,11,12. Ytterligare rening kan uppnås genom positiva eller negativa urval24. Men riskerar detta synsätt att minska avkastningen av livskraftiga trofoblaster. Immunocytochemical analys av Cytokeratin-7 i primära trofoblaster isolerade med proceduren presenteras här efter 24 kontra 72 h kultur tid bekräftat att cellerna genomgick syncytialization vilket framgår av förekomsten av Multinucleära cell massorna på 72 h, en kontrollstämpel händelse i livslängden för en trofoblaster (figur 3A och B). Immunocytochemical analys av Vimentin i primära trofoblaster odlade för 72 h visade dessutom mycket få kontaminerande fibroblaster (figur 3 c). För rutinmässiga, kan renheten av trofoblaster övervakas i kultur av enkel morfologisk bedömning. På 24 h kultur tid dominerar runda enskilda cytotrophoblasts kulturen. Cytotrophoblasts genomgå syncytialization efter 72 h av kultur, vilket resulterar i klumpar av smält celler. Den vanligaste kontaminerande Celltypen i denna kultur är den fibroblast eller endotelceller, som är avlånga och månghörnigt form, respektive. Dessa funktioner kan övervakas ungefär med ljusa Mikroskop.

Behandling av primära trofoblaster med TNFα ger ett kontrollerat system som gör att man kan mäta effekten av TNFα signalering om reglering av kritiska vägar i trofoblaster. Naturligtvis finns det andra faktorer än TNFα i feta maternell miljö i vivo som kan vara ansvarig för modulerande trofoblaster funktion. Dessa inkluderar men begränsas inte till hormonella signaler, hyperlipidemi och en mängd andra proinflammatoriska faktorer25. Kombinationer av olika behandlingar kommer ytterligare recapitulate feta intrauterin miljö ex vivo på mer fysiologiskt korrekt sätt. Koncentrationerna av exogena TNFα används för att behandla trofoblaster i detta protokoll långt överstiger de vanligtvis cirkulerar i vivo. Serumkoncentrationer har varit rapporterade att nå 20 ng/mL eller högre i vissa inflammatoriska tillstånd26. För att få ett mätbart svar av nuvarande laboratoriemetoder (dvs Western blotting), är det nödvändigt att förstärka TNFα koncentrationer för att avslöja förändringar i genuttryck och vägar av intresse. Svaren kan finnas i vivo i mindre utsträckning. Dock kunde de ändå avsevärt påverka funktionen av trofoblaster. Utsätta trofoblaster till höga koncentrationer av TNFα riskerar att producera artefakter i genuttryck och pathway analyser som kan förankras i cytotoxiska effekter. Måttlig cytotoxicitet hos trofoblaster utsätts för 104 pg/mL TNFα kompletteras media för 24 h vilket framgår av LDH cytotoxicitet analyser (inga data anges). Koncentrationer vid eller under 103 pg/mL TNFα gav dock inte någon betydande celldöd.

Testning TNFα koncentrationer på mindre intervall eller som är lägre än beskrivs här kan bäst följas av kvantitativapolymeras-kedjereaktion (qPCR) för gen uttryck analys, en teknik som lämpar sig väl för att upptäcka små förändringar i genuttryck. Medan qPCR testar specifikt för gen uttryck nivåer på transkriptionell nivå, upptäcker Western blotting de slutliga nivåerna av proteinprodukter som finns förmodligen att utföra deras cellulära uppgift(er). Använda både analytiska tekniker tillsammans är en kraftfull metod för att fastställa effekterna av TNFα behandling om reglering av genen uttrycksnivåerna samt när det gäller att avgöra om förändringar i uttryck är ett resultat av transkriptionell, post-transcriptional, eller post-translationella förordning. Inflammatorisk stress kan påverka trofoblaster beteende, morfologi och syncytialization. Inklusive morfologiska bedömningar (dvs immuncytokemi) förutom molekylär analytiska tillvägagångssätt kommer att ge en mer omfattande analys av effekterna av TNFα exponering på trofoblaster hälsa. Justering av TNFα koncentrationer testade och nedströms analyserna enligt experimentella krav är tillrådligt.

Av genomförandet av protokollet som beskrivs här, visar TNFα-medierad inflammation sig upregulate Rubicon uttryck i mänskliga trofoblaster från lean graviditeter med kvinnliga foster. Western blotting för Rubicon i trofoblaster lysates avslöjade två distinkta band nära och ovan beräknade molekylvikten för 140 kDa (figur 4A). Det finns bevis som tyder på att det lägre bandet är icke-specifik (PD047 anti Rubicon pAb, MBL datablad, http://ruo.mbl.co.jp/bio/g/dtl/A/?pcd=PD027#u-pub). Trofoblaster kvinnor visat förmåga att upregulate uttrycket av Rubicon i TNFα behandlingssvaret av koncentrationer upp till 250 pg/mL. Vid koncentrationer som är högre än detta, Rubicon uttryck nivåerna sjönk tillbaka mot baslinjen (kontrollgrupp) och även nedan (figur 4B, n = 3). Med tanke på att behandling av trofoblaster från lean graviditeter med TNFα simulerar inflammation i feta intrauterin miljö, är detta resultat ett komplement till konstaterandet att Rubicon är kraftigt uppreglerad i flash-fryst villösa vävnadsbiopsier från moderkakor från feta graviditeter med kvinnliga foster jämfört med lean kontroller (figur 4 c och D, ANOVA, n = 6 per BMI klass, P < 0,05).

Medan autophagic flux inte verkar skilja sig åt i trofoblaster från feta graviditeter med kvinnliga foster jämfört med lean kontroller, uppvisar trofoblaster från feta graviditeter med manliga foster aktivering av bildandet och ackumulering av autophagosomes 13. Rubicon är en negativ regulator av autofagi, där den fungerar för att stoppa autophagosome-Lysosomen fusion27. Kvinnliga trofoblaster kan upregulate uttrycket av Rubicon som en kompenserande eller skyddande mekanism mot TNFα-medierad inflammation, som kan aktivera autofagi22, gör det möjligt för dem att bibehålla lean-liknande autophagic flux i fastställandet av moderns fetma. Detta svar i moderkakan kan spela en roll i hur kvinnliga foster fare bättre än män i feta intrauterin miljö. Modeling den inflammatoriska miljön som förknippas med maternell övervikt ex vivo genom behandling av primär mänsklig trofoblaster med TNFα ger en plattform för att studera effekterna av feta intrauterina miljön på regleringen av kritiska vägar i trofoblaster. Om ändring av detta protokoll med nya och kombinatoriska behandlingar syftar till att går igenom den feta maternell miljön kommer att ge en spännande avenue för att studera effekterna av moderns fetma på placenta funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka kvinnor som donerade sin moderkakor för denna studie. Vi tackar också det arbete och leverans avdelningen på OHSU och mödra och fostrets forskargrupp för att samordna insamling av moderkakor. Vi är tacksamma att Eric Wang, Ph.D., och Kelly Kuo, VD för stöd och hjälp med experimentella metoder och optimering.

Detta arbete var finansierad av NIH HD076259A (AM) och AHA GRNT29960007 (AM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X HBSS Gibco 14185-052
CaCl2 (anhyd.) Sigma-Aldrich C1016-100G
MgSO4 (anhyd.) Sigma-Aldrich M7506-500G
Hepes Fisher Scientific BP310-500
Trypsin Gibco 15090-046
DNAse Worthington Biochemical Corp. LS002139
Protease/Phosphatase inhibitors Thermofisher Scientific 88668
Tris HCl Invitrogen 15506-017
EDTA Invitrogen 15576-028
NaCl Sigma-Aldrich S7653-1KG
SDS Fisher Scientific BP166-600
Sodium deoxycholate. Fisher Scientific AAJ6228822
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML
Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) Gibco 12440-046
Fetal Bovine Serum (FBS) Corning 35-010-CV
Neonatal Calf Serum (NCS) Gibco 26010-074
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) Gibco 15140-122
10% Formalin Fisher Scientific 23-427-098
DMSO Sigma-Aldrich D2650-100ML
TNFα Sigma-Aldrich SRP3177-50UG
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 70013-032
K2EDTA vacutainer blood collection tubes BD 366450
Percoll (Density Gradient Media, DGM) GE Healthcare 17-0891-01
6 well plates Corning 353046
Cell strainers Fisher Scientific 22363549
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL, natural Fisher Scientific 22363352
Trypan Blue Corning 25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System Bio-Rad 1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad 1658033
TGX FastCast Acrylamide Kit, 12% Bio-Rad 1610175
Mini-Protean 3 Multi-Casting Chamber Bio-Rad 1654112
4X Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148-100ML
Glycine Bio-Rad 1610718
Tween-20 Sigma-Aldrich P7949-500ML
Instant Nonfat Dry Milk Carnation
Rubicon (D9F7) Rabbit mAb Cell Signalling Technology 8465S
Monoclonal Anti-β-Actin antibody produced in mouse Sigma-Aldrich A2228-100UL
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody Cell Signalling Technology 7074S
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signalling Technology 7076S
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate Thermo Scientific 34578

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
  2. van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
  3. Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
  4. Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
  5. Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
  6. Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
  7. Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
  8. Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
  9. Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
  10. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  11. Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
  12. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  13. Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
  14. Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
  15. Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
  16. Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
  17. Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
  18. Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
  19. Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
  20. Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
  21. Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
  22. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
  23. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
  24. Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
  25. Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975 (2014).
  26. Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
  27. Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).

Tags

Medicin fråga 127 placenta hos människa moderns fetma inflammation tumörnekrosfaktor alfa (TNFα) villösa vävnad trofoblaster primära cellkulturer Western blot autofagi Rubicon könsdimorfism
En primär mänsklig trofoblaster modell för att studera effekten av Inflammation i samband med moderns fetma på reglering av autofagi i moderkakan
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Simon, B., Bucher, M., Maloyan, A. A More

Simon, B., Bucher, M., Maloyan, A. A Primary Human Trophoblast Model to Study the Effect of Inflammation Associated with Maternal Obesity on Regulation of Autophagy in the Placenta. J. Vis. Exp. (127), e56484, doi:10.3791/56484 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter