Summary
Здесь мы описываем метод для создания модели Зика вирус индуцированной микроцефалия в мыши. Этот протокол включает методы для эмбриона, новорожденных и взрослых стадии внутримозговых прививка Зика вируса.
Abstract
Зика вирус (ZIKV) является flavivirus в настоящее время эндемическим в Северной, Центральной и Южной Америке. Сейчас установлено, что ZIKV может вызвать микроцефалия и дополнительные мозга аномалии. Однако механизм, лежащий в основе патогенеза ZIKV в развивающийся мозг остается неясным. Внутримозговых хирургические методы часто используются в неврологии исследований для решения вопросов о развитии нормальных и ненормальных мозга и функции мозга. Этот протокол использует классический хирургических методов и описывает методы, которые позволяют модель ZIKV-связанные неврологических заболеваний человека в нервной системе мыши. Хотя прямые мозга прививка не модели нормальный режим передачи вируса, метод позволяет следователям целевой вопросы, касающиеся последствие после ZIKV инфекции развивающегося мозга. Этот протокол описывает эмбриональных, у новорожденных и взрослых этапов внутрижелудочкового прививки ZIKV. Как только освоил, этот метод может стать простым и воспроизводимый метод, который занимает всего несколько часов, чтобы выполнить.
Introduction
Микроцефалия это состояние в результате развития дефектных мозга характеризуется меньше, чем средний размер головы у новорожденных. Дети с микроцефалия exhibit целый ряд симптомов, которые могут включать задержки развития, захват, умственной инвалидности, потеря слуха, проблемы со зрением и проблемы с движением и баланса, среди прочего, в зависимости от тяжести заболевания и Причина1,2,3. Это условие является многофакторной в природе, с генетическими, инфекционного агента и экологические факторы, связанные с вызывая микроцефалия4,5,6,,78, 9. До 2015-2016 ZIKV вспышки 8 из 10 000 рождений детей были диагностированы с микроцефалия в Соединенных Штатах согласно CDC10. На 1 февраляst 2016 года Всемирная организация здравоохранения объявила Зика вирус общественного здравоохранения чрезвычайная международная озабоченность ввиду тревожного увеличения числа диагнозов микроцефалия, связанные с ZIKV инфекции у матери11, 12. Недавнее исследование от CDC на ZIKV дела в Соединенных Штатах свидетельствует о том, что матери ZIKV инфекции приводит к кратной повышенный риск для ребенка развивать микроцефалия, по сравнению с неинфицированным лицам и 4% ZIKV инфицированных матерей от США привели к дети с микроцефалия11. Скорость связанные микроцефалия врожденных дефектов во время беременности от инфекции ZIKV в Бразилии, как сообщается, повлияли на 17% младенцев в ВИЧ-инфицированных матерей, указав, что повышенного риска может способствовать другие факторы в Латинской Америке 13. в то время как мы знаем, что ZIKV может вызвать микроцефалия и патогенез в нейронных прогениторных клеток (NPC) населения7,8,14, полный патогенез ZIKV в развитии мозга остается труднодостижимой. Важно развивать животных моделей для дальнейшего изучения болезни механизмы, лежащие в основе патологий мозга, связанные с ZIKV инфекцией.
Напрямую изучить воздействие ZIKV на развитие мозга, мы впервые разработана модель мыши, с помощью внутримозговых прививка эмбриональных день 14,5 (E14.5) мозга с ZIKV7. Этот этап был выбран как это считается представителем в конце первого триместра в человеческой беременности14. Щенков может выжить до послеродового день 5 (P5) с этот метод эмбриональных внутримозговых инъекции (~ 1 мкл 1,7 x 106 Культура ткани инфекционный дозы (TCID50/мл)). Эти послеродовой щенков демонстрируют широкий спектр фенотипов, аналогичным образом наблюдается в инфицированных человеческих младенцев, включая увеличение желудочков мозга, нейронные потерю, аксональное разрежения, astrogliosis и микроглии активации12,15. Мозг новорожденного мыши относительно незрелых, сродни стадии развития человеческого мозга в середине беременности16, и развитие мозга мыши включает в себя основные постнатальный компонент. Для изучения более поздней беременности стадии инфекции, также описан метод для послеродовой инфекции. Новорожденных заражены ZIKV на P1 способны выжить до 13 дней после инъекции. Кровь родился взрослой стадии инфекции была описана в мыши ранее17 но требует использования транскрипции регулирования фактор (МАФ) интерферон (ИФН) факторы МАФ-3, -5,-7 Двухместный нокаут штамма. Этот протокол описывает метод прививки ZIKV intraventricularly обойти отключение противовирусное ответ мышиных модели в взрослых. Хотя это обходит мышиных иммунной системы, этот маршрут инъекций непосредственно не подражать типичный маршрут инфекции. Для устранения этого несоответствия непосредственно, экспериментатор можно выполнить внутриутробная инфекция ZIKV вместо внутричерепных маршрут. Принято от предыдущей работы18, мы кратко описали эту технику в этом протоколе эмбриональных инфекции.
Штаммы вируса Зика, Реализовано с помощью этого метода включают мексиканской изолировать MEX1-447,19 и Африканской изолировать MR-766 изолированы в 1947 году20. Зика MEX1-44 был изолирован в штате Чьяпас, Мексика в январе 2016 из зараженных Aedes aegypti комаров. Мы получили этот вирус с разрешения через университет Техаса Медицинское отделение на Галвестон (UTMB). Кроме того серотипа вируса денге 2 (DENV2) был засеян, используя эту технику в исследовании сравнение. DENV2, штамм S16803 (последовательностей GenBank GU289914), был изолирован от пациента выборки из Таиланда в 1974 году и пассированной в клетках С6/36. Вирус был пассированной дважды в клетках Vero Всемирный консультационный центр для новых вирусов и арбовирусов (WRCEVA) до мыши инъекции. Это показывает, что этот метод работает одинаково хорошо для различных штаммов ZIKV и других flaviviruses, которые могут иметь влияние на развитие мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные используют протоколы следовать руководящие принципы ухода за животными в университете Южной Калифорнии и в Университете Джорджии. Методы эвтаназии для беременных плотин и взрослых производятся согласно утвержденным протоколы: удушение двуокиси углерода, следуют шейки матки дислокации как дополнительный метод для обеспечения эвтаназии. Новорожденных щенков умерщвлены путем обезглавливания.
Предупреждение: Следующий протокол предполагает обработку патогенного вируса. Надлежащие меры предосторожности должны приниматься при обработке вируса. Все протоколы должны быть одобрены соответствующие институциональные Комитета до использования.
1. эмбриональных внутримозговых прививка Зика вируса
- Для приурочен беременных спаривания, рассмотрим полдень на следующий день после спаривания как E0.5. Пару мышей в конце дня и проверьте заглушки рано утром для сокращения вариабельности спаривания время.
- Подготовка стекла иглы до операции. Вытащить иглу и разрезать на 1/3 своей длины, а затем точить под углом 45°, с помощью микропипеткой мясорубку с капельной воды до тех пор, пока поры размером до 50-70 мкм. Проверьте концы иглы под стереоскоп для качества и поломки.
- Держите вирус аликвота на льду. Просто до операции Загрузите микс ZIKV инъекции в подготовленных стеклянных иглу. Соберите газонепроницаемой инъекции шприца (50 мкл объем), luer-lock вложения и труб и насыщают собрал шприц с трубки с минеральным маслом. Как только насыщенных, приложите иглы и рисовать ~ 6-7 мкл ZIKV в иглу (~ 1 мкл-1.7 × 106 TCID50/мл).
- Придать беременных C57BL/6J или 129S1/SvImJ мышей эмбриональных день E14.5 эмбрионов (внутричерепная инъекций) или E10.5 эмбрионов (для внутриутробного инъекций) с кетамина гидрохлорид (80-100 мг/кг) и ксилазина (5-10 мг/кг) разводят стерильным физиологическим раствором внутрибрюшинно навести анестезии в мать. Кроме того анестезировать матерей с контролируемых изофлюрановая изофлюрановая, предоставляемый ингаляции, с очистки отходящих газов, если это уместно. Придать бупренорфин SR (0.5-1.0mg/kg), подкожно в том, чтобы побудить анальгезии.
- Щепотка тест под наркозом матерей на кончик пальца или хвост и затем разложите их лежа на животных утвержденного грелку (теплопроводящая прокладка 2,5 100 x 200 мм). Мыс щепотку щипцы не стерильных и не используется для обработки тканей в хирургии. В качестве альтернативы перчатках может использоваться для проверки рефлекс вывод щепотку мыс.
Примечание: Обратитесь к сотрудникам институциональных ветеринарные для предпочтительного периоперационных способ нагрева. Кавер был помещен между электрогрелки и животного. - Добавьте глазной мази в глаза.
- Брить поверхности живота и стерилизовать йодом и алкоголя в три раза. Чередовать йода и алкоголя салфетки; Протирайте круговыми движениями от хирургической сайта.
- Натягивание кожи вокруг хирургического сайт с Стерильные салфетки чтобы избежать загрязнения разрез и инструментов.
Примечание: Драпировка открытие не должно быть больше, чем готовы хирургической сайта; нет волос следует рассматривать в открытии пелерина. - Ущипнуть кожу матери от ее живот с щипцами и сократить нижней части живота в линии 1-1,5 см на медиальной сагиттальной линии с стерильные хирургические ножницы. Это врезается в кожу и дальше в брюшной полости, так что теперь подвергаются эмбрионов.
Примечание: Хирургические ножницы используются для надрезать кожу и перитонеальной слоя. Стерильные инструменты и перчатки используются для каждой операции. - Cut щели в середине небольшой стерильные марлевые и применить на вершине хирургическое открытие. Гидрат с стерильного физиологического раствора. Вытяните эмбрионов через прорезь на стерильную марлю, с осторожностью, чтобы не удалить более чем 4-5 эмбрионов упором на один рога матки в одно время.
- Гидрат эмбрионов с стерильного физиологического раствора до начала и на протяжении прививка чтобы убедиться, что они не высохнуть. Keep track of какие эмбрионы вводят и их расположения в рога матки. Отдельных эмбрионов, таким образом, рассматриваются как отдельные эксперименты, как эмбрионы не изменяйте положение при разработке в утробе матери. (Продолжают шаг 1.15 для внутриутробного инъекций).
- Осторожно поместите шпатель под руководством начальника эмбриона. Осветить эмбрионы с лампой для визуализации головы и череп швы.
Примечание: Асептический технику следует, включая стерильные хирургические перчатки и инструментов. После манипулируют нестерильные предметы (например, лампы), перчатки должны быть заменены новым стерильные перчатки до обработки стерильных инструментов и областей. - Позиция головы, манипулируя эмбриона с лампой (за голову для видимости) и бесплатно пальцы до тех пор, пока голова эмбриона толкнул вверх непосредственно к стенке матки и удерживается на месте с недоминирующей руки.
Примечание: Позиционирование эмбриона является критической частью и метод, который принимает практике, большинство. Слишком большое давление пальца может повредить мембраны embryonic, ведущих к летальность и не хватает давления может затруднить инъекции. - Используйте кровеносных сосудов, идущую вдоль швов черепа как руководство. Внедрить вирус ZIKV (~ 1 мкл, 1.7 × 106 TCID50/мл мексиканской изолировать MEX1-44) в боковых желудочков мозга эмбриона E14.5 с собрал шприц и иглу. Использование управления СМИ как фиктивный инъекции.
- Для улучшения сохранения беременности, Избегайте вирусных инъекции двух эмбрионов рядом с яичниками и двух эмбрионов рядом с верхней влагалище (рис. 1A). В целом не более чем 6 эмбрионы вводят за литр сократить время операции и предотвращения потери эмбриона.
- Место эмбрионы вводят обратно в беременных самок и заполнить брюшной полости с ~ 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Чтобы закрыть сначала шовные оба брюшной мышцы брюшной полости и, во-вторых шовные внешней кожи слой с 4.0 стерильная швами. Предпочтительнее использовать Прерванный швов; Существует возможность зияние раны, если мышь жует шовный материал.
- Поместите курсор мыши в клетке, частично опираясь на грелку, чтобы позволить мыши бежать без подогрева области при необходимости. Контролировать матери пока они восстановить (1-2 ч) от анестезии. Развитие эмбрионов после хирургии для разнообразных раз согласно индивидуальных экспериментов.
-
Внутриутробная инъекций
- С одним рога матки и эмбрионы воздействию, использовать 1 мл шприц и 27G иглы для вставки 100 мкл Зика вирус (106 TCID50 единиц приостановлено в 100 мкл DMEM), или управления среднего, в пространство внутриутробной или в плацентарной ткани. Обратите внимание, какие эмбрионы были введены для вскрытия эмбриональной стадии. Ранее опубликованные работы для больше детали18см.
- Место эмбрионы вводят обратно в беременных самок и заполнить брюшной полости с ~ 0,5 мл стерильного физиологического раствора. Чтобы закрыть сначала шовные брюшной мышцы брюшной полости и, во-вторых шовные внешней кожи слой с 4.0 стерильная швами. Предпочтительнее использовать Прерванный швов; Существует возможность зияние раны, если мышь жует шовный материал.
- Поместите курсор мыши в клетке, частично опираясь на грелку, чтобы позволить мыши бежать без подогрева области при необходимости. Контролировать матери пока они восстановить (1-2 ч) от анестезии. Развитие эмбрионов после хирургии для разнообразных раз согласно индивидуальных экспериментов.
2. новорожденных внутримозговых прививка Зика вируса: P0/P1
- Убедитесь, что газонепроницаемый шприцы (объем 10 мкл) и иглы не забиты. Очистить и проверить путем загрузки три 20 мл-шприцы с иглами 26-го калибра: один с соленой, один с 70% этиловом спирте и один с воздуха для очистки решения. Стерилизуйте с хлоркой 10%, если ранее использовались для инъекций вирус.
- Держите вирусы на льду. Загрузить шприц, наполнив его физиологического раствора для уменьшения мертвого объема в шприц и рисовать 0,75 мкл воздуха отделить физиологический раствор от инъекционного материала.
- Настройка утепленные увлажненные восстановления камеру для вводят щенков. С помощью блока Отопление, поместите контейнер closeable (например поле Подсказка пустым) с стерильной марлей и увлажнить с соленой. Подогрейте его перед началом инъекций.
- Настройка microinjector, включая насос и контроллер. Определить код типа устройства для конкретных шприц (то есть, для 10 мкл шприц, тип устройства — «D»). Определите скорость впрыска.
- Соберите послеродовой день 0 или 1 щенков (P0/P1) вблизи Хирургические установки. Загрузите инъекции шприц с вирусом. Лечить голову горе щенка с 70% EtOH.
- Оберните детенышей тонким слоем марли и похоронить их полностью во льду для достижения анестезии государство. Щенков, cryoanesthetized на 5 мин убедитесь, что щенки достаточно наркозом для инъекций, выполняя щепотку хвост/мыс без ответа. Это дает примерно 15 мин обезболивающий государства.
- Поместите щенка на головы горе, стерилизовать поверхности головы с йодом и этанола (три раза) и затем протрите сухой стерильной салфеткой (изопропиловый спирт или 70% EtOH).
- Марк лямбда с черным маркером и записывать координаты лямбда, с использованием стереотаксического инструмента. Измерить расстояние от лямбда до края глаз и начиная с стереотаксического координаты лямбда вычислить расстояние 2/5 от лямбда в глаза (для обоих полушарий, если вы инъекционных оба).
- Повторно проверьте обезболивающий глубину до создания отверстие для укола. Используйте 26-иглы для тщательно и поверхностно прокола кожи головы и черепа в месте инъекции (череп очень мягкой новорожденных) создать отверстие для инъекционной иглы.
- Опустите иглу в Проколотые местоположение и после того, как иглы всего нарушило кожи, рассчитать глубину 1 мм для инъекции (бокового желудочка) с использованием стереотаксического инструмента.
- После того, как иглы опускается на глубину инъекции, программа microinjector для вставки: 1 мкл вируса, в размере 10 nL/s, инъекционных примерно 1 мкл свыше 1,5 мин (~ 1 мкл 3,4 x 105 TCID50/мл ZIKV).
- Когда заканчивается инъекции, подождите 30 сек и отозвать иглы с шагом 0,5 мм, повернув винт (дорсально), в ожидании 30 s после каждого приращения.
Примечание: Это уменьшает утечки вводят вируса. - После удаления, либо быстро загрузить иглы и шприца с более вирус (различные вирусы или макет элементов управления должны быть загружены в отдельные шприцы/иглы) или удалить щенка из головы горе подогретым увлажненные палату. Следить за щенком каждые несколько минут, для оценки восстановления. Замените его помет щенков.
3. Взрослый внутримозговых прививка Зика вируса
- Придать взрослых мышей внутрибрюшинно с кетамина гидрохлорид (80-100 мг/кг) и ксилазина (5-10 мг/кг) разводят в стерильного физиологического раствора побудить анестезии. Придать бупренорфин SR (0.5-1.0mg/kg), подкожно в том, чтобы побудить анальгезии. Мыс/хвост масштабирования мыши, чтобы обеспечить ее анестезии государство и впоследствии смонтировать его на стереотаксического инструмента (с электрогрелки) для иммобилизации голову во время операции.
- Добавьте глазной мази в глаза, чтобы предотвратить глаза мыши от пересыхания во время операции. Бритье головы, начиная за глаза к началу по уши. Стерилизовать открытые участки кожи с йодом и 70% EtOH три раза. Чередовать йода и алкоголя салфетки; Протирайте круговыми движениями от хирургической сайта.
- Повторно проверьте обезболивающий глубину до промо кожи. С помощью скальпеля, сделайте 0,5 см разрез вдоль медиального сагиттальной линии головы в стерилизованные месте, подвергая bregma. С помощью подвижного движений с ватным наконечником аппликатором, снимите поверхности черепа менингеальные тканей, одновременно прижимая кожи от инъекции сайтов.
- Начиная с bregma, выровняйте Хирургические сверла и определить места инъекции, используя следующие координаты: AP -0,5 мм, мл: +/-1.5 мм. с помощью ножной педали управления, углубиться в череп относительно медленно только сверлить кости до тех пор, пока расчищаются отверстие для иглы.
- Замените microinjector насос и газонепроницаемой шприца (объем 10 мкл) на стереотаксического сверла. Оставляя небольшой воздушный пузырь между физиологическим раствором и вирус, нарисуйте ~ 4-5 мкл вируса. Определите код типа устройства для конкретных шприц тома (т.е., D 10 мкл объема шприца). Опустите иглу в DV: -1,5 мм от поверхности мозга. Чтобы придать 1 мкл вируса, программа скоростью 10 nL/s, инъекционных примерно 1 мкл более 1,5 мин.
- Когда заканчивается инъекции, подождите 30 сек и удалите иглу с шагом 0.5 мм, ожидания 30 секунд после каждого поворота. Это уменьшает противотока и утечки вводят вируса.
- По окончании injection(s) Используйте щипцы для разрыхления кожи и восстановить подвергаются черепа. Шовный материал, волосистой части головы обратно вместе с помощью 4.0 швы и удалить мыши из стереотаксического инструмента. Место мыши в клетке, частично опираясь на грелку позволяет мыши, чтобы бежать без подогрева область, если необходимо и следить за то время, как они восстановить (1-2 ч) от анестезии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Представитель изображения наших методов впрыска для прививки ZIKV эмбриональных мозга отображаются в диаграммах, изображающие внутримозговых инъекции (рис. 1A) и внутриутробной и intraplacental инъекции (рис. 1B), иллюстрирующие путь беременных дам и эмбрионы следует оценивать и ориентированы для хирургии (протокол эмбриональных прививка). Рисунок 2A экспонатов ZIKV (MEX1-44) инфекции (immunostained с антителами против flavivirus группы антигена, зеленый) в коре E18.5. Pax6 (красный) этикетки НИПы в развивающихся коры. ZIKV был засеян в эмбриональных мозги E14.5. С помощью TCID50 assay от образцов ткани7, наш рост кривой анализы показывают, что ZIKV можно эффективно реплицировать и расти в развивающемся мозге (Рисунок 2B, 2 C), опубликованного7. 2D рисунок показывает успешное инфекции с DENV2 в развивающемся коры, с использованием метода эмбриональных прививка. DENV2 обнаружен с помощью антитело против антигена группы flavivirus (зеленый). 2E рисунок демонстрирует инфекции с другой штамм ZIKV, Африканский lineage (MR-766). 2F рисунок демонстрирует представитель инфекции для прививки intraplacental альтернатива маршрут, ZIKV-Азия (MEX1-44) на стадии E10.5.
На рисунке 3A является диаграмма, изображающая достопримечательности, используется для определения местоположения инъекции в боковых желудочков для ZIKV вакцинация щенков P0/1. Рисунок 3B показывает ZIKV (MEX1-44) инфекции в коре P13 после инъекции P0/1. ZIKV (MEX1-44) обнаруживается с помощью антител против антигенов группы flavivirus (красный). Рисунок 4 показывает флуоресцентные бусины (красный), которые были использованы на практике инъекций местоположение и успех инъекционного бокового желудочка в взрослых.
Рисунок 1: эмбриональных прививки ZIKV. (A) схему, представляющую воздействия одного рога матки, с запиской, чтобы избежать инъекции эмбрионов, прилегающих к влагалище и наиболее боковой эмбриона вдоль Африканского Рога. (B) схема, представляющая воздействия одного рога матки, изображающие расположение intraplacental и внутриутробное инъекции. Эти схемы были изменены с их оригинальной публикации21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: эмбриональных прививки ZIKV в E14.5. (A) на E18.5 инфицированных эмбриональных мозга с ZIKV-Азия (MEX1-44) на всех слоях развивающихся коры головного мозга (шкалы бар – 200 мкм). Нейронные прогениторных клеток, полученных с Pax6 (красный) и ZIKV через антиген flavivirus (зеленый). (B) TCID50 результаты от послеродового день 3 (P3) ткани мозга привиты на E14.5 с ZIKV-Азия (MEX1-44). Планки погрешностей указывают s.e.m. трех независимых измерений с одним макет и один ZIKV-инфицированных мозг в каждом измерении (***p < 0,0001, t критерия Стьюдента)7. (C) TCID50 результаты, описывающих типичные рост кривой ZIKV виремии в тканях инфицированных мозга плода. Планки погрешностей указывают s.e.m. трех независимых измерений с одним макет и один ZIKV-Азия (MEX1-44) инфицированных мозг в каждом измерении. Дисперсионный анализ (ANOVA) обнаруживает значительное увеличение титра вирусный по мере развития7. (D) представитель гистология инфицированных вирусом денге (DENV2) (E14.5 эмбрионы прививанным с ~ 1 мкл 3,4 x 105 TCID50/мл, шкалы бар – 200 мкм) и (E) ZIKV-Африка (MR766) представитель гистологии (шкала бар 200 мкм). (F) ZIKV-Азия (MEX1-44) инфицированных представитель гистология от стратегии intraplacental инъекции (шкалы бар – 200 мкм). Во всех изображениях Hoechst пятна ядер. Эти цифры были изменены с их оригинальной публикации7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель гистология P1 прививки ZIKV. (A) диаграмма демонстрирует метод для определения местоположения инъекции в боковых желудочков P1 щенков. (B) представитель корональных cryosections immunostained для антигена flavivirus группы с низким (слева, шкалы бар-100 мкм) и высокой (справа, шкалы бар-50 мкм) увеличение P1 прививки ZIKV на P15 (~ 1 мкл 3,4 x 105 TCID50/мл ZIKV). "Хёхст" пятна ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Взрослый этап внутрижелудочкового введения инъекций. Взрослый мыши вводится с бусами Флюоресцентная был пожертвован вскоре после операции, чтобы определить успех место инъекции (шкалы бар – 200 мкм). Сагиттальный cryosection может рассматриваться сразу же после разрезания как бусины не требуют дальнейшего окрашивания. "Хёхст" пятна ядер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанный здесь метод внутримозговых прививки ZIKV стадии эмбриона, новорожденных и взрослых для изучения ZIKV-индуцированных повреждений в развитии мозга. Хотя простой, есть несколько соображений, которые следователи должны принять для обеспечения качества исследования и безопасность тех, кто участвует.
DENV тесно связана с ZIKV из рода flavivirus. DENV не были каузально связаны с детской мозга расстройств в организме человека. DENV2 успешно может заразить и реплицировать в развивающийся мозг, используя метод эмбриональных прививка (~ 1 мкл 3,4 x 105 TCID50/мл) (Рисунок 2D). Таким образом в дополнение к неинфицированных СМИ клеток Веро (макет), DENV инфекция может использоваться как отрицательный контроль с целью изучения патогенеза ZIKV-конкретного развивающегося мозга. Важно избежать вирус утечки в утробе матери, что может привести к нежелательной загрязнения других эмбрионов. Таким образом это необходимо для проверки инфицированных и не инфицированных лиц через изолирующие ткани мозга от каждого эмбриона, следуют qRT ПЦР или TCID50 assay. Краска могут быть добавлены к вирусной средних визуально подтвердить инъекции, но тест, чтобы убедиться, что краска не повредить сам.
Мышь штаммов демонстрируют рост изменчивости, и поэтому P1 мест инъекции необходимо проверить для каждой мыши линии. Выполнение инъекции макет новорожденным с бусами Флюоресцентная визуализировать место инъекции. Это предварительное исследование сообщит ли инъекций достигает желудочка или идет слишком глубоко в ткани мозга. Для идеальных результатов щенков может быть принесены в жертву вскоре после инъекции для определения местоположения флуоресцентные бусины в желудочке. Вся глава щенка может быть исправлено на ночь, встроенные и cryosectioned соблюдать точное инъекции местоположение. Инъекции шприцом нефтенасыщенных требует опыта и рекомендуется для практики использования инъекций Шам с краской на парафина для проверки, что объем впрыска является точной.
Меры биологической безопасности имеют решающее значение в этих исследованиях, чтобы избежать случайного заражения лабораторного персонала, работающего с вирусом. Биобезопасности утверждения должны быть заблаговременно на объекте где работа выполняется. ZIKV считается патогена 2-го уровня биобезопасности (BSL2), центрами Соединенных Штатов по контролю и профилактике заболеваний. Все люди работают с вирусом или работают в районах, где обрабатывается вирус должен быть осведомлены и ознакомились с протоколы биобезопасности для их учреждения. Все инструменты и поверхностей, подвергающихся ZIKV или DENV2 должно быть продезинфицированы с 10% отбеливатель уничтожить оставшиеся вирусных частиц после использования. Женщины, которые беременны или пытаетесь забеременеть, рекомендуется не взаимодействуют с исследования в области ZIKV или DENV2. Все ткани, используемые для гистологии фиксируются в 4% PFA инактивирует вирусы для анализа. Хранение и выращивание вирус должно быть сделано в клетках Vero в капот, предназначенных для работы BSL2. Складе вирусов и титрование ткани могут быть количественно с помощью протокола TCID50.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы признать д-р Абдель Латиф Benraiss в Университете Рочестер для его наставничества и обсуждения соответствующих для обучения взрослых хирургические и новорожденным методов. Авторы также хотел бы признать, д-р Джеймс Lauderdale в UGA для использования его стереотаксического оборудования и обсуждения связанных с настройкой методологии для этой техники и улучшения для исследования ученые колледжа (дуги) фонд для их поддержка и наша поддержка NIH (NINDS гранты & F99NS105187-01 R01NS096176-02, R01NS097231-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | - | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | - | |
| Mineral Oil | VWR | - | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
