Summary
Här presenterar vi Nematoden Caenorhabditis elegans som en mångsidig värdemodell för att studera mikrobiell interaktion.
Abstract
Vi visar en metod där Caenorhabditis elegans som en modell värd för att studera mikrobiell interaktion. Mikrober införs via kosten att göra tarmen den primära platsen för sjukdom. Nematoder tarmen strukturellt och funktionellt härmar däggdjur tarmar och är transparent vilket gör den mottaglig för mikroskopisk undersökning av colonization. Här visar vi att patogener kan orsaka sjukdom och död. Vi har möjlighet att identifiera mikrobiell mutanter som visar förändrad virulens. Dess bevarade medfödda svar för biotiska påfrestningar gör C. elegans ett utmärkt system sond aspekter av värd medfödd immun-interaktioner. Vi visar att värdar med mutationer i genen dubbla oxidas inte kan producera reaktiva syreradikaler och inte kan motstå mikrobiell förolämpning. Vi ytterligare Visa mångsidigheten hos presenterade överlevnad analysen av visar att det kan användas för att studera effekterna av hämmare av mikrobiell tillväxt. Denna analys kan också användas för att upptäcka svamp virulensfaktorer som mål för utvecklingen av romanen antimykotika, samt ge möjlighet till ytterligare avslöja värd-mikrobinteraktioner. Utformningen av denna analys lämpar sig väl för hög genomströmning helgenom-skärmar, medan förmågan att cryo-preserve maskar för framtida användning gör det en kostnadseffektiv och attraktiva hela djurmodell att studera.
Introduction
C. elegans har använts som en kraftfull modellorganism för mer än 50 år. I 1960 pionjärer sydafrikanska biolog Sydney Brenner användningen av C. elegans att studera neuronal utveckling, banar väg för en lång härstamning av forskare att studera olika aspekter av cellen och djurens biologi i nematoder. Denna härstamning innehåller nobelpristagare Craig Mello och Andrew Fire för deras RNAi arbete1, Robert Horvitz och John Sulston för deras arbete på orgel utveckling och apoptos2,3,4, och Martin Chalfie för hans arbete med grönt fluorescerande protein5. Även om denna modellorganism har traditionellt använts för att studera molekylära och developmental biology, under de senaste 15 åren, har forskarna börjat använda C. elegans att undersöka olika mänskliga patogener inklusive Pseudomonas biologi aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericaoch Serratia marcescens6,7,8,9,10. Dessa studier visade att många av mekanismerna som är involverade i mänskliga-patogen samspelet bevaras i nematoder, men också att det finns vissa immunitet mekanismer som är unika för denna modell organism11,12. I naturen, C. elegans möter en mängd hot från intagna patogener närvarande i marken och detta har gett ett starkt selektionstryck att utvecklas och bibehålla en sofistikerad medfödda immunförsvaret i dess intestinala lumen. Många av de gener och mekanismer som är inblandade i skyddet av intestinala lumen är iscensatt av starkt konservativa element som också finns i högre däggdjur11,13. C. elegans utgör därför en bra modell för att studera mag patogener som Salmonella enterica14, Shigella boydii15eller Vibrio kolera16.
Här belyser vi anmärkningsvärd mångsidigheten hos C. elegans som en modell värd att studera smittämnen såsom C. albicans. C. elegans som en modell värd möjliggör hög genomströmning screening för virulens som är mindre dyra och tidskrävande än en musmodell, som vanligtvis används för att studera candidiasis42.
I den här studien visar vi att denna modell och anknutet överlevnad analysen på ett tillförlitligt sätt kan användas för att studera värd medfödd immun effektorer viktigt att motverka infektioner, patogen bestämningsfaktorer som driver virulens, och farmakologiska föreningar som kan ingripa i patogenesen. Olikt tidigare beskrivna analyser, denna metod ger en möjlighet att studera exponering för patogener under hela livstiden för djuret, från larvstadium till vuxen ålder, snarare än bara vuxenlivet till döden43,44. Sammanfattningsvis, vår C. elegans - är C. albicans modellen en mångsidig och kraftfullt verktyg som kan användas inte bara för att studera de genetiska baserna som driver infektion och immunitet utan också att identifiera nya föreningar för terapeutisk intervention.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av Nematoden tillväxt Medium (NGM)
- för 1 L av media, kombinera 20 g agar, 2,5 g organiskt kväve källa (t.ex., bacto-pepton) och 3 g natriumklorid i en 2 L kolv. Lägg till 975 mL sterilt vatten.
- Lägg till i ett sterilt rör bar. Om du använder en automatisk media pourer, autoklav slangar och media för 15 min; Media bör autoklaveras för längre om en högre volym görs.
- Media på uppståndelse plattan, och låt svalna.
- När media är varm röra (ca 60 ° C) aseptiskt tillsätt 1 mL 1 M MgSO 4 ● H 2 O 1 mL 1 M CaCl 2, KPO 4 25 mL och 1 mL 0,5% kolesterol i etanol.
- Häll media (för hand eller genom automatisk pump) under laminärt flöde i 35 x 10 mm steril petriskålar. Låt torka under huven för 1-2 dagar före användning.
Obs: Plattor ska förvaras vid 4 ° C att förhindra kontaminering.
2. Att göra en mask plocka
- skär en 1,5 cm bit aluminium tråd. Försiktigt in ca 0,5 cm av denna längd i spetsen av en Pasteur-pipett.
- En bunsenbrännare eller alkohol lampa, smälta glas pipettspetsen genom att långsamt rotera det i lågan tills tråden följs ordentligt pipetten, utan att kompromissa med den ursprungliga formen av pipettspetsen.
3. Beredning av E. coli kultur
- med hjälp av en steril ögla, Inokulera enda koloni av E. coli-stam OP50 i 200 mL Luria buljong. Inkubera över natten med skakningar vid 37 ° C.
- Flytande kulturen är klar för användning dagen efter och får lagras vid 4 ° C när inte i använda.
Obs: E. coli stam, OP50, används som en näringskälla för C. elegans. Denna kultur kan användas för upp till flera månader om den förvaras vid 4 ° C.
4. Väsentliga C. elegans underhåll
- utsäde utarbetats NGM agarplattor med E. coli av spotting ca 50-100 µL av beredda OP50 flytande kultur på mitten av plattan.
- Täcka plåtar och låt dem torka i rumstemperatur i 24 h. När torr, placera plattorna vid 37 ° C över natten för snabb tillväxt eller förvara i rumstemperatur, önskas långsammare tillväxt.
- Lägg till maskar till plattan genom att antingen " spaltning, " (se protokollet steg 5 " Chunking och plocka maskar "), plocka maskar individuellt eller att placera masken ägg direkt på plattan (se protokollet steg 6 " ägg förberedelse ").
5. Chunking och plocka maskar
Obs: " spaltning, " refererar till en praxis som är vanlig i C. elegans underhåll. Detta innebär att skära ett avsnitt av NGM agarplattan som innehåller maskar och överför denna pjäs på en ny tallrik, således också överföra ett stort antal maskar i processen. Kontaminering kan också skäras ur plattan på detta sätt. När plocka maskar, är det viktigt att upprätthålla integriteten av agar eftersom maskar kan gå förlorade i hål i ägarn. Dessutom är det viktigt att plocka svalna innan du vidrör plattan för att förhindra smältning ägarn eller brännande maskar.
- För att snabbt överföra stora mängder av maskar på nya plattor, skär en bit av NGM agar som innehåller valda maskar med en spatel. Ta bort den avskurna pappersbiten och placera den ansiktet ner på kanten av gräsmattan av OP50 på en ny platta.
- Överföring maskar individuellt som beskrivs nedan i protokollet steg 8.2, " överlevnad analys, " använda en mask plocka. Lågan kabeln i masken plocka tills den är röd. Ta bort det från lågan och låt den svalna i några sekunder.
- Med tråd på plockningen, försiktigt skrapa gräsmattan OP50 kultur odlas på nya plattan, som täcker kabeln på plockningen.
- Trögflytande kulturen som täcker spetsen av tråd gör maskar stick till spetsen av plockningen, således försiktigt plocka upp valda maskar med en swipe rörelse.
- En gång valda maskar är samlade, placera dem på en ny plattan genom att försiktigt dra kultur över ägarn. Placera tråden på låga ta bort återstående kultur på plockningen.
6. Ägg förberedelse
- Placera cirka 20 vuxna djur (cirka 2-3 dagar efter kläckningen när odlas vid 20 ° C) genom att antingen plocka eller spaltning enligt protokollet steg 5, " Chunking och plocka maskar, " på en tallrik som ympats med 50 µL av E. coli-stam, OP50.
- Att samla ägg, översvämma plattan med 10 mL av M9 bufferten efter 1-2 dagar. Med glas serologiska pipett, snurra och blanda försiktigt innehållet på agarplattan att släppa ägg som fastnat på OP50 eller vuxna djur. Samla all vätska som innehåller ägg och vuxna.
- Överföra M9 och OP50 lösning till en 15 mL konisk slang. Centrifugera 15 mL koniska rör vid 2.100 x g i 2 min.
- Aspirera cirka 9 mL av supernatanten utan att störa pelleten OP50.
- Återsuspendera pelleten i 2 mL sterilt vatten, 1 mL av blekmedel och 1 mL 0.25 M NaOH.
- Blanda försiktigt genom inversion tills majoriteten (cirka 70 procent) av vuxna djur visas lyserat; normalt ägg förbli intakt under denna korta blekmedel behandling på grund av deras skal. Centrifugera koniska röret vid 990 x g i 2 min.
- Aspirera supernatanten utan att störa pelleten. Resuspendera pelleten i 10 mL M9 buffert.
- Centrifugera koniska röret i 990 x g för 2 min. Aspirera supernatanten utan att störa pelleten. Resuspendera pelleten med 200 µL M9 buffert.
Anmärkning: Ägg förberedelse kan kräva flera prövningar. Ägg kan förstöras om de utsätts för att bleka för länge. Om äggen inte kläcks antingen sänka koncentrationen av blekmedel i lösning eller minska exponeringstiden att bleka.
7. Infektion plattan Set-up
- fördela 3-5 mL av YPD till ett sterilt provrör och Inokulera det med en enda koloni av Candida albicans med hjälp av en steril ögla.
- Placera röret på en roterande trumma för cirka 16-18 h 30 ° C.
- Etikett-mikrofugrör för ett 1,5 mL innehåller C. albicans, och en annan för att innehålla OP50. Vikten för varje tom tube.
- Plats 500 µL av övernattnings C. albicans kultur i röret märkt C. albicans och 1 500 µL av övernattning OP50 kultur (från steg 3.1) i röret OP50.
- Centrifugera i 10 min vid 16,100 x g. Aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
- Återsuspendering varje pellet med 500 µL sterilt vatten. Centrifugera under 5 minuter vid 16,100 x g.
- Aspirera supernatanten utan att störa pelleten. Den slutliga vikten av microfuge tuber.
- Bestämma vikten på varje pellet genom att subtrahera den ursprungliga vikten av microfuge rören från den slutliga vikten.
- Med sterilt vatten, återsuspendering C. albicans pelleten till 10 mg/mL och OP50 pelleten till 200 mg/mL. Gör en master infektion blanda genom att kombinera 10 µL av en 50 mg/mL Streptomycin, 2,5 µL OP50 kultur, 0,5 µL av C. albicans kultur och 7 µL sterilt vatten.
- För kontrollplattor, skapa en master mix genom att ersätta volymen av C. albicans kultur med sterilt vatten. Seed 20 µL av infektion mix eller OP50 kontrollösning på center av NGM plattorna med hjälp av en mikropipett.
Obs: Cirka 100 maskar behövs för att bestämma statistisk signifikans under analys. Denna analys är vanligtvis kör i tre exemplar. Således görs en 3,2 x infektion mix samt en 3,2 x kontrollösning. Dessa blandningar är gjorda för att vara något över 3 x originalet att säkerställa att en full 20 µL är seedade på varje tallrik, ger utrymme för fel. Denna master mix skapas eftersom svalget av masken är för liten under larval inledningsskedet (L1-L3) att konsumera C. albicans. För exponering för farmakologiska medel såsom flukonazol ( figur 3B) introduceras agenten till infektion blandningen. Koncentrationen av agenten bestäms empiriskt. Till exempel i figur 3B, 50 µM flukonazol är representerad, however 0, 12,5, 25, 50 och 100 µM flukonazol var också testats med samma protokoll.
- För kontrollplattor, skapa en master mix genom att ersätta volymen av C. albicans kultur med sterilt vatten. Seed 20 µL av infektion mix eller OP50 kontrollösning på center av NGM plattorna med hjälp av en mikropipett.
8. Analys av deformerade Anal Region (Dar) fenotyp och överlevnad Assay
- visualisera den Dar fenotypen
Obs: Dar bäst visualiseras vid L3 scenen och bortom. Dar presenterar som ett litet utstick i inlägget anala regionen av masken ( figur 2A), som blir mer framträdande med tiden.- Bekräfta om ett djur har Dar genom att snabbt trycka plattan på scenen av mikroskopet dissektion; djur utan Dar vilja flytta bakåt omedelbart, medan djur med Dar kommer antingen måste upprepas rundor av avlyssning att vända deras riktning, eller de gör inte alls.
- Överlevnad assay
- äggets förberedelse som tidigare beskrivs i protokollet steg 6, " ägg preparatet ". Räkna äggen omfattas dissektion, och späd ägg lösningen med M9 tills en koncentration av cirka 5-6 friska ägg per µL uppnås. Med pipett, fördela 20 µL prov som innehåller ca 30 ägg på beredda NGM tallrik, i området mellan den bakteriella kulturen och sidan av plattan (ägg och mask mat, OP50, finns i två distinkta fläckar).
- Inkubera plattorna vid 20 ° C för 48 h. I dissektion Mikroskop, räkna antalet levande och döda vuxna maskar på varje platta, liksom antalet maskar med Dar. Registrera procent med Dar.
- Överväga ett djur döda om det inte reagerar på avlyssnas på huvudet av en aluminiumwire eller knacka på tallriken.
- Varannan dag, överföra återstående vuxna maskar genom plockning enligt protokollet steg 5, " Chunking och plocka maskar, " på en ny infektion eller kontroll tallrik. Vid denna punkt, om det behövs, utföra en överlevnad analys genom spårning av antalet levande, döda och saknade maskar varje dag.
Obs: Denna analys kan köras i två veckor, börjar med ägg förberedelse. Dessutom bör ägg lösningen inte avskaffas på den bakteriella kulturen, som lösningen kan innehålla spår av blekmedel som kan döda OP50. Lösningen bör också doseras ca 0,5 cm från kanten av plattan, som ägg kan fastna mellan sidorna av plattan och ägarn. Dessutom, på grund av den snabba spridningen av maskar, överföra vuxna på nya plattor är avgörande för att skilja dem från deras avkomma.
- Analysera överlevnad
- analysera resultaten med överlevnad kurva analysprogramvara (se lista över material).
- Jämför överlevnad kurvor med metoden Grehan-Breslow-Wilcoxon (förutsatt att uppgifterna från början överlevnadstiden är mer exakt än senare tider, vikt data med detta) samt log rank statistiska verktyg 45.
Obs: Till exempel i figur 4B -C, överlevnaden av maskar behandlas med mutant C. albicans är jämfört med dem som behandlades med syngena vildtyp kontroller eller complementarystrains.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En patogenes assay (figur 1) med hjälp av C. albicans och C. elegans har tidigare beskrivits av våra lab17,18 och andra labs19,20. Vi visar föredragandens att använda C. elegans för att studera C. albicans virulens visar att C. albicans celler snabbt intas av maskar och ackumuleras i intestinala lumen orsakar långsammare förflyttning, deformerade anal region (Dar) (figur 2A), svullnad i vulva (figur 2B), dilatation av tarmen (figur 3A) och dödlighet (bild 3, bild 4). Vi mäter också livslängden av infekterade maskar som ett kvantitativt mått på konditionen. Till exempel lever C. elegans infekterade med C. albicans 10-12 dagar jämfört med 20-22 för icke-infekterade kontroller. I C. elegans angripits av C. albicans dubbel knock out-mutant, efg1/efg1 cph1/cph1, som är två viktiga virulensfaktorer som krävs för infektion hos mus, råtta och mänskliga epitelceller modeller21, 23, nematoder överlevde betydligt längre än kontroller (figur 3B). Dessa experiment tyder på att några av de lärdomar som vi lär oss i denna enklare modell om C. albicans virulens kan förbli giltigt hos högre däggdjur och vice versa.
Vi visar också att nematoder modell systemet kan vara farmakologiskt modulerade (figur 3B). I närvaro av flukonazol, det mest förskrivna svampdödande läkemedlet, maskar utmanas med C. albicans överlevde betydligt längre än kontroller. Detta bevis av princip experiment tyder på att nematoder modellen kan användas för småmolekylära screening. Vår C. elegans modell var verkligen avgörande för att identifiera filastatin, en liten molekyl som hämmar olika aspekter av svamp virulens24.
Sjukdom fenotyper och mikroskopisk analys av C. elegans infektion
C. elegans var utsatt till C. albicans över en period på sex dagar och observerade för tecken på infektion, progression av sjukdomen och döden. Den Dar fenotypen är mest synliga i dag 4 överlevnad analysens, som konstaterade en utskjutande anal region som inte är synliga i de icke-infekterade djuren (figur 2A). Maskar som smittats av C. albicans är kända för att uppvisa svullnad i regionen vulva (figur 2B). I båda fallen är masken inte kan rensa infektion efter att ha nått detta stadium. För att visualisera koloniseringen av C. albicans i intestinala lumen, matades maskar vildtyp C. albicans med RFP, etiketten som orsaka områden kolonisering till fluorescerar i rött (figur 3A). För att producera dessa bilder, var maskar sövda på en 2% agaros pad 0,01 M natriumazid. Maskar var utsatt till vildtyp C. albicans eller RFP-taggade C. albicans, och överföras till 5 µM M9 buffert på agaros pad. Agaros pad täcktes sedan med ett täckglas. Maskar visades på 200 X och 400 X förstoring med ett inverterat Mikroskop med fluorescerande mikroskopi kapacitet. Bilder har skapats under differentiell störningar kontrast (Nomarski) och epifluorescence optik. Fluorescerande bilderna förstärks med hjälp av programvara (figur 3A). Tid serien micrographs av infekterade maskar bestäms att C. albicans koloniserade den intestinala lumenen av den tredje dagen av assay17. Infekterade maskar visade mer allvarliga intestinal buk än observerade i oinfekterade kontrollen.
Genetiska och farmakologiska verktyg att studera infektion
Nästa, vi testade modellen med hjälp av genetiska och farmakologisk modulering. Vi testade även tidigare dokumenterade virulensfaktorer som reglerar hyphal övergången av C. albicans25 och har visat sig vara viktiga i vivo infektioner av möss och nematoder20,26 . Vi testade maskar förmåga att överleva infektion orsakad av C. albicans efg1/efg1 cph1/cph1 dubbel mutant. Efg1 är en starkt konservativa transkriptionsfaktor och en viktig del av cykliskt AMP och protein kinase A (PKA) metabolism. I C. albicans reglerar detta utbildningsavsnitt hyphal morfogenes27, vit-ogenomskinlig byta28och en arsenal av viktiga virulensfaktorer. Dessa virulensfaktorer inkluderar Hwp1 och Hwp2, två jäst-specifika cellväggen proteiner involverade i vidhäftning och biofilm bildning, Eap1, en cell-vägg adhesin inblandade i bindning till humana epitelceller29, och Sap5, ett hydrolytiska enzym som deltar i epitelvävnad invasion30. Cph1 är en transkriptionsfaktor som reglerar många metaboliska processer inklusive parning, filamentation och biofilm bildning och har visat sig spela en avgörande roll i skadliga epitelceller31 och mänskliga rekonstruerade epitel21 . Störningar av endera av dessa gener har en betydande inverkan på virulens och samtidiga störningar både i cph1/cph1efg1/efg1 resultat i dramatiska virulens minskning av olika djurmodeller inklusive möss25, Drosophila 32, zebrafiskar33,34 och moth34. Cph1/cph1efg1/efg1 dubbel mutant anses av C. albicans gemenskapen Avirulenta stammen av definition och den gyllene standarden för validering av nya modellsystem. Den efg1Δ och cph1Δ enda mutanter visade minskad Dar (~ 10% och ~ 50%, respektive) jämfört med den cognate vildtyp, medan efg1Δ cph1Δ dubbel mutant misslyckades att framkalla de Dar svar17. Dessa resultat recapitulate mönstret av virulens hos möss, där cph1∆ mutant dämpas något, efg1∆ mutant är significantly försvagade och dubbel mutant är helt Avirulenta25. Maskar infekterade med cph1/cph1 efg1 / efg1C. albicans dubbel mutant levde statistiskt signifikant längre än kontroller (p < 0,01 för både Log Rank och Breslow statistiska test, n = 60) tyder på att dessa två gener krävs för C. albicans virulens mot C. elegans (figur 3B).
För att undersöka möjligheten att använda vår C. elegans modell för potentiella drogkontroll, testat vi effekten av tillägg av flukonazol på det slutliga resultatet av infektionen. Vi använde en mängd olika koncentrationer av flukonazol och fann att 50 µM gav oss mest betydande resultat. Maskar som angripits av C. albicans och 50 µM flukonazol (figur 3B) levde statistiskt signifikant längre än kontroller (p < 0,01 på både Log Rank och Breslow statistiska test, n = 60). Denna koncentration bestämdes empiriskt (se anmärkning i slutet av protokollet steg 7, ”infektion plattan ställa in”). Dessa bevis av princip experiment visade att vår nematoder modell kan användas för småmolekylära svampdödande screening. Modellen var faktiskt avgörande för upptäckten av filastatin, en liten molekyl som hämmar olika aspekter av svamp virulens som genomgår för närvarande ytterligare prekliniska studier24. Vår analys är därför lämpliga för att utforska C. albicans och farmakologiska agenter virulens strategier.
Studie av medfödda värdrespons
Nästa, vi ville studera de ömsesidiga värd försvar mot patogener, eftersom aspekter av detta medfödda immuniteten bevaras i däggdjur11,35. Det är väl känt att C. elegans ger ROS vid både bakterie-och svampinfektioner18,36,37 som en del av dess försvarsmekanism. ROS ha biocideffekter på invadera organismer och spela en viktig roll i medfödd immunitet. zcf15/zcf15 hyper känslighet för ROS i vitro ledde oss till hypotes att dess minskad virulens i C. elegans berodde på en nedsatt förmåga att tåla värdens genereras ROS. För att testa vår hypotes, bestämda vi zcf15/zcf15 förmåga att döda antingen vildtyp maskar eller maskar med en nedsatt förmåga att producera ROS. Representativa C. albicans mutant zcf15 som är känslig för reaktiva syreradikaler (figur 4A) visade minskad virulens i vildtyp C. elegans. C. elegans svarar på intag av patogen genom producerar extracellulära ROS i intestinala lumen via Ce-Duox1, en NADPH-oxidas som kodas av genen bli-3. Vid tillverkning av ROS producerar de intestinala cellerna också intracellulära antioxidanter via DAF-16 att skydda sina egna vävnader från de ROS skadliga effekter36,38. CE-Duox1 är ett protein med en N-terminal peroxidas domän, en C-terminal superoxid-genererande NADPH-oxidas domän och två centrala calmodulin-bindande platser39. Vid mikrobiell infektion använder detta protein cytosoliska NADPH för att generera extracellulära giftiga ROS i intestinala lumen att motverka infektionen. Under en rad biokemiska analyser i en 2009 studie visade Jain et al. att ROS produceras rikligt vid svampinfektion och att bli-3 förlust av funktion via bli-3(e767) minskar dramatiskt nematoder förmåga att producera ROS. Som visas i figur 4B, maskar utmanas med zcf15/zcf15 överlevde betydligt längre än vildtyp eller kompletteras stammar (p < 0,01 av det log-rank-testet) som anger att ZCF15 krävs för virulens. Dock när vi utmanade ROS-brist C. elegansbli-3(e767), vi fick kinetik av mord som var jämförbara mellan zcf15/zcf15, vildtyp och kompletteras stam (figur 4 c). Detta bevis visar att zcf15/zcf15 misslyckas att döda nematoder om värdens förmåga att producera ROS äventyras. Sammantaget tyder dessa resultat på att ZCF15 krävs för full virulens och att denna gen är sannolikt inblandad i patogenens förmåga att motstå värd genereras ROS. Till bäst av vår kunskap är detta första gången som ZCF15 har visat sig vara inblandade i patogenicitet och ROS motstånd.
Figur 1: En schematisk representation av C. elegans infektion. C. elegans är utsatt för en blandning av E. coli -stam OP50 och en patogen och observerade under en period på 4 dagar efter att ha nått vuxen ålder för tecken på infektion och progression av sjukdomen.
Figur 2: sjukdom fenotyper. (A) Deformed anala regionen (Dar) är synlig (indikeras med en pil) som en svullnad i inlägget anala regionen av infekterade maskar (höger panel) fyra dagar efter exponering. Maskar i den vänstra panelen är virusfri och tjäna som en kontroll. (B), en delmängd (~ 15%) av infekterade maskar Visa en svullnad i vulva (rätt panel, anges med en pil) jämfört med icke-infekterade kontroll maskar (till vänster) som representerar disseminerad infektion leder matricidal död. Alla bilder är tagna som beskrivs i den representativa resultat18.
Figur 3: Den C. albicans - C. elegans modell är mottagliga för mikroskopiska manipulation och farmakologiskt och genetiskt kan anpassas. (A) C. albicans taggade med RFP ackumulering i nematoder intestinala lumen dag 3 post infektion. Jästceller intas snabbt av maskar och ackumuleras i den intestinala lumenen som är helt intakt, vilket indikerar att de ska kunna överleva mekanisk krossning av svalget. Bilder togs som beskrivs i den representativa resultat18. (B) Kaplan-Meier överlevnadskurvor för nematoder utmanas med vildtyp C. albicans, cph1/cph1efg1/efg1 dubbel mutant eller vildtyp C. albicans + 50 µM av flukonazol jämfört med icke-infekterade kontroll maskar.
38. (B) Kaplan-Meier överlevnadskurvor Visa att ZCF15 radering begränsar dödandet av vildtyp maskar. (C) The Kaplan-Meier-kurva för överlevnad visar liknande priser för överlevnad mellan zcf15/zcf15, vildtyp och kompletteras stam när ROS-brist C. elegansbli-3(e767) var infekterade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoderna för testmetoder C. elegans infektion och överlevnad över livstidsexponeringen för C. albicans som vi har beskrivit kan ändras för att testa en annan patogen. Flytande kulturer en annan bakterier eller svamp kan göras och matas till C. elegans på ett liknande sätt. Dessutom seriell infektioner kan analyseras genom först utsätta larven till en patogen som beskrivs, och sedan överföra djuren på ny plåt som innehåller en separat patogen efter att ha nått vuxen ålder.
Under utförande av denna analys, är det viktigt att ägna stor uppmärksamhet åt timing. Först när du fyller ägg förberedelser för att skörda ägg för analysen, är det viktigt att begränsa mängden tid äggen utsätts för att bleka. Mängden tid som behövs för att lösa upp vuxna i blekmedel lösning för att släppa äggen varierar. Omedelbart efter administrering av blekmedel lösningen, måste mask lösningen vara bevakas noga under en dissektion Mikroskop. När ungefär 70% av maskar har desintegrerade, bör sedan lösningen vara centrifugeras. Om ägget preparatet inte ger livskraftiga ägg, minska koncentrationen av blekmedel eller exponeringstiden att bleka. Att slutföra denna analys, är det också viktigt att uppmärksamhet ägnas åt överlåtande vuxna maskar på nya tallrikar som behövs för att undvika förvirrande studie försökspersoner med deras avkomma. Begränsning av antalet ägg pläterade i början av analysen till 25-30 ägg bör förhindra detta också. Slutligen, överföra vuxna maskar på nya plattor ofta också minskar risken för maskar kryper upp sidorna av petriskål och dör.
Vi har utnyttjat Caenorhabditis elegans som en mångsidig modell värd för att studera patogena eller kommensaler relationer mellan mikrober eller en mikrob och dess värd. Vårt system kan användas som ett verktyg för att studera mikrobiell eller host-mikrob interaktion på cellulär och molekylär nivå med framåt och bakåt genetiska metoder men också för att utforska nya molekyler för terapeutisk intervention. Vi har visat detta system mångsidighet genom att bedriva en genetisk skärm för att identifiera gener som bidrar till virulens40, de kopplade till mikrobiell fitness41, de som förmedlar värdrespons till mikrober17, 18, samt använder modellen för hög genomströmning ansökningar om drug discovery24. Detta är en bra modell för användning av studenter eftersom det inte behöver dyr infrastruktur att upprätthålla kolonier, med tanke på att djur kan vara cryo-bevaras för framtida tillämpningar. Slutligen, detta ger en perfekt ”mellanhand” för in vitro- studier och murina modeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete utfördes på och stöds av Worcester Polytekniska institutet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (granulated, bacterilogical grade) | Apex BioResearch Products | 20-248 | |
| Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) | Genesee Scientific | 59-1M32P | |
| Axiovision Zeiss Inverted Microscope | Axiovision Zeiss | ||
| Bacto-Peptone | Fisher BioReagants | BP1420-500 | |
| C. elegans strain Bli-3 | Caenorhabditis Genetics Center | Bli-3(e767) CB767 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP51-250 | |
| Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% | Sigma | C8667-25G | |
| Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) | FIsherBrand | 14-961-33 | |
| Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) | Nikon Instrument Inc. | ||
| E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) | GraphPad Software | ||
| LB Broth (Miller's) | Apex BioResearch Products | 11-120 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Wildtype C. albicans SC5314 | ATCC | SC5314 | |
| Wildtype C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center | N2 |
References
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44 (6), 817-829 (1986).
- Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).
- Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model. BMC Complement Altern Med. 14, 4 (2014).
- Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity. Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
- Sem, X., Rhen, M. Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host. PLoS One. 7 (9), e45417 (2012).
- Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, e1000982 (2010).
- Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
- Bae, T., et al. Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).
- Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).
- Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway. Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).
- Kesika, P., Balamurugan, K. Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions. Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).
- Cinar, H. N., et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (7), e11558 (2010).
- Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection. Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).
- Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
- Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds. Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).
- Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. 7 (6), e1002074 (2011).
- Dieterich, C., et al. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).
- Chen, C. G., et al. Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection. Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).
- Ricicova, M., et al. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).
- Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).
- Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
- Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog. 4 (2), e35 (2008).
- McDonough, K. A., Rodriguez, A. The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).
- Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator. Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).
- Li, F., Palecek, S. P. EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).
- Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection. Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).
- Korting, H. C., et al. Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium. J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).
- Chamilos, G., et al. Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).
- Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).
- Mallo, G. V., et al. Inducible antibacterial defense system in C. elegans. Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).
- Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).
- Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).
- Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans. PLoS Pathog. 7 (12), e1002453 (2011).
- Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).
- Issi, L., et al. Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans. Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).
- Ford, C. B., et al. The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans. Elife. 4, e00662 (2015).
- Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).
- Garsin, D. A., et al. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).
- Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis. Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).
- Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
