Summary
Här beskriver vi en metod för att upprätta en modell av Zika virus-inducerad mikrocefali i musen. Detta protokoll innehåller metoder för embryonala, neonatal och vuxen-scenen intracerebral inympning av zikaviruset.
Abstract
Zikaviruset (ZIKV) är ett flavivirus som för närvarande ingår i Nord-, Central- och Sydamerika. Det är nu fastställt att ZIKV kan orsaka mikrocefali och ytterligare hjärnan avvikelser. Mekanismen bakom patogenesen av ZIKV i hjärnans utveckling är dock fortfarande oklart. Intracerebral kirurgiska metoder används ofta i neurovetenskap forskning på adress frågor om både normala och onormala hjärnans utveckling och hjärnans funktion. Detta protokoll använder klassiskt kirurgiska tekniker och beskriver metoder som tillåter en att modell ZIKV-associerade neurologiska sjukdomar i nervsystemet mus. Medan direkt hjärnan inympning inte modell normalläge virus överföring, tillåter metoden utredarna att ställa riktade frågor om följden efter ZIKV infektion i hjärnans utveckling. Det här protokollet beskriver embryonala, neonatal och vuxna stadier av intraventrikulär inokulering av ZIKV. När behärskar, kan denna metod blir en okomplicerad och reproducerbara teknik som bara tar några timmar att utföra.
Introduction
Mikrocefali är ett tillstånd som följd av defekt hjärnans utveckling kännetecknas av mindre än genomsnittliga huvud storlek hos nyfödda. Barn med mikrocefali uppvisar ett spektrum av symtom som kan inkludera utvecklingsförsening, beslag, intellektuella funktionshinder, hörselnedsättning, synproblem och problem med rörlighet och balans, bland annat beroende på sjukdomens svårighetsgrad och orsaka1,2,3. Detta tillstånd är multifaktoriell karaktär, med genetiska, infektiösa agent, och miljömässiga faktorer kopplade till orsakar mikrocefali4,5,6,7,8, 9. Innan 2015-2016 ZIKV utbrott, hade 8 barn ur 10 000 födslar diagnosen mikrocefali i USA enligt CDC10. På februari 1st 2016 WHO deklarerade zikaviruset en nödsituation av internationella folkhälsoproblem på grund av den alarmerande ökningen mikrocefali diagnoser ZIKV infektioner i mödrar11, med 12. En färsk studie från CDC på ZIKV fall i USA tyder på att moderns ZIKV infektion resultat i en 20-fold ökad risk för ett barn att utveckla mikrocefali jämfört med icke-infekterade individer och 4% av ZIKV infekterade mödrar från USA har resulterat i barn med mikrocefali11. Graden av mikrocefali-associerade missbildningar under graviditeten från ZIKV infektion i Brasilien har rapporterats ha påverkat upp till 17% av spädbarn i infekterade mödrar, som anger att andra faktorer i Latinamerika kan bidra till den ökade risken 13. även om vi vet att ZIKV kan orsaka mikrocefali och patogenes i neurala stamceller cell (NPC) befolkningen7,8,14, komplett patogenesen av ZIKV i utvecklingsländerna hjärnan förblir svårfångade. Det är viktigt att utveckla djurmodeller för att ytterligare undersöka sjukdomsmekanismerna bakom hjärnan avvikelser förknippas med ZIKV-infektion.
För att direkt studera den effekt som ZIKV har på hjärnans utveckling, utvecklade vi först en musmodell med intracerebral inympning av embryonala dag 14,5 (E14.5) hjärnan med ZIKV7. Detta skede valdes eftersom det anses representativt av i slutet av första trimestern i mänskliga dräktigheten14. Valpar kan överleva upp till postnatal dag 5 (P5) med detta embryonala intracerebral injektion metod (~ 1 µL 1,7 x 106 vävnad infektiös dos i cellkultur (TCID50/mL)). Dessa postnatal pups uppvisar en rad fenotyper likaså observerats i infekterade mänskliga spädbarn inklusive förstorade ventriklar, neuronala förlust, axonal förtunning, astrogliosis och mikrogliala aktiveringen12,15. En nyfödd mus hjärnan är relativt omogen, besläktad med utvecklingsstadiet av den mänskliga hjärnan halva dräktigheten16, och mus hjärnans utveckling inkluderar en postnatal huvudkomponent. För att studera senare dräktighet scenen infektioner, beskrivs också en metod för postnatal infektion. Nyfödda infekterade med ZIKV på P1 kan överleva upp till 13 dagar efter injektion. Blod-född adult Stadium infektion har beskrivits i musen tidigare17 men kräver användning av interferon (IFN) reglerande faktor (IRF) transkription faktorer IRF-3, -5-7 trippel knockout stam. Det här protokollet beskriver en metod för ympning ZIKV intraventrikulärt för att kringgå inaktivera antivirala responsen av murina modellen i vuxen. Medan detta kringgår murina immunsystemet, härma denna administreringsväg injektion inte direkt den typiska rutten av infektion. För att åtgärda denna diskrepans direkt, kan försöksledaren utföra en intrauterin infektion i ZIKV istället för intrakraniell rutten. Antagna från tidigare arbete18, har vi kortfattat denna teknik i detta embryonala infektion protokoll.
Den Zika virusstammar genomförs med denna teknik inkluderar isolatet av mexikanska MEX1-447,19 och i Afrika isolera herr-766 isolerade i 194720. Zika MEX1-44 var isolerad i Chiapas, Mexiko i januari 2016 från en infekterad Aedes aegypti mygga. Vi fick detta virus med behörighet via den University of Texas Medical branschen i Galveston (CD). Dessutom var den denguefeber virus serotypen 2 (DENV2) inokuleras med denna teknik i en jämförande studie. DENV2, stam S16803 (sekvens GenBank GU289914), isolerades från ett patientprov från Thailand 1974 och anpassade i C6/36 celler. Viruset var överförda två gånger i Vero-celler genom World Reference Center för framväxande virus och Arboviruses (WRCEVA) innan musen injektioner. Detta visar att denna teknik fungerar lika bra för olika stammar av ZIKV och andra flavivirus som kan ha en inverkan på hjärnans utveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur använder protokoll följa djurens vård riktlinjer vid University of Southern California och University of Georgia. Dödshjälp metoder för gravida dammar och vuxna utförs enligt godkända protokoll: koldioxid kvävning, följt av cervikal dislokation som en sekundär metod för dödshjälp. Neonatala valpar är euthanized genom halshuggning.
Varning: Följande protokoll innebär hantering ett lågpatogent virus. Ordentlig försiktighet bör tas vid hantering av viruset. Alla protokoll skall godkännas av de lämpliga institutionella utskottet före användning.
1. embryonala Intracerebral inympning av zikaviruset
- För tidsbestämda gravid parning, överväga middagstid dagen efter parning som E0.5. Para ihop möss i slutet av dagen och kolla pluggar tidigt på morgonen att minska variationen av parningstid.
- Förbereda glas nålen före operation. Dra ut nålen och skär 1/3 av dess längd, sedan skärpa i 45° vinkel med en mikropipett kvarn med vatten dropp tills porerna är storlek till 50-70 µm. Kontrollera nålen tips under ett stereoskop för kvalitet och går sönder.
- Håll virus alikvotens på isen. Strax före kirurgi, Ladda ZIKV injektion mixen i injektionsnålen förberedd glas. Montera den gastäta injektionsspruta (50 µL volym), luer-lock fastsättning och slangar och mätta den sammansatta sprutan med slangen med mineralolja. När mättad, Fäst nålen och dra ~ 6-7 µL ZIKV in nålen (~ 1 µL är 1,7 × 106 TCID50/mL).
- Injicera gravid C57BL/6J eller 129S1/SvImJ möss med embryonala dag E14.5 embryon (för intrakraniell injektion) eller E10.5 embryon (för intrauterin injektion) med ketamin hydroklorid (80-100 mg/kg) och xylazin (5-10 mg/kg) utspätt i steril koksaltlösning intraperitonealt att inducera anestesi hos modern. Alternativt, söva mödrar med övervakade isofluran isofluran som tillhandahålls av inandning, med rökgaserna rensning, om så är lämpligt. Injicera buprenorfin-SR (0.5-1.0mg/kg) subkutant för att inducera analgesi.
- Nypa testet sövda mödrar på tå tip eller svans och sedan lägga dem liggande på en djur-godkända värmedyna (termisk pad 100 x 200 2,5 mm). Tå nypa tången är inte sterilt och används inte för att hantera vävnad i kirurgi. Handskar på händerna kan alternativt användas för att testa tå nypa tillbakadragande reflexen.
Obs: Se din institutionella veterinärpersonal för den föredragna perioperativ uppvärmningssätt. En cover placerades mellan denna Värmekudde och djuret. - Lägg till oftalmologiska salva i ögonen.
- Raka ytan av buken och sterilisera med jod och alkohol tre gånger. Alternativa jod och alkohol våtservetter; torka i en cirkulär rörelse bort från operationsområdet.
- Drapera huden runt operationsområdet med sterila dukar att undvika kontaminering av snittet och instrument.
Obs: Drapera öppnandet bör inte vara större än beredd operationsområdet; inget hår bör ses i drapera öppningen. - Nypa mammans hud från hennes mage med pincett och skär nedre delen av magen i en 1-1,5 cm linje vid mediala sagittal linjen med sterila kirurgiska saxar. Detta skär in i huden och vidare in i bukhålan så att embryona utsätts nu.
Obs: Kirurgisk sax används till incisionsfilm hud och peritonealdialys lager. Sterila instrument och handskar används för varje operation. - Skär en skåra i mitten en liten steril gasbinda och applicera ovanpå kirurgiska öppningen. Återfukta med steril koksaltlösning. Dra embryona genom skåran att vila på steril gasväv, med omsorg för att inte ta bort mer än 4-5 embryon med fokus på en livmoderns horn på en gång.
- Hydrate embryon med steril koksaltlösning före och under hela inympningen för att säkerställa att de inte torkar. Håll koll på vilka embryon injiceras och deras plats i livmoderns horn. Enskilda embryon är således behandlas som separata experiment, som embryon inte ändrar position samtidigt utveckla i livmodern. (Fortsätt till steg 1.15 intrauterin injektionsvätska).
- Placera försiktigt en spatel under huvudet på embryot. Belysa embryona väl med en lampa att visualisera huvud och kranium suturerna.
Obs: Aseptisk teknik följs, inbegripet sterila operationshandskar och instrument. Efter icke-sterila föremål (såsom lampan) manipuleras, handskar bör ersättas med nya sterila handskar före hantering av sterila instrument och områden. - Position huvudet genom att manipulera embryot med både lampa (bakom huvudet för synlighet) och gratis fingrar tills huvudet av embryot skjuts direkt mot livmoderväggen och hålls på plats med den icke-dominanta handen.
Obs: Positionering embryot är en viktig del och den teknik som tar de flesta praxis. För mycket fingertryck kan skada embryonala membranen leder till dödlighet och inte tillräckligt tryck kan försvåra injektionen. - Använd de blodkärl som löper längs skalle suturen som guide. Injicera ZIKV virus (~ 1 µL, 1,7 × 106 TCID50/mL mexikanska isolera MEX1-44) i laterala ventriklarna i E14.5 embryo hjärnor med den sammansatta sprutan och nålen. Använda kontroll media som en simulerad injektion.
- För att förbättra retention av graviditeten, undvika viral injektion av de två embryona intill äggstockarna och de två embryona bredvid övre slidan (figur 1A). Sammantaget injiceras högst 6 embryon per kull att minska tiden för operationen och förhindra förlust av embryo.
- Placera de injicerade embryona tillbaka till gravida dammarna och fylla bukhålan med ~ 0,5 mL steril koksaltlösning. Stänga, först sutur både buk peritoneal muskeln och sedan för det andra sutur yttre hudlagret med 4.0 sterila suturer. Det är bättre att använda avbrutna suturer; Det finns möjlighet att såret sårruptur om musen tuggar suturen.
- Placera musen i en bur som delvis vilar på en värmedyna att låta musen för att fly till en icke-uppvärmda området om det behövs. Övervaka mödrar medan de återhämtar sig (1-2 h) från anestesi. Utveckla embryona efter kirurgi för varierade tider enligt individuella experiment.
-
Intrauterin injektion
- Med en livmoder horn och embryon utsatt, Använd en 1 mL spruta och 27G nål för att injicera 100 μL zikavirus (106 TCID50 enheter upphängd i 100 μL DMEM), eller kontroll medium, in i intrauterin utrymme eller i placenta vävnaden. Notera vilka embryon har injicerats för fosterstadium dissektioner. Se tidigare publicerade arbete för mer detaljer18.
- Injicerade embryon tillbaka till gravida dammarna, och fyll bukhålan med ~ 0,5 mL steril koksaltlösning. Stänga, först sutur i peritoneal magmuskelstation och sedan för det andra sutur yttre hudlagret med 4.0 sterila suturer. Det är bättre att använda avbrutna suturer; Det finns möjlighet att såret sårruptur om musen tuggar suturen.
- Placera musen i en bur som delvis vilar på en värmedyna att låta musen för att fly till en icke-uppvärmda området om det behövs. Övervaka mödrar medan de återhämtar sig (1-2 h) från anestesi. Utveckla embryona efter kirurgi för varierade tider enligt individuella experiment.
2. neonatal Intracerebral inympning av Zika Virus: P0/P1
- Se till att den gastäta injektion sprutor (10 µL volym) och nålar inte är tilltäppta. Rengör och testa av laddar tre 20 mL sprutor med 26-gauge nålar: en med saltlösning, en med 70% etanol och en med luft för att klara lösningarna. Sterilisera med 10% blekmedel om tidigare använt virus injektionsvätska.
- Håll virus på is. Ladda sprutan genom att fylla det med koksaltlösning att minska dödvolym i sprutan och rita 0,75 µL av luft för att separera saltlösning från injektion material.
- Ställa in en uppvärmda befuktade återhämtning kammare för injicerade pups. Använda en värmeblocket, placera en förslutbar behållare (till exempel en tom tip box) med en steril kompress och fukta med saltlösning. Värm det före start injektioner.
- Ställ in den microinjector inklusive pumpen och controller. Bestämma enhet typkoden för specifika sprutan (dvs.för en 10 µL spruta, enhetstypen är ”D”). Bestämma hastigheten på injektion.
- Samla postnatal dag 0 eller 1 valparna (P0/P1) nära den kirurgiska setup. Fyll sprutan med virus. Desinficera pup huvud fästet med 70% EtOH.
- Packa in ungarna i ett tunt lager gasbinda och begrava dem helt i is för att uppnå ett bedövningsmedel tillstånd. Valpar är cryoanesthetized för 5 min. se till att valparna är tillräckligt sövd för injektion genom att utföra en svans toe nypa utan svar. Detta ger ungefär 15 min av en stat som bedövningsmedel.
- Placera pup på huvudet mount, sterilisera ytan av huvudet med jod och, etanol (tre gånger) och torka sedan torrt med en steril torka (isopropanol eller 70% EtOH).
- Markera lambda med en svart markering och spela in koordinaterna på lambda stereotaxic instrumentet. Mäta avståndet från lambda till kanten av ögat och början från stereotaxic koordinaterna för lambda färdsträckan 2/5 från lambda för ögat (för båda hjärnhalvorna om du injicerar båda).
- Kontrollera igen det anestetiska djupet innan du skapar ett hål för injektionsstället. Använd en 26-gauge nål försiktigt och ytligt punktera hårbotten och skallen på platsen för injektion (skallen är mycket mjuk hos nyfödda) för att skapa en öppning för injektionsnålen.
- Lägre injektionsnålen på den punkterade platsen, och när nålen har precis brutit mot huden, beräkna 1 mm djup för injektionsstället (laterala ventrikeln) stereotaxic instrumentet.
- När nålen är sänkt till injektion djupet, programmet microinjector att injicera: 1 µL av virus, med en hastighet av 10 nL/s, injicera ca 1 µL över 1,5 min (~ 1 μl 3,4 x 105 TCID50/mL ZIKV).
- När injektionen är klar, vänta 30 s, och dra in nålen i steg om 0,5 mm genom att vrida skruven (dorsalt), vänta 30 s efter varje ökning.
Obs: Detta reducerar läckage av injicerade viruset. - När tagits bort antingen snabbt belastning kanylen och sprutan med fler virus (olika virus eller håna kontroller ska läsas in separata sprutor/nålar) eller ta bort pup från huvudet fästet till pre uppvärmda befuktade kammaren. Övervaka pup varje några minuter för att mäta återhämtning. Ersätta pups med sin kull.
3. vuxna Intracerebral inympning av zikaviruset
- Injicera vuxna möss intraperitonealt med ketamin hydroklorid (80-100 mg/kg) och xylazin (5-10 mg/kg) utspätt i steril koksaltlösning att inducera anestesi. Injicera buprenorfin-SR (0.5-1.0mg/kg) subkutant för att inducera analgesi. Tå/svans nypa musen för att säkerställa dess bedövningsmedel tillstånd, och därefter montera den på det stereotaxic instrumentet (med en värmedyna) för att immobilisera huvudet under operation.
- Lägg till oftalmologiska salva i ögonen för att förhindrar uttorkning under operation av ögonen på musen. Raka hårbotten börjar bakom ögonen till början av öronen. Sterilisera utsatta huden med jod och 70% EtOH tre gånger. Alternativa jod och alkohol våtservetter; torka i en cirkulär rörelse bort från operationsområdet.
- Kontrollera igen bedövningsmedel djupet innan öppning av huden. Med en skalpell, göra en 0,5 cm snitt längs mediala sagittal huvudet i steriliserade platsen, utsätta bregma. Med ett rullande vinkar med en bomull spets applikator, rensa ytan av skallen av meningeal vävnader, medan samtidigt trycka huden från injektionsställena.
- Start från bregma, justera den kirurgiska borren och identifiera injektionsställena med hjälp av följande koordinater: AP -0,5 mm, ML: +/-1,5 mm. använder foten pedalen, borra i skallen sakta att bara borra ben tills ett hål har rensats för nålen.
- Ersätta borren med microinjector pump och gastät spruta (10 µL volym) på den stereotaxic. Lämnar en liten luftbubbla mellan saltlösning och viruset, Rita ~ 4-5 µL av virus. Bestämma enhet typkoden för specifika spruta volymen (dvs D för 10 μL volym spruta). Sänka nålen till DV: -1,5 mm från hjärnans yta. För att injicera 1 µL av virus, programmera en hastighet av 10 nL/s, injicera ca 1 µL över 1,5 min.
- När injektionen är klar, vänta 30 s, och ta bort nålen i steg om 0,5 mm, vänta 30 s efter varje vänd. Detta minskar återflödet och läckage av injicerade viruset.
- När injection(s) är klar, Använd pincett att lossa huden och återställa exponerade skallen. Sutur hårbotten tillbaka tillsammans med 4.0 suturer och ta bort musen från det stereotaxic instrumentet. Plats med musen i en bur som delvis vilar på en värmedyna att tillåta musen för att fly till en icke-uppvärmda området om det behövs och övervaka medan de återhämtar sig (1-2 h) från anestesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representativa bilder av våra injektion metoder för ZIKV inympning av embryonala hjärnan visas i diagram skildrar intracerebral injektioner (figur 1A) och intrauterin och intraplacental injektioner (figur 1B), som illustrerar den vägen gravid dammen och embryon bör visas och orienterade för kirurgi (embryonala inympning protocol). Figur 2A uppvisar ZIKV (MEX1-44) infektion (immunostained med antikroppen mot flavivirus grupp antigen, grön) i E18.5 hjärnbarken. Pax6 (röd) Etiketter NPCs i utvecklingsländer cortex. ZIKV var inokuleras i E14.5 embryonala hjärnor. Med TCID50 analys från vävnad prover7, vår tillväxt kurva analyser visar att ZIKV kan effektivt replikera och växa i utveckla hjärnor (figur 2B, 2 C), som publicerade7. Figur 2D visar framgångsrik infektion med DENV2 i utvecklingsländer cortex med metoden embryonala inympning. DENV2 upptäcks med hjälp av en antikropp mot flavivirus grupp antigen (grön). Figur 2E visar infektion med en annan stam av ZIKV, afrikansk härstamning (herr-766). Figur 2F visar en representativ infektion för alternativ-route, intraplacental inympning av ZIKV-Asien (MEX1-44) i skede E10.5.
Figur 3A är ett diagram som skildrar de landmärken som används för att identifiera platsen för injektion i den laterala ventriklarna för ZIKV inokulering av P0/1 valparna. Figur 3B visar ZIKV (MEX1-44) infektionen på P13 hjärnbarken efter P0/1 injektion. ZIKV (MEX1-44) detekteras med hjälp av antikropp mot flavivirus grupp antigen (röd). Figur 4 visar de fluorescerande pärlorna (röd) som användes för att öva injektion läge och laterala ventrikeln injektion framgång hos vuxna.
Figur 1: embryonala inokulering av ZIKV. (A) Diagram som representerar exponering av en livmoderns horn, med en notering att undvika injektion av embryon i anslutning till slidan och mest laterala embryot längs horn. (B) diagrammet som representerar exponering av en livmoderns horn, som skildrar intraplacental och intrauterin injektioner. Dessa diagram har ändrats från sina ursprungliga publikation21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ZIKV embryonala inympning på E14.5. (A) på E18.5 embryonala hjärnan är infekterad med ZIKV-Asien (MEX1-44) över alla lager av utveckla hjärnbarken (skalstapeln är 200 µm). Neurala stamceller är immunolabeled med Pax6 (röd) och ZIKV via flavivirus antigen (grön). (B) TCID50 resultat från Postnatal dag 3 (P3) hjärnvävnad inokuleras på E14.5 med ZIKV-Asien (MEX1-44). Felstaplar visar s.e.m. av tre oberoende mätningar med en mock och en ZIKV-infekterade hjärnan i varje mätning (***p < 0,0001, Students t-test)7. (C) TCID50 resultat som beskriver typiska ökad tillväxtkurvan för ZIKV viremi i infekterade fostrets hjärnvävnad. Felstaplar visar s.e.m. av tre oberoende mätningar med en mock och en ZIKV-Asien (MEX1-44) infekterade hjärnan i varje mätning. Variansanalys (ANOVA) upptäcker en betydande ökning i viral titer som utveckling fortsätter7. (D) denguefeber virus (DENV2) infekterade representativa histologi (E14.5 embryon inokuleras med ~ 1 µL 3,4 x 105 TCID50/mL, skalstapeln är 200 um) och (E) ZIKV-Afrika (MR766) infekterade representativa histologi (skala bar 200 µm). (F) ZIKV-Asien (MEX1-44) infekterade representativa histologi från intraplacental injektion strategin (skalstapeln är 200 µm). I alla bilder fläckar Hoechst atomkärnor. Dessa siffror har ändrats från sina ursprungliga publikation7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa histologi av P1 inokulering av ZIKV. (A) diagrammet visar metoden att fastställa injektion var in i de laterala ventriklarna P1 pups. (B) representativa koronalt kryosnitt immunostained för flavivirus grupp antigen med låg (vänster, skalstapeln är 100 µm) och hög (höger skala bar är 50 µm) förstoring av P1 inokulering av ZIKV på P15 (~ 1 μl 3,4 x 105 TCID50/mL ZIKV). Hoechst fläckar atomkärnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: vuxen skede intraventrikulär injektion. Vuxen mus injiceras med fluorescerande pärlor offrades strax efter operationen för att bestämma injektion läge framgång (skalstapeln är 200 µm). Sagittal cryosection kunde ses omedelbart efter snittning pärlor inte kräver ytterligare färgning. Hoechst fläckar atomkärnor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrivs här är en metod för intracerebral inympning av ZIKV på embryonala, neonatal och vuxna stadier för utredning av ZIKV-inducerade skador i hjärnans utveckling. Medan enkla, finns det några överväganden som utredare bör vidta för att säkerställa kvaliteten på studien och säkerheten för de inblandade.
DENV är närbesläktad med ZIKV i släktet flavivirus. DENV har inte länkats causally med pediatrisk hjärnstörningar hos människor. DENV2 kan infektera och replikera i hjärnans utveckling använder den embryonala inokuleringsmetod (~ 1 µL 3,4 x 105 TCID50/mL) (figur 2D). Därför, förutom oinfekterade Vero cell media (mock), DENV infektion kan användas som en negativ kontroll för att studera ZIKV-specifika patogenesen i hjärnans utveckling. Det är viktigt att undvika virus läckage i livmodern, vilket kan resultera i oönskade kontaminering av andra embryon. Det är därför nödvändigt att kontrollera infekterade och icke-infekterade individer genom isolera hjärnvävnad från varje embryo följt av qRT-PCR eller TCID50 analysen. Ett färgämne kan läggas till det virala mediet för att visuellt bekräfta injektionen, men testa för att säkerställa att färgämnet inte orsakar skada sig själv.
Mus stammar uppvisar tillväxt variabilitet, och därför P1 injektion platser behöver kontrolleras för varje mus-rad. Utföra en mock nyfödda injektion med fluorescerande pärlor att visualisera injektionsstället. Denna preliminära studie informerar om injektionen når ventrikeln eller går för djupt in i hjärnvävnaden. För perfekt resultat, kan valpar offras strax efter injektionen för att identifiera lokaliseringen av fluorescerande pärlorna i ventrikeln. Hela huvudet av pup kan fastställas över natten, inbäddade, och cryosectioned att observera platsen exakt injektion. Injektion med olja-mättade sprutan kräver erfarenhet och det rekommenderas att öva på att använda simulerade injektioner med färgämne på parafilm Kontrollera att injektionsvolymen är korrekt.
Åtgärder för biosäkerhet är kritiska i dessa studier för att undvika oavsiktlig infektion av laboratoriepersonal som arbetar med virus. Biosäkerhet godkännanden måste göras i förväg på anläggningen där arbetet utförs. ZIKV anses biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) patogener av Förenta staterna Centers for Disease Control och Prevention. Alla individer som arbetar med virus eller arbetar i områden där viruset hanteras bör vara medvetna om och bekantat med biosäkerhet protokoll för sin institution. Alla verktyg och ytor som utsätts för den ZIKV eller DENV2 bör desinficeras med 10% blekmedel att förstöra resterande viruspartiklar efter användning. Kvinnor som är gravida eller försöker bli gravida rekommenderas att inte interagera med forskningsområden som utsätts för ZIKV eller DENV2. Alla vävnad används för histologi korrigeras i 4% PFA att inaktivera virus för analys. Lagra och odla virus bör göras i Vero-celler i en huv som utsetts för BSL2 arbete. Beståndet virus och vävnad titrering kan kvantifieras med hjälp av TCID50 protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna Dr Abdellatif Benraiss vid University of Rochester för sitt mentorskap och diskussioner relevant för lära sig vuxen kirurgiska och nyfödda tekniker. Författarna vill även berömma Dr James Lauderdale på UGA för användning av hans stereotaxic utrustning och diskussioner relaterade till ställa in metoden för denna teknik, och befordran för forskning College forskare (bågar) foundation för deras och våra NIH stöd (NINDS bidrag R01NS096176-02, R01NS097231-01 & F99NS105187-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | - | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | - | |
| Mineral Oil | VWR | - | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
