Summary
Hier beschreiben wir eine Methode für den Aufbau eines Modells von Zika virusbedingte Mikrozephalie in Maus. Dieses Protokoll enthält Methoden zum embryonalen, Neugeborenen und Erwachsenen-Bühne intrazerebrale Inokulation von Zika-Virus.
Abstract
Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein Flavivirus derzeit in Nord-, Mittel- und Südamerika weit verbreitet. Es ist jetzt festgestellt, dass die ZIKV Mikrozephalie und zusätzliche Gehirn Anomalien verursachen kann. Der Mechanismus der Pathogenese von ZIKV in das sich entwickelnde Gehirn bleibt jedoch unklar. Intrazerebrale Operationsmethoden werden häufig in der neurowissenschaftlichen Forschung Fragen über normalen und abnormalen Hirnentwicklung und Funktion des Gehirns verwendet. Dieses Protokoll nutzt klassische Operationstechniken und beschreibt Methoden, die ein Modell ZIKV-assoziierten neurologischen Krankheiten des Nervensystems Maus zu lassen. Während direkte Gehirn Impfung nicht den normalen Modus der Virenübertragung Modell, kann die Methode Ermittler, gezielte Fragen über die Folge nach ZIKV Infektion der das sich entwickelnde Gehirn. Dieses Protokoll beschreibt embryonale, Neugeborene und Erwachsene Phasen der intraventrikulären Inokulation von ZIKV. Einmal gemeistert, kann diese Methode eine einfache und reproduzierbare Technik werden, die dauert nur ein paar Stunden durchzuführen.
Introduction
Mikrozephalie ist eine Erkrankung, die durch defekte Gehirnentwicklung gekennzeichnet durch kleiner als durchschnittliche Kopfumfang bei Neugeborenen. Kinder mit Mikrozephalie weisen eine Reihe von Symptomen, darunter für Entwicklungsverzögerung, Beschlagnahme, geistige Behinderung, Schwerhörigkeit, Sehstörungen und Probleme mit Bewegung und Gleichgewicht, unter anderem abhängig von der Schwere der Erkrankung und Ursache1,2,3. Diese Bedingung ist multifaktoriell, in der Natur, mit genetischen, infektiöse Agenten und Umweltfaktoren verbunden, Mikrozephalie,4,5,6,7,8zu verursachen, 9. Vor dem Ausbruch 2015-2016 ZIKV waren 8 Kinder von 10.000 Geburten mit Mikrozephalie in den Vereinigten Staaten nach der CDC-10diagnostiziert. Am Februar 1St 2016 die Weltgesundheitsorganisation erklärte der Zika-Virus eine Public Health Notlage von internationaler Tragweite aufgrund der alarmierenden Zunahme Mikrozephalie Diagnosen zugeordnet ZIKV Infektion in Mütter11, 12. Eine aktuelle Studie aus der CDC ZIKV Fälle in den Vereinigten Staaten legt nahe, dass mütterliche ZIKV Infektion führt in ein 20-fold erhöhtes Risiko für ein Kind, Mikrozephalie, im Vergleich zu nicht infizierten Personen und 4 % der ZIKV infizierte Mütter aus den USA zu entwickeln geführt haben Kinder mit Mikrozephalie11. Die Rate der Mikrozephalie assoziierten Fehlbildungen während der Schwangerschaft von ZIKV Infektion in Brasilien gemeldet wurden, betroffen sind bis zu 17 % der Babys in infizierten Müttern, darauf hinweist, dass andere Faktoren in Lateinamerika auf das erhöhte Risiko beitragen kann 13. während wir wissen, dass die ZIKV in den neuronalen Vorläuferzellen Zelle (NPC) Bevölkerung7,8,14Mikrozephalie und Pathogenese führen kann, die komplette Pathogenese von ZIKV in der Entwicklung des Gehirns bleibt schwer. Es ist wichtig, Tiermodelle um weiter zu untersuchen, die Krankheitsmechanismen, die die Gehirn Anomalien ZIKV Infektion zu entwickeln.
Um direkt die Wirkung zu untersuchen, die die ZIKV auf die Entwicklung des Gehirns hat, haben wir zuerst ein Maus-Modell mit ZIKV7intrazerebrale Inokulation von embryonalen Tag 14,5 (E14.5) Gehirn entwickelt. Diese Phase wurde gewählt, weil es als repräsentativ für das Ende des ersten Trimesters in menschlichen Schwangerschaft14 gilt. Welpen können mit dieser Methode der embryonalen intrazerebrale Injektion bis zu postnatalen Tag 5 (P5) überleben (~ 1 µL von 1,7 x 106 Gewebekultur Infektionsdosis (TCID50/mL)). Diese postnatalen Welpen zeigen eine Reihe von Phänotypen, die in ähnlicher Weise beobachtet bei infizierten menschlichen Säuglingen einschließlich der erweiterten Ventrikel, neuronaler Verlust axonalen Verdünnung, Astrogliosis und Microglial Aktivierung12,15. Ein Neugeborenes Mäusegehirn ist relativ unreif, vergleichbar mit der Entwicklungsstufe des menschlichen Gehirns bei Mid Schwangerschaftswoche16und Maus Gehirnentwicklung umfasst eine postnatale Hauptkomponente. Um späteren Schwangerschaft Bühne Infektionen zu studieren, ist eine Methode für die postnatale Infektion auch beschrieben. Neugeborene infiziert mit ZIKV auf P1 sind in der Lage, bis zu 13 Tage nach der Injektion zu überleben. Blut geboren Erwachsenstadium Infektion ist beschrieben worden, in der Maus bisher17 aber den Einsatz von erfordert Interferon (IFN) regulatorischen Faktor (IRF) Transkription Faktoren IRF-3,-5-7 triple Knockout-Stamm. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode des ZIKV intraventricularly um zu umgehen, Deaktivieren der antiviralen Reaktion des murinen Modells beim Erwachsenen impfen. Während dies das murine Immunsystem umgeht, ist diese Route der Injektion nicht direkt den typischen Weg der Infektion nachahmen. Um diese Diskrepanz zu beheben kann direkt, der Experimentator eine intrauterine Infektion der ZIKV anstelle der intrakraniellen Route durchführen. Aus früheren Arbeiten18übernommen, haben wir diese Technik in diesem Protokoll embryonalen Infektion kurz beschrieben.
Zika Virusstämme umgesetzt mit dieser Technik gehören das mexikanische Isolat MEX1-447,19 und die afrikanischen isolieren Herr-766 in 194720isoliert. Zika MEX1-44 wurde in Chiapas, Mexiko isoliert im Januar 2016 von einem infizierten Aedes Aegypti Mücke. Wir erhalten dieses Virus mit Genehmigung durch die University of Texas Medical Branch in Galveston (UTMB). Darüber hinaus wurde das Dengue-Virus Serotyp 2 (DENV2) geimpft mit dieser Technik in einer Vergleichsstudie. DENV2, Stamm S16803 (Reihenfolge GenBank GU289914), wurde im Jahr 1974 von einer Patientenprobe aus Thailand isoliert und in C6/36 Zellen passagiert. Das Virus wurde zweimal in Vero-Zellen durch die Welt-Referenzzentrum für auftauchende Viren und Arboviren (WRCEVA) vor der Maus Injektionen passagiert. Dies zeigt, dass diese Technik genauso funktioniert gut für verschiedene Stämme von ZIKV und anderen Flaviviren, die sich auf die Entwicklung des Gehirns auswirken können.
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Protocol
Alle Tier verwenden Protokolle folgen die Tierpflege-Richtlinien von der University of Southern California und der University of Georgia. Euthanasie-Methoden für Schwangere Dämme und Erwachsene erfolgt nach anerkannten Protokolle: Kohlendioxid Erstickung, gefolgt von zervikale Dislokation als sekundäre Methode zur Euthanasie zu gewährleisten. Neugeborene Welpen sind durch Enthauptung eingeschläfert.
Achtung: Das folgende Protokoll beinhaltet ein pathogenes Virus Handhabung. Beim Umgang mit dem Virus, sollten geeignete Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. Alle Protokolle bedürfen der Zustimmung der entsprechenden institutionellen Ausschuss vor dem Gebrauch.
(1) embryonalen intrazerebrale Inokulation von Zika-Virus
- Betrachten Sie zur rechten Zeit schwanger Paarung, Mittag des Tages nach der Paarung als E0.5. Paar Mäuse am Ende des Tages und überprüfen Sie den Stecker in den frühen Morgenstunden, Variabilität der Paarungszeit zu reduzieren.
- Bereiten Sie die glasnadel vor der Operation. Ziehen Sie die Nadel und an 1/3 ihrer Länge geschnitten, dann in einem Winkel von 45° mit einer Mikropipette Schleifmaschine mit einem Tropfen Wasser, bis die Pore, um 50-70 µm. Check Nadelspitzen unter ein Stereoskop für Qualität und Bruch angepasst wird zu schärfen.
- Halten Sie das Virus aliquoten auf Eis. Nur vor der Operation laden Sie die ZIKV Injektion Mischung in die vorbereitete Glas Injektionsnadel. Montieren Sie der gasdichte Injektionsspritze (50 µL Volumen), Luer-Lock Befestigung und Schläuche, und sättigen Sie die montierte Spritze mit dem Schlauch mit Mineralöl. Gesättigt, befestigen Sie die Nadel und ziehen ~ 6-7 µL ZIKV in die Nadel (~ 1 µL beträgt 1,7 × 106 TCID50/mL).
- Injizieren Sie schwanger C57BL/6J oder 129S1/SvImJ Mäuse mit embryonalen Tag E14.5 Embryonen (für intrakranielle Injektion) oder E10.5 Embryonen (für intrauterine Injektion) mit Ketamin Hydrochlorid (80-100 mg/kg) und Xylazin (5 – 10 mg/kg) in steriler Kochsalzlösung verdünnt Anästhesie bei der Mutter intraperitoneal induzieren. Alternativ zu betäuben Mütter mit überwachten Isofluran Isofluran vorgesehenen Inhalation mit Abgas Aufräumvorgang, gegebenenfalls. Buprenorphin-SR (0.5-1.0mg/kg) subkutan zur Analgesie induzieren zu injizieren.
- Kneiftest Mütter auf der Fußspitze oder Schweif betäubt und dann legen Sie diese Rückenlage auf ein Tier zugelassen Heizkissen (Wärmeleitpad von 100 x 200 2,5 mm). Die Zehe Prise Zangen sind nicht steril und werden nicht verwendet, um Gewebe in der Chirurgie zu behandeln. Behandschuhte Händen können alternativ verwendet werden, die Zehe Prise Rückzug Reflex testen.
Hinweis: Finden Sie Ihren institutionellen Tierärzten für die bevorzugte Perioperative Heizung Methode. Eine Abdeckung wurde zwischen dieses Heizkissen und dem Tier gelegt. - Fügen Sie ophthalmologischen Salbe für die Augen.
- Die Oberfläche des Bauches zu rasieren und desinfizieren mit Jod und Alkohol dreimal. Wechseln Sie die Tücher Jod und Alkohol; Wischen Sie in einer kreisförmigen Bewegung weg von der Operationsstelle.
- Drapieren Sie die Haut rund um die Operationsstelle mit sterilen Tüchern zur Vermeidung von Kontaminationen der Schnitt und die Instrumente.
Hinweis: Das Tuch öffnen sollte nicht größer als der vorbereiteten Operationsstelle sein; kein Haar sollte in der Faltenwurf Öffnung gesehen werden. - Drücken Sie die Mutter Haut weg von ihrem Bauch mit der Pinzette und schneiden Sie Unterbauch in einer 1-1,5 cm-Linie an der medialen sagittale Linie mit sterile Chirurgische Schere. Dieses schneidet in die Haut und weiter in die Bauchhöhle, so dass die Embryonen nun ausgesetzt sind.
Hinweis: Chirurgische Scheren dienen zur Haut und peritonealen Schicht einzuschneiden. Sterile Instrumente und Handschuhe sind für jede Operation eingesetzt. - Schneiden Sie einen Schlitz in der Mitte eine kleine sterile Gaze und wenden auf der Oberseite der chirurgischen Eröffnung. Hydrat mit steriler Kochsalzlösung. Ziehen Sie die Embryonen durch den Schlitz auf die sterile Gaze, mit Sorgfalt, nicht mehr als 4-5 Embryonen mit Schwerpunkt auf eine uterine Horn auf einmal zu entfernen.
- Hydrat die Embryonen mit steriler Kochsalzlösung vor und während der Impfung um sicherzustellen, dass sie nicht austrocknen. Behalten Sie den Überblick welche Embryonen injiziert werden und ihre Position innerhalb der Gebärmutter Horn. Einzelnen Embryonen werden somit als separate Experimente als Embryonen nicht Position ändern während der Entwicklung im Mutterleibbehandelt. (Weiter zu Schritt 1.15 für intrauterine Injektion).
- Sanft lege einen Spatel unter dem Kopf des Embryos. Beleuchten Sie die Embryonen auch mit einer Lampe, die Kopf und Schädel Nähte zu visualisieren.
Hinweis: Aseptischer Technik ist gefolgt, einschließlich sterile OP-Handschuhe und Instrumente. Nach unsteril Elemente (z. B. Leuchte) manipuliert, Handschuhe mit neuen sterile Handschuhe vor dem Umgang mit sterilen Instrumenten und Bereichen ausgetauscht werden. - Stellung den Kopf durch die Manipulation des Embryos mit der Lampe (hinter dem Kopf sichtbar) und die Finger frei, bis der Kopf des Embryos ist direkt gegen die Gebärmutterwand geschoben und mit der nichtdominanten Hand in Position gehalten.
Hinweis: Positionierung des Embryos ist ein wichtiger Bestandteil und die Technik, die meisten Praxis findet. Zuviel Druck mit den Fingern kann die embryonale Membranen führt zu Letalität beschädigen und nicht genügend Druck kann die Injektion schwierig machen. - Die Blutgefäße, die entlang der Schädel Naht als Leitfaden zu verwenden. ZIKV Virus zu injizieren (~ 1 µL, 1,7 × 106 TCID50/mL mexikanische isolieren MEX1-44) in die seitlichen Ventrikel E14.5 Embryo Gehirne mit dem montierten Spritze und Nadel. Verwenden Sie Steuermedien als einer Scheininjektion.
- Zur Verbesserung der Aufbewahrung der Schwangerschaft vermeiden Sie viralen Injektion von zwei Embryonen neben den Eierstöcken und den zwei Embryonen neben der oberen Vagina (Abbildung 1A). Insgesamt sind nicht mehr als 6 Embryonen injiziert pro Wurf, reduzieren Sie die Zeit der Operation und Embryo Verlust zu verhindern.
- Setzen Sie die injizierten Embryonen wieder schwanger Dämme, und füllen Sie die Bauchhöhle mit ~ 0,5 mL sterile Kochsalzlösung. Abschließend möchte ich sagen, zuerst beide den peritonealen Bauchmuskel Naht und dann zweitens die äußere Hautschicht mit 4,0 steriles Nahtmaterial Naht. Es ist vorzuziehen, unterbrochene Nähte zu verwenden; Es besteht die Möglichkeit der Wunde Dehiszenz wenn die Maus den Faden kaut.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in einem Käfig teilweise ruht auf einem Heizkissen um die Maus zu einem unbeheizten Bereich zu entkommen, bei Bedarf zu ermöglichen. Überwachen Sie die Mütter während sie zurückgewinnen (1-2 h) aus der Narkose. Nach Chirurgie für Zeiten nach einzelnen Experimenten variiert entwickeln Sie die Embryonen.
-
Intrauterine Injektion
- Mit einer Gebärmutter Horn und Embryonen ausgesetzt, verwenden Sie eine 1 mL Spritze und 27G Nadel 100 μL Zika-Virus (106 TCID50 Einheiten in 100 μL DMEM aufgehängt), Spritzen oder Steuermedium, in der intrauterinen Raum oder in der plazentaren Gewebes. Beachten Sie, welche Embryonen für embryonalen Stadium Sezierungen injiziert haben. Zuvor veröffentlichte Arbeit für mehr Details18zu sehen.
- Setzen Sie injizierte Embryonen wieder schwanger Dämme, und füllen Sie die Bauchhöhle mit ~ 0,5 mL sterile Kochsalzlösung. Zu schließen, zuerst den peritonealen Bauchmuskel Naht und dann zweitens die äußere Hautschicht mit 4,0 steriles Nahtmaterial Naht. Es ist vorzuziehen, unterbrochene Nähte zu verwenden; Es besteht die Möglichkeit der Wunde Dehiszenz wenn die Maus den Faden kaut.
- Platzieren Sie den Mauszeiger in einem Käfig teilweise ruht auf einem Heizkissen um die Maus zu einem unbeheizten Bereich zu entkommen, bei Bedarf zu ermöglichen. Überwachen Sie die Mütter während sie zurückgewinnen (1-2 h) aus der Narkose. Nach Chirurgie für Zeiten nach einzelnen Experimenten variiert entwickeln Sie die Embryonen.
(2) Neugeborenen intrazerebrale Inokulation von Zika-Virus: P0/P1
- Sicherstellen Sie, dass die gasdichte Injektionsspritzen (10 µL Volumen) und Nadeln nicht verstopft sind. Gereinigt und getestet durch das Laden drei 20 mL Einwegspritzen mit 26-Gauge Nadeln: eines mit Kochsalzlösung, eine mit 70 % Ethanol und eine mit Luft, die Lösungen zu löschen. Sterilisieren Sie mit 10 % Bleichmittel, wenn zuvor für Virus Injektion verwendet.
- Halten Sie Viren auf Eis. Laden Sie die Spritze durch füllen mit Kochsalzlösung, Totvolumen in der Spritze zu reduzieren und zeichnen Sie 0,75 µL der Luft das Injektionsmaterial Salzlösung getrennt.
- Richten Sie eine angewärmte befeuchtete Erholung Kammer für injizierten Welpen. Mit einem Heizblock, einen verschließbaren Behälter (z. B. eine leere Tipp-Box) mit steriler Gaze und mit Kochsalzlösung befeuchtet. Heizen Sie es vor dem Beginn der Injektionen.
- Richten Sie die Microinjector einschließlich der Pumpe und dem Controller. Bestimmen Art Gerätecode für die spezifische Spritze (d. h., bei einer 10 µL Spritze, der Gerätetyp ist "D"). Bestimmen Sie die Geschwindigkeit der Injektion.
- Die postnatale Tag 0 oder 1-Welpen (P0/P1) in der Nähe der chirurgischen Einrichtung zu sammeln. Laden Sie die Injektionsspritze mit Virus. Desinfizieren der Welpe Galgen mit 70 % EtOH.
- Wickeln Sie die Welpen in eine dünne Schicht aus Gaze und beerdigen Sie vollständig im Eis, einen Narkose Zustand zu erreichen. Welpen sind Cryoanesthetized für 5 min. Stellen Sie sicher, dass die Welpen ausreichend für die Injektion betäubt sind, durch die Durchführung einer Rute/Toe Klemme ohne Antwort. Dies ergibt ca. 15 min von einer Narkose Zustand.
- Platzieren Sie den Welpen am Galgen, Sterilisieren Sie die Oberfläche des Kopfes mit Jod und Ethanol (dreimal) und dann mit einem sterilen Tuch trockenwischen (Isopropanol oder 70 % EtOH).
- Markieren Sie Lambda mit einem schwarzen Filzstift und notieren Sie die Koordinaten an Lambda mit dem stereotaktischen Instrument. Die Distanz von Lambda bis an den Rand des Auges und ab der stereotaktischen Koordinaten von Lambda berechnen Sie den Abstand von 2/5 von Lambda für das Auge (für beide Gehirnhälften, wenn Sie beide injizieren).
- Überprüfen Sie die Narkose Tiefe vor dem Erstellen ein Loch für die Injektionsstelle. Verwenden Sie eine 26-Gauge-Nadel, um vorsichtig und oberflächlich zu durchbohren die Kopfhaut und Schädel an den anspritzpunkt (der Schädel ist sehr weich beim Neugeborenen) um eine Öffnung für die Injektionsnadel zu erstellen.
- Senken Sie die Injektionsnadel in die punktierte Stelle, und sobald die Nadel nur die Haut verletzt ist, berechnen Sie eine 1 mm Tiefe für die Injektionsstelle (seitliche Ventrikel) mit dem stereotaktischen Instrument.
- Sobald die Nadel auf die Injektion Tiefe abgesenkt ist, Programmieren der Microinjector zu injizieren: 1 µL des Virus, mit einer Rate von 10 nL/s, Injektion von etwa 1 µL über 1,5 min (~ 1 μl 3,4 x 105 TCID50/mL ZIKV).
- Wenn die Injektion abgeschlossen ist, warten 30 s und zurückziehen die Nadel in Schritten von 0,5 mm durch Drehen der Schraube (dorsal), warten 30 s nach jedem Schritt.
Hinweis: Dies verringert Leckage des injizierten Virus. - Sobald entfernt, entweder schnell laden die Nadel und Spritze mit mehr Virus (verschiedene Viren oder mock Kontrollen sollten in separaten Spritzen/Nadeln geladen werden) oder der Welpe aus der Galgen in die vorgewärmte Feuchte Kammer entfernen. Überwachen Sie die Welpen alle paar Minuten um Erholung zu beurteilen. Ersetzen Sie die Welpen mit ihren Wurf.
3. Erwachsene intrazerebrale Inokulation von Zika-Virus
- Injizieren sie Erwachsene Mäusen intraperitoneal mit Ketamin Hydrochlorid (80-100 mg/kg) und Xylazin (5 – 10 mg/kg) verdünnt in sterile Kochsalzlösung, Anästhesie zu induzieren. Buprenorphin-SR (0.5-1.0mg/kg) subkutan zur Analgesie induzieren zu injizieren. Zehe/Tail Kneifen die Maus, um die Narkose Zustand zu gewährleisten, und montieren Sie ihn anschließend auf dem stereotaktischen Instrument (mit einem Heizkissen) um den Kopf während der Operation zu immobilisieren.
- Fügen Sie ophthalmologischen Salbe für die Augen, die Augen der Maus vor dem Austrocknen während der Operation zu verhindern. Rasieren der Kopfhaut, hinter den Augen bis zum Anfang der Ohren ab. Sterilisieren die exponierten Haut mit Jod und 70 % EtOH dreimal. Wechseln Sie die Tücher Jod und Alkohol; Wischen Sie in einer kreisförmigen Bewegung weg von der Operationsstelle.
- Überprüfen Sie die Narkose Tiefe vor Einritzen der Haut. Mit einem Skalpell, machen Sie einen 0,5 cm Schnitt entlang der medialen sagittale Linie des Kopfes in den sterilisierten Standort Bregma auszusetzen. Mit eine Rollbewegung mit einem Baumwoll-gespitzten Applikator, klar die Oberfläche des Schädels von meningealen Gewebe, drücken Sie gleichzeitig die Haut weg von den Injektionsstellen.
- Ausgehend von Bregma, die chirurgische Bohrer ausrichten und identifizieren die Injektionsstellen mit den folgenden Koordinaten: AP-0,50 mm, ML: + /-1,5 mm. mit Fußpedal steuern, Bohren in Schädel langsam, nur Knochen Bohren, bis ein Loch für die Nadel gelöscht wurde.
- Ersetzen Sie den Bohrer mit Microinjector Pumpe und gasdichte Spritze (10 µL Volumen) auf der stereotaktischen. Eine kleine Luftblase zwischen Kochsalzlösung und Virus verlassend zeichnen ~ 4-5 µL des Virus. Bestimmen Sie den Typ Gerätecode für spezifische Spritzenvolumen (dh, D für 10 μL Volumen Spritze). Senken Sie die Nadel auf DV:-1,50 mm von der Oberfläche des Gehirns. 1 µL des Virus zu injizieren, programmieren Sie eine Rate von 10 nL/s, ca. 1 µL über 1,5 min injizieren.
- Wenn die Injektion abgeschlossen ist, warten 30 s, und entfernen Sie die Nadel in Schritten von 0,5 mm, warten 30 s nach jedem Zug. Dies reduziert Rückfluss und Leckage des injizierten Virus.
- Nach Abschluss der Injection(s) verwenden Sie Zange, um der Haut zu lösen und den freigelegten Schädel zu erholen. Naht die Kopfhaut wieder zusammen mit 4,0 Nähte und entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Gerät. Statt der Maus in einen Käfig teilweise ruht auf einem Heizkissen erlauben die Maus, um zu einem unbeheizten Bereich bei Bedarf zu entkommen und zu überwachen, während sie (1-2 h) wiederherstellen aus der Narkose.
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Representative Results
Repräsentative Bilder unserer Einspritzung Methoden für die ZIKV Impfung des embryonalen Gehirns in Diagrammen darstellen intrazerebrale Injektionen (Abbildung 1A) angezeigt werden und intrauterine und Intraplacental Injektionen (Abbildung 1 b), zur Veranschaulichung der Art und Weise der schwangeren Damm und Embryonen sollten angesehen und für Chirurgie (embryonale Inokulation Protokoll) orientiert. Abbildung 2A zeigt ZIKV (MEX1-44) Infektion (Immunostained mit dem Antikörper gegen Flavivirus Gruppe Antigen, grün) in der Großhirnrinde E18.5. PAX6 (rot) Etiketten NPCs in den Entwicklungsländern Kortex. ZIKV war in E14.5 embryonalen Gehirn geimpft. Mit der TCID50 Assay von Gewebe Proben7, unser Wachstum Kurve Analysen zeigen, dass die ZIKV können effizient replizieren und wachsen in den entwickelnden Gehirnen (Abb. 2 b, 2 C), als veröffentlicht7. Abb. 2D zeigt erfolgreiche Infektion mit DENV2 im entwickelnden Kortex mit der embryonalen Impfung-Methode. DENV2 Erkennung erfolgt anhand eines Antikörpers gegen Flavivirus Gruppe Antigen (grün). Abbildung 2E zeigt Infektion mit einem anderen Stamm der ZIKV, der afrikanischen Linie (Herr-766). Abbildung 2F zeigt eine repräsentative Infektion für die Alternative-Route, Intraplacental Impfung des ZIKV-Asien (MEX1-44) in Phase E10.5.
Abbildung 3A ist ein Diagramm Darstellung der Wahrzeichen verwendet, um die Position der Injektion in die seitlichen Ventrikel ZIKV Impfung der P0/1 Welpen zu identifizieren. Abbildung 3 b zeigt die ZIKV (MEX1-44) Infektion auf P13 Großhirnrinde nach P0/1 Injektion. ZIKV (MEX1-44) ist mit Antikörper gegen Flavivirus Gruppe Antigen (rot) nachgewiesen. Abbildung 4 zeigt die fluoreszierenden Perlen (rot), die verwendet wurden, um anspritzpunkt und seitlichen Ventrikel Injektion Erfolg bei Erwachsenen üben.
Abbildung 1: embryonale Inokulation von der ZIKV. (A) Diagramm Vertretung Exposition eine uterine Horn, mit einem Hinweis auf die Injektion von Embryonen angrenzend an Scheide und die meisten seitlichen Embryo entlang des Horns zu vermeiden. (B) Diagramm repräsentiert Exposition eine uterine Horn, Darstellung der Lage des Intraplacental und intrauterine Injektionen. Diese Diagramme wurden von ihrer ursprünglichen Veröffentlichung21geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: ZIKV embryonalen Inokulation bei E14.5. (A) am E18.5 der embryonale Gehirn infiziert mit ZIKV-Asien (MEX1-44) über alle Ebenen des entwickelnden Neocortex (Maßstabsleiste beträgt 200 µm). Neurale Vorläuferzellen sind Immunolabeled mit Pax6 (rot) und ZIKV über Flavivirus Antigen (grün). (B) TCID50 ergibt sich aus Hirngewebe postnatale Tag3 (P3) geimpft am E14.5 mit ZIKV-Asien (MEX1-44). Fehlerbalken zeigen s.e.m von drei unabhängigen Messungen mit einem Mock und ein ZIKV-infizierten Gehirn bei jeder Messung (***p < 0,0001, Studenten t-Test)7. (C) TCID50 Ergebnisse beschreiben typische erhöhte Wachstumskurve der ZIKV Virämie in infizierten fetalen Hirngewebes. Fehlerbalken zeigen die s.e.m von drei unabhängigen Messungen mit einem Mock und ein ZIKV-Asien (MEX1-44) infiziert Gehirn bei jeder Messung. Varianzanalyse (ANOVA) erkennt eine deutliche Steigerung in virale Titer Entwicklung7verläuft. (D) Dengue-Virus (DENV2) infiziert repräsentative Histologie (E14.5 Embryonen geimpft mit ~ 1 µL 3,4 x 105 TCID50/mL, Maßstabsleiste ist um 200) und (E) ZIKV-Afrika (MR766) infiziert repräsentative Histologie (Skala bar 200 µm). (F) ZIKV-Asien (MEX1-44) infiziert repräsentative Histologie aus der Intraplacental-Injektion-Strategie (Maßstabsleiste beträgt 200 µm). In allen Bildern Flecken Hoechst Kerne. Diese Zahlen wurden von ihrer ursprünglichen Veröffentlichung7geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Repräsentative Histologie der P1 Inokulation von ZIKV. (A) Diagramm zeigt die Methode zur Bestimmung der Injektion Position in die seitlichen Ventrikel P1 Welpen. (B) repräsentative koronalen Cryosections Immunostained für Flavivirus Gruppe Antigen mit niedrigen (Links, Maßstabsleiste ist 100 µm) und hohen (rechts, Maßstabsleiste ist 50 µm) Vergrößerung des P1 Inokulation von ZIKV bei P15 (~ 1 μl 3,4 x 105 TCID50/mL ZIKV). Hoechst Flecken Kerne. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Erwachsenen Stadium intraventrikuläre Injektion. Erwachsener Mäuse injiziert mit fluoreszierenden Perlen wurde kurz nach der Operation den Injektion Lage Erfolg geopfert (Maßstabsleiste beträgt 200 µm). Sagittale Cryosection kann sofort nach dem Schneiden wie Perlen nicht benötigen weitere Färbung angesehen werden. Hoechst Flecken Kerne. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier beschrieben, ist eine Methode für intrazerebrale Inokulation von der ZIKV in embryonalen, Neugeborene und Erwachsene Stadien für die Untersuchung der ZIKV-induzierten Schäden in die Entwicklung des Gehirns. Während einfach, gibt es ein paar Überlegungen, die Ermittler nehmen sollten, um die Qualität der Studie und die Sicherheit aller Beteiligten zu gewährleisten.
DENV ist ZIKV in der Gattung Flavivirus eng verwandt. DENV ist nicht kausal mit pädiatrischen hirnstörungen bei Menschen verbunden worden. DENV2 erfolgreich infizieren kann und in das sich entwickelnde Gehirn mit der embryonalen Inokulation Methode replizieren (~ 1 µL 3,4 x 105 TCID50/mL) (Abb. 2D). Daher kann neben nicht infizierten Vero Zelle Medien (mock), DENV-Infektion als Negativkontrolle verwendet werden um ZIKV-spezifische Pathogenese in das sich entwickelnde Gehirn zu studieren. Es ist wichtig, Virus Leckage in der Gebärmutter, zu vermeiden, was zu unerwünschten Verunreinigungen von anderen Embryonen führen kann. Daher ist es zu prüfen, infizierten und nicht infizierten Personen durch Hirngewebe von jedem Embryo gefolgt von qRT-PCR oder TCID50 Assay zu isolieren. Ein Farbstoff kann hinzugefügt werden, um virale Mittel-und visuell bestätigen die Injektion, aber testen, um sicherzustellen, dass der Farbstoff keine Schäden selbst verursacht.
Mausstämme zeigen Wachstum Variabilität und P1 Anspritzpunkte müssen daher für jede Maus Zeile überprüft werden. Führen Sie eine mock Neugeborene Injektion mit fluoreszierenden Perlen an die Injektionsstelle zu visualisieren. Diese Vorstudie informieren, ob die Injektion erreicht die Herzkammer oder geht zu tief in das Hirngewebe. Für optimale Ergebnisse können Welpen kurz nach der Injektion zur Identifizierung des Speicherorts der fluoreszierenden Perlen in der Herzkammer geopfert werden. Der gesamte Kopf der Pup fixierbar über Nacht eingebettet, und Cryosectioned, die präzise anspritzpunkt zu beobachten. Injektion mit der Spritze Öl gesättigt erfordert Erfahrung und es empfiehlt sich, üben mit Schein-Injektionen mit Farbstoff auf Parafilm um sicherzustellen, dass das Injektionsvolumen korrekt ist.
Biologische Maßnahmen sind kritisch in diesen Studien zu versehentlichen Infektion des Laborpersonals arbeiten mit dem Virus zu vermeiden. Biosafety Genehmigungen müssen im Voraus in der Einrichtung erfolgen, wo ist die Arbeit abgeschlossen sein. ZIKV gilt ein Biosafety Level 2 (BSL2) Erreger durch die United States Centers für Disease Control and Prevention. Bewusst und familiäre mit Biosafety Protokolle für ihre Institution sollten alle Personen arbeiten mit dem Virus oder in Bereichen, wo das Virus behandelt wird. Alle Tools und Oberflächen der ZIKV oder DENV2 sollte mit 10 % Bleichmittel zerstören verbleibenden Viruspartikel nach Gebrauch desinfiziert werden. Frauen, die schwanger sind oder versuchen, schwanger werden empfohlen, nicht mit ZIKV oder DENV2 ausgesetzt Forschungsbereichen interagieren. Alle Gewebe zur histologischen feststehen in 4 % PFA, die Viren für die Analyse zu inaktivieren. Speichern und Kultivierung des Virus erfolgt in Vero-Zellen in eine Haube für BSL2 Arbeit bezeichnet. Auf Viren und Gewebe Titration können unter Verwendung des Protokolls TCID50 quantifiziert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Die Autoren möchte Dr. Abdellatif Benraiss an der University of Rochester für seine Betreuung und Diskussionen für die Erwachsenen chirurgische und Neugeborene Techniken zu lernen anerkennen. Die Autoren möchten auch anerkennen, Dr. James Lauderdale am UGA für die Nutzung seiner stereotaktischen Ausrüstung und Diskussionen im Zusammenhang mit der Methodik für diese Technik und die Förderung für Forschung College Wissenschaftler (ARCS) Grundlage für die Einrichtung ihrer Support und Hotline NIH (NINDS gewährt R01NS096176-02, R01NS097231-01 & F99NS105187-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | - | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | - | |
| Mineral Oil | VWR | - | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
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