Summary
כאן נתאר שיטת יצירת מודל של Zika הנוצרות על-ידי וירוס microcephaly עכבר. פרוטוקול זה כולל שיטות חיסון גרם עובריים neonatal, מבוגר-שלב של הנגיף Zika.
Abstract
הווירוס Zika (ZIKV) הוא flavivirus כיום אנדמית ב צפון, מרכז, דרום אמריקה. עכשיו זה נקבע כי ZIKV יכול לגרום microcephaly חריגות המוח נוספים. עם זאת, המנגנון שבבסיס בפתוגנזה של ZIKV במוח המתפתח עדיין לא ברור. שיטות הניתוח גרם משמשים לעתים קרובות במחקר מדעי המוח על שאלות על התפתחות המוח תקינה ולא תקינה ותפקוד המוח. פרוטוקול זה מנצל טכניקות ניתוחיות קלאסית, מתאר שיטות שבהן אפשר אחד דגם ZIKV-הקשורים האנושי מחלה נוירולוגית במערכת העצבים העכבר. בזמן חיסון מוח ישירה דגם לא נורמלי ההידבקות וירוס, השיטה מאפשרת חוקרים כדי לשאול שאלות יישוב הנוגעות התוצאה לאחר זיהום ZIKV של המוח המתפתח. פרוטוקול זה מתאר בשלבים עובריים neonatal, למבוגרים של חיסון ע של ZIKV. לאחר mastered, שיטה זו יכולה להפוך טכניקה פשוטה, לשחזור לוקח רק כמה שעות לביצוע.
Introduction
Microcephaly היא מצב הנובע התפתחות המוח פגומה מאופיין קטן יותר גודל ראש ממוצע ילודים. ילדים עם microcephaly מוצג מגוון של תסמינים אשר יכולות לכלול עיכוב התפתחותי, פרכוס, מוגבלות, אובדן שמיעה, בעיות ראייה ובעיות עם תנועה ואיזון, בין היתר, בהתאם לחומרת המחלה, לגרום1,2,3. מצב זה הוא multifactorial בטבע, עם סוכן זיהומיות גנטיים, גורמים סביבתיים קשורים וגרם microcephaly4,5,6,7,8, 9. לפני תחילת 2015-2016 ZIKV, 8 ילדים מתוך 10,000 לידות אובחנו עם microcephaly בארצות הברית על פי ה-CDC10. ב-1 בפברוארst של 2016 ארגון הבריאות העולמי הכריז הווירוס Zika בריאות הציבור חירום של הבינלאומי דאגה לנוכח העלייה מדאיג אבחנות microcephaly המשויך ZIKV זיהום אמהות11, 12. מחקר שנערך לאחרונה מהמרכז לבקרת מחלות על מקרים ZIKV בארצות הברית עולה כי התוצאות זיהום ZIKV האימהי סיכון מוגבר 20-fold לילד לפתח microcephaly לעומת אנשים נגוע, ו 4% מהאמהות ZIKV נגוע מארצות הברית גרמו ילדים עם microcephaly11. הקצב microcephaly-הקשורים למומים מולדים במהלך ההריון מזיהום ZIKV בברזיל דווחו משפיע עד 17% של תינוקות: האמהות נגועים, המציין כי גורמים אחרים באמריקה הלטינית עשוי להיות תורם סיכון מוגבר 13. בזמן שאנו יודעים כי ZIKV יכול לגרום microcephaly ו פתוגנזה ב קדמון עצבית תא (NPC) האוכלוסייה7,8,14, מלאה בפתוגנזה של ZIKV בפיתוח המוח נשאר קשה להבנה. חשוב לפתח מודלים בעלי חיים להמשיך לחקור את מנגנוני המחלה הבסיסית של חריגות המוח הקשורים עם זיהום ZIKV.
ללמוד ישירות את ההשפעה ZIKV על התפתחות המוח, לראשונה פיתחנו מודל העכבר באמצעות חיסון גרם של המוח (E14.5) 14.5 יום עובריים ZIKV7. בשלב זה נבחר כפי שהוא נחשב נציג של סוף השליש הראשון ההיריון האנושי14. הגורים יכולים לשרוד עד יום כמחנכת 5 (P5) בשיטה זו זריקה גרם עובריים (~ 1 µL של 1.7 x 106 תרביות רקמה זיהומיות מינון (TCID50/mL)). לאחר הלידה הגורים להפגין מגוון פנוטיפים באופן דומה נצפתה אצל תינוקות בני אדם נגועים כולל החדרים מוגדלים, אובדן עצביים, עצב rarefaction, astrogliosis, microglial הפעלה12,15. מוח העכבר היילוד הוא יחסית לא בוגר, דומה השלב ההתפתחותי של המוח האנושי בגיל אמצע ההיריון16, התפתחות המוח העכבר כולל מרכיב מרכזי כמחנכת. ללמוד זיהומים בשלב מאוחר יותר של ההיריון, מתואר גם שיטה של זיהום לאחר הלידה. Neonates נגוע ZIKV ב P1 מסוגלים לשרוד 13 ימים שלאחר ההזרקה. זיהום דם-נולד הבמה למבוגרים שתיארנו העכבר בעבר17 אך מחייב השימוש שעתוק גורם רגולטורי (IRF) אינטרפרון (IFN) גורמים IRF-3,-5, נוקאאוט טריפל-7 זן. פרוטוקול זה מתאר שיטה מזריקים ZIKV intraventricularly לעקוף את השבתת התגובה אנטי ויראליים של המודל מאתר אצל אדם בוגר. בזמן זה עוקף את המערכת החיסונית מאתר, המסלול של הזרקת לא ישירות לחקות את המסלול טיפוסי של זיהום. כדי לטפל אי-התאמה זו ישירות, הנסיין ניתן לבצע זיהום תוך רחמי של ZIKV במקום תוואי תוך-גולגולתי. לאימוץ מבית בעבודה הקודמת18, בקצרה תארנו טכניקה זו בפרוטוקול זה זיהום מתחלקים.
זני וירוס Zika מיושם עם טכניקה זו כוללים את בידוד מקסיקני7,MEX1-4419 ולבודד אפריקה ב 194720מר-766. Zika MEX1-44 היתה מבודדת במקסיקו, צ'יאפס בינואר 2016 מ נגוע Aedes aegypti יתושים. . השגנו את הוירוס הזה עם אישור באמצעות הסניף הרפואה באוניברסיטת טקסס בגלבסטון (UTMB). בנוסף, serotype וירוס דנגה 2 (DENV2) היה מחוסן בעזרת טכניקה זו במחקר השוואה. DENV2, זן S16803 (רצף GenBank GU289914), היה מבודד מדגם החולה מתאילנד בשנת 1974, passaged בתאים C6/36. הווירוס היה passaged פעמיים בתאים Vero על ידי המרכז התייחסות העולם מתעוררים וירוסים, Arboviruses (WRCEVA) לפני זריקות העכבר. זה מדגים כי טכניקה זו פועלת באותה מידה גם עבור זנים שונים של ZIKV ושל אחרים flaviviruses שעשויה להיות לו השפעה על התפתחות המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל חיה להשתמש פרוטוקולים בצע את ההנחיות טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת דרום קליפורניה, אוניברסיטת של גאורגיה. המתת חסד שיטות סכרים בהריון ומבוגרים מבוצעות על פי פרוטוקולים שאושרו: חנק פחמן דו-חמצני, ואחריו נקע בצוואר הרחם כשיטה משנית כדי להבטיח המתת חסד. הגורים neonatal מורדמים ע י עריפת ראשו.
התראה: פרוטוקול הבאים כרוך בטיפול וירוס פתוגניים. זהירות נאות צריך להתייחס לטיפול את הוירוס. כל הפרוטוקולים תאושר ע י ראש המנזר הוועדה המוסדית המתאים לשימוש.
1. עובריים חיסון גרם של וירוס Zika
- להזדווגות מתוזמן בהריון, שקול בצהריים של יום לאחר ההזדווגות כמו E0.5. זוג עכברים בסוף היום וסמנו פקקים בשעות הבוקר המוקדמות כדי להפחית את השתנות זמן הזיווג.
- הכינו את המחט זכוכית לפני הניתוח. משוך את המחט, לחתוך ב- 1/3 אורכו, לאחר מכן לחדד בזווית של 45° בעזרת מטחנה micropipette עם טפטוף מים עד הנקבובית מותאם 50-70 מיקרומטר. הסימון עצות מחט תחת סטריאוסקופ איכות, שבירה.
- נחזיק בווירוס aliquot על הקרח. רק לפני הניתוח, לטעון את התמהיל הזרקת ZIKV לתוך המחט הזרקת זכוכית מוכן. להרכיב את המזרק הזרקת גז חזק (נפח µL 50) מצורף נעל-סכינים סטריליים, אבובים וירווה את המזרק התאספו עם הצנרת עם שמן מינרלי. ברגע רווי, לצרף את המחט, ולצייר ~ 6-7 µL ZIKV לתוך המחט (~ 1 µL הוא 1.7 × 106 TCID50/mL).
- להזריק C57BL בהריון/6J או 129S1/SvImJ עכברים עם עוברי E14.5 יום עובריים (להזרקה תוך-גולגולתי) או עוברי E10.5 (להזרקה תוך רחמי) עם קטמין הידרוכלוריד (80-100 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (5-10 מ"ג/ק"ג) מדולל בתמיסת סטרילי intraperitoneally כדי לגרום הרדמה ב האמא. לחלופין, עזים ומתנגד אמהות עם איזופלוריין איזופלוריין בפיקוח שסופקו על-ידי שאיפה, עם גז פסולת ניקוי, במידת הצורך. להזריק הבופרנורפין-SR (0.5-1.0mg/kg) subcutaneously לזירוז שיכוך כאבים.
- מבחן קמצוץ ומורדמת אמהות על קצה הבוהן או זנב, ואז להניח אותם פרקדן על רכיב pad שאושרו על-ידי חיה חימום (תרמי משטח של 100 x 200 2.5 מ מ). המלקחיים קמצוץ הבוהן אינם סטריליים, לא משמשים כדי להתמודד עם רקמות בניתוח. לחלופין, ניתן להשתמש ידיים בכפפות לבחון את רפלקס הנסיגה קמצוץ של הבוהן.
הערה: עיין שלך צוות וטרינרי מוסדי עבור perioperative המועדפת חימום בשיטה. כיסוי הוצב בין זה טמפון החיה. - הוסף אופטלמולוגיות משחה לעיניים.
- לגלח את פני השטח של הבטן ולחטא עם יוד ואלכוהול שלוש פעמים. לסירוגין את המגבונים יוד ואלכוהול; נגב בתנועה סיבובית מן האתר כירורגית.
- לעטוף את העור שמסביב באתר כירורגית עם בד סטרילי כדי למנוע זיהום של החתך והמכשירים.
הערה: פתיחת הכיסוי ותאבטחי לא צריך להיות גדול יותר מאשר באתר כירורגית מוכן; אין שיער צריך להיראות תלויה בפתיחה. - צובטים את העור של האם מן הבטן שלה עם מלקחיים, לחתוך את הבטן התחתונה בקו 1-1.5 ס מ על קו הסאגיטלי המדיאלי עם מספריים כירורגיים סטרילי. זה חותך העור ולא נוספת לתוך חלל הבטן כך העוברים חשופים כעת.
הערה: מספריים כירורגיים משמשות תחתכי את העור, שכבת הצפק. כלי סטרילי וכפפות משמשים עבור כל ניתוח. - לחתוך חתך באמצע גזה סטרילי קטן ולהחיל על גבי הפתח כירורגי. מימה עם מלח סטרילית. למשוך את העוברים דרך הסדק לנוח על גזה סטרילית, בזהירות כדי לא להסיר יותר מ 4-5 עוברי התמקדות קרן הרחם אחת בבת אחת.
- מימה העוברים עם מלח סטרילית לפני ובמהלך את חיסון כדי להבטיח שהם לא יתייבש. לשמור על מעקב אחר של העוברים אילו מוזרקים ואת המיקום שלהם בתוך הקרן הרחם. העוברים הבודדים נחשבים ניסויים נפרדים, ולכן כפי העוברים אינם משנים עמדה תוך פיתוח בתוך הרחם. (ממשיכים לצעוד 1.15 להזרקה תוך רחמי).
- הנח בעדינות מרית מתחת לראש של העובר. להאיר את העוברים עם מנורה כדי להמחיש את התפרים הראש והגולגולת.
הערה: מלווה הטכניקה Aseptic, כולל כפפות כירורגי סטרילי וכלי נגינה. לאחר יפגעו שאינו סטרילי פריטים (כגון המנורה), כפפות צריך להיות מוחלף עם כפפות סטריליות חדש לפני הטיפול סטרילי מכשירים ואזורי. - עמדה בראש על-ידי מניפולציה העובר עם המנורה (מאחורי הראש עבור ניראות) והן אצבעות חינם עד ראש העובר הקדמתי ישירות על הקיר הרחם, שנערך במקום עם היד האחרת.
הערה: מיקום העובר הוא חלק קריטי הטכניקה שיוביל בפועל רוב. מדי לחץ אצבע עלולה לגרום נזק בקרום embryonic שמוביל קטלני, לא מספיק לחץ עלולה להקשות את הזריקה. - השתמש בכלי הדם, מי שניצח את התפר הגולגולת כמדריך. מזריקים ZIKV וירוס (~ 1 µL, 1.7 × 106 TCID50/mL מקסיקני ולבודד MEX1-44) לתוך החדרים הצדדיים של מוח העובר E14.5 עם מזרק שהורכב ואת המחט. להשתמש בקרת מדיה כמו זריקה המזויפים.
- כדי לשפר את השמירה של ההריון, להימנע הזרקת ויראלי של שני העוברים בסמוך השחלות, שני העוברים ליד הנרתיק העליונה (איור 1 א'). בסך הכל, לא יותר מ 6 עוברי מוזרקים בכל המלטה כדי לצמצם את זמן הניתוח ולמנוע אובדן העובר.
- למקם את העוברים מוזרק לתוך הסכרים בהריון, ולמלא את חלל הבטן עם ~ 0.5 מ ל תמיסת מלח סטרילית. כדי לסגור, קודם תפר בשני לשריר הצפק בטן ולאחר מכן שנית תפר את שכבת העור החיצונית בתפרים סטרילי 4.0. . זה עדיף להשתמש התפרים קטעה; יש אפשרות של התבקעות הפצע אם העכבר לועס את התפר.
- הנח את העכבר בכלוב חלקית מונח על כרית החימום כדי לאפשר את העכבר כדי להימלט לאזור לא מחוממים במידת הצורך. מעקב האמהות בזמן השחזור (1-2 h) מן ההרדמה. לפתח את העוברים לאחר ניתוח מגוונים פעמים לפי ניסויים בודדים.
-
הזרקה תוך רחמי
- עם הרחם קרן אחת, העוברים חשופים, להשתמש מחט מזרק ו- 27G 1 מ"ל להחדיר וירוס Zika μL 100 (106 TCID50 יחידות הושעו ב 100 μL DMEM), או שליטה בינונית, לחלל תוך רחמי או לתוך הרקמה היפרדות. שים לב אילו עוברי יש הוזרק עבור ניתוח בשלב העוברי. ראה עבודה שפורסמו קודם לכן עבור פרטים נוספים18.
- המקום העוברים מוזרק לתוך הסכרים בהריון, ממלאים את חלל הבטן עם ~ 0.5 מ ל תמיסת מלח סטרילית. כדי לסגור, תחילה תפר את שריר הבטן הצפק ולאחר מכן שנית תפר את שכבת העור החיצונית בתפרים סטרילי 4.0. . זה עדיף להשתמש התפרים קטעה; יש אפשרות של התבקעות הפצע אם העכבר לועס את התפר.
- הנח את העכבר בכלוב חלקית מונח על כרית החימום כדי לאפשר את העכבר כדי להימלט לאזור לא מחוממים במידת הצורך. מעקב האמהות בזמן השחזור (1-2 h) מן ההרדמה. לפתח את העוברים לאחר ניתוח מגוונים פעמים לפי ניסויים בודדים.
2. neonatal חיסון גרם של וירוס Zika: P0/P1
- ודא כי מכשור רנטגן וטומוגרפיה גז חזק (נפח µL 10) של מחטים לא סתומים. נקי ובדוק על-ידי טעינת שלושה מזרקים חד פעמיות 20 מ עם מחטים 26-מד: אחד עם תמיסת מלח, אחד עם 70% אתנול, ואחד עם אוויר כדי לנקות את הפתרונות. לחטא עם אקונומיקה 10% אם השתמש בעבר עבור הזרקת וירוס.
- שמור וירוס על קרח. לטעון את המזרק מאת למלא. את זה עם מי מלח כדי לצמצם את נפח מת במזרק, לצייר µL 0.75 אוויר כדי להפריד את תמיסת החומר הזרקה.
- הגדרת תא ומחוממת שחזור humidified עבור הגורים מוזרק. בעזרת בלוק חימום, מיכל closeable (כגון תיבה ריקה עצה) עם גזה סטרילי מקם, ללחלוח עם תמיסת מלח. מחממים אותו לפני הפעלת זריקות.
- להגדיר את microinjector כולל המשאבה ואת הבקר. לקבוע את קוד סוג ההתקן עבור המזרק ספציפי (קרי, תחפש מזרק 10 µL, לסוג ההתקן הוא "D"). לקבוע את המהירות של הזרקה.
- לאסוף את הגורים כמחנכת יום 0 או 1 (P0/P1) ליד הגדרת כירורגי. לטעון את המזרק הזרקת בווירוס. לחטא ההר ראש pup עם 70% EtOH.
- לעטוף את הגורים בשכבה דקה של גזה ולקבור אותם לגמרי במקרה קרח כדי להגיע למצב של הרדמה. הגורים נמצאים cryoanesthetized עבור 5 דק. ודא כי הגורים הם מספיק ומורדמת להזרקה על-ידי ביצוע קמצוץ toe זנב ללא תגובה. זה מניב בערך 15 דקות של מדינת הרדמה.
- במקום הכלבלב על ראש הר, לעקר השטח של הראש עם יוד ו, אתנול (שלוש פעמים), לאחר מכן לנגב היבש עם מגבון סטרילי (אלכוהול איזופרופיל 70% EtOH).
- לסמן למבדה עם סמן שחור ולהקליט את הקואורדינטות-למבדה באמצעות מכשיר stereotaxic. למדוד המרחק למדא לקצה של העין, החל מ stereotaxic נקודות הציון של למדא לחשב את המרחק 2/5 של למדא לעין (עבור שתי ההמיספרות אם אתה מזריק שניהם).
- בדוק שנית את העומק הרדמה לפני יצירת חור בשביל ההזרקה. להשתמש בזהירות, באופן שטחי לנקב את הקרקפת והגולגולת במיקום ההזרקה (הגולגולת הוא רך מאוד ב- neonates) כדי ליצור פתח המחט הזרקת של מחט בקוטר 26.
- להנמיך את המחט הזרקה אל המיקום מנוקבת, לאחר המחט פשוט פרצו את העור, לחשב 1 מ מ לעומק על ההזרקה (לרוחב החדר) באמצעות מכשיר stereotaxic.
- ברגע שהמחט הוא הוריד את העומק הזרקה, לתכנת את microinjector כדי להזריק: 1 µL של וירוס, בקצב של 10 nL/s, הזרקת כ 1 µL מעל 1.5 דקות (~ 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV).
- כאשר הזריקה מסיים, חכה 30 s, ומשכו את המחט במרווחים 0.5 מ מ על-ידי סיבוב הבורג (dorsally), מחכה 30 s לאחר כל תוספת.
הערה: זה מפחית את בריחת של הוירוס שהוחדר. - ברגע הוסר, גם במהירות טעינת מחט של מזרק עם וירוס נוסף (נגיפים שונים או פקדים מבוים יש לטעון מזרקים נפרד/מחטים) או להסיר את הכלבלב מן ההר ראש אל התא humidified מראש ומחוממת. לפקח על הכלבלב כל כמה דקות כדי לאמוד את השחזור. החלף את הגורים שלה המלטה.
3. למבוגרים חיסון גרם של וירוס Zika
- להזריק עכברים בוגרים intraperitoneally עם קטמין הידרוכלוריד (80-100 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (5-10 מ"ג/ק"ג) מעורבבת עם מלח סטרילית כדי לגרום הרדמה. להזריק הבופרנורפין-SR (0.5-1.0mg/kg) subcutaneously לזירוז שיכוך כאבים. הבוהן/זנב לצבוט את העכבר כדי להבטיח למצבו הרדמה ולאחר מכן לעלות אותו על המכשיר stereotaxic (עם כרית חימום) כדי לשתק את הראש במהלך הניתוח.
- הוסף אופטלמולוגיות משחה לעיניים כדי למנוע את העיניים של העכבר מתייבש במהלך הניתוח. לגלח את הקרקפת מתחיל בעיניים להתחלה של האוזניים. לחטא את העור חשוף עם יוד ו- 70% EtOH שלוש פעמים. לסירוגין את המגבונים יוד ואלכוהול; נגב בתנועה סיבובית מן האתר כירורגית.
- בדוק שנית את העומק הרדמה לפני אם העור. באמצעות אזמל, תגרום עושים חתך 0.5 ס מ לאורך הקו הסאגיטלי המדיאלי של הראש מיקום מעוקר, חשיפת bregma. באמצעות תנועה מתגלגל המוליך שקצהו כותנה, נקה את פני השטח של הגולגולת של רקמות של קרום המוח, בזמן בו זמנית לדחוף את העור מן האתרים הזרקה.
- החל מ- bregma, ליישר את המקדחה כירורגי ולזהות את האתרים הזרקה בעזרת הקואורדינטות הבאות: AP -0.5 מ. מ., ML: + /-1.5 מ מ. בעזרת דוושת רגל שליטה, לקדוח לתוך הגולגולת לאט כדי לקדוח רק עצם עד חור נוקתה המחט.
- החלף את התרגיל עם משאבת microinjector ועם מזרק גז חזק (נפח µL 10)-stereotaxic. שעזב את בועת אוויר קטן בין תמיסת מלח הנגיף, לצייר ~ 4-5 µL של וירוס. לקבוע את קוד סוג ההתקן עבור אמצעי האחסון מזרק מסוים (כלומר, D עבור 10 μL נפח מזרק). להנמיך את המחט to DV:-1.5 מ מ פני המוח. כדי להזריק µL 1 של וירוס, תוכנית שיעור של 10 nL/s, הזרקת כ 1 µL מעל 1.5 דקות.
- כאשר הזריקה מסיים, חכה 30 s, ולהסיר את המחט במרווחים של 0.5 מ מ, מחכה 30 s לאחר כל תור. זה מפחית זרם אחורי ודליפה של הוירוס שהוחדר.
- כאשר סיים את injection(s), להשתמש מלקחיים כדי לשחרר את העור ולשחזר את הגולגולת חשוף. תפר הקרקפת בחזרה יחד בעזרת תפרים 4.0 ולהסיר את העכבר מן הכלי stereotaxic. המקום העכבר בתוך כלוב חלקית מונח על כרית החימום כדי לאפשר את העכבר כדי לברוח לאזור לא מחוממים במידת הצורך, מעקב בזמן השחזור (1-2 h) מן ההרדמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
להחליפן בתמונות שלנו שיטות הזרקה חיסון ZIKV של המוח העוברי של מוצגים בדיאגרמות המתארים גרם זריקות (איור 1 א'), תוך רחמי וזריקות intraplacental (איור 1B), הממחישות דרך סכר בהריון ואת עוברי צריך להציג אותו מונחה לניתוח (פרוטוקול חיסון עובריים). איור 2A תערוכות ZIKV (MEX1-44) זיהום (immunostained עם הנוגדן כנגד אנטיגן קבוצה flavivirus, ירוק) בקליפת E18.5. Pax6 (אדום) תוויות NPCs בקליפת המתפתח. ZIKV מחוסנת למוחות עובריים E14.5. שימוש TCID50 וזמינותו של דגימות רקמה7, ניתוחים עקומת הגדילה שלנו מראים את ZIKV יכול ביעילות לשכפל ו הגדלים בתוך המוח המתפתח (איור 2B, 2 ג), כפי שפורסם7. איור דו-ממדי מציג זיהום מוצלח עם DENV2 קליפת המוח המתפתח באמצעות שיטת חיסון עובריים. DENV2 מזוהה באמצעות נוגדן כנגד אנטיגן קבוצה flavivirus (ירוק). איור 2E מדגים זיהום עם זן שונה של ZIKV, שושלת היוחסין אפריקאי (מר-766). איור 2F מדגים זיהום נציג עבור חיסון intraplacental חלופית-המסלול, ZIKV-אסיה (MEX1-44) בשלב E10.5.
איור 3A היא דיאגרמה המתארת את ציוני הדרך להשתמש כדי לזהות את המיקום של הזרקה לתוך החדרים הצדדיים עבור חיסון ZIKV של הגורים P0/1. איור 3B מראה הזיהום ZIKV (MEX1-44) ב P13 קליפת המוח לאחר הזרקת P0/1. ZIKV (MEX1-44) מזוהה באמצעות נוגדן כנגד אנטיגן קבוצה flavivirus (אדום). איור 4 מציג את החרוזים פלורסנט (אדום) שהיו בשימוש כדי לתרגל את מיקום ההזרקה, והצלחה לרוחב החדר זריקה אצל מבוגרים.
איור 1: חיסון עובריים של ZIKV. דיאגרמה (A) המייצג את החשיפה של קרן הרחם אחד, עם פתק כדי למנוע הזרקה של העוברים סמוך לנרתיק, העובר לרוחב ביותר לאורך ' קרן '. דיאגרמה (B) המייצג את החשיפה של קרן הרחם אחד, המתארות את המיקום של intraplacental, זריקות תוך רחמי. דיאגרמות אלה שונו הפרסום המקורי שלהם21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: חיסון עובריים ZIKV ב E14.5. (א)-E18.5 המוח העוברי נגוע עם ZIKV-אסיה (MEX1-44) על פני כל השכבות של קליפת המתפתח (סולם בר הוא 200 מיקרומטר). עצבית ובתאים הם immunolabeled עם Pax6 (אדום) ו- ZIKV ויה flavivirus אנטיגן (ירוק). TCID50 (B) נובעת רקמת המוח היום כמחנכת 3 (P3) מחוסן-E14.5 עם ZIKV-אסיה (MEX1-44). קווי שגיאה מצביעות על s.e.m. של שלוש מדידות עצמאי עם אחד מעושה, מח אחד נגוע ZIKV בתוך כל אחת מהמידות (* * *p < 0.0001, מבחן t של סטודנט)7. (ג) TCID50 תוצאות המתארת עקומת אופיינית גדילה מוגברת של ZIKV viremia ברקמת המוח העוברי נגוע. קווי שגיאה מציינים את s.e.m. של שלוש מדידות עצמאי עם אחד מעושה והמוח ZIKV-אסיה (MEX1-44) נגוע אחד בתוך כל אחת מהמידות. ניתוח השונות (ANOVA) מזהה עלייה משמעותית בויראלי כייל נוגדנים כמו פיתוח מתקדם7. (D) וירוס דנגה (DENV2) נגוע היסטולוגיה נציג (E14.5 עוברי מחוסן עם ~ 1 µL של 3.4 x 105 TCID50/mL, סולם בר הוא 200 המ) ו- (E) ZIKV-אפריקה (MR766) נגוע נציג היסטולוגיה (סולם בר מיקרומטר 200). (F) ZIKV-אסיה (MEX1-44) נגוע היסטולוגיה נציג של האסטרטגיה הזרקת intraplacental (סולם בר הוא 200 מיקרומטר). בכל התמונות, Hoechst כתמי גרעינים. הדמויות שונו הפרסום המקורי שלהם7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: היסטולוגיה נציג של P1 חיסון של ZIKV. (א) תרשים הממחיש את השיטה כדי לקבוע את המיקום הזרקה לתוך החדרים הצדדיים ולהמליט P1. Immunostained נציג cryosections הילתית (B) עבור flavivirus אנטיגן קבוצה עם נמוך (מימין, סולם בר הוא 100 מיקרומטר) וגבוהה (בצד ימין, סולם בר הוא 50 מיקרומטר) הגדלה של P1 חיסון של ZIKV-P15 (~ μl 3.4 x 10 15 TCID50/mL ZIKV). Hoechst כתמי גרעינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: מבוגר – שלב הזרקת ע. העכבר למבוגרים מוזרק עם חרוזים פלורסנט הוקרב זמן קצר לאחר הניתוח כדי לקבוע את ההצלחה מיקום ההזרקה (סולם בר הוא 200 מיקרומטר). Cryosection הווריד יכול להציג מיד לאחר חלוקתה כמו חרוזים אינם דורשים יותר מכתים. Hoechst כתמי גרעינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המתוארים כאן היא שיטת חיסון גרם של ZIKV בשלבים עובריים neonatal, למבוגרים עבור החקירה של ZIKV-induced נזקים בהתפתחות המוח. אמנם פשוטה, ישנם מספר שיקולים חוקרים שעליך לבצע כדי לוודא את איכות העבודה ואת הבטיחות של המעורבים.
DENV קשורה קשר הדוק ZIKV של הסוג flavivirus. DENV לא סיבתי חובר הפרעות מוח בילדים בבני אדם. DENV2 בהצלחה ניתן להדביק, לשכפל במוח המתפתח באמצעות שיטת חיסון עובריים (~ 1 µL של 3.4 x 105 TCID50/mL) (איור דו-ממדי). לכן, בנוסף נגוע Vero תא מדיה (מדומה), זיהום DENV יכול לשמש פקד שלילי ללימוד פתוגנזה ZIKV ספציפיים במוח המתפתח. חשוב למנוע וירוס זליגת בתוך הרחם, אשר עלולה לגרום זיהום בלתי רצויים אחרים העוברים. לכן, זה הכרחי לוודא אנשים נגועים, לבריא דרך לבודד את רקמת המוח של העובר כל ואחריו לרביעיית-PCR או וזמינותו TCID50. ניתן להוסיף צבע המדיום ויראלי חזותית לאשר את הזריקה, אבל בדיקה כדי להבטיח כי לצבוע אינו גורם נזק עצמו.
העכבר זנים להפגין צמיחה השתנות, לכן P1 הזרקת מיקומים צריך לאמת עבור כל קו העכבר. לבצע זריקה neonate מעושה עם חרוזים פלורסנט להמחיש ההזרקה. מחקר ראשוני זה יודיע אם הזריקה מגיעה הנוזלים או נכנסת עמוק מדי לתוך רקמת המוח. לקבלת תוצאות אידיאלי, הגורים יכולים להקריב זמן קצר לאחר ההזרקה לזהות את מיקומו של חרוזים פלורסנט בחלל. בראש כל הגורים ניתן לתקן בן לילה, מוטבע, ו- cryosectioned כדי לבחון את המיקום הזרקה מדויקת. הזרקת עם המזרק רווי שמן דורש ניסיון, מומלץ לתרגל את השימוש זריקות דמה עם צבע על גבי מצלמות-מיקרוסקופים כדי לאמת העוצמה הזרקה מדויקת.
אמצעי אבטחה הם קריטיים במחקרים אלה כדי למנוע זיהום מקרית של עובדי מעבדה עובד עם הווירוס. אישורי אבטחה חייב להיעשות מראש במתקן שבו הושלמה העבודה. ZIKV נחשב חיידק אבטחה ברמה 2 (BSL2) על ידי ארצות הברית המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן. כל אדם עובד עם הווירוס או לעבוד באזורים שבו מטופל הנגיף צריך להיות מודע להיכרות עם פרוטוקולי אבטחה במוסד שלהם. כל כלים ומשטחים חשופים ZIKV או DENV2 צריך להיות נקיים עם 10% מלבין להרוס שנותרו נגיפים לאחר השימוש. נשים בהריון או מנסה להרות, מומלץ לא לקיים אינטראקציה עם שטחי מחקר נחשפים ZIKV או DENV2. כל רקמה משמש היסטולוגיה המתוקנים ב- 4% מחברים כדי להשבית את וירוסים לניתוח. אחסון של culturing הנגיף צריך להיעשות בתאים Vero ברדס המיועד לעבודה BSL2. ניתן לכמת רקמות טיטור ווירוסים מניות באמצעות פרוטוקול TCID50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים רוצה להכיר את ד ר Benraiss אללטיף ב אוניברסיטת רוצ'סטר עבור ההדרכה שלו ודיונים רלוונטיים למידה למבוגרים כירורגי וטכניקות neonate. המחברים גם רוצה להכיר ד ר ג'יימס לודרדייל-עוגה עבור השימוש שלו ציוד stereotaxic ודיונים הקשורים הגדרת את המתודולוגיה של טכניקה זו, ולקידום עבור מדענים המכללה מחקר (קשתות) הרישמי שלהם התמיכה והתמיכה שלנו NIH (NINDS מעניקה R01NS096176-02, R01NS097231-01, & F99NS105187-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | - | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | - | |
| Mineral Oil | VWR | - | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
