Summary
여기는 마우스에서 바이러스 유도 microcephaly Zika의 모델을 설정 하는 방법에 설명 합니다. 이 프로토콜에는 Zika 바이러스의 미 발달, 신생아, 그리고 성인 무대 intracerebral 접종에 대 한 메서드가 포함 됩니다.
Abstract
Zika 바이러스 (ZIKV) 북쪽, 중앙, 그리고 남아메리카에 현재 발병 flavivirus는 이다. 이제는 ZIKV microcephaly 및 추가 뇌 이상이 발생할 수 있습니다 설치 된다. 그러나, 발전 두뇌에 있는 ZIKV의 병 인을 기본 메커니즘 불분명 남아 있습니다. Intracerebral 수술 방법은 자주 주소 질문 정상과 비정상적인 두뇌 개발 및 뇌 기능에 대 한 신경 과학 연구에 사용 됩니다. 이 프로토콜 클래식 수술 기법을 활용 하 고 마우스 신경 시스템에서 하나의 모델 ZIKV 연관 된 인간의 신경 질환을 허용 하는 방법에 설명 합니다. 직접 뇌 접종 바이러스 전송의 정상 모드를 모델링 하지 않습니다, 하는 동안 메서드를 사용 하면 개발 두뇌의 ZIKV 감염 후 결과 관한 대상 질문을 조사 수 있습니다. 이 프로토콜의 ZIKV intraventricular 접종의 미 발달, 신생아, 및 성인 단계를 설명합니다. 일단 마스터,이 방법만 수행 하는 몇 시간을 소요 하는 간단 하 고 재현성 기술 될 수 있다.
Introduction
Microcephaly 결함이 두뇌 개발 신생아에서 평균 머리 크기 보다 작은 특징에서 유래 하는 조건입니다. Microcephaly 어린이 발달 지연, 발작, 지적 장애, 난청, 시력 문제, 그리고 운동 및 균형, 다른 가운데, 질병의 심각도 따라 문제를 포함할 수 있는 증상의 범위를 전시 하 고 원인1,2,3. 이 상태는 자연, 유전적, 전염 성 에이전트와 일으키는 microcephaly4,,56,,78에 연결 하는 환경 요인에 multifactorial 9. ZIKV 2015-2016 발발 전에 10000 출생에서 8 어린이 microcephaly10CDC 따르면 미국에서 진단 했다. 에 2 월 1일 2016 년 세계 보건 기구 선언 Zika 바이러스 microcephaly 진단 어머니11, ZIKV 감염과 관련 된 놀라운 증가로 인해 국제 관심사의 공중 보건 비상 사태 12. 미국에서 ZIKV 경우에 CDC에서 최근 연구 개발 microcephaly 미국에서 감염 되지 않은 개인, 및 ZIKV 감염 어머니의 4%에 비해 자녀에 대 한 위험을 증가 20-fold에 모성 ZIKV 감염 결과 귀착되 었 제안 microcephaly11아이 들. 브라질의 ZIKV 감염에서 임신 중 microcephaly 관련 된 출생 결함의 비율 최대 17% 라틴 아메리카에 있는 다른 요인 위험 증가에 기여 수 있습니다 나타내는 감염 된 어머니에 아기의 영향을 보고 되었습니다. 13. 우리는 ZIKV은 신경 조상 세포 (NPC) 인구7,,814는 microcephaly pathogenesis 발생할 수 있습니다 알고, 하는 동안 개발에 ZIKV의 완전 한 병 인 뇌 애매 하 게 남아 있다. 그것은 더 ZIKV 감염과 관련 된 뇌 이상이 기본 질병 메커니즘을 조사 하기 위해 동물 모델을 개발 하는 것이 중요입니다.
직접 효과 ZIKV는 두뇌 개발에 연구, 우리는 먼저 ZIKV7배아 일 14.5 (E14.5) 두뇌의 intracerebral 접종을 사용 하 여 마우스 모델을 개발 했다. 이 단계는 인간의 임신14첫 번째 임신의 끝의 대표자 이라고 여겨진다으로 선정 되었다. 새끼는 출생 후 하루 5 (P5)이 배아 intracerebral 주입 방법으로 살아남을 수 (~ 106 조직 문화 감염 복용량 (TCID50/mL) x 1.7의 1 µ L). 이러한 산 후 새끼 고기 마찬가지로 확대 심, 신경 손실, axonal 희박, astrogliosis, 및 microglial 활성화12,15를 포함 하 여 감염 된 인간 유아에서 관찰의 범위를 전시 한다. 신생아 쥐의 뇌 중간 임신16, 인간 두뇌의 발달 단계에 가깝다 상대적으로 성숙 이며 마우스 두뇌 개발 주요 출생 후 구성 요소를 포함 합니다. 공부 하 고 나중에 임신 단계 감염, 출생 후 감염에 대 한 방법은 또한 설명 합니다. 신생아 감염 p 1에서 ZIKV 13 일 후 주입에 살아남을 수 있습니다. 혈액 태어난 성인 무대 감염 마우스 이전17 만 사용 해야 합니다에 설명 하 고 인터페론 (IFN) 규정 요인 (IRF) 녹음 방송 요인 IRF-3,-5,-7 트리플 녹아웃 스트레인. 이 프로토콜 murine 모델은 성인에서의 항 바이러스 반응 억제를 회피 하는 intraventricularly ZIKV를 접종 하는 방법을 설명 합니다. 동안이 circumvents murine 면역 시스템, 주입의이 경로 감염의 전형적인 경로 모방 직접 않습니다. 이러한 불일치를 해결 하기 위해 직접는 실험 intracranial 경로 대신 ZIKV의 자궁내 감염을 수행할 수 있습니다. 이전 작업18채택, 우리 간단히이 배아 감염 프로토콜에서이 기법을 설명 했습니다.
이 기술로 구현 Zika 바이러스 변종 멕시코 격리 MEX1-447,19 와 아프리카 씨-766 194720에 고립 된 분리 있습니다. Zika MEX1-44 감염된 Aedes aegypti 에서 2016 년 1 월에에서 치아 파스, 멕시코에서 분리 되었습니다 모기. 우리는 텍사스 대학 의료 지점 Galveston (UTMB)에서 통해 권한이 있는이 바이러스를 얻었다. 또한, 뎅기열 바이러스 serotype 2 (DENV2)이이 기법을 사용 하 여 비교 연구에 주사 했다. DENV2, 스트레인 S16803 (시퀀스 은행 GU289914), 1974 년에 태국에서 환자 샘플 로부터 격리 했다 및 C6/36 셀에 passaged. 바이러스는 passaged Vero 세포에 (서) 두번 세계 참조 센터 신흥 바이러스 및 Arboviruses (WRCEVA)에 대 한 마우스 주사 하기 전에. 이이 기술을 동일 하 게 작동 하는 방법을 보여 줍니다 ZIKV 및 두뇌 발달에 영향을 미칠 수 있는 다른 flaviviruses의 다양 한 변종에 대 한 잘.
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Protocol
모든 동물 프로토콜 따라 대학 남부 캘리포니아와 조지아의 대학의 동물 관리 지침을 사용 합니다. 임신 댐 및 성인을 위한 안락사 방법을 승인 된 프로토콜에 따라 수행 됩니다: 이산화탄소 질 식, 뒤에 안락사를 위해 보조 방법으로 자 궁 경관 탈 구. 신생아 강아지 잘린 여 안락사 된다.
주의: 다음 프로토콜 병원 성 바이러스 처리 작업이 포함 됩니다. 바이러스를 처리 하는 동안 적절 한 예방 조치를 취해야 한다. 모든 프로토콜을 사용 하 여 적절 한 기관 위원회 사전에 의해 승인을 받아야 한다.
1. 배아 Intracerebral 접종 Zika 바이러스의
- 초과 임신 짝짓기, E0.5로 짝짓기 후 하루의 정오를 고려 하십시오. 하루의 끝에서 마우스를 연결 하 고 시간 짝짓기의 다양성을 줄이기 위해 이른 아침에 플러그를 확인 합니다.
- 수술 전에 유리 바늘을 준비 합니다. 당겨 바늘의 길이 1/3에서 잘라 다음 50-70 µ m. 체크 바늘 팁 stereoscope 품질 및 파손에 대 한 아래에 기 공 크기가 될 때까지 물 똑으로 micropipette 분쇄기를 사용 하 여 45 ° 각도에서 선명 하 게 합니다.
- 계속 바이러스 aliquot 얼음. 수술 직전 준비 유리 주입 바늘 ZIKV 주입 혼합 로드. 어셈블합니다 가스 꽉 주입 주사기 (50 µ L 볼륨), luer 잠금 첨부 파일 및 튜브, 고 미네랄 오일 배관 조립된 주사기를 포화. 일단 포화, 바늘, 연결 하 고 그릴 ~ 바늘에 6-7 µ L ZIKV (~ 1 µ L는 1.7 × 106 TCID50/mL).
- (Intracranial 주입)에 대 한 배아 하루 E14.5 배아와 케 타 민 염 산 염 (80-100 mg/kg)와 xylazine (5-10 mg/kg) 멸 균 생리 식 염 수에 희석 (자궁내 주입)에 대 한 E10.5 배아 임신 C57BL/6J 또는 129S1/SvImJ 쥐를 주사 어머니 마 취 유도를 intraperitoneally. 해당 되는 경우 또는 모니터링된 isoflurane isoflurane 폐기물 가스 청소와 흡입에 의해 제공으로 어머니 anesthetize. Buprenorphine-SR (0.5-1.0mg/kg) 무 통을 유발 하는 것을 피하 주사.
- 꼬 집 음 시험 취 발가락 끝 또는 꼬리에 어머니 하 고에 그들을 하다 부정사 동물 승인 난방 패드 (100 x 200 2.5 m m의 열 패드). 발가락 핀치 집게 살 균 되지 않으며 수술에서 조직 처리에 사용 되지 않습니다. 또는, gloved 손 발가락 핀치 철수 반사를 테스트를 사용할 수 있습니다.
참고: 기본 수술 난방 방법에 대 한 기관 수의 직원을 참조 하십시오. 커버는이 난방 패드와 동물 사이 배치 했다. - 눈에 눈 연 고를 추가 합니다.
- 복 부의 표면에 면도 하 고 세 번 요오드와 알코올 소독. 요오드와 알코올 잎사귀; 대체 수술 사이트에서 원형 모션 닦으십시오.
- 피부 절 개 및 악기의 오염을 피하기 위하여 메 마른 천으로 수술 사이트를 둘러싼 드러 워 진.
참고: 드 레이프 개방 하지 보다 커야 준비 외과 사이트; 머리카락은 드 레이프 오프닝에서 보여야 한다. - 집게와 그녀의 복 부에서 어머니의 피부를 꼬 집 그리고 아랫으로 중간 화살 줄에 1-1.5 cm 선 무 균 수술가 위. 이 피부에 상처 하 고 태아는 이제 노출 되도록 복 부 구멍으로 더.
참고: 수술가 위 incise 피부 및 복 막 층 하는 데 사용 됩니다. 무 균 악기와 장갑 각 수술에 사용 됩니다. - 작은 멸 균 거 즈에 중간에 슬릿을 절단 하 고 외과 여 위에 적용. 멸 균 식 염 수와 하이드 레이트. 4-5 개 이상 배아를 한 번에 한 자 궁 경적에 초점을 제거 하지 하 주의 무 균 거 즈에 슬릿을 통해 배아를 당겨.
- 이전에, 그들은 밖으로 건조 하지 마십시오 있도록 접종을 통해 메 마른 염 분으로 배아 하이드 레이트. 추적할 어떤 태아 주입 하 고 자 궁 경적 내의 그들의 위치. 개별 배아 배아 utero에서개발 하는 동안 위치를 변경 하지 마십시오으로 별도 실험, 따라서 처리 됩니다. (1.15 자궁내 주입에 대 한 단계를 계속).
- 부드럽게 태아의 머리 아래 주걱 장소. 머리와 두개골 봉합을 시각화 하는 램프와 잘 배아를 밝히는.
참고: 무 균 기술 뒤, 무 균 수술 장갑과 악기를 포함 하 여. 후 살 균 되지 않은 항목 (예: 램프) 조작, 장갑 살 균 악기와 영역을 처리 하기 전에 새로운 멸 균 장갑으로 대체 되어야 한다. - 위치는 태아의 머리까지 (뒤에 시정에 대 한 머리) 램프와 무료 손가락 배아를 조작 하 여 머리를 직접 자 궁 벽에 밀어 이며 비 지배적인 손을 가진 장소에서 개최.
참고: 중요 한 부분과 대부분 연습이 필요 기술 이다 태아 위치. 너무 많은 손가락 압력 치 사 율으로 이어지는 배아 세포 막을 손상 시킬 수 있습니다 그리고 충분 하지 않은 압력 주입을 어렵게 만들 수 있습니다. - 가이드로 두개골 봉합 따라 혈관을 사용 합니다. ZIKV 바이러스를 주입 (~ 1 µ L, 1.7 × 106 TCID50/mL 멕시코 격리 MEX1-44) 조립된 주사기와 바늘 E14.5 태아 두뇌의 측면 뇌 실에. 컨트롤 미디어를 사용 하 여 가짜 사출으로.
- 임신의 유지 향상, 난소 옆 두 개의 배아와 위 질 (그림 1A) 옆에 있는 두 개의 배아의 바이러스 주입을 하지 마십시오. 전반적으로, 6 개 이상의 태아 수술 시간을 단축 하며 태아 손실을 방지 쓰레기 당 주입 됩니다.
- 임신 댐에 다시 주입된 태아를 놓고와 함께 복 부 구멍 채우기 ~ 0.5 mL 메 마른 염 분. 종료, 먼저 두 복 부 복 막 근육을 봉합 하 고 둘째 4.0 살 균 봉합 외부 피부 층을 봉합. 중단된 봉합;를 사용 하는 것이 좋습니다. 경우 마우스 씹는 다 봉합 상처 dehiscence의 가능성이 있다.
- 부분적으로 필요한 경우 탈출 비가 열 영역을 마우스 수 있도록 난방 패드에 휴식에 마우스를 놓습니다. 마 취에서 어머니 (1-2 h)를 복구 하는 동안 모니터링 합니다. 수술에 대 한 다양 한 개별 실험에 따라 시간 후 배아를 개발 합니다.
-
자궁내 주입
- 한 자 궁 경적 및 노출 태아를 사용 하 여 1 mL 주사기와 27 G 바늘 주사 100 μ Zika 바이러스 (106 TCID50 단위 100 μ DMEM에), 또는 제어 매체, 자궁내 공간으로 또는 placental 조직으로. Note는 배아 배아 단계 해에 대 한 주입 되어 있다. 자세한 내용은18에 대 한 이전 게시 된 작업을 참조 하십시오.
- 임신 댐에 다시 주입된 태아를 놓고와 함께 복 부 구멍을 채우기 ~ 0.5 mL 메 마른 염 분. 닫습니다, 먼저 복 부 복 막 근육을 봉합 하 고 둘째 4.0 살 균 봉합 외부 피부 층을 봉합 합니다. 중단된 봉합;를 사용 하는 것이 좋습니다. 경우 마우스 씹는 다 봉합 상처 dehiscence의 가능성이 있다.
- 부분적으로 필요한 경우 탈출 비가 열 영역을 마우스 수 있도록 난방 패드에 휴식에 마우스를 놓습니다. 마 취에서 어머니 (1-2 h)를 복구 하는 동안 모니터링 합니다. 수술에 대 한 다양 한 개별 실험에 따라 시간 후 배아를 개발 합니다.
2. 신생아 Intracerebral 접종 Zika 바이러스의: P0/P1
- 가스 꽉 주입 주사기 (10 µ L 볼륨) 및 바늘 하지 막혀 있는지 확인 합니다. 청소 하 고 26-게이지 바늘 3 20 mL 일회용 주사기를 로드 하 여 테스트: 한 식 염 수, 70% 에탄올, 및 공기 솔루션을 취소. 이전 바이러스 주입에 사용 하는 경우에 10% 표 백제로 소독.
- 얼음에 바이러스를 유지. 주사기는 주사기에 죽은 볼륨을 줄이기 위해 염 분으로 작성 하 여 로드 하 고 염 분 해결책 주입 물질에서 분리 하는 공기의 0.75 µ L를 그립니다.
- 주입 된 강아지는 따뜻하게 습도 복구 챔버를 설정 합니다. 열 블록을 사용 하 여, 멸 균 거 즈와 closeable 컨테이너 (예: 빈 팁 상자) 놓고 식 염 수와 축이다. 주사를 시작 하기 전에 그것을 예 열.
- 펌프 및 컨트롤러를 포함 하 여 microinjector를 설정 합니다. 장치 유형 코드 특정 주사기에 대 한 결정 (즉, 10 µ L 주사기, 장치 종류에 대 한 "D"는 이다). 사출 속도 결정 합니다.
- 수술 설치 근처 출생 후 하루 0 또는 1 강아지 (P0/P1)를 수집 합니다. 바이러스 주입 주사기를 로드 합니다. 70%와 강아지 머리 산 소독 EtOH.
- 거 즈의 얇은 층에 새끼를 포장 하 고는 마 취 상태를 달성 하기 위해 얼음에서 그들을 완전히 묻어. 강아지는 5 분은 새끼는 충분히 마 취 주입에 대 한 응답 없이 꼬리/발가락 핀치를 수행 하 여 확인에 대 한 cryoanesthetized. 이 대략 15 분의 마 취 상태 생성합니다.
- 강아지에 머리 산, 요오드, 에탄올 머리의 표면에 소독 (세 번) 놓고 다음 살 균 삭제 기능으로 닦아 건조 (소 프로 파 놀 또는 70 %EtOH).
- 람다 블랙 마커를 표시 하 고 람다 stereotaxic 악기를 사용 하 여 좌표를 기록 합니다. 눈와 람다 stereotaxic 좌표에서 가장자리에 람다에서 거리 측정 람다 (두 반구 둘 다를 주입 하는 경우)에 대 한 눈의 2/5 거리를 계산 합니다.
- 다시 마 취 깊이 주사 사이트에 대 한 구멍을 만들기 전에 확인 합니다. 26-게이지 바늘을 사용 하 여 신중 하 고 피상적으로 두 피와 두개골 (두개골은 매우 부드러운 신생아에) 주입 위치에 주사 바늘에 대 한 개방을 만들려고 펑크.
- 주사 바늘 구멍이 위치에 낮은 고 바늘은 그냥 피부 위반, 일단 stereotaxic 악기를 사용 하 여 사출 사이트 (측면 심)에 대 한 1 mm 깊이 계산.
- 일단 바늘 주입 깊이를 낮 췄 다, 프로그램 삽입 microinjector: 1 µ L 10 nL/s, 1.5 분 이상 약 1 µ L 주입의 속도에서 바이러스의 (~ 1 μ 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV).
- 때 주입 완료, 대기 30 s, 바늘을 철회 하 고 (dorsally) 나사를 회전 하 여 0.5 m m 단위로, 대기 30 각 증가 후 s.
참고:이 주입 된 바이러스의 누설을 줄일 수 있습니다. - 일단 제거 하거나 신속 하 게 로드 바늘과 주사기 더 많은 바이러스 (다른 바이러스 또는 모의 컨트롤 로드 해야 별도 주사기/바늘에) 미리 데워 진된 습도 챔버에 머리 산에서 강아지를 제거 하거나. 몇 분 마다 복구를 측정 하는 강아지를 모니터링 합니다. 그 쓰레기 새끼를 바꿉니다.
3. 성인 Intracerebral 접종 Zika 바이러스의
- 주사 마 취를 유도 하기 위해 멸 균 식 염 수에 희석 하는 케 타 민 염 산 염 (80-100 mg/kg)와 xylazine (5-10 mg/kg) intraperitoneally 성인 쥐. Buprenorphine-SR (0.5-1.0mg/kg) 무 통을 유발 하는 것을 피하 주사. 발가락/꼬리의 마 취 상태를 확인 하 고 그 후 마운트 (생리대)와 stereotaxic 악기에 수술 하는 동안 머리를 고정 마우스를 꼬집어.
- 마우스의 눈 수술 하는 동안 밖으로 건조 하지 않도록 눈 안과 연 고를 추가 합니다. 귀 앞에 눈 뒤에 시작 하는 두 피를 면도. 요오드와 70% 노출 된 피부를 소독 EtOH 3 번. 요오드와 알코올 잎사귀; 대체 수술 사이트에서 원형 모션 닦으십시오.
- 다시 피부를 incising 전에 마 취 깊이 확인 합니다. 메스를 사용 하 여, 확인 머리의 화살 중간 라인을 따라 0.5 c m 절 개 소독된 위치에 bregma 노출 합니다. 솜 밀고 주걱으로 롤링 모션을 사용 하 여, 사출 사이트에서 피부를 동시에 추진 하는 동안 meningeal 조직, 두개골의 표면 선택을 취소 합니다.
- 수술 드릴 비트 정렬 bregma에서 시작, 및 다음 좌표를 사용 하 여 사출 사이트 식별: AP-0.5 m m, ML: ± 1.5 m m. 제어 발 페달을 사용 하 여, 천천히만 구멍 바늘에 대 한 삭제 되었습니다 때까지 뼈를 드릴로 두개골을 드릴.
- Microinjector 펌프와 가스 꽉 주사기 (10 µ L 볼륨)에 stereotaxic 드릴을 교체 합니다. 무승부는 생리 식 염 수와 바이러스 사이 작은 기포를 떠나 ~ 바이러스의 µ L 4-5. 특정 주사기 볼륨 (즉, 10 μ 볼륨 주사기에 대 한 D)에 대 한 장치 유형 코드를 확인 합니다. DV 바늘 낮은:-1.5 m m 뇌 표면에서. 바이러스의 1 µ L를 투입, 10 nL/s, 1.5 분 이상 약 1 µ L 주입의 프로그램.
- 때 주입 완료, 대기 30의 30을 기다리고 0.5 m m 단위로 바늘을 제거 하 고 각 턴 후 s. 이 역류와 주입 된 바이러스의 유출을 감소 시킨다.
- injection(s) 끝나면는 집게를 사용 하 여 피부를 느슨하게 노출된 두개골을 복구. 봉합 사 두 피 4.0 봉합을 사용 하 여 함께 다시 고 stereotaxic 악기에서 마우스를 제거 마 취에서 필요한 경우 비가 열 영역을 탈출 하 고 그들은 (1-2 h)을 복구 하는 동안 모니터 마우스를 수 있도록 장소 부분적으로 난방 패드에 휴식에 마우스.
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Representative Results
미 발달 두뇌의 ZIKV 접종에 대 한 우리의 주입 방법의 대표 이미지 intracerebral 주사 (그림 1A)를 묘사 하는 다이어그램에 표시 됩니다 및 자궁내 intraplacental 주사 (그림 1B), 설명 하 고는 방법은 임신 댐과 배아에 볼와 수술 (배아 접종 프로토콜)에 대 한 지향 있어야 합니다. 그림 2A 전시 E18.5 대뇌 피 질에서 ZIKV (MEX1-44) 감염 (flavivirus 그룹 항 원, 녹색에 대 한 항 체와 immunostained). Pax6 (빨간색) 개발 피에 Npc를 라벨. ZIKV는 E14.5 미 발달 머리에 주사 했다. 우리의 성장 곡선 분석 표시 하는 ZIKV 한 조직 샘플7, TCID50 분석 결과 사용 하 여 복제 및 출판7개발 두뇌 (그림 2B, 2c)에서 성장 효율적으로 수 있습니다. 그림 2D 배아 접종 방법을 사용 하 여 개발 피에 DENV2와 함께 성공적인 감염을 보여줍니다. DENV2는 flavivirus 그룹 항 원 (녹색)에 대 한 항 체를 사용 하 여 검색 됩니다. 그림 2E ZIKV, 아프리카 혈통 (씨-766)의 다른 긴장으로 감염을 보여 줍니다. 그림 2 층 단계 E10.5에서 ZIKV-아시아 (MEX1-44)의 대안 경로, intraplacental 접종에 대 한 대표적인 감염을 보여 줍니다.
그림 3A P0/1 새끼의 ZIKV 접종에 대 한 측면 뇌 실에 삽입의 위치를 식별 하는 데 사용 하는 건축물을 묘사 하는 다이어그램입니다. 그림 3B P0/1 주입 후 P13 대뇌 피 질에서 ZIKV (MEX1-44) 감염을 보여준다. ZIKV (MEX1-44) flavivirus 그룹 항 원 (빨간색)에 대 한 항 체를 사용 하 여 검색 됩니다. 그림 4 는 형광 구슬 (적색)를 주입 위치, 및 성인 측면 뇌 실 주입 성공 연습 하는 데 사용 했다.
그림 1:는 ZIKV의 배아 접종. (A) 도표 대표 하는 질에 인접 한 배아와 경적 따라 가장 측면 태아의 주입을 피하기 위해 메모와 함께 한 자 궁 경적의 노출. (B) 도표 대표 하는 하나의 자 궁 경적의 노출, intraplacental 및 자궁내 주입의 위치를 묘사. 이 다이어그램에서 그들의 원래 간행물21수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: E14.5에 ZIKV 배아 접종. (A)에서 E18.5 배아 뇌 감염 ZIKV-아시아 (MEX1-44) 개발 피 질의 모든 레이어에서 (눈금 막대는 200 µ m). 신경 조상 세포 flavivirus 항 원 (녹색) 통해 Pax6 (빨간색)와 ZIKV immunolabeled는. (B) TCID50 ZIKV-아시아 (MEX1-44)와 E14.5에 접종 생 후 3 일 (P3) 뇌 조직에서 발생 합니다. 오차 막대 표시 한 모의와 각 측정에의 한 ZIKV에 감염 된 뇌 3 개의 독립적인 측정의 s.e.m. (* * *p < 0.0001, 스튜던트 t-검정)7. (C) TCID50 결과 감염 된 태아 뇌 조직에서 ZIKV 니의 일반적인 증가 성장 곡선을 설명 하. 오차 막대는 각 측정에 한 ZIKV-아시아 (MEX1-44) 감염 뇌 한 모의와 3 개의 독립적인 측정의 s.e.m.를 나타냅니다. 분산 분석 (ANOVA) 개발 진행7바이러스 titer에 상당한 증가 감지 합니다. (D) 뎅기열 바이러스 (DENV2) 감염 대표 조직학 (E14.5 배아와 주사 ~ 3.4 x 10의 1 µ L5 TCID50/mL 눈금 막대는 200 um) (E) ZIKV-아프리카 (MR766) 감염 대표 조직학 (눈금 막대 200 µ m). (F) ZIKV-아시아 (MEX1-44) 감염 intraplacental 주입 전략에서 대표적인 조직학 (눈금 막대는 200 µ m). 모든 이미지, Hoechst 얼룩 핵. 이 숫자는 그들의 원래 간행물7에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: ZIKV의 P1 접종의 대표적인 조직학. (A) 도표는 메서드를 보여 주는 P1 강아지의 측면 뇌 실에 주입 위치를. (B) 낮은 flavivirus 그룹 항 원에 대 한 대표적인 코로나 cryosections immunostained (왼쪽에 눈금 막대는 100 µ m) 및 (오른쪽에 눈금 막대는 50 µ m) P15에서 ZIKV의 P1 접종의 확대 (~ 1 μ 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV). Hoechst 얼룩 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 성인 무대 intraventricular 주입. 성인 마우스 형광 구슬 주사 주입 위치 성공을 결정 하는 수술 직후 희생 되었다 (눈금 막대는 200 µ m). 화살 cryosection 구슬 필요가 없습니다 더 얼룩으로 단면 후 즉시 볼 수 수 있습니다. Hoechst 얼룩 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기서 설명 하는 것은 두뇌 개발에 ZIKV 유도 손해의 조사에 대 한 미 발달, 신생아, 및 성인 단계에는 ZIKV의 intracerebral 접종에 대 한 방법이입니다. 동안 간단, 조사 연구의 품질 및 그 참여의 안전을 보장 하기 위해 취해야 하는 몇 가지 고려 사항이 있다.
DENV는 flavivirus 속에 ZIKV 밀접 하 게 관련 있다. DENV 하지 원인이 인 간에 있는 소아 뇌 장애와 연결 되어있다. DENV2 수 있습니다 성공적으로 감염 하 고 배아 접종 방법을 사용 하 여 개발 두뇌에 복제 (~ 3.4 x 10의 1 µ L5 TCID50/mL) (그림 2D). 따라서 감염 되지 않은 Vero 세포 미디어 (모의), 뿐만 아니라 DENV 감염 사용할 수 있습니다 부정적인 제어로 개발 두뇌 병 인 ZIKV 관련 공부 하기 위하여. 그것은 바이러스 누설에 방지 utero에서, 다른 배아의 원치 않는 오염 발생할 수 있습니다 해야 합니다. 따라서, 그것은 다음 qRT-PCR 또는 TCID50 분석 결과 각 배아에서 뇌 조직 분리를 통해 감염 되 고 감염 되지 않은 개인을 확인 하는 데 필요한. 시각적으로 주입 확인 하지만 염료 자체 손상을 발생 하지 않습니다 테스트 바이러스 성 매체에 염료를 추가할 수 있습니다.
마우스 종자 전시 성장 다양성, 그리고 따라서 P1 주입 위치 각 마우스 라인을 확인할 필요가 있다. 사출 사이트를 시각화 하기 위해 형광 구슬 모의 신생아 주입을 수행 합니다. 이 예비 연구는 주사는 심 실에 도달 여부 뇌 조직에 너무 깊이 알릴 것 이다. 이상적인 결과 대 한 새끼는 심 실에서 형광 구슬의 위치를 식별 하는 주입 직후 희생 수 있습니다. 강아지의 전체 머리 고정 될 수 있는, 포함, 및 정확한 주입 위치를 관찰 하는 cryosectioned. 석유 포화 주사기 주입 경험을 필요로 하 고 주입 볼륨은 정확한 확인 parafilm에 염료와 가짜 주사를 사용 하 여 연습 하는 것이 좋습니다.
Biosafety 조치 작업 바이러스 실험실 직원의 실수로 감염을 피하기 위해 이러한 연구에 중요 하다. Biosafety 승인 되어야 합니다 사전에 시설에서 작업이 완료 되 고. ZIKV 미국 국가 센터에 의해 질병 통제 및 예방에 대 한 Biosafety 수준 2 (BSL2) 병원 균으로 간주 됩니다. 바이러스 작업 또는 바이러스 처리 되 고 있는 분야에서 일하고 모든 개인 인식 하 고 그들의 기관에 대 한 biosafety 프로토콜과 친숙 해야 합니다. 모든 도구와 ZIKV 또는 DENV2에 노출 표면 10% 표 백제 사용 후 바이러스 성 입자를 남은 파괴와 소독 되어야 한다. 여자 들 임신 또는 임신을 시도 하는 ZIKV 또는 DENV2에 노출 하는 연구 분야와 상호 작용 하지 것이 좋습니다. 모든 조직 조직학 사용 4% 고정 PFA 분석에 대 한 바이러스 비활성화 하. 저장 하 고 바이러스를 경작 BSL2 작업에 대 한 지정 후드에 Vero 세포에서 이루어져야 한다. 주식 바이러스 및 조직 적정 TCID50 프로토콜을 사용 하 여 측정할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자 그의 멘토링 및 토론에 대 한 로체스터의 대학에 박사 Abdellatif Benraiss 성인 수술과 신생아 기법 학습 관련 인정 하 고 싶습니다. 저자 또한 자신의 stereotaxic 장비 및 토론의 사용을 위한 UGA에서 박사 제임스 로더 데 일이이 기술에 대 한 방법론 및 연구 대학 과학자 (호) 재단 발전 관련을 인정 하 고 싶습니다 그들의 지원 및 우리의 NIH 지원 (NINDS 부여 R01NS096176-02, R01NS097231-01, & F99NS105187-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | - | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | - | |
| Mineral Oil | VWR | - | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
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