Summary
Her beskriver vi en metode for å opprette en modell av Zika forårsaket av virus microcephaly i mus. Denne protokollen inneholder metoder for embryonale neonatale og voksne-trinns intracerebral vaksinasjon av Zika viruset.
Abstract
Zika viruset (ZIKV) er en flavivirus er endemisk i Nord-, sentral- og Sør-Amerika. Det er nå etablert at ZIKV kan forårsake microcephaly og flere hjernen unormalt. Mekanismen bak patogenesen av ZIKV i utvikle hjernen er imidlertid uklart. Intracerebral kirurgiske metoder brukes ofte i nevrovitenskap forskning å svare på spørsmål om både normale og unormale hjernens utvikling og hjernefunksjon. Denne protokollen bruker klassiske kirurgiske teknikker og beskriver metoder som tillater en å modell ZIKV-assosiert menneskelige nevrologisk sykdom i nervesystemet musen. Mens direkte hjernen inoculation ikke modell normalmodus for virus smitte, tillater den etterforskerne å stille målrettet spørsmål om konsekvensen etter ZIKV infeksjon av utvikle hjernen. Denne protokollen beskriver embryonale neonatale og voksne stadier av intraventricular vaksinasjon av ZIKV. Når mestret, kan denne metoden blitt en enkel og reproduserbar metode som tar bare et par timer utføre.
Introduction
Microcephaly er en tilstand som følge av defekte hjernens utvikling preget av mindre enn gjennomsnittlig hode størrelse i nyfødte. Barn med microcephaly forevise en omfang av symptomer som kan inkludere utviklingsmessige forsinkelser, beslag, intellektuelle handikap, hørselstap, synsproblemer og problemer med bevegelse og saldo, blant annet avhengig av alvorlighetsgraden av sykdommen og forårsake1,2,3. Denne tilstanden er multifaktoriell i naturen, med genetisk, smittsomme agent, og miljømessige faktorer knyttet til forårsaker microcephaly4,5,6,7,8, 9. Før 2015-2016 ZIKV utbruddet, ble 8 barn ut av 10 000 fødsler diagnostisert med microcephaly i USA Ifølge CDC10. På februar 1st i 2016 Verdens helseorganisasjon erklært Zika viruset en Public Health Emergency av International bekymring på grunn av alarmerende økningen i microcephaly diagnoser knyttet ZIKV infeksjon i mødre11, 12. En fersk undersøkelse fra CDC på ZIKV tilfeller i USA viser at mødre ZIKV infeksjon resultater 20-fold økt fare for et barn å utvikle microcephaly forhold til uninfected enkeltpersoner og 4% av ZIKV infisert mødre fra USA har resultert i barn med microcephaly11. Frekvensen av microcephaly-assosiert fødselsskader i svangerskapet fra ZIKV infeksjon i Brasil har blitt rapportert å ha påvirket opptil 17% av babyer i infiserte mødre, som angir at andre faktorer i Latin-Amerika kan bidra til økt risiko 13. selv om vi vet at ZIKV kan forårsake microcephaly og patogenesen i nevrale celle (NPC) befolkningen7,8,14, komplett patogenesen av ZIKV i utviklingsland hjernen er fortsatt flyktig. Det er viktig å utvikle dyremodeller for ytterligere å undersøke sykdom mekanismene bak hjernen forandringene knyttet ZIKV infeksjon.
Å direkte studere effekten at ZIKV har på hjernens utvikling, utviklet vi en musemodell med intracerebral vaksinasjon av embryonale dag 14,5 (E14.5) brain med ZIKV7. Denne scenen ble valgt som regnes som representant for slutten av første trimester i menneskelig svangerskapet14. Pups kan overleve til postnatal dag 5 (P5) med denne embryonale intracerebral injeksjon metoden (~ 1 µL av 1,7 x 106 vev kultur infeksiøs dose (TCID50/mL)). Disse postnatal pups forevise en omfang av fenotyper tilsvarende observert i infiserte menneskelige spedbarn inkludert utvidet ventriklene, neuronal tap, axonal rarefaction, astrogliosis og microglial aktivisering12,15. Nyfødte musen hjernen er relativt umodne, beslektet med det utviklingen scenen av den menneskelige hjernen på midten av svangerskapet16musen hjernens utvikling omfatter et postnatal hovedkomponenten. For å studere senere svangerskapet scenen infeksjoner, er en metode for postnatal infeksjon også beskrevet. Nyfødte infisert med ZIKV på P1 er kjøpedyktig overleve opp til 13 dager etter injeksjon. Blod-født voksen stadium infeksjon har blitt beskrevet i musen tidligere17 men krever bruk av interferon (IFN) regulatoriske faktor (IRF) transkripsjon faktorer IRF-3,-5,-7 trippel knockout belastning. Denne protokollen beskriver en metode for å vaksinere ZIKV intraventricularly for å omgå deaktivering antiviral svaret av murine modellen i voksen. Mens dette omgår murine immunforsvaret, ikke denne ruten av injeksjon, direkte etterligne typisk ruten av infeksjon. For å løse dette avviket direkte, kan eksperimentator utføre en intrauterine infeksjon i ZIKV i stedet for intrakranielt ruten. Vedtatt tidligere arbeid18, har vi kort beskrevet denne teknikken i denne embryonale infeksjon protokollen.
Zika viruset stammer implementert med denne teknikken inkluderer den meksikanske isolere MEX1-447,19 og afrikanske isolere MR-766 isolert i 194720. Zika MEX1-44 ble isolert i Chiapas, Mexico i januar i 2016 fra en infisert Aedes aegypti mygg. Vi fikk dette viruset med tillatelsen gjennom University of Texas Medical Branch i Galveston (UTMB). I tillegg ble Dengue virus serotype 2 (DENV2) inokulert bruker denne teknikken i en studie. DENV2, stamme S16803 (sekvens GenBank GU289914), ble isolert fra en pasient utvalg fra Thailand i 1974 og passaged i C6/36 celler. Viruset ble passaged to ganger i Vero celler av verden referanse Center for Emerging virus og Arboviruses (WRCEVA) før musen injeksjoner. Dette viser at denne teknikken fungerer like godt for ulike stammer av ZIKV og andre flaviviruses kan ha en innvirkning på hjernens utvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr bruker protokoller følge dyr omsorg retningslinjene i University of Southern California og University of Georgia. Eutanasi metoder for gravide damer og voksne utføres etter godkjent protokoller: karbondioksid kvelning, etterfulgt av cervical forvridning som sekundær å sikre euthanasia. Neonatal pups er euthanized ved halshogging.
Advarsel: Følgende protokollen innebærer håndtering patogene virus. Riktige forholdsregler bør tas under behandling av viruset. Alle protokoller må godkjennes av den aktuelle institusjonelle komiteen før bruk.
1. embryonale Intracerebral vaksinasjon av Zika Virus
- Tidsbestemt gravid parring, vurdere middag av dagen etter parring som E0.5. Par musene på slutten av dagen og sjekk plugger i tidlig morgen å redusere variasjonen av parring tid.
- Forberede glass nålen før kirurgi. Dra pinnen klipp 1/3 lengden, og skjerpe i 45° vinkel med en brønnene jeksel med en vann drypper til pore størrelse 50-70 µm. Sjekk nål tips under en stereoscope for kvalitet og brekkasje.
- Holde viruset aliquot på is. Like før kirurgi, Legg ZIKV injeksjon blandingen i forberedt glass injeksjon nålen. Gass-tette injeksjon sprøyten (50 µL volum), luer-lock vedlegg og rør og Mette montert sprøyten med slangen med mineralolje. Når mettet, knytte nålen, og trekke ~ 6-7 µL ZIKV inn nålen (~ 1 µL er 1,7 × 106 TCID50/mL).
- Injisere gravid C57BL/6J eller 129S1/SvImJ mus embryonale dag E14.5 embryo (for intrakranielt injeksjon) eller E10.5 embryo (for intrauterine injeksjon) med ketamin hydrochloride (80-100 mg/kg) og xylazine (5-10 mg/kg) fortynnet i sterilt saltvann intraperitoneally å indusere anestesi i mor. Alternativt bedøve mødre med overvåkede isoflurane isoflurane levert av innånding, med avfall gass scavenging, hvis aktuelt. Injisere buprenorfin-SR (0.5-1.0mg/kg) subcutaneously å indusere analgesi.
- Klype test anesthetized mødre på tå tips eller hale og deretter legge dem ryggen på et dyr-godkjent varmeputen (varmeplate 100 x 200 2.5 mm). Tå knipe tang er ikke sterile og brukes ikke til å håndtere vev i kirurgi. Hansker hender kan også brukes til å teste tå knipe uttak refleks.
Merk: Se din institusjonelle veterinary stab for den foretrukne perioperative oppvarming metode. En coverversjon ble plassert mellom denne varmeputen og dyret. - Legg ophthalmica salve for øynene.
- Barbere overflaten av magen og sterilisere med jod og alkohol tre ganger. Alternative jod og alkohol kluter; Tørk med sirkelbevegelser fra kirurgiske området.
- Drapere huden rundt kirurgiske området med sterilt kluter å unngå forurensning i snitt og instrumenter.
Merk: Drapere åpningen bør ikke være større enn forberedt kirurgiske området. ingen hår bør sees i drapere åpningen. - Klype mors huden fra hennes underliv med tang og kutt lavere magen i en 1-1,5 cm linje mediale sagittal linje med sterilt kirurgisk saks. Dette kutt i huden og videre inn i bukhulen slik at embryoene vises nå.
Merk: Kirurgisk saks brukes til incise huden og peritoneal lag. Sterilt instrumenter og hansker brukes for hver operasjon. - Klippe en rift i en liten sterilt gasbind og søke på kirurgisk åpningen. Fukt med sterilt saltvann. Trekk embryoene gjennom slit å hvile på sterilt gasbind, forsiktig å ikke fjerne mer enn 4-5 embryo fokuserer på en livmor horn samtidig.
- Hydrat embryo med sterilt saltvann før og gjennom inoculation slik de ikke tørke ut. Hold rede på hvilke embryoer er injisert og deres plassering i livmor Hornet. Individuelle embryo, dermed behandles som separate forsøk, som embryo ikke endre posisjon samtidig utvikle i utero. (Fortsett å gå 1.15 for intrauterine injeksjon).
- Forsiktig plassere en slikkepott under leder for fosteret. Belyse embryoene godt med en lampe å visualisere hodet og skallen bildet.
Merk: Steril teknikk følges, inkludert sterilt kirurgiske hansker og instrumenter. Etter ikke-sterilt elementer (som lampen) er manipulert, hansker skal erstattes med nye sterilt hansker før håndtering sterilt instrumenter og områder. - Plasser hodet ved å manipulere embryoet med både lampe (bak hodet for synlighet) og gratis fingrene til fosteret er presset opp direkte mot livmor veggen og holdt på plass med ikke-dominante hånd.
Merk: Posisjonering embryoet er en kritisk del og teknikken som tar de fleste praksis. For mye finger press kan skade embryonic membraner fører til dødelighet og ikke nok press kan gjøre injeksjonen vanskelig. - Bruk blodkar kjører langs det skalle suture som en guide. Injisere ZIKV virus (~ 1 µL, 1,7 × 106 TCID50/mL meksikanske isolere MEX1-44) i laterale ventriklene E14.5 embryoet hjerner med sammensatte sprøyten og nål. Bruke kontroll media som en humbug injeksjon.
- For å forbedre oppbevaring av svangerskapet, unngå viral injeksjon av de to embryoene ved eggstokkene og de to embryoene ved øvre vagina (figur 1A). Samlet er mer enn 6 embryoer injisert per kull til å redusere tiden med kirurgi og hindre tap av fosteret.
- Plasser de injiserte embryoene til gravide demninger, og fylle bukhulen med ~ 0,5 mL sterilt saltvann. Lukke, først Sutur både abdominal peritoneal muskelen og deretter det andre Sutur eksterne huden laget med 4.0 sterile suturer. Det anbefales å bruke avbrutt suturer; Det er mulighet av sår dehiscence Hvis musen tygger suture.
- Plass musen i et bur delvis hviler på en varmeputen slik at musen å flykte til et utendørs område hvis nødvendig. Overvåke mødre mens de komme (1-2 h) bedøvelsen. Utvikle embryoene etter kirurgi for variert ganger etter personlige eksperimenter.
-
Intrauterine injeksjon
- Med en livmor horn og embryo utsatt, bruk en 1 mL sprøyte og 27G nål for å injisere 100 μL Zika virus (106 TCID50 enheter suspendert i 100 μL DMEM), eller kontroll, i intrauterine plassen eller placental vevet. Merk hvilke embryoer har blitt injisert for gryende scenen disseksjoner. Se tidligere publiserte arbeid for mer detaljer18.
- Plasser injisert embryo tilbake til gravide demninger, og fylle bukhulen med ~ 0,5 mL sterilt saltvann. Lukke, først Sutur peritoneal bukmuskel og deretter det andre Sutur eksterne huden laget med 4.0 sterile suturer. Det anbefales å bruke avbrutt suturer; Det er mulighet av sår dehiscence Hvis musen tygger suture.
- Plass musen i et bur delvis hviler på en varmeputen slik at musen å flykte til et utendørs område hvis nødvendig. Overvåke mødre mens de komme (1-2 h) bedøvelsen. Utvikle embryoene etter kirurgi for variert ganger etter personlige eksperimenter.
2. neonatale Intracerebral vaksinasjon av Zika Virus: P0/P1
- Kontroller at gass-tette injeksjon sprøyter (10 µL volum) og nåler ikke er tett. Rengjør og teste ved lasting tre 20 mL engangssprøyter med 26-måle pinner: en med saltvann, med 70% etanol, og en med luft å fjerne løsninger. Sterilisere med 10% blekemiddel Hvis tidligere brukte for virus injeksjon.
- Holde viruset på is. Legg i sprøyten ved å fylle det med saltvann å redusere døde volum i sprøyten og trekke 0,75 µL av luft å skille saltvann fra injeksjon materialet.
- Definere et oppvarmet fuktet frisk kammer for injisert pups. Bruker en oppvarming blokk, Plasser en closeable beholder (for eksempel en tom tips boks) med et sterilt gasbind og fukte med saltvann. Forvarm det før du starter injeksjoner.
- Definere microinjector inkludert pumpen og kontrolleren. Fastslå typen enhetskoden for bestemte sprøyten (dvs.for en 10 µL sprøyte, enhetstypen er "D"). Bestemme injeksjon.
- Samle postnatal dag 0 eller 1 valpene (P0/P1) nær kirurgisk oppsettet. Last injeksjon sprøyten med virus. Desinfiser pup hode festet med 70% EtOH.
- Pakk pups i et tynt lag med gasbind og begrave dem helt i isen for å oppnå en anesthetic tilstand. Valpene er cryoanesthetized for 5 min. sikre at valpene er tilstrekkelig anesthetized for injeksjon ved å utføre en hale/toe knipe uten respons. Dette gir omtrent 15 min av en anesthetic tilstand.
- Plasser pup på hodet montere, sterilisere overflaten av hodet med jod og, etanol (tre ganger) og tørk tørr med et sterilt tørke (isopropanol eller 70% EtOH).
- Merke lambda med en svart markør og registrere koordinatene på lambda bruker stereotaxic apparatet. Mål avstanden fra lambda til kanten av øyet og begynnelsen fra stereotaxic koordinatene til lambda beregne 2/5 avstanden fra lambda til øyet (for begge halvkuler hvis du bruker begge).
- Re-sjekk bedøvende dybden før du oppretter et hull for innsprøytingen sted. Bruk en 26-gauge nål å nøye og overfladisk punktere hodebunnen og skallen på injeksjon sted (skallen er veldig myk i nyfødte) for å lage en åpning for injeksjon nålen.
- Senke injeksjon nålen på punktert plasseringen og når nålen har bare brutt huden, beregne en 1 mm dybde for injeksjonsstedet (lateral ventrikkel) bruker stereotaxic apparatet.
- Når nålen senkes til injeksjon dybden, programmet microinjector å injisere: 1 µL av viruset, med en hastighet på 10 nL/s, injisere ca 1 µL over 1,5 min (~ 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV).
- Når injeksjon fullføres, vent 30 s, og trekke nålen i 0,5 mm trinn ved å vri skruen (ytterst), vente 30 s etter hver økning.
Merk: Dette reduserer lekkasje av injisert virus. - Når fjernet, enten raskt laste sprøytespiss- og sprøytebytteprogrammer med flere virus (forskjellige virus eller uekte kontroller skal legges inn i separate spisser/sprøyter) eller fjerne programmet fra hode festet til forvarmes fuktet kammeret. Overvåke pup hver noen minutter for å måle utvinning. Erstatte valpene med sin søppel.
3. voksen Intracerebral vaksinasjon av Zika Virus
- Injisere voksen mus intraperitoneally med ketamin hydrochloride (80-100 mg/kg) og xylazine (5-10 mg/kg) fortynnet i sterilt saltvann å indusere anestesi. Injisere buprenorfin-SR (0.5-1.0mg/kg) subcutaneously å indusere analgesi. Toe/hale knip musen for å sikre sin bedøvende tilstand, og deretter montere den på stereotaxic maskinen (med en varmeputen) for å nakkens hodet under operasjonen.
- Legge til ophthalmica salve øynene for å hindre øynene til musen tørker under operasjonen. Barbere hodebunnen begynner bak øynene til begynnelsen av ørene. Sterilisere den utsatte huden med jod og 70% EtOH tre ganger. Alternative jod og alkohol kluter; Tørk med sirkelbevegelser fra kirurgiske området.
- Re-sjekk bedøvende dybden før incising huden. Bruke en skalpell, lage en 0,5 cm snitt langs mediale sagittal hodet på sterilisert sted, utsette bregma. Bruker en bølgende bevegelse med en bomull-tipped applicator, Fjern overflaten av skallen meningeal vev, mens samtidig skyve huden fra webområdene injeksjon.
- Starter fra bregma, justere kirurgisk borekronen og identifisere injeksjon-nettsteder som bruker følgende koordinater: AP-0.5 mm, ML: +/-1,5 mm. med fotpedal control, bore i skallen sakte som bare bore bein til hull er ryddet etter nålen.
- Erstatt drill med microinjector pumpen og gass-tette sprøyten (10 µL volum) på den stereotaxic. Forlate en liten luftboble mellom saltvann og viruset, tegne ~ 4-5 µL av virus. Bestem typen enhetskoden for den bestemte sprøytevolum (dvs D for 10 μL volum sprøyte). Lavere nålen til DV:-1.5 mm fra hjernen overflaten. For å injisere 1 µL av virus, programmet en rate på 10 nL/s, injisere ca 1 µL over 1,5 min.
- Når injeksjon fullføres, vent 30 s, og fjerne nålen i 0,5 mm trinn, venter 30 s etter hver runde. Dette reduserer tilbakestrømming og lekkasje av injisert viruset.
- Når injection(s) er fullført, bruk tang til å løsne huden og gjenopprette eksponert skallen. Sutur hodebunnen tilbake sammen med 4.0 suturer og fjerne musen fra stereotaxic apparatet. Sted musen i et bur delvis hviler på en varmeputen å tillate musen å flykte til et utendørs område hvis nødvendig og overvåke mens de komme (1-2 h) fra anestesi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Representant bilder av våre injeksjon ZIKV inoculation av embryonale hjernen vises i diagrammer som viser intracerebral injeksjoner (figur 1A) og intrauterine og intraplacental injeksjoner (figur 1B), illustrerer den veien gravid dammen og embryo skal vises og orientert for kirurgi (embryonale inoculation protocol). Figur 2A utstillinger ZIKV (MEX1-44) infeksjon (immunostained med antistoffer mot flavivirus gruppe antigen, grønne) i hjernebarken E18.5. Pax6 (rød) etiketter NPCer i utviklingsland cortex. ZIKV ble inokulert inn i E14.5 embryonale hjerner. Bruke TCID50 analysen fra vev prøver7, vår vekst kurve analyser viser at ZIKV kan effektivt replikere og vokse i utvikle hjernen (figur 2B, 2 C), som publiserte7. Figur 2D viser infeksjonen med DENV2 i utviklingsland cortex med metoden embryonale vaksinering. DENV2 er oppdaget bruker et antistoff mot flavivirus gruppe antigen (grønn). Figur 2E demonstrerer infeksjon med en annen stamme av ZIKV, den afrikanske avstamning (MR-766). Figur 2F demonstrerer en representant infeksjon for alternativ rute, intraplacental vaksinasjon av ZIKV-Asia (MEX1-44) på stadium E10.5.
Figur 3A er et diagram som viser landemerkene brukes til å identifisere plasseringen til injeksjon i laterale ventriklene for ZIKV vaksinasjon av P0/1 valpene. Figur 3B viser ZIKV (MEX1-44) infeksjon P13 hjernebarken etter P0/1 injeksjon. ZIKV (MEX1-44) oppdages ved hjelp av antistoff mot flavivirus gruppe antigen (rød). Figur 4 viser fluorescerende perler (rød) som ble brukt til å praktisere injeksjon plassering og lateral ventrikkel injeksjon suksess hos voksne.
Figur 1: embryonale vaksinasjon av ZIKV. (A) diagrammet representerer eksponering av en livmor horn, med et notat å unngå injeksjon av embryo tilstøtende til vagina og mest lateral embryoet langs Hornet. (B) diagrammet som representerer eksponering av en livmor horn, som viser plasseringen av intraplacental og intrauterine injeksjoner. Disse diagrammene er endret fra deres opprinnelige publikasjonen21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: ZIKV embryonale Inoculation på E14.5. (A) på E18.5 embryonale hjernen er infisert med ZIKV Asia (MEX1-44) over alle lag av utvikle neocortex (skala baren er 200 µm). Nevrale stamceller er immunolabeled med Pax6 (rød) og ZIKV via flavivirus antigen (grønn). (B) TCID50 resultater fra Postnatal dag 3 (P3) hjernevev inokulert på E14.5 med ZIKV Asia (MEX1-44). Feilfelt viser s.e.m. av tre uavhengige målinger med en uekte og en ZIKV-infiserte hjernen i hver måling (***p < 0,0001, Student t-test)7. (C) TCID50 resultater beskriver typisk økt vekstkurve av ZIKV viremia i infiserte fosterets hjernevev. Feilfelt viser s.e.m. av tre uavhengige målinger med en uekte og en ZIKV-Asia (MEX1-44) infisert hjernen i hver måling. Variansanalyse (ANOVA) oppdager en betydelig økning i viral titer som utviklingen fortsetter7. (D) Dengue virus (DENV2) infiserte representant histology (E14.5 embryo inokulert med ~ 1 µL av 3.4 x 105 TCID50/mL, skala bar er 200 um) og (E) ZIKV-Afrika (MR766) infisert representant histology (skala bar 200 µm). (F) ZIKV-Asia (MEX1-44) infisert representant histology i intraplacental injeksjon strategien (skala baren er 200 µm). I alle bilder flekker Hoechst kjerner. Disse tallene er endret fra deres opprinnelige publikasjonen7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant histology av P1 vaksinasjon av ZIKV. (A) Diagram viser metoden å avgjøre hvor injeksjon i laterale ventriklene P1 pups. (B) representant koronale cryosections immunostained for flavivirus gruppe antigenet med lav (venstre, skala baren er 100 µm) og høy (høyre skala baren er 50 µm) forstørrelsen av P1 vaksinasjon av ZIKV på P15 (~ 1 μl 3.4 x 105 TCID50/mL ZIKV). Hoechst flekker kjerner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: voksen scenen intraventricular injeksjon. Voksen mus injisert med fluorescerende perler ble ofret kort tid etter operasjonen for å bestemme injeksjon plasseringen suksessen (skala baren er 200 µm). Sagittal cryosection kan sees umiddelbart etter skjæring som perler ikke krever ytterligere flekker. Hoechst flekker kjerner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beskrevet her er en metode for intracerebral vaksinasjon av ZIKV på embryonale neonatale og voksne stadier for etterforskningen av ZIKV-indusert skader i hjernens utvikling. Mens enkelt, er det noen hensyn som etterforskerne tar for å sikre kvaliteten på studien og sikkerheten til de involverte.
DENV er nært knyttet til ZIKV i flavivirus slekten. DENV er ikke causally koblet med pediatric hjernen lidelser hos mennesker. DENV2 kan infisere og gjenskape i utvikle hjernen med metoden embryonale inoculation (~ 1 µL av 3.4 x 105 TCID50/mL) (figur 2D). Derfor, i tillegg til uninfected Vero cellen media (falske), DENV infeksjon kan brukes som en negativ kontroll for å studere ZIKV-spesifikke patogenesen i utvikle hjernen. Det er viktig å unngå virus lekkasje i utero, som kan resultere i uønskede forurensning av andre embryoer. Derfor er det nødvendig å kontrollere infisert og ikke-infiserte individer gjennom isolere hjernevevet fra hver embryoet etterfulgt av qRT PCR eller TCID50 analysen. En farge kan legges til viral medium å visuelt bekrefte injeksjon, men tester for å sikre at fargestoff ikke forårsaker skade seg selv.
Musen stammer utstilling vekst variasjon, og derfor P1 injeksjon steder må bekreftes for hver musen linje. Utføre en narr neonate injeksjon med fluorescerende perler å visualisere injeksjonsstedet. Denne innledende studien vil informere om injeksjon når ventrikkel eller går for dypt i hjernevevet. For perfekt resultat, kan pups bli ofret etter injeksjon for å identifisere plasseringen til fluorescerende perlene i ventrikkel. Hele hodet av valp kan være fast over natten, innebygd, og cryosectioned å observere hvor nøyaktig injeksjon. Injeksjon med olje-mettet sprøyten krever erfaring og det anbefales å øve på å bruke humbug injeksjoner med fargestoff til parafilm kan kontrollere injeksjon volumet er nøyaktig.
Biosikkerhet er kritisk i disse studiene å unngå utilsiktet infeksjon av laboratoriepersonell som arbeider med viruset. Biosikkerhet godkjenninger må gjøres på forhånd på anlegget der arbeidet som utføres. ZIKV regnes en grad 2 (BSL2) patogen av United States Centers for Disease Control og Prevention. Alle personer arbeider med viruset eller arbeider i områder der viruset håndteres skal være klar og gjøre bekjent med biosikkerhet protokoller for institusjonen. Alle verktøy og overflater utsatt til ZIKV eller DENV2 bør desinfiseres med 10% blekemiddel å ødelegge gjenværende virus partikler etter bruk. Kvinner som er gravide eller prøver å tenke anbefales å ikke arbeide med forskningsområder utsatt for ZIKV eller DENV2. Alle vev brukes for histology er løst i 4% PFA å deaktivere virus for analyse. Lagring og dyrking viruset bør gjøres i Vero celler i hette utpekt for BSL2 arbeid. Lager virus og vev titrering kan kvantifiseres ved hjelp av TCID50-protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne Dr. Abdellatif Benraiss ved University of Rochester for hans mentor og diskusjoner relevant for lære voksen kirurgiske og neonate teknikker. Forfatterne vil også erkjenner Dr. James Lauderdale på UGA for bruk av hans stereotaxic utstyr og diskusjoner relatert til metodikken for denne teknikken, og fremme for forskning College forskere (BUER) grunnlaget for deres støtte og vår NIH støtte (NINDS gir R01NS096176-02, R01NS097231-01, og F99NS105187-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flexible Drive Shaft Drill Hanging Motor | Leica | 39416001 | |
| Mouse Stereotax | Kopf | 04557R | |
| Micro4 Microsyringe Pump Controller | WPI | SYS-MICRO4 | |
| UMP3 UltraMicroPump | WPI | UMP3 | |
| Modulamp | Schott | - | |
| Luer-lock tubing (19-gauge) | Hamilton | 90619 | |
| Melting Point Capillary | Kimble | 34500-99 | Glass needle |
| Fluoro-Max: Red Fluorescent Microspheres | Thermo Scientific | R25 | No dilution; Use for practice injections |
| 10 µL, Model 1701 LT SYR | Hamilton | 80001 | for embryonic inoculation |
| 10 µL, Model 1701 RN SYR, Small Removable NDL, 26s ga, 2 in, point style 2 | Hamilton | 80030 | for neonate/adult |
| 4-0 Ethilon Nylon Sutures | Ethicon | - | |
| Mineral Oil | VWR | - | |
| micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Micropipette Grinder | Narishige | EG-44 | |
| Fastgreen FCF Dye | Sigma | F7252 | inject with 0.5% Dye |
| Antibodies | |||
| Flavivirus group antigen antibody | Millipore | MAB10216 | ms IgG2a 1:400 (Figure 2, Figure 3) |
| Pax6 | DBHB | Pax6-s | ms IgG1 1:20 |
References
- Dreher, A. M., et al. Spectrum of Disease and Outcome in Children with Symptomatic Congenital Cytomegalovirus Infection. J of Pediatr. 164 (4), 855-859 (2014).
- Lanzieri, T. M., et al. Long-term outcomes of children with symptomatic congenital cytomegalovirus disease. J of Perinatol. 37 (7), 875-880 (2017).
- Naseer, M. I., et al. A novel WDR62 mutation causes primary microcephaly in a large consanguineous Saudi family. Ann Saudi Med. 37 (2), 148-153 (2017).
- Abuelo, D. Microcephaly Syndromes. Semin Pediatr Neurol. 14 (3), 118-127 (2007).
- Nicholas, A. K., et al. WDR62 is associated with the spindle pole and is mutated in human microcephaly. Nat Genet. 42 (11), 1010-1014 (2010).
- Pulvers, J. N., et al. Mutations in mouse Aspm (abnormal spindle-like microcephaly associated) cause not only microcephaly but also major defects in the germline. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (38), 16595-16600 (2010).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. Zika virus infection disrupts neurovascular development and results in postnatal microcephaly with brain damage. Development. 143 (22), 4127-4136 (2016).
- Li, C., et al. Zika Virus Disrupts Neural Progenitor Development and Leads to Microcephaly in Mice. Cell Stem Cell. 19 (5), 672 (2016).
- Miki, T., Fukui, Y., Takeuchi, Y., Itoh, M. A quantitative study of the effects of prenatal X-irradiation on the development of cerebral cortex in rats. Neurosci Res. 23, 241-247 (1995).
- Cragan, J. D., et al. Population-based microcephaly surveillance in the United States, 2009 to 2013: An analysis of potential sources of variation. Birth Defects Res Part A Clin Mol Teratol. 106 (11), 972-982 (2016).
- Cragan, J. D., et al. Baseline Prevalence of Birth Defects Associated with Congenital Zika Virus. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 66 (8), 219-220 (2017).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
- Jaenisch, T., Rosenberger, D., Brito, C., Brady, O. Risk of microcephaly after Zika virus infection in Brazil, 2015 to 2016. Bull World Health Organ. 95 (3), 191-198 (2017).
- Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Translating developmental time across mammalian species. Neuroscience. 105 (1), 7-17 (2001).
- Driggers, R. W., et al. Zika Virus Infection with Prolonged Maternal Viremia and Fetal Brain Abnormalities. N Engl J Med. 374 (22), 2142-2151 (2016).
- Semple, B. D., Blomgren, K., Gimlin, K., Ferriero, D. M., Noble-Haeusslein, L. J. Brain development in rodents and humans: Identifying benchmarks of maturation and vulnerability to injury across species. Prog Neurobiol. 106, 1-16 (2013).
- Li, H., et al. Zika Virus Infects Neural Progenitors in the Adult Mouse Brain and Alters Proliferation. Cell Stem Cell. 19 (5), 593-598 (2016).
- Vermillion, M., et al. Intrauterine Zika virus infection of pregnant immunocompetent mice models transplacental transmission and adverse perinatal outcomes. Nat. Commun. 8, 14575 (2017).
- Goodfellow, F., et al. Zika Virus Induced Mortality and Microcephaly in Chicken Embryos. Stem Cells Dev. 25 (22), 1-27 (2016).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F. Zika Virus (I). Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
- Shao, Q., Herrlinger, S., et al. The African Zika virus MR-766 is more virulent and causes more severe brain damage than current Asian lineage and Dengue virus. Development. , (2017).
