Summary
Qui descriviamo un metodo per l'instaurazione di un modello di microcefalia indotta da virus di Zika nel topo. Questo protocollo include metodi per inoculazione intracerebrale embrionale, neonatale e adulto-fase del virus Zika.
Abstract
Il virus di Zika (ZIKV) è un flavivirus attualmente endemico in Nord, centro e Sud America. È ormai accertato che il ZIKV può causare microcefalia e le anomalie supplementari del cervello. Tuttavia, il meccanismo alla base della patogenesi della ZIKV nel cervello in via di sviluppo rimane poco chiaro. Metodi chirurgici intracerebral sono frequentemente utilizzati in ricerca in neuroscienza per rispondere alle domande su entrambi lo sviluppo normale e anormale del cervello e la funzione del cervello. Questo protocollo utilizza tecniche chirurgiche classiche e vengono descritti metodi che permettono di malattia neurologica umana ZIKV-collegata di modello nel sistema nervoso del mouse. Mentre l'inoculazione diretta del cervello non modella la normale modalità di trasmissione del virus, il metodo consente gli investigatori a fare domande mirate riguardanti la conseguenza dopo l'infezione di ZIKV del cervello in via di sviluppo. Questo protocollo descrive le fasi embrionali, neonatale e adulte di inoculazione intraventricolare di ZIKV. Una volta imparato, questo metodo può diventare una tecnica semplice e riproducibile che dura solo poche ore per eseguire.
Introduction
La microcefalia è una circostanza derivando dallo sviluppo di cervello difettoso caratterizzato da minore dimensione media testa nei neonati. Bambini con microcefalia esibiscono una gamma di sintomi che possono includere ritardo inerente allo sviluppo, il sequestro, disabilità intellettiva, perdita dell'udito, problemi di visione e problemi con il movimento e l'equilibrio, tra gli altri, a seconda della gravità della malattia e causa1,2,3. Questa condizione è multifattoriale in natura, con agente di genetica, infettiva e fattori ambientali legati a causare la microcefalia4,5,6,7,8, 9. Prima dello scoppio del 2015-2016 ZIKV, 8 bambini su 10.000 nascite sono stati diagnosticati con microcefalia negli Stati Uniti secondo il CDC10. Su 1 febbraiost del 2016 l'organizzazione mondiale della sanità ha dichiarato il virus di Zika una preoccupazione di sanità pubblica emergenza di internazionale dovuto l'allarmante aumento nelle diagnosi di microcefalia associata con l'infezione in madri11, ZIKV 12. Un recente studio del CDC su casi ZIKV negli Stati Uniti suggerisce che i risultati di infezione materne ZIKV in un rischio aumentato di 20 volte per un bambino a sviluppare microcefalia rispetto ai soggetti non infetti e il 4% delle madri ZIKV infettati dagli Stati Uniti hanno portato a bambini con microcefalia11. Il tasso di difetti alla nascita associata a microcefalia durante la gravidanza dall'infezione di ZIKV in Brasile sono stati segnalati per avere influenzato fino al 17% dei neonati di madri infette, che indica che altri fattori in America Latina possono contribuire al rischio aumentato 13. mentre sappiamo che la ZIKV può causare microcefalia e patogenesi nei progenitori neurali delle cellule (NPC) popolazione7,8,14, patogenesi completa di ZIKV in via di sviluppo del cervello resta sfuggente. È importante sviluppare modelli animali per indagare ulteriormente i meccanismi di malattia che le anomalie del cervello associate con l'infezione ZIKV.
Per studiare direttamente l'effetto che il ZIKV ha sullo sviluppo del cervello, abbiamo sviluppato un modello del mouse mediante inoculazione intracerebrale del cervello (e 14.5) 14,5 di giorno embrionale con ZIKV7. Questa fase è stato scelto in quanto è considerato rappresentante della fine del primo trimestre di gestazione umana14. I cuccioli possono sopravvivere fino a giorno postnatale 5 (P5) con questo metodo di iniezione intracerebrale embrionale (~ 1 µ l di 1,7 x 106 coltura tissutale dose infettiva (TCID50/mL)). Questi cuccioli postnatali esibiscono una gamma di fenotipi osservati allo stesso modo nei neonati umani infetti compreso ventricoli allargati, perdita di un neurone, rarefazione assonale, astrogliosis e attivazione microglial12,15. Un cervello di topo neonato è relativamente immaturo, simile allo stadio di sviluppo del cervello umano a metà gestazione16, e lo sviluppo del cervello del mouse include una componente importante di postnatale. Per studiare le infezioni successive fase di gestazione, è anche descritto un metodo per l'infezione postnatale. Neonati infettati con ZIKV P1 sono in grado di sopravvivere fino post-all'iniezione 13 giorni. Infezione anima-nati fase adulta è stata descritta nel topo in precedenza17 ma richiede l'uso di fattori la trascrizione del fattore regolatore (IRF) di interferone (IFN) IRF-3, -5, ceppo di knockout triple-7. Questo protocollo descrive un metodo di inoculazione ZIKV intraventricularly aggirare disabilitando la risposta antivirale del modello murino nell'adulto. Mentre questo elude il sistema immunitario murino, questa via di iniezione non imitare direttamente l'itinerario tipico dell'infezione. Per risolvere questa discrepanza direttamente, lo sperimentatore può eseguire un'infezione intrauterina di ZIKV anziché la route intracranica. Adottata dal precedente lavoro18, abbiamo brevemente descritto questa tecnica in questo protocollo di infezione embrionale.
I ceppi di virus di Zika implementati con questa tecnica includono l'isolato messicano MEX1-447,19 e l'africano isolare MR-766 isolato nel 194720. Zika MEX1-44 è stato isolato in Chiapas, Messico nel gennaio del 2016 da un infetto aegypti di Aedes zanzara. Abbiamo ottenuto questo virus con l'autorizzazione tramite l'Università del Texas Medical Branch a Galveston (UTMB). Inoltre, il sierotipo del virus di febbre rompiossa 2 (DENV2) è stato inoculato con questa tecnica in uno studio di confronto. DENV2, ceppo S16803 (sequenza GenBank GU289914), è stato isolato da un campione clinico dalla Thailandia nel 1974 e attraversate in cellule C6/36. Il virus era attraversato due volte in cellule Vero da centro di riferimento mondiale per i virus emergenti e gli arbovirus (WRCEVA) prima di iniezioni del mouse. Ciò dimostra che questa tecnica funziona altrettanto bene per diversi ceppi di ZIKV e altri flavivirus che possono avere un impatto sullo sviluppo del cervello.
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Protocol
Tutti gli animali utilizzare protocolli seguire le indicazioni di cura degli animali della University of Southern California e l'Università della Georgia. Metodi di eutanasia per dighe incinte e adulti vengono eseguite secondo protocolli approvati: asfissia di anidride carbonica, seguita da dislocazione cervicale come metodo secondario affinché l'eutanasia. Cuccioli neonatali sono euthanized per decapitazione.
Attenzione: Il seguente protocollo coinvolge manipolano un virus patogeni. Corretta precauzione dovrebbe essere presa mentre si maneggia il virus. Tutti i protocolli devono essere approvati dal Priore Comitato istituzionale appropriato da utilizzare.
1. embrionale inoculazione intracerebrale di Virus di Zika
- Per l'accoppiamento incinta temporizzata, considera mezzogiorno del giorno dopo l'accoppiamento come 0.5. Coppia di topi alla fine della giornata e controllare le spine al mattino presto per ridurre la variabilità del tempo accoppiamento.
- Preparare l'ago di vetro prima dell'intervento chirurgico. Estrarre l'ago e la lunghezza di taglio a 1/3, quindi affinare un'angolazione di 45°, utilizzando una smerigliatrice micropipetta con una goccia d'acqua fino a quando il poro è dimensionato per 50-70 µm. Check punte dell'ago sotto uno stereoscopio per qualità e rottura.
- Tenere il virus aliquota sul ghiaccio. Appena prima dell'intervento, è necessario caricare il mix di iniezione di ZIKV nell'ago per iniezione vetro preparato. Montare la siringa a tenuta di gas (50 µ l di volume), attacco luer-lock e tubi e saturare la siringa assemblata con il tubo con olio minerale. Una volta saturato, inserire l'ago e disegnare ~ 6-7 µ l ZIKV nell'ago (~ 1 µ l è 1,7 × 106 TCID50/mL).
- Iniettare incinta C57BL/6J o 129S1/SvImJ topi con embrioni e 14.5 giorno embrionale (per iniezione intracranica) o gli embrioni e 10.5 (per iniezione intrauterina) con ketamina cloridrato (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg) diluito in soluzione salina sterile per via intraperitoneale per indurre l'anestesia nella madre. In alternativa, anestetizzare le madri con isoflurano isoflurano monitorato fornito da inalazione, con evacuazione dei gas di scarico, se del caso. Iniettare buprenorfina-SR (0.5-1.0mg/kg) per via sottocutanea per indurre l'analgesia.
- Prova di pizzico anestetizzati madri sulla punta o la coda e poi stendetele supina su un rilievo di riscaldamento animale-autorizzato (pad termico 2,5 100 x 200 mm). Il forcipe di pizzico di punta non sono sterile e non sono abituato a gestire dei tessuti in chirurgia. In alternativa, le mani guantate possono essere utilizzate per verificare il riflesso di ritiro pizzico di punta.
Nota: Fare riferimento al vostro personale veterinario istituzionale per la perioperative comodo metodo di riscaldamento. Una cover è stata posta tra la pastiglia di riscaldamento e l'animale. - Aggiungere unguento oftalmico agli occhi.
- Radere la superficie dell'addome e sterilizzare con iodio e alcol tre volte. Alternare le salviettine alcool e iodio; strofinate delicatamente con movimento circolare dal sito chirurgico.
- Drappo la pelle che circonda il sito chirurgico con panni sterili per evitare la contaminazione della incisione e degli strumenti.
Nota: L'apertura di drappeggio non deve superare il sito chirurgico preparato; capelli non dovrebbero essere visto nell'apertura di drappeggio. - Pizzicare la pelle della madre dal suo addome con una pinza e taglio basso addome in una linea di 1-1,5 cm alla linea sagittale mediale con forbici chirurgiche sterili. Questo tagli nella pelle e maggiori nella cavità addominale in modo che gli embrioni sono ora esposti.
Nota: Forbici chirurgiche vengono utilizzate per incidere la pelle e lo strato peritoneale. Guanti e strumenti sterili vengono utilizzati per ogni intervento chirurgico. - Tagliare una fessura nel mezzo di una piccola garza sterile e applicare sulla parte superiore dell'apertura chirurgica. Idratare con soluzione salina sterile. Tirare gli embrioni attraverso la fessura di riposare su garza sterile, con cura di non rimuovere più di 4-5 embrioni concentrandosi su un corno uterino in una sola volta.
- Idratare gli embrioni con soluzione salina sterile prima di e durante l'inoculazione affinché che non si asciugano. Tenere traccia di quali embrioni vengono iniettati e la loro posizione all'interno del corno uterino. Individuali degli embrioni sono pertanto considerati esperimenti separati, come embrioni non cambiare posizione durante lo sviluppo in utero. (Continua al passo 1.15 per iniezione intrauterina).
- Posizionare delicatamente una spatola sotto la testa dell'embrione. Illuminare gli embrioni bene con una lampada per visualizzare i punti di sutura testa e cranio.
Nota: Una tecnica asettica è seguita, tra cui strumenti e guanti chirurgici sterili. Dopo gli elementi non sterili (ad esempio la lampada) sono manipolati, guanti devono essere sostituiti con nuovi guanti sterili prima di gestire strumenti sterili e aree. - Posizione la testa manipolando l'embrione con la lampada (dietro la testa per visibilità) e dita gratuite fino a quando la testa dell'embrione è spinto verso l'alto direttamente contro la parete uterina e tenuta in posizione con la mano non dominante.
Nota: Posizionamento dell'embrione è una parte fondamentale e la tecnica che prende la maggior parte pratica. Troppa pressione con le dita può danneggiare le membrane embrionali che conduce a letalità e pressione non sufficiente può rendere difficile l'iniezione. - Utilizzare i vasi sanguigni che corrono lungo la sutura del cranio come guida. Iniettare il virus ZIKV (~ 1 µ l, 1,7 × 106 TCID50/mL messicano isolare MEX1-44) nei ventricoli laterali del cervello embrionale e 14.5 assemblato siringa e l'ago. Utilizzare mezzi di controllo come una finta iniezione.
- Per migliorare la ritenzione della gravidanza, evitare l'iniezione virale di due embrioni accanto le ovaie e i due embrioni accanto alla vagina superiore (Figura 1A). Nel complesso, non più di 6 embrioni vengono iniettati per figliata per ridurre i tempi della chirurgia e prevenire la perdita dell'embrione.
- Inserire nuovamente gli embrioni iniettati le dighe incinte e riempire la cavità addominale con ~ 0,5 mL di soluzione di fisiologica sterile. Per chiudere, prima sutura sia il muscolo peritoneale addominale e poi in secondo luogo suturare lo strato esterno della pelle con 4,0 suture sterili. È preferibile utilizzare suture interrotte; C'è possibilità di deiscenza della ferita, se il mouse mastica la sutura.
- Posizionare il mouse in una gabbia parzialmente che riposa su un rilievo di riscaldamento per consentire il mouse sfuggire a una zona non riscaldata, se necessario. Monitorare le madri mentre recuperano (1-2 h) dall'anestesia. Gli embrioni si sviluppano dopo chirurgia per varie volte secondo singoli esperimenti.
-
Iniezione intrauterina
- Con un corno uterino ed embrioni esposti, è necessario utilizzare un ago di siringa e 27G di 1 mL per iniettare il virus di Zika 100 μL (106 TCID50 unità sospesa in 100 μL di DMEM), o controllo medio, nello spazio intrauterino o nel tessuto placenta. Si noti che gli embrioni sono stati iniettati per le dissezioni stadio embrionale. Vedere il lavoro precedentemente pubblicato per più dettagli18.
- Inserire nuovamente embrioni iniettati le dighe incinte e riempire la cavità addominale con ~ 0,5 mL di soluzione di fisiologica sterile. Per chiudere, prima sutura del muscolo addominale peritoneale e poi in secondo luogo suturare lo strato esterno della pelle con 4,0 suture sterili. È preferibile utilizzare suture interrotte; C'è possibilità di deiscenza della ferita, se il mouse mastica la sutura.
- Posizionare il mouse in una gabbia parzialmente che riposa su un rilievo di riscaldamento per consentire il mouse sfuggire a una zona non riscaldata, se necessario. Monitorare le madri mentre recuperano (1-2 h) dall'anestesia. Gli embrioni si sviluppano dopo chirurgia per varie volte secondo singoli esperimenti.
2. neonatale inoculazione intracerebrale di Virus di Zika: P0/P1
- Assicurarsi che le siringhe a tenuta di gas (10 µ l di volume) e gli aghi non siano ostruiti. Pulire e provare caricando tre siringhe monouso da 20 mL con aghi 26-gauge: uno con soluzione fisiologica, uno con etanolo al 70% e uno con aria per cancellare le soluzioni. Sterilizzare con candeggina al 10% se utilizzato in precedenza per l'iniezione di virus.
- Mantenere il virus sul ghiaccio. Caricare la siringa riempiendolo con soluzione fisiologica per ridurre il volume morto nella siringa e disegnare 0,75 µ l di aria per separare la soluzione salina dal materiale di iniezione.
- Istituire una camera riscaldata umidificata recupero per cuccioli iniettati. Utilizzo di un blocco di riscaldamento, posizionare un contenitore closeable (ad esempio una casella di punta vuota) con una garza sterile e umidificare con soluzione fisiologica. Preriscaldarlo prima di iniziare le iniezioni.
- Impostare il microinjector compreso la pompa e il controller. Determinare il codice del tipo di dispositivo per la siringa specifico (vale a dire, per una siringa 10 µ l, il tipo di dispositivo è "D"). Determinare la velocità di iniezione.
- Raccogliere i cuccioli postnatale giorno 0 o 1 (P0/P1) vicino l'installazione chirurgica. Caricare la siringa di iniezione con virus. Disinfettare il Monte testa pup con 70% EtOH.
- Avvolgere i cuccioli in un sottile strato di garza e seppellirli completamente in ghiaccio per raggiungere uno stato di anestetico. I cuccioli sono cryoanesthetized per 5 min, assicurarsi che i cuccioli sono sufficientemente anestetizzati per iniezione eseguendo un pizzico di coda/punta senza risposta. Questo produce circa 15 min di un stato di anestesia.
- Posizionare il cucciolo sul Monte testa, sterilizzare la superficie della testa con iodio e, etanolo (tre volte) e quindi asciugare con un panno sterile (isopropanolo o 70% EtOH).
- Lambda di segnare con un pennarello nero e registrare le coordinate a lambda utilizzando lo strumento stereotassica. Misurare la distanza da lambda al bordo dell'occhio e inizio dalle coordinate stereotassiche di lambda calcolare la distanza di 2/5 da lambda all'occhio (per entrambi gli emisferi se si inietta entrambi).
- Ricontrollare la profondità anestetica prima di creare un foro per il sito di iniezione. Usi un ago 26-gauge per attentamente e superficialmente perforare il cuoio capelluto e il cranio nella posizione di iniezione (il cranio è molto morbido in neonati) per creare un'apertura per l'inserimento dell'ago.
- Abbassare l'ago per iniezione nella posizione forata e una volta che l'ago ha appena violato la pelle, calcolare una profondità di 1 mm per il sito di iniezione (ventricolo laterale) utilizzando lo strumento stereotassica.
- Una volta che l'ago si abbassa fino alla profondità di iniezione, programmare il microinjector per iniettare: 1 µ l di virus, ad un tasso di 10 nL/s, iniettare circa 1 µ l oltre 1,5 min (~ 1 μl e 3,4 x 105 TCID50/mL ZIKV).
- Quando termina l'iniezione, attesa 30 s e ritrarre l'ago in incrementi di 0,5 mm mediante rotazione della vite (dorsalmente), in attesa 30 s dopo ogni incremento.
Nota: Questo riduce la perdita di virus iniettato. - Una volta rimosso, uno rapidamente caricare l'ago e la siringa con altri virus (virus diversi o finti controlli devono essere caricati in siringhe/aghi separati) o rimuovere il programma potenzialmente indesiderato dal Monte testa alla camera umidificata pre-riscaldata. Monitorare il cucciolo ogni pochi minuti per misurare il recupero. Sostituire i cuccioli con sua lettiera.
3. adulto inoculazione intracerebrale di Virus di Zika
- Iniettare topi adulti, intraperitonealmente con ketamina cloridrato (80-100 mg/kg) e xilazina (5-10 mg/kg), diluiti in soluzione salina sterile per indurre l'anestesia. Iniettare buprenorfina-SR (0.5-1.0mg/kg) per via sottocutanea per indurre l'analgesia. Punta/coda pizzicare il mouse per garantire il suo stato di anestesia e successivamente montarla sullo strumento stereotassica (con un rilievo di riscaldamento) per immobilizzare la testa durante la chirurgia.
- Aggiungere unguento oftalmico agli occhi per evitare che gli occhi del mouse secchino durante la chirurgia. Radere il cuoio capelluto a partire dietro gli occhi all'inizio delle orecchie. Sterilizzare la pelle esposta con iodio e 70% EtOH tre volte. Alternare le salviettine alcool e iodio; strofinate delicatamente con movimento circolare dal sito chirurgico.
- Ricontrollare la profondità anestetica prima di pungere la pelle. Usando un bisturi, praticare un'incisione di 0,5 cm lungo la linea sagittale mediale della testa nella posizione sterilizzata, esponendo il bregma. Utilizza un movimento di rotolamento con un applicatore con punta di cotone, cancellare la superficie del cranio dei tessuti meningei, spingendo contemporaneamente la pelle lontano dai siti di iniezione.
- A partire da bregma, allineare la punta del trapano chirurgico e identificare i siti di iniezione utilizzando le seguenti coordinate: AP mm-0,50, ML: + /-1,5 mm. usando il pedale di controllo, forare il cranio lentamente da forare solo osso fino a quando un foro è stato cancellato per l'ago.
- Sostituire il trapano con la pompa di microinjector e la siringa a tenuta di gas (10 µ l di volume) sulla stereotassica. Lasciando una piccola bolla d'aria tra la soluzione salina e il virus, disegnare ~ 4-5 µ l di virus. Determinare il codice del tipo di dispositivo per il volume della siringa specifici (vale a dire, D per siringa di volume 10 μL). Abbassare l'ago a DV:-1,50 mm dalla superficie del cervello. Per iniettare 1 µ l di virus, programmare un tasso di 10 nL/s, iniettare circa 1 µ l oltre 1,5 min.
- Quando termina l'iniezione, attesa 30 s e rimuovere l'ago in incrementi di 0.5 mm, in attesa di 30 s dopo ogni turno. Questo riduce il riflusso e dispersione del virus iniettato.
- Al termine il gruppo, utilizzare pinze per allentare la pelle e ripristinare il cranio esposto. Sutura del cuoio capelluto utilizzando 4,0 suture e rimuovere il mouse dallo strumento stereotassica. Posto il mouse in una gabbia parzialmente che riposa su un rilievo di riscaldamento per consentire il mouse sfuggire a una zona non riscaldata se necessario e monitorare mentre recuperano (1-2 h) dall'anestesia.
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Representative Results
Immagini rappresentative dei nostri metodi di iniezione per l'inoculazione di ZIKV del cervello embrionale sono indicati nei diagrammi raffiguranti intracerebrale iniezioni (Figura 1A) e intrauterina e iniezioni di intraplacental (Figura 1B), che illustrano la modo la diga incinta ed embrioni dovrebbero essere guardati e orientati per la chirurgia (protocollo di inoculazione embrionali). Figura 2A esibisce l'infezione ZIKV (MEX1-44) (immunostained con l'anticorpo contro l'antigene di gruppo di flavivirus, verde) nella corteccia cerebrale E18.5. PAX6 (rosso) etichette NPC nella corteccia in via di sviluppo. ZIKV è stato inoculato nei cervelli embrionali e 14.5. Usando l'analisi di TCID50 da campioni di tessuto7, le nostre analisi di curva di crescita mostrano che il ZIKV in modo efficiente può replicare e crescere nel cervello in via di sviluppo (Figura 2B, 2C), come pubblicato7. Figura 2D Mostra successo infezione con DENV2 nella corteccia in via di sviluppo utilizzando il metodo di inoculazione embrionale. DENV2 è rilevato usando un anticorpo contro l'antigene di gruppo flavivirus (verde). Figura 2E dimostra l'infezione con un ceppo diverso di ZIKV, la discendenza africana (MR-766). Figura 2F dimostra un'infezione rappresentativa per l'inoculazione di intraplacental alternativa-rotta, di ZIKV-Asia (MEX1-44) in fase e 10.5.
Figura 3A è un diagramma che raffigura i punti di riferimento utilizzati per identificare la posizione di iniezione nei ventricoli laterali per inoculazione di ZIKV dei cuccioli P0/1. Figura 3B Mostra l'infezione ZIKV (MEX1-44) alla corteccia cerebrale P13 dopo iniezione P0/1. ZIKV (MEX1-44) è rilevato usando l'anticorpo contro l'antigene di gruppo flavivirus (rosso). La figura 4 Mostra le perline fluorescenti (rosso) che sono stati utilizzati per la pratica posizione di iniezione e ventricolo laterale iniezione successo negli adulti.
Figura 1: inoculazione embrionale della ZIKV. (A) diagramma che rappresenta l'esposizione di un corno uterino, con una nota per evitare l'iniezione di embrioni adiacenti alla vagina e l'embrione più laterale lungo il corno. (B) diagramma che rappresenta l'esposizione di un corno uterino, raffigurante la posizione di intraplacental e iniezioni intrauterine. Questi diagrammi sono stati modificati dal loro originale pubblicazione21. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: ZIKV inoculazione embrionale presso e 14.5. (A) a E18.5 il cervello embrionale è stato infettato con ZIKV-Asia (MEX1-44) attraverso tutti gli strati della neocorteccia in via di sviluppo (barra della scala è 200 µm). Cellule progenitrici neurali sono immunolabeled con Pax6 (rosso) e ZIKV via flavivirus antigene (verde). (B) TCID50 risultati dal tessuto di cervello postnatale giorno 3 (P3) inoculato a e 14.5 con ZIKV-Asia (MEX1-44). Barre di errore indicano s.e.m. di tre misurazioni indipendenti con un finto e un cervello ZIKV-infettati in ogni misura (* * *p < 0,0001, test t di Student)7. (C) TCID50 risultati che descrivono curve tipiche di crescita aumentata della viremia ZIKV nel tessuto cerebrale fetale infetti. Barre di errore indicano lo s.e.m. di tre misurazioni indipendenti con un finto e un cervello ZIKV-Asia (MEX1-44) infettato in ogni misurazione. Analisi della varianza (ANOVA) rileva un aumento significativo nel titolo virale come procede lo sviluppo7. (D) infettati virus Dengue (DENV2) rappresentanza istologia (e 14.5 embrioni inoculati con ~ 1 µ l di 3.4 x 105 TCID50/mL, barra della scala è 200 um) e (E) ZIKV-Africa (MR766) infettati rappresentanza istologia (scala bar 200 µm). (F) ZIKV-Asia (MEX1-44) infettati rappresentanza istologia dalla strategia di iniezione intraplacental (barra della scala è 200 µm). In tutte le immagini, Hoechst macchie i nuclei. Queste cifre sono state modificate dal loro originale pubblicazione7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: istologia rappresentativo dell'inoculazione di P1 di ZIKV. Diagramma (A) dimostrazione del metodo per determinare la posizione di iniezione nei ventricoli laterali di cuccioli di P1. (B) rappresentante della corona cryosections immunostained per l'antigene di gruppo flavivirus con basso (sulla sinistra, la barra della scala è 100 µm) e alta (sulla destra, la barra della scala è 50 µm) ingrandimento dell'inoculazione di P1 di ZIKV presso P15 (~ 1 μl e 3,4 x 105 TCID50/mL ZIKV). Hoechst macchie i nuclei. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: adulto fase iniezione intraventricolare. Topo adulto iniettato con perline fluorescenti è stato sacrificato poco tempo dopo chirurgia per determinare il successo di posizione di iniezione (barra della scala è 200 µm). Sagittale donatrici potrebbero essere visto immediatamente dopo il sezionamento come perline non richiedono ulteriore colorazione. Hoechst macchie i nuclei. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui descritto è un metodo per inoculazione intracerebrale della ZIKV per l'indagine sui danni indotti da ZIKV nello sviluppo del cervello nella fase embrionale, neonatale e adulto. Mentre semplice, ci sono alcune considerazioni che gli investigatori devono prendere per garantire la qualità dello studio e la sicurezza delle persone coinvolte.
DENV è collegato strettamente a ZIKV del genere flavivirus. DENV causale non è stato collegato con i disordini cerebrali pediatrici in esseri umani. DENV2 con successo può infettare e replicare nel cervello in via di sviluppo utilizzando il metodo di inoculazione embrionale (~ 1 µ l di 3.4 x 105 TCID50/mL) (Figura 2D). Pertanto, oltre ai supporti di cellule Vero non infetti (finto), infezione DENV può essere utilizzato come controllo negativo al fine di studiare la patogenesi ZIKV specifiche nel cervello in via di sviluppo. È importante evitare virus perdita nell'utero, che possono provocare indesiderati contaminazione di altri embrioni. Pertanto, è necessario verificare gli individui infetti e non infetti attraverso il tessuto cerebrale da ogni embrione seguita da qRT-PCR o il dosaggio TCID50 di isolamento. Un colorante può essere aggiunto al mezzo virale a visivamente confermare l'iniezione, ma prova per garantire che il colorante non causino danni sé.
Diversi ceppi di topi esibiscono crescita variabilità, e quindi P1 sedi di iniezione devono essere verificati per ogni linea di mouse. Eseguire un'iniezione di finto neonato con perline fluorescenti per visualizzare il sito di iniezione. Questo studio preliminare informerà se l'iniezione raggiunge il ventricolo o va troppo in profondità nel tessuto cerebrale. Per risultati ottimali, i cuccioli possono essere sacrificati poco dopo l'iniezione per identificare la posizione delle perline fluorescenti nel ventricolo. L'intera testa del cucciolo può essere risolto durante la notte, incorporato e cryosectioned per osservare la posizione di iniezione precisa. Iniezione con la siringa olio saturo richiede esperienza e si raccomanda di fare pratica utilizzando le finte iniezioni con colorante sul parafilm per verificare che il volume di iniezione sia accurato.
Misure di biosicurezza sono fondamentali in questi studi per evitare infezione accidentale del personale di laboratorio che lavora con il virus. Approvazioni di sicurezza biologica devono essere effettuate in anticipo presso l'impianto dove il lavoro è in fase di completamento. ZIKV è considerato un patogeno di livello 2 di biosicurezza (BSL2) dai centri degli Stati Uniti per controllo e la prevenzione. Tutti gli individui lavorano con il virus o lavorano nelle zone dove viene gestito il virus dovrebbero essere conoscenza e dimestichezza con i protocolli di biosicurezza per la loro istituzione. Tutti gli strumenti e le superfici esposte al ZIKV o DENV2 devono essere disinfettate con candeggina al 10% per distruggere le restanti particelle virali dopo l'uso. Le donne che sono incinte o sono tentando di concepire si consigliano di non interagire con aree di ricerca esposti a ZIKV o DENV2. Tutti i tessuti utilizzati per l'istologia sono stati corretti nel 4% PFA per inattivare i virus per l'analisi. Memorizzazione e la coltura del virus dovrebbe essere fatto in cellule Vero in un cappuccio designato per BSL2 lavoro. D'archivio virus e titolazione del tessuto può essere quantificate utilizzando il protocollo TCID50.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desidera ringraziare il Dr. Abdellatif Benraiss presso l'Università di Rochester per il suo mentore e discussioni rilevanti per imparare le tecniche di neonato e adulto chirurgica. Gli autori inoltre desidera ringraziare Dr. James Lauderdale a UGA per l'uso delle sue apparecchiature stereotassiche e discussioni legate alla impostazione della metodologia per questa tecnica e l'avanzamento per la Fondazione di ricerca College scienziati (archi) per loro supporto e il nostro supporto di NIH (NINDS concede & F99NS105187-01 R01NS096176-02, R01NS097231-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | - | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | - | |
| Mineral Oil | VWR | - | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
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