Summary
Hier beschrijven we een methode voor de vaststelling van een model voor Zika virus-geïnduceerde microcefalie in muis. Dit protocol bevat methoden voor embryonale, Neonatale en volwassene-fase intracerebrale inoculatie van de Zika-virus.
Abstract
Het Zika-virus (ZIKV) is een flavivirus momenteel endemisch in Noord-, Midden- en Zuid-Amerika. Nu blijkt dat de ZIKV microcefalie en extra hersenen afwijkingen kan veroorzaken. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de pathogenese van ZIKV in de ontwikkelende hersenen blijft echter onduidelijk. Intracerebrale chirurgische methoden worden vaak gebruikt in het onderzoek neurowetenschap om vragen te stellen over zowel normale en abnormale hersenontwikkeling en hersenfunctie. Dit protocol maakt gebruik van klassieke chirurgische technieken en beschrijving van de methoden waarmee een model ZIKV-geassocieerde neurologische ziekten bij de mens in het zenuwstelsel van de muis. Terwijl directe hersenen inoculatie doet niet model op de normale wijze van transmissie van het virus, kan de methode onderzoekers gerichte vragen betreffende het gevolg na ZIKV infectie van de ontwikkelende hersenen. Dit protocol beschrijft embryonale, Neonatale en volwassen stadia van intraventricular inoculatie van ZIKV. Eenmaal onder de knie, kan deze methode worden een ongecompliceerd en reproduceerbare techniek die duurt slechts een paar uur uit te voeren.
Introduction
Microcefalie is een voorwaarde die voortvloeien uit de ontwikkeling van de defecte hersenen gekenmerkt door kleiner is dan de gemiddelde hoofdmaat bij pasgeborenen. Kinderen met microcefalie vertonen een aantal symptomen die kunnen bestaan uit vertraging in de ontwikkeling, inbeslagneming, verstandelijke beperking, gehoorverlies, visie problemen en problemen met beweging en balans, ondermeer, afhankelijk van de ernst van de ziekte en 1,2,3te veroorzaken. Deze voorwaarde is multifactoriële aard, met de genetische, besmettelijke agent en milieufactoren gekoppeld aan waardoor microcefalie4,5,6,7,8, 9. 8 kinderen uit 10.000 geboorten werden voor het 2015-2016 ZIKV uitbreken, microcefalie in de Verenigde Staten volgens de CDC10gediagnosticeerd. Op 1 februarist van 2016 de World Health Organization verklaarde de Zika-virus een zorg van de noodsituatie van International van volksgezondheid als gevolg van de alarmerende toename van de microcefalie diagnoses die zijn gekoppeld aan ZIKV besmetting in moeders11, 12. Een recente studie van de CDC op ZIKV gevallen in de Verenigde Staten suggereert dat moeders ZIKV infectie resulteert in een verhoogd risico op 20-fold voor een kind te ontwikkelen microcefalie ten opzichte van niet-geïnfecteerde personen, en 4% van de ZIKV besmet moeders uit de Verenigde Staten hebben geleid tot kinderen met microcefalie11. Het tarief van microcefalie-geassocieerde geboorteafwijkingen tijdens de zwangerschap van ZIKV infectie in Brazilië zijn gemeld te hebben beïnvloed tot 17% van de baby's in geïnfecteerde moeders, die aangeeft dat andere factoren in Latijns-Amerika kunnen bijdragen aan het verhoogde risico op 13. terwijl we weten dat de ZIKV microcefalie en pathogenese kan veroorzaken in de neurale progenitor cel (NPC) bevolking7,8,14, de volledige pathogenese van ZIKV in de ontwikkeling van de hersenen blijft ongrijpbaar. Het is belangrijk voor de ontwikkeling van diermodellen om de ziekte mechanismen ten grondslag liggen aan de afwijkingen van de hersenen die zijn gekoppeld aan ZIKV infectie verder te onderzoeken.
Direct studeren het effect dat de ZIKV op de ontwikkeling van de hersenen heeft, ontwikkelden we eerst een muismodel intracerebrale inoculatie van embryonale dag 14,5 (E14.5) hersenen met ZIKV7. Deze fase werd gekozen aangezien het als vertegenwoordiger van het einde van het eerste trimester in menselijke dracht14wordt beschouwd. Pups kunnen overleven tot postnatale dag 5 (P5) met deze methode embryonale intracerebrale injectie (~ 1 µL van 1,7 x 106 weefselkweek infectieuze dosis (TCID50/mL)). Deze postnatale pups vertonen een aantal fenotypen ook waargenomen in besmette menselijke baby's, met inbegrip van uitgebreide ventrikels, neuronale verlies axonale rarefaction, astrogliosis en12,15van de activering van de microglial. Een pasgeboren muis brein is relatief onvolwassen, verwant aan het ontwikkelingsstadium van het menselijk brein op middellange dracht16, en de ontwikkeling van de hersenen van de muis bevat een grote postnatale component. Studeren later dracht fase infecties, is ook een methode voor postnatale infectie beschreven. Pasgeborenen geïnfecteerd met ZIKV bij P1 zijn in staat om te overleven tot aan 13 dagen na injectie. Bloed-geboren volwassen stadium infectie is beschreven in de muis eerder17 maar het gebruik van vereist de interferon (IFN) regulerende factor (IRF) transcriptie factoren IRF-3, -5,-7 triple knockout stam. Dit protocol beschrijft een methode voor het enten van de ZIKV intraventricularly om te omzeilen de antivirale reactie van het lymfkliertest model in de volwassene uit te schakelen. Terwijl dit het lymfkliertest immuunsysteem omzeilt, deze route van injectie doet niet direct na te bootsen de typische route van infectie. Om deze discrepantie direct, kunt de experimentator uitvoeren een uteriene infectie van ZIKV in plaats van de intracraniële route. Overgenomen uit eerdere werk18, hebben we deze techniek in dit protocol embryonale infectie kort beschreven.
De Zika-virusstammen uitgevoerd met deze techniek zijn de Mexicaanse isolaat MEX1-447,19 en de Afrikaanse isoleren heer-766 geïsoleerd in 194720. Zika MEX1-44 werd geïsoleerd in Chiapas, Mexico in januari voor 2016 vanaf een geïnfecteerde Aedes aegypti -mug. Wij verkregen dit virus met toestemming door de Universiteit van Texas Medical Branch in Galveston (UTMB). Daarnaast is het Dengue virus serotype 2 (DENV2) werd geënt met behulp van deze techniek in een vergelijkende studie. DENV2, stam S16803 (reeks GenBank GU289914), werd geïsoleerd uit een patiënt monster uit Thailand in 1974 en gepasseerd in C6/36 cellen. Het virus werd gepasseerd tweemaal in Vero-cellen door de wereld-referentiecentrum voor opkomende virussen en Arboviruses (WRCEVA) voor muis injecties. Dit toont aan dat deze techniek net zo werkt goed voor verschillende stammen van ZIKV en andere flavivirussen die een impact op de ontwikkeling van de hersenen hebben kunnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dier gebruik protocollen volgen de richtlijnen van de verzorging van de dieren van de University of Southern California en de University of Georgia. Euthanasie methoden voor zwangere dammen en volwassenen worden uitgevoerd volgens goedgekeurde protocollen: kooldioxide verstikking, gevolgd door cervicale dislocatie als secundaire methode om euthanasie. Neonatale pups zijn euthanized door onthoofding.
Let op: Het volgende protocol omvat de behandeling van een pathogene virus. Juiste voorzorgsmaatregelen moet worden getroffen tijdens het verwerken van het virus. Alle protocollen moeten worden goedgekeurd door de bevoegde institutionele Commissie vóór gebruik.
1. embryonale intracerebrale inoculatie van Zika-Virus
- Voor getimede zwangere paring, kunt u overwegen middag van de dag na de paring als E0.5. Paar muizen aan het eind van de dag en selectievakje stekkers in de vroege ochtend om de variabiliteit van de paring van de tijd.
- De glazen naald vóór de ingreep voor te bereiden. Trek de naald en knipt bij 1/3 de lengte en daarna verscherpen op een hoek van 45° met behulp van een micropipet grinder met een druipneus totdat de porie is KMO's tot 50-70 µm. Check naald tips onder een stereoscoop voor kwaliteit en breuk.
- Houd het virus aliquoot op ijs. Net vóór de operatie, de ZIKV injectie mix in de naald van de injectie bereid glas te laden. De gasdichte injectiespuit (50 µL volume), luer-lock bijlage en buis monteren, en verzadigen van de geassembleerde spuit met de slang met minerale olie. Eenmaal verzadigd, hechten de naald en teken ~ 6-7 µL ZIKV in de naald (~ 1 µL is 1.7 × 10-6 TCID50/mL).
- Injecteren van zwangere C57BL/6J of 129S1/SvImJ muizen met embryonale dag E14.5 embryo's (voor intracraniële injectie) of E10.5-embryo's (voor anticonceptie injectie) met ketamine hydrochloride (80-100 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg) verdund in een steriele zoutoplossing intraperitoneally voor het opwekken van verdoving in de moeder. U kunt ook anesthetize moeders met gecontroleerde Isofluraan Isofluraan geboden door inademing, met het afgas opruiming, indien van toepassing. Buprenorfine-SR (0.5-1.0mg/kg) subcutaan te induceren analgesie te injecteren.
- Snuifje test verdoofd moeders op de teen tip of staart en dan leg ze liggende op een dier-goedgekeurde verwarming pad (thermische pad van 100 x 200 2.5 mm). De teen snuifje verlostang zijn niet steriel en worden niet gebruikt voor het verwerken van weefsel in de chirurgie. Gehandschoende handen kunnen ook, worden gebruikt voor het testen van de teen reflex voor de terugtrekking van de snuifje.
Nota: Verwijs naar uw institutionele veterinair personeel voor de voorkeur perioperatieve verwarming methode. Een cover werd geplaatst tussen deze verwarming pad en het dier. - Ophthalmic zalf toevoegen aan de ogen.
- Het oppervlak van de buik scheren en steriliseren met jodium en alcohol driemaal. Alternatieve jodium en alcohol veegt; Veeg in een draaiende beweging uit de buurt van de chirurgische site.
- Drape de huid rondom de chirurgische site met steriele doeken om verontreiniging van de incisie en de instrumenten te voorkomen.
Opmerking: De gordijn opening mag niet groter zijn dan de bereid chirurgische site; geen haar moet worden gezien in de opening van het gordijn. - Knijp de Moederdag huid weg van haar buik met een tang en snijd de onderbuik in een 1-1,5 cm lijn bij de mediale Sagittaal lijn met een steriele chirurgische schaar. Dit snijdt in de huid en verder in de buikholte, zodat de embryo's nu worden blootgesteld.
Opmerking: Chirurgische schaar worden gebruikt om de incise van de huid en peritoneale laag. Steriele instrumenten en handschoenen worden gebruikt voor elke operatie. - Knip een gleuf in het midden van een kleine steriel gaas en bovenop de chirurgische opening van toepassing. Hydrateren met een steriele zoutoplossing. Trek de embryo's door de gleuf te rusten op het steriele gaas, met zorg niet meer dan 4-5 embryo's zich te concentreren op een baarmoeder-hoorn in één keer verwijderen.
- Hydrateer de embryo's met steriele zoutoplossing voorafgaand aan en tijdens de inoculatie om ervoor te zorgen dat ze niet uitdrogen. Bijhouden van welke embryo's worden geïnjecteerd en hun locatie binnen de baarmoeder hoorn. Individuele embryo's worden dus behandeld als aparte experimenten, zoals embryo's standpunt niet wijzigen terwijl de ontwikkeling in utero. (Stap 1.15 voor anticonceptie injectie blijven).
- Voorzichtig plaats een spatel onder het hoofd van het embryo. Verlichten de embryo's ook met een lamp te visualiseren van het hoofd en schedel hechtingen.
Opmerking: Aseptische techniek wordt gevolgd, met inbegrip van steriele chirurgische handschoenen en instrumenten. Na niet-steriele items (zoals het licht) worden gemanipuleerd, handschoenen moeten worden vervangen door nieuwe steriele handschoenen vóór behandeling steriele instrumenten en gebieden. - Positie het hoofd door het manipuleren van het embryo met zowel de lamp (achter het hoofd voor zichtbaarheid) en de vrije vingers totdat het hoofd van het embryo is rechtstreeks tegen de baarmoederwand opgedreven en op zijn plaats met de niet-dominante hand gehouden.
Opmerking: Positionering van het embryo is een cruciaal onderdeel en de techniek die de meeste praktijk neemt. Teveel vinger druk kan schade aan de embryonic membranen leidt tot letaliteit en niet genoeg druk de injectie kan bemoeilijken. - Gebruik de bloedvaten loopt langs de schedel hechtdraad als een gids. Injecteren ZIKV virus (~ 1 µL, 1.7 × 10-6 TCID50/mL Mexicaanse isoleren MEX1-44) in de laterale ventrikels van E14.5 embryo hersenen met de geassembleerde spuit en naald. Control media gebruiken als een schijnvertoning injectie.
- Vermijd om te verbeteren retentie van de zwangerschap, virale injectie van de twee embryo's naast de eierstokken en de twee embryo's naast de bovenste vagina (figuur 1A). Over het algemeen worden niet meer dan 6 embryo's geïnjecteerd per nest te verminderen van het tijdstip van de operatie en embryo verlies te voorkomen.
- Plaats de ingespoten embryo's terug in de zwangere dammen, en vul de buikholte met ~ 0,5 mL steriele zoutoplossing. Sluiten, eerst suture zowel de peritoneale buikspier en vervolgens in de tweede suture de externe huidlaag met 4.0 steriele hechtingen. Het is beter om het gebruik van onderbroken hechtingen; Er is mogelijkheid voor wond dehiscentie als de muis de hechtdraad kauwt.
- Plaats de muis in een kooi gedeeltelijk rustend op een verwarming pad dat de muis te ontsnappen naar een niet verwarmde gebied indien nodig. Monitor de moeders terwijl ze herstellen (1-2 h) van anesthesie. Ontwikkelen de embryo's na chirurgie voor gevarieerd tijden volgens individuele experimenten.
-
Uteriene injectie
- Met een baarmoeder hoorn en embryo's blootgesteld, gebruik een 1 mL spuit en 27G naald te injecteren 100 μl Zika virus (106 TCID50 eenheden gesuspendeerd in 100 μl DMEM), of controle medium, in de uteriene ruimte of in de placenta weefsel. Opmerking welke embryo's zijn ingespoten voor ontledingen van de embryonale fase. Zie eerder gepubliceerde werken voor meer details18.
- Plaats van ingespoten embryo's terug in de zwangere dammen, en vul de buikholte met ~ 0,5 mL steriele zoutoplossing. Sluiten, eerst suture de peritoneale buikspier en vervolgens in de tweede suture de externe huidlaag met 4.0 steriele hechtingen. Het is beter om het gebruik van onderbroken hechtingen; Er is mogelijkheid voor wond dehiscentie als de muis de hechtdraad kauwt.
- Plaats de muis in een kooi gedeeltelijk rustend op een verwarming pad dat de muis te ontsnappen naar een niet verwarmde gebied indien nodig. Monitor de moeders terwijl ze herstellen (1-2 h) van anesthesie. Ontwikkelen de embryo's na chirurgie voor gevarieerd tijden volgens individuele experimenten.
2. de neonatale intracerebrale inoculatie van Zika-Virus: P0/P1
- Zorg ervoor dat de gasdichte injectiespuiten (10 µL volume) en de naalden zijn niet verstopt. Reinigen en testen door het laden van de drie 20 mL disposable spuiten met 26-gauge naalden: een met zoutoplossing, een met 70% ethanol, en een met lucht te wissen van de oplossingen. Steriliseren met 10% bleekwater als eerder gebruikt voor virus injectie.
- Houd virus op ijs. Laad de spuit door vullen met zoutoplossing om dood volume in de spuit, en tekenen van 0,75 µL van lucht te scheiden van de zoutoplossing van het materiaal van de injectie.
- Instellen van een verwarmde bevochtigde herstel kamer voor ingespoten pups. Met behulp van een blok van Verwarming, plaats een afgesloten container (zoals een lege tip box) met een steriel gaas en humidify met zoutoplossing. Verwarm het vóór het opstarten van injecties.
- De microinjector met inbegrip van de pomp en de controller instellen. De apparaatcode die type voor de specifieke spuit bepalen (dat wil zeggen, voor een 10 µL spuit, het apparaattype is "D"). Bepaal de snelheid van de injectie.
- Verzamel de postnatale dag 0 of 1 pups (P0/P1) in de omgeving van het chirurgische setup. De injectiespuit met virus worden geladen. Desinfecteren van de pup hoofd montering met 70% EtOH.
- Wikkel de pups in een dun laagje gaas en hen volledig te begraven in ijs om een verdoving staat. Pups zijn cryoanesthetized voor 5 min. Zorg ervoor dat de pups zijn voldoende verdoofd voor injectie door het uitvoeren van een staart/teen snuifje zonder reactie. Dit levert ongeveer 15 min van een verdoving staat.
- Plaats van de pup op hoofd mount, steriliseren van het oppervlak van het hoofd met jodium en ethanol (drie keer) en vervolgens veeg droog met een steriel doekje (isopropanol of 70% EtOH).
- Lambda markeren met een zwarte marker en registreren de coördinaten op lambda met behulp van het stereotaxic instrument. Maatregel de afstand van lambda aan de rand van het oog en het begin van de stereotaxic coördinaten van lambda berekenen van de afstand van de 2/5 van de lambda voor het oog (voor beide halfronden als u zijn het injecteren van beide).
- Vinkt de verdoving diepte voordat een gat voor de injectieplaats. Gebruik een 26-gauge naald om zorgvuldig en oppervlakkig de hoofdhuid en de schedel op de locatie van de injectie (de schedel is zeer zacht bij pasgeborenen) als u wilt maken van een opening voor de injectie naald punctie.
- De injectie naald lager in de geperforeerde locatie, en zodra de naald heeft net het overtreden van de huid, bereken een 1 mm diepte voor de injectieplaats (laterale ventrikel) met behulp van het stereotaxic instrument.
- Zodra de naald wordt verlaagd tot de diepte van de injectie, programma de microinjector te injecteren: 1 µL van virus, met een snelheid van 10 nL/s, injecteren van ongeveer 1 µL meer dan 1,5 min (~ 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV).
- Wanneer de injectie is voltooid, wacht 30 s, en intrekken van de naald in stappen van 0,5 mm door het draaien van de schroef (dorsally), wachten 30 s na elke increment.
Opmerking: Dit vermindert lekkage van ingespoten virus. - Zodra verwijderd, hetzij snel laden de naalden en spuiten met meerder virus (verschillende virussen of mock besturingselementen moeten worden geladen in aparte injectiespuiten/naalden) of verwijderen van de pup uit het hoofd mount voor de voorverwarmde bevochtigde kamer. Volgen de pup om de paar minuten te meten van herstel. Vervang de pups met haar nest.
3. volwassen intracerebrale inoculatie van Zika-Virus
- Injecteren van volwassen muizen intraperitoneally met ketamine hydrochloride (80-100 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg) verdund in een steriele zoutoplossing voor het opwekken van de verdoving. Buprenorfine-SR (0.5-1.0mg/kg) subcutaan te induceren analgesie te injecteren. Teen/staart knijpen de muis om te zorgen dat de verdoving staat en dit vervolgens koppelen op de stereotaxic instrument (met een verwarming pad) om te immobiliseren het hoofd tijdens de operatie.
- Ophthalmic zalf toevoegen aan de ogen om te voorkomen dat de ogen van de muis uitdrogen tijdens de operatie. Scheren van de hoofdhuid starten achter de ogen naar het begin van de oren. Steriliseren van de blootgestelde huid met jodium en 70% EtOH driemaal. Alternatieve jodium en alcohol veegt; Veeg in een draaiende beweging uit de buurt van de chirurgische site.
- Vinkt de verdoving diepte vóór het gebeuren van de huid. Met behulp van een scalpel, maak een incisie 0.5 cm langs de mediale Sagittaal lijn van het hoofd in de gesteriliseerde locatie, bregma bloot. Een afrollen met een applicator katoen-tipped, schakelt u het oppervlak van de schedel van meningeal weefsels, terwijl het tegelijkertijd duwen de huid van de bezienswaardigheden van de injectie.
- Vanaf bregma, aanpassing van de chirurgische boor en identificeren van de sites van de injectie met behulp van de volgende coördinaten: AP -0,5 mm, ML: +/-1,5 mm. met behulp van het voetpedaal controle, boren in schedel langzaam over het bot alleen boren totdat een gat voor de naald is gewist.
- Vervang de boor met de microinjector pomp en gasdichte spuiten (10 µL volume) op de stereotaxic. Het verlaten van een kleine luchtbel tussen de zoutoplossing en het virus, trekken ~ 4-5 µL van het virus. De apparaatcode die type voor de specifieke Pompvolume (ie, D voor 10 μL volume spuit) bepalen. Verlagen van de naald aan DV:-1.5 mm van het oppervlak van de hersenen. Program om te injecteren 1 µL van virus, een snelheid van 10 nL/s, injecteren van ongeveer 1 µL meer dan 1,5 min.
- Wanneer de injectie is voltooid, wacht 30 s, en verwijder de naald in stappen van 0,5 mm, wachten 30 s na elke beurt. Dit vermindert terugvoer en lekkage van het geïnjecteerde virus.
- Wanneer de injection(s) zijn klaar, gebruik pincet los van de huid te herstellen van de blootgestelde schedel. Sutuur (geologie) de hoofdhuid terug samen met behulp van 4.0 hechtingen en verwijder de muis uit de stereotaxic instrument. Plaats de muis in een kooi gedeeltelijk rustend op een verwarming pad dat de muis om te ontsnappen naar een niet verwarmde gebied indien nodig en controleren terwijl ze herstellen (1-2 h) van anesthesie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representatieve beelden van onze injectie methoden voor de ZIKV-inoculatie van embryonale hersenen worden weergegeven in diagrammen afgebeeld intracerebrale injecties (figuur 1A) en uteriene en intraplacental injecties (figuur 1B), illustreren de manier de zwangere dam en embryo's moeten worden bekeken en worden georiënteerd voor chirurgie (embryonale inoculatie protocol). Figuur 2A vertoont ZIKV (MEX1-44) infectie (immunostained met het antilichaam tegen flavivirus groep antigeen, groen) in de hersenschors E18.5. Pax6 (rood) gegevenslabels NPC's in de ontwikkelingslanden cortex. ZIKV was geënt in embryonale hersenen E14.5. Gebruik de TCID50 kwantitatieve analyse van weefsel monsters7, onze groei curve analyses tonen aan dat de ZIKV kan efficiënt repliceren en groeien in de ontwikkelende hersenen (figuur 2B, 2 C), zoals gepubliceerde7. Figuur 2D toont succesvolle infectie met DENV2 in de ontwikkelende cortex die met behulp van de embryonale beëntingsmethode. DENV2 wordt gedetecteerd met behulp van een antilichaam tegen flavivirus groep antigeen (groen). Figuur 2E toont infectie met een andere stam van ZIKV, de Afrikaanse afkomst (heer-766). Figuur 2F toont een representatieve infectie voor de inoculatie van het alternatief-route, intraplacental van ZIKV-Azië (MEX1-44) stadium E10.5.
Figuur 3A is een diagram waarin u ziet de bezienswaardigheden gebruikt voor het identificeren van de locatie van de injectie in de laterale ventrikels voor ZIKV inoculatie van de pups P0/1. Figuur 3B toont de ZIKV (MEX1-44) infectie op P13 hersenschors na P0/1 injectie. ZIKV (MEX1-44) wordt gedetecteerd met behulp van antilichamen tegen flavivirus groep antigeen (rood). Figuur 4 toont de fluorescerende kralen (rood) die werden gebruikt om te oefenen injectie locatie en laterale ventrikel injectie succes bij volwassenen.
Figuur 1: embryonale inoculatie van de ZIKV. (A) Diagram vertegenwoordigt van de blootstelling van een baarmoeder hoorn, met een briefje om te voorkomen dat de injectie van embryo's grenzend aan de vagina en het meest laterale embryo langs de hoorn. (B) Diagram vertegenwoordigt van de blootstelling van een baarmoeder hoorn, beeltenis van de locatie van intraplacental en uteriene injecties. Deze diagrammen zijn gewijzigd van hun oorspronkelijke publicatie21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: de embryonale inoculatie van de ZIKV bij E14.5. (A) op E18.5 de embryonale hersenen is geïnfecteerd met ZIKV-Azië (MEX1-44) over alle lagen van de ontwikkelingslanden neocortex (schaal bar is 200 µm). Neurale voorlopercellen zijn immunolabeled met Pax6 (rood) en ZIKV via flavivirus antigeen (groen). (B) TCID50 resultaten van postnatale dag 3 (P3) hersenweefsel geënt op E14.5 met ZIKV-Azië (MEX1-44). Foutbalken geven s.e.m. van drie onafhankelijke metingen met een mock en één ZIKV-besmette hersenen in elke meting (***p < 0,0001, Student t-test)7. (C) TCID50 resultaten beschrijven typisch groeicurve van ZIKV voorjaarsviremie in besmette foetaal hersenweefsel. Foutbalken geven de s.e.m. van drie onafhankelijke metingen met een mock en één ZIKV-Azië (MEX1-44) besmette hersenen in elke meting. Variantieanalyse (ANOVA) detecteert een aanzienlijke stijging in virale titer zoals ontwikkeling7 opbrengst. (D) Dengue virus (DENV2) besmette representatieve histologie (E14.5 embryo's geënt met ~ 1 µL van 3.4 x 105 TCID50/mL, schaal bar is 200 um) en (E) ZIKV-Afrika (MR766) besmet representatieve histologie (schaal bar 200 µm). (F) ZIKV-Azië (MEX1-44) besmet representatieve histologie van de strategie van de injectie van intraplacental (schaal bar is 200 µm). In alle afbeeldingen vlekken Hoechst kernen. Deze cijfers zijn gewijzigd van hun oorspronkelijke publicatie7. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: vertegenwoordiger histologie van de P1 inoculatie van ZIKV. (A) Diagram demonstreren de methode om te bepalen van de locatie van de injectie in de laterale ventrikels van P1 pups. (B) vertegenwoordiger coronale cryosecties immunostained voor flavivirus groep antigeen met een lage (op links, schaal bar is 100 µm) en hoog (aan rechterzijde schaal bar is 50 µm) vergroting van P1 inoculatie van ZIKV bij P15 (~ 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV). Hoechst vlekken kernen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: volwassene etappe intraventricular injectie. Volwassen muis ingespoten met fluorescerende kralen geofferd werd kort na de operatie bepalen het succes van de locatie injectie (schaal bar is 200 µm). Sagittaal cryosection kan worden gezien onmiddellijk na afdelen als parels vereisen geen verdere kleuring. Hoechst vlekken kernen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier wordt beschreven, is een methode voor intracerebrale inoculatie van de ZIKV in embryonale, Neonatale en volwassen stadia voor het onderzoek van ZIKV-veroorzaakte schade in de ontwikkeling van de hersenen. Terwijl heel simpel: er zijn een paar overwegingen die onderzoekers nemen moeten om ervoor te zorgen de kwaliteit van de studie en de veiligheid van de betrokkenen.
DENV is nauw verwant aan ZIKV in het geslacht flavivirus. DENV heeft geen causaal verband gebracht met pediatrische Hersenafwijkingen bij de mens. DENV2 met succes kunnen infecteren en repliceren in de ontwikkelende hersenen met behulp van de embryonale beëntingsmethode (~ 1 µL van 3.4 x 105 TCID50/mL) (figuur 2D). Daarom, naast niet-geïnfecteerde Vero cel media (mock), DENV-infectie kan worden gebruikt als een negatieve controle om ZIKV-specifieke pathogenese in de ontwikkelende hersenen te bestuderen. Het is belangrijk om te voorkomen dat virus lekkage in utero, die in ongewenste verontreiniging van andere embryo's resulteren kan. Daarom is het nodig om te controleren of besmette en niet-besmette personen door het isoleren van hersenweefsel van elk embryo gevolgd door qRT-PCR of de TCID50 assay. Een kleurstof kan worden toegevoegd aan de virale middellange tot visueel bevestigen de injectie, maar om ervoor te zorgen dat de kleurstof geen schade zelf veroorzaakt testen.
Muis spanningen vertonen groei variabiliteit en P1 injectie locaties moeten worden gecontroleerd voor elke regel van de muis. Het uitvoeren van een mock neonate injectie met fluorescerende kralen te visualiseren van de injectieplaats. Deze voorstudie informeert de injectie bereikt het ventrikel of gaat te diep in het hersenweefsel. Voor een ideaal resultaat kunnen pups kort na injectie te identificeren van de locatie van de fluorescerende parels in de ventrikel worden opgeofferd. De gehele kop van de pup's nachts, kan worden vastgesteld ingesloten, en cryosectioned te observeren de nauwkeurige injectie-locatie. Injectie met de olie-verzadigd spuit vereist ervaring en het wordt aanbevolen om te oefenen met behulp van sham injecties met kleurstof op parafilm om te verifiëren dat het geïnjecteerde volume juist is.
Bioveiligheid maatregelen zijn cruciaal in deze studies om te voorkomen dat toevallige besmetting van laboratoriumpersoneel werken met het virus. Bioveiligheid goedkeuringen moeten op voorhand worden gemaakt op de faciliteit waar het werk is gaande. ZIKV wordt beschouwd als een ziekteverwekker Biosafety Level 2 (BSL2) door de Verenigde Staten Centers voor Disease Control and Prevention. Alle personen die werken met het virus of werken in gebieden waar het virus wordt afgehandeld moeten worden bewust en vertrouwd met bioveiligheid protocollen voor hun instelling. Alle hulpmiddelen en oppervlakken die zijn blootgesteld aan de ZIKV of de DENV2 moeten worden ontsmet met 10% bleekwater te vernietigen resterende virale deeltjes na gebruik. Vrouwen die zwanger zijn of proberen om zwanger te worden aanbevolen aan geen interactie met de onderzoeksgebieden blootgesteld aan ZIKV of DENV2. Alle weefsel gebruikt voor histologie worden opgelost met 4% PFA voor inactivering van de virussen voor analyse. Opslaan en kweken van het virus moeten gebeuren in Vero-cellen in een kap die bestemd zijn voor BSL2 werk. Voorraad virussen en titratie van het weefsel kunnen worden gekwantificeerd aan de hand het TCID50 protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen Dr. Abdellatif Benraiss bij de Universiteit van Rochester voor zijn mentorschap en de discussies relevant zijn voor het leren van de volwassene chirurgische en neonate technieken. De auteurs wil ook erkennen Dr. James Lauderdale op UGA voor het gebruik van zijn stereotaxic apparatuur en discussies aan het opzetten van de methodologie voor deze techniek, en de vooruitgang voor onderzoek College wetenschappers (ARCS) Stichting voor gerelateerde hun en onze ondersteuning van NIH (NINDS grants R01NS096176-02, R01NS097231-01, en F99NS105187-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | - | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | - | |
| Mineral Oil | VWR | - | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
