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Genetics

Le nématode Caenorhabditis Elegans - un modèle polyvalent In Vivo pour étudier les Interactions hôtes-microorganismes

Published: October 18, 2017 doi: 10.3791/56487
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Nous présentons ici le nématode Caenorhabditis elegans comme un modèle d’hôte polyvalent pour étudier l’interaction microbienne.

Abstract

Nous démontrons une méthode utilisant Caenorhabditis elegans comme un hôte de modèle pour étudier les interactions microbiennes. Les microbes sont introduites par le régime alimentaire, rendant l’intestin l’emplacement principal pour la maladie. L’intestin nématode structurellement et fonctionnellement imite les intestins chez les mammifères et est transparent, ce qui en fait se prêtent à l’étude au microscope de la colonisation. Ici, nous montrons que les agents pathogènes peuvent causer la maladie et la mort. Nous sommes en mesure d’identifier des mutants microbiennes qui montrent la virulence altérée. Sa réponse innée conservée aux stress biotiques rend c. elegans , un excellent système pour sonder les facettes des interactions immunitaires innées hôte. Nous montrons que hôtes présentant des mutations dans le gène de l’oxydase double ne peut pas produire des espèces réactives de l’oxygène et sont incapables de résister à une insulte microbienne. Nous démontrons plus loin la polyvalence de l’analyse de survie présenté en montrant qu’il peut être utilisé pour étudier les effets des inhibiteurs de la croissance microbienne. Ce test peut également être utilisé pour découvrir les facteurs de virulence fongique comme cibles pour le développement de nouveaux agents antifongiques, mais aussi de donner l’occasion de découvrir davantage les interactions hôtes-microorganismes. La conception de ce test prête bien à un débit élevé du génome entier écrans, tandis que la capacité à worms en cryo-preserve pour une utilisation future rend un modèle animaux rentable et attractif pour étudier.

Introduction

C. elegans a été utilisé comme un organisme modèle puissant depuis plus de 50 ans. Dans les années 1960, biologiste sud-africain Sydney Brenner pionnier de l’utilisation c. elegans afin d’étudier le développement neuronal, ouvrant la voie à une longue lignée de scientifiques pour étudier divers aspects de la biologie cellulaire et animale dans les nématodes. Cette lignée inclut des lauréats du prix Nobel Craig Mello et Andrew Fire pour leur travail de RNAi1, Robert Horvitz et John Sulston pour leurs travaux sur le développement des organes et l’apoptose2,3,4et Martin Chalfie pour ses travaux sur la protéine fluorescente verte5. Bien que cet organisme modèle a été utilisé traditionnellement pour étudier la biologie moléculaire et du développement, au cours des 15 dernières années, les chercheurs ont commencé à utiliser des c. elegans pour étudier la biologie des différents agents pathogènes humains, y compris Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericaet Serratia marcescens6,7,8,9,10. Ces études ont révélé que bon nombre des mécanismes impliqués dans l’interaction homme-pathogène sont conservées dans les nématodes, mais aussi qu’il y a des mécanismes immunitaires qui sont propres à ce modèle organisme11,12. Dans la nature, c. elegans rencontre une variété de menaces par des agents pathogènes ingérés présents dans le sol et cela a fourni une forte pression sélective à évoluer et à maintenir un système sophistiqué d’immunitaire inné dans la lumière intestinale. Plusieurs des gènes et des mécanismes impliqués dans la protection de la lumière intestinale sont orchestrés par des éléments hautement conservée qui existent aussi en plus les mammifères11,13. C. elegans représente donc un excellent modèle pour étudier les agents pathogènes gastro-intestinaux comme Salmonella enterica14, Shigella boydii15ou16de la Vibrio cholerae.

Ici, nous mettons en évidence la polyvalence remarquable de c. elegans comme un hôte de modèle pour l’étude des agents infectieux tels que c. albicans. C. elegans comme un hôte de modèle permet de criblage à haut débit pour la virulence qui est long et moins coûteux qu’un modèle de souris, ce qui est couramment utilisé pour étudier la candidose42.

Dans cette étude, nous montrons que ce modèle et le test de survie assosiated peuvent être utilisés efficacement pour l’étude des effecteurs immunitaires innées hôte importants lutter contre les infections, les déterminants pathogène qui animent la virulence, et pharmacologiques des composés qui peuvent intervenir dans la pathogenèse. Dissemblables aux déterminations décrites précédemment, cette méthode fournit un moyen d’étudier l’exposition à un agent pathogène sur la durée de vie de l’animal, du stade larvaire à l’âge adulte, plutôt que seulement l’âge adulte à mort43,44. En résumé, notre c. elegans - modèle de c. albicans est un outil puissant et polyvalent qui peut être utilisé non seulement pour étudier les bases génétiques qui animent et immunitaires mais aussi d’identifier de nouveaux composés pour l’intervention thérapeutique.

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Protocol

1. préparation du nématode à croissance moyenne (NGM)

  1. pour 1 L de médias, mélanger 20 g de gélose, source d’azote organique 2,5 g (p. ex., bacto-peptone) et 3 g de chlorure de sodium dans un flacon de 2 L. Ajouter 975 mL d’eau stérile.
    1. Add dans un bar d’agitation stérile. Si vous utilisez un bec verseur automatique de médias, les tubes de l’autoclave et les médias pendant 15 min ; médias devrait être stérilisés à l’autoclave pour plus si un volume plus élevé est en.
  2. Set médias sur plaque de remuer et laisser pour refroidir.
    1. Une fois que le média est chaud au toucher (environ 60 ° C) aseptiquement ajouter 1 mL de 1 M MgSO 4 ● H 2 O, 1 mL de 1 M CaCl 2, 25 mL de KPO 4 et 1 mL de cholestérol de 0,5 % dans l’éthanol.
    2. Verser médias (à la main ou par pompe automatique) sous hotte à flux laminaire dans 35 x 10 mm plats de Pétri stériles. Laisser pour sécher sous capot pendant 1 à 2 jours avant l’utilisation.
      Remarque : Les plaques doivent être conservés à 4 ° C pour éviter la contamination.

2. Faire un ver Pick

  1. coupe un morceau de 1,5 cm de fil d’aluminium. Insérez avec précaution environ 0,5 cm de cette longueur dans l’embout de la pipette Pasteur.
    1. à l’aide d’un bec Bunsen ou la lampe à alcool, faire fondre l’embout de la pipette de verre en tournant lentement dans la flamme jusqu'à ce que le fil est fermement adhéré à la pipette, sans pour autant compromettre la forme originale de l’embout de la pipette.

3. Préparation de la Culture d’e. coli

  1. à l’aide d’une anse stérile, ensemencer la seule colonie d’e. coli de souche OP50 dans 200 mL de bouillon de Luria. Incuber pendant la nuit, avec agitation à 37 ° C.
  2. La culture liquide est prêt à être utilisé le jour suivant et peuvent être conservée à 4 ° C quand pas en service.
    Remarque : La souche e. coli, OP50, est utilisée comme source de nourriture pour elegans de c. Cette culture peut être utilisée pour jusqu'à plusieurs mois s’il est conservé à 4 ° C.

4. Essentiel c. elegans entretien

  1. graines préparé des boîtes de gélose NGM à e. coli en repérant environ 50-100 µL de prêt OP50 culture liquide vers le centre de la plaque.
  2. Plaques de recouvrement et laissez-les sécher à température ambiante pendant 24h. Une fois sec, placez les plaques à 37 ° C pendant la nuit pour une croissance rapide ou garder à température ambiante, si vous souhaitez une croissance plus lente.
  3. Ajouter vers la plaque soit par " chunking, " (voir protocole étape 5 " Chunking et cueillette vers "), cueillette vers individuellement, ou en plaçant des oeufs de ver directement sur la plaque (voir protocole étape 6 " oeuf préparation ").

5. Chunking et cueillette vers

Remarque : " Chunking, " se réfère à une pratique courante dans l’entretien de c. elegans. Il s’agit de couper une section de la gélose NGM qui contient les vers et transférer ce morceau sur une nouvelle plaque, transférant ainsi également un grand nombre de vers dans le processus. Contamination peut également être découpée dans la plaque de cette manière. Lors de la cueillette de worms, il est important de maintenir l’intégrité de l’agar, car les vers peuvent être perdus dans des trous dans la gélose. En outre, il est important de permettre le prélèvement refroidir avant de toucher la plaque afin d’éviter de faire fondre la gélose ou brûler les vers.

  1. Pour transférer rapidement de grandes quantités de vers sur les nouvelles plaques, couper un morceau d’agar NGM contenant les vers sélectionnés à l’aide d’une spatule. Retirez le morceau coupé et placez-le face vers le bas sur le bord de la pelouse de OP50 sur une nouvelle assiette.
  2. Transfert worms individuellement comme décrit ci-dessous dans protocole étape 8.2, " test de survie, " à l’aide d’un ver pick. Le fil dans le prélèvement de ver la flamme jusqu'à ce qu’il est rouge. Retirer du feu et laisser refroidir pendant quelques secondes.
  3. En utilisant le fil sur la pique, grattez légèrement la pelouse de la culture OP50 cultivée sur la nouvelle plaque, couvrant le fil sur la pique.
  4. La culture visqueuse couvrant l’extrémité du fil fait vers s’en tenir à la pointe du médiator, donc doucement ramasser sélectionné vers un mouvement glisser.
  5. Une fois vers sélectionnés sont réunis, placez-les sur une plaque de nouveau en glissant doucement la culture à travers l’agar. Placez le fil dans la flamme pour éliminer la culture restante sur la pique.

6. Préparation des oeufs

  1. Placer environ 20 animaux adultes (environ 2-3 jours après l’éclosion, lorsque cultivées à 20 ° C) par cueillette ou segmentation tel que décrit à l’étape de protocole 5, " Chunking et cueillette vers, " sur une plaque de graines avec 50 µL de souche d’e. coli, OP50.
  2. Pour recueillir les oeufs, recouvrir la plaque avec 10 mL de tampon de M9 après 1-2 jours. À l’aide d’une pipette sérologique de verre, tourbillon et agiter délicatement le contenu sur la gélose pour libérer les oeufs collés sur OP50 ou animaux adultes. Recueillir tout le liquide contenant les oeufs et les adultes.
  3. Solution de transfert M9 et OP50 dans un 15 mL conique tube. Centrifuger le tube conique de 15 mL à 2 100 x g pendant 2 min.
  4. Aspirer environ 9 mL du surnageant sans déranger le culot OP50.
  5. Resuspendre le culot dans 2 mL d’eau stérile, 1 mL d’eau de Javel et 1 mL de 0,25 M NaOH.
  6. Mélanger doucement en retournant jusqu'à ce que la majorité (environ 70 %) des animaux adultes apparaître lysée ; en général, œufs restent intacts pendant ce traitement de l’eau de Javel court à cause de leur coquille. Centrifuger le tube conique à 990 x g pendant 2 min.
  7. Aspiration surnageant sans déranger le culot. Resuspendre le culot dans 10 mL de tampon de M9.
  8. Centrifuger le tube conique en 990 x g pendant 2 min. aspirer surnageant sans culot inquiétante. Resuspendre le culot avec 200 µL de tampon de M9.
    Remarque : Préparation de l’oeuf peut-être nécessiter plusieurs essais. Œufs peuvent être détruits si ils sont exposés à l’eau de Javel pendant trop longtemps. Si les oeufs ne pas éclos, soit diminuer la concentration d’eau de Javel en solution ou diminuer la durée d’exposition à l’eau de Javel.

7. Infection par plaque de montage

  1. distribuer 3-5 mL de la DPJ dans un tube stérile et il inoculer avec une seule colonie Candida albicans à l’aide d’une anse stérile.
    1. Placer le tube sur un tambour rotatoire pour environ 16-18 h à 30 ° C.
  2. Label un 1,5 mL tube à centrifuger contenant c. albicans et un autre pour contenir OP50. Noter le poids de chaque tube vide.
    1. Place 500 µL de la nuit la culture de c. albicans dans tube marqué c. albicans et 1 500 µL de la culture OP50 durant la nuit (à l’étape 3.1) dans le tube étiqueté OP50.
    2. Centrifugation pendant 10 min à 16 100 x surnageant aspirat g. sans culot inquiétante.
    3. Une nouvelle suspension chaque granule avec 500 µL d’eau stérile. Centrifuger pendant 5 min à 16 100 x g.
    4. Aspiration surnageant sans déranger le culot. Noter le poids final des microtubes.
    5. Déterminer le poids de chaque granule en soustrayant le poids initial des microtubes du poids final.
  3. à l’aide de l’eau stérile, resuspendre le culot de c. albicans à 10 mg/mL et le culot OP50 à 200 mg/mL. Faire une infection maître mélanger en combinant les 7 µL d’eau stérile, 0,5 µL de la culture de c. albicans, 10 µL d’une solution de 50 mg/mL de streptomycine et 2,5 µL de culture OP50.
    1. Pour les plaques de contrôle, créez un mélange maître en remplaçant le volume de la culture de c. albicans avec de l’eau stérile. Graines de 20 µL du mélange d’infection ou la solution de contrôle sur les plaques de centre de NGM à l’aide d’une micropipette OP50.
      NOTE : Environ 100 vers sont nécessaires pour déterminer la signification statistique au cours de l’analyse. Ce dosage est généralement exécuté en trois exemplaires. Ainsi, un 3.2 x mélange d’infection ainsi qu’un 3.2 x solution de contrôle est effectuée. Ces mélanges sont faites pour être un peu plus de 3 x l’original pour s’assurer qu’un complet 20 µL est ensemencé sur chaque plaque, ce qui permet de place à l’erreur. Ce mélange maître est créé car le pharynx du ver est trop petit durant les premiers stades larvaires (L1-L3) à consommer c. albicans. Pour l’exposition à des agents pharmacologiques tels que le fluconazole ( Figure 3 b), l’agent est introduit dans le mélange de l’infection. La concentration de l’agent est déterminée empiriquement. Par exemple, dans la Figure 3 b, 50 µM Fluconazole est représenté, mais 0, 12,5, 25, 50 et 100 µM et Fluconazole furent également testés en utilisant le même protocole.

8. Analyse du phénotype de la région anale déformé (Dar) et test de survie

  1. visualiser le phénotype de Dar
    Remarque : Dar est mieux visualisé au stade L3 et au-delà. Dar se présente comme une petite saillie dans la région anale post du ver ( Figure 2 a), qui devient plus importante au fil du temps.
    1. Confirmer si un animal a Dar en appuyant rapidement sur la plaque sur la scène du microscope à dissection ; animaux sans volonté de Dar se déplacent en arrière immédiatement, tandis que les animaux avec Dar sera soit besoin répété tours de tapping pour inverser leur direction, ou ils ne sera pas du tout.
  2. Test de survie
    1. préparation oeuf complet comme décrite dans l’étape de protocole 6, " oeuf préparation ". Compter les oeufs dans le cadre de la dissection et diluer la solution oeuf avec M9 jusqu'à l’obtention d’une concentration d’environ 5-6 de œufs sains par µL. En utilisant une pipette, ajouter 20 µL d’échantillon contenant environ 30 œufs sur la plaque NGM préparé, dans la zone située entre la culture et du côté de la plaque (oeufs et ver alimentaire, OP50, sont à deux endroits distincts).
    2. Incuber les plaques à 20 ° C pendant 48 h. Sous le microscope à dissection, compter le nombre de vers vivants et morts adultes dans chaque assiette, ainsi que le nombre de vers avec Dar. Enregistrer les % avec Dar.
    3. Examiner un animal mort, si elle ne répond pas à l’écoute sur la tête par un fil d’aluminium ou tapant sur la plaque.
    4. Tous les jours, transférer vers adultes restantes de cueillette comme décrit à l’étape de protocole 5, " Chunking et cueillette vers, " sur une nouvelle plaque de contrôle ou d’infection. À ce stade, si nécessaire, effectuer un test de survie en vérifiant le nombre de vers vivants, morts et disparus chaque jour.
      Remarque : Ce test peut fonctionner pendant deux semaines, commençant par la préparation de l’oeuf. En outre, la solution de l’oeuf ne devrait pas être dispensée sur la culture bactérienne, comme la solution peut contenir des traces d’eau de Javel qui peut tuer la OP50. La solution devrait également être distribué environ 0,5 cm du bord de la plaque, car les œufs peuvent se coincer entre les côtés de la plaque et l’agar. En outre, en raison de la prolifération rapide de worms, transférant les adultes sur les nouvelles plaques est critique pour les séparer de leur progéniture.
  3. Analyser la survie
    1. analyser les résultats à l’aide du logiciel d’analyse courbe de survie (voir liste des matériaux).
    2. Comparer la survie de courbes à l’aide de la méthode Grehan-Breslow-Wilcoxon (en supposant que les données des périodes tôt de survie sont plus précises qu’ULTERIEUREMENT, pondérer les données en conséquence) ainsi que d’outils statistiques Logrank 45.
      NOTE : Par exemple, dans la Figure 4 b -C, la survie vers traités avec mutant c. albicans est comparée à ceux traités par les contrôles de type sauvage isogéniques ou complementarystrains.

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Representative Results

Un dosage de pathogenèse (Figure 1) à l’aide de c. albicans et c. elegans a déjà été décrite par notre laboratoire17,18 et autres laboratoires19,20. Nous démontrons la susceptibilité de l’utilisation de c. elegans afin d’étudier la virulence de c. albicans montrant que les cellules de c. albicans sont rapidement ingérés par les vers et s’accumulent dans la lumière intestinale en provoquant la locomotion plus lente, déformé anal région (Dar) (Figure 2 a), un gonflement de la vulve (Figure 2 b), la distension de l’intestin (Figure 3 a) et la létalité (Figure 3, Figure 4). Nous mesurons également la durée de vie vers infectés comme une mesure quantitative de remise en forme. Par exemple, c. elegans infectés par c. albicans vivent 10 à 12 jours par rapport à 20-22 pour les contrôles non infectés. Chez c. elegans infectés par le c. albicans à double assommer mutant, efg1/efg1 cph1/cph1, qui sont deux facteurs de virulence clés nécessaires à l’infection chez les souris, les rats et épithéliales humaines modèles21, 23, nématodes ont survécu beaucoup plus longues que les contrôles (Figure 3 b). Ces expériences suggèrent que certaines des leçons que nous apprenons dans ce modèle plus simple sur la virulence de c. albicans peuvent rester valides chez les mammifères supérieurs et vice versa.

Nous montrons également que le système de modèle de nématodes peut être modulé sur le plan pharmacologique (Figure 3 b). En présence de fluconazole, médicament antifongique plus couramment prescrit, worms a contesté avec c. albicans a survécu beaucoup plus longues que les contrôles. Cette preuve de l’expérience de principe suggère que le modèle de nématodes peut être utilisé pour le dépistage de petites molécules. En effet, notre modèle de c. elegans a contribué à identifier les filastatin, une petite molécule inhibant les divers aspects de la virulence fongique24.

Les phénotypes de la maladie et l’analyse au microscope de C. elegans , infection
C. elegans ont été exposées à c. albicans durant une période de six jours et a observé des signes d’infection, la progression de la maladie et la mort. Le phénotype de Dar est plus visible par jour 4 de l’analyse de survie, comme le fait remarquer une saillie région anale qui n’est pas visible chez l’animal non infectée (Figure 2 a). Vers infectés par c. albicans sont également connus pour pièce enflure dans la région de la vulve (Figure 2 b). Dans les deux cas, le ver est incapable d’éliminer l’infection après avoir atteint ce stade. Afin de visualiser la colonisation de c. albicans dans la lumière intestinale, worms étaient nourris sauvage c. albicans taggés DP, qui causent des zones de colonisation à une fluorescence rouge (Figure 3 a). Afin de produire ces images, les vers ont été anesthésiés sur un tapis de 2 % d’agarose contenant de l’azide de sodium 0,01 M. Vers ont été exposés à sauvage c. albicans ou DP-tag c. albicanset transférés dans la zone tampon de M9 5 µM sur le coussinet de gel d’agarose. Le coussin de gel d’agarose est ensuite recouvert d’un lamelle couvre-objet. Les vers étaient considérés à 200 X et 400 X grossissement, à l’aide d’un microscope inversé avec des capacités de microscopie fluorescente. Des images ont été créés sous contraste interférentiel différentiel (Nomarski) et épifluorescence optique. Les images fluorescentes ont été améliorés à l’aide de logiciels (Figure 3 a). Micrographies série temps des infectés vers déterminé que c. albicans a colonisé la lumière intestinale par la troisième journée de l' épreuve17. Vers infectés ont montré une distension intestinale plus sévère que celle observée dans le contrôle non infecté.

Outils génétiques et pharmacologiques pour étudier l’infection
Ensuite, nous avons testé le modèle en utilisant la modulation génétique et pharmacologique. Nous avons aussi testé les facteurs de virulence précédemment documenté qui réglementent la transition des hyphes de c. albicans25 et qui auraient dû être divulgués important dans les infections in vivo des souris et des nématodes20,26 . Nous avons testé la capacité vers de survivre infection causée par c. albicans efg1/efg1 cph1/cph1 double mutant. Efg1 est un facteur de transcription hautement conservée et une composante essentielle de la voie métabolique de l’AMP cyclique/protéine kinase A (PKA). Chez c. albicans , cette voie régule la morphogenèse des hyphes27,28et un arsenal de facteurs de virulence essentiel de commutation blanc opaque. Ces facteurs de virulence sont Hwp1 et Hwp2, deux parois cellulaires de levures spécifiques protéines impliquées dans l’adhérence et la formation de biofilm, Eap1, une adhésine de paroi cellulaire impliqué dans la fixation aux cellules épithéliales humaines29et Sap5, une enzyme hydrolytique impliqués dans tissu épithélial invasion30. Cph1 est un facteur de transcription qui réglemente les nombreux processus métaboliques, y compris d’accouplement, filamentation et la formation de biofilm et s’est avéré jouent un rôle essentiel en endommager les cellules épithéliales31 et l’épithélium humain reconstruit21 . Perturbation d’un de ces gènes a un impact significatif sur la virulence et la perturbation simultanée des deux résultats cph1/cph1efg1/efg1 réduction dramatique de virulence dans divers modèles animaux y compris souris25, Drosophila 32, zebrafish33,34 et papillon34. Le mutant double cph1/cph1efg1/efg1 est considéré par la communauté de c. albicans que la souche non virulente de définition et de l’étalon-or pour la validation de systèmes nouveaux modèles. Le efg1Δ et Δ cph1single mutants ont montré une diminution de Dar (~ 10 % et environ 50 %, respectivement) par rapport à la souche sauvage apparentée, tandis que le mutant double efg1Δ cph1Δ n’a pu provoquer la réponse de Dar17. Ces résultats récapitulent le patron de la virulence chez la souris, où le mutant cph1∆ est légèrement atténué, le mutant efg1∆ est trgnificantly atténuée, et le double mutant est complètement non virulente25. Infectés par les vers cph1/cph1 efg1 / efg1C. albicans double mutant vécu statistiquement significativement plus que les témoins (p < 0,01 pour les Log Rank et Breslow test statistique, n = 60) ce qui suggère que ces deux gènes sont nécessaires pour C. albicans virulence contre c. elegans (Figure 3 b).

Afin d’explorer la possibilité d’utiliser notre modèle de c. elegans pour le dépistage de drogues potentiels, nous avons testé l’effet de l’ajout du fluconazole sur le résultat final de l’infection. Nous avons utilisé une variété de différentes concentrations de fluconazole et a constaté que 50 µM nous a donné les résultats les plus significatifs. Vers infectés par c. albicans et 50 µM fluconazole (Figure 3 b) vécu statistiquement significativement plus que les témoins (p < 0.01 à Log Rank et Breslow test statistique, n = 60). Cette concentration a été empiriquement déterminée (voir la note à la fin de l’étape de protocole 7, « plaque d’infection établie »). Ces expériences de principe la preuve a montré que notre modèle nématode peut être utilisé pour le dépistage antifongique de petites molécules. Le modèle était en fait un rôle déterminant dans la découverte de filastatin, une petite molécule inhibant les divers aspects de la virulence fongique qui fait actuellement l’objet de plus des études précliniques24. En conséquence, notre essai convient pour explorer les stratégies de la virulence de c. albicans et les agents pharmacologiques.

Étude de la réponse innée de l’hôte
Ensuite, nous avons voulu étudier les défenses de l’hôte réciproque contre les agents pathogènes, étant donné que les aspects de cette immunité innée sont conservés chez les mammifères11,35. Il est bien connu que le c. elegans produit ROS sur les deux infections bactériennes et fongiques de36,18,37 dans le cadre de son mécanisme de défense. ROS ont un effet biocide envahir les organismes et jouent un rôle majeur dans l’immunité innée. zcf15/zcf15 hyper susceptibilité à ROS in vitro nous a conduit à émettre l’hypothèse que sa virulence réduite chez c. elegans a été due à une diminution de la capacité de résister à que l’hôte générée ROS. Pour tester notre hypothèse, nous avons déterminé la capacité de zcf15/zcf15 de tuer soit sauvage vers ou worms avec capacité pour produire des ROS. Représentant c. albicans mutant zcf15 qui est sensible aux espèces réactives de l’oxygène (Figure 4 a) ont montré réduit virulence sauvage de c. elegans. C. elegans répond à l’ingestion d’agent pathogène par la production de ROS extracellulaire dans la lumière intestinale par l’intermédiaire de Ce-Duox1, une NADPH oxydase codée par le gène bli-3. Au cours de la production de ROS, les cellules intestinales produisent également des antioxydants intracellulaires via DAF-16 pour protéger ses propres tissus de la ROS néfastes effets36,38. Ce-Duox1 est une protéine avec un domaine de peroxydase N-terminal, un domaine de NADPH oxydase C-terminal génératrices de superoxyde et deux sites de liaison calmoduline central39. Lors de l’infection microbienne, cette protéine utilise cytosolique NADPH pour générer des ROS toxiques extracellulaire dans la lumière intestinale pour lutter contre l’infection. Dans toute une série d’épreuves biochimiques dans une étude de 2009, Jain et al ont montré qu’EOA sont abondamment produites sur l’infection à levures et que bli-3 la perte de fonction par l’intermédiaire de bli-3(e767) réduit considérablement la capacité des nématodes de produire ROS. Comme le montre la Figure 4 b, vers contesté avec zcf15/zcf15 ont survécu beaucoup plus longues que le type sauvage ou souches complétées (p < 0,01 par le test du log-rank) indiquant que ZCF15 est requise pour la virulence. Cependant, quand nous avons contesté ROS-deficient c. elegansbli-3(e767), nous avons obtenu la cinétique des tueries qui ont été comparables entre zcf15/zcf15, de type sauvage et de souche complémentée (Figure 4). Cet élément de preuve indique que zcf15/zcf15 ne parviennent pas à tuer les nématodes, à moins que la capacité des hôtes pour produire le ROS est compromise. Pris ensemble, ces résultats suggèrent que ZCF15 est requis pour la virulence complet et que ce gène est probablement impliqué dans la capacité de l’agent pathogène à résister à l’hôte généré ROS. Au meilleur de notre connaissance, c’est la première fois que ZCF15 s’est avéré d’être impliqués dans la pathogénicité et la résistance de ROS.

Figure 1
Figure 1 : Une représentation schématique de l’infection à c. elegans . C. elegans sont exposées à un mélange d’e. coli , souche OP50 et un agent pathogène et observée sur une période de 4 jours après avoir atteint l’âge adulte pour les signes d’infection et de la progression de la maladie.

Figure 2
Figure 2 : phénotypes maladies. (A) région anale Deformed (Dar) est visible (indiqué par une flèche) comme une enflure dans la région anale après des infectés vers (panneau de droite) quatre jours après l’exposition. Les vers sur le panneau de gauche sont sains et servent comme un contrôle. (B) un sous-ensemble (~ 15 %) du spectacle infecté vers un gonflement de la vulve (panneau de droite, indiqué par une flèche) par rapport aux vers de contrôle non infectées (panneau de gauche) qui représente l’infection disséminée entraînant la mort d’endotocie. Toutes les images ont été prises comme décrit dans les résultats représentatifs18.

Figure 3
Figure 3 : c. albicans - modèle de c. elegans se prête à la manipulation microscopique et peut être modulé sur le plan pharmacologique et génétiquement. (A) c. albicans tag accumulation DP dans la lumière intestinale nématode jour 3 après l’infection. Les cellules de levure sont rapidement ingérés par les vers et s’accumulent dans la lumière intestinale complètement intacte, ce qui indique qu’ils sont capables de survivre à l’écrasement mécanique du pharynx. Des images ont été prises comme décrit dans les résultats représentatifs18. (B) de nématodes a contesté avec sauvage c. albicans, cph1/cph1efg1/efg1 double mutant ou sauvage c. albicans + 50 µM du fluconazole par rapport au contrôle non infectées vers des courbes de survie de Kaplan-Meier.

Figure 438. (B) les courbes de survie de Kaplan-Meier montrent que la suppression de ZCF15 limite le meurtre de worms de type sauvage. (C) courbe de survie de Kaplan-Meier le montre des taux similaires de survie entre zcf15/zcf15, le type sauvage et souche complétée lorsque ROS-deficient c. elegansbli-3(e767) ont été infectés.

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Discussion

Les méthodes pour doser l’infection à c. elegans et la survie au cours de la durée d’exposition à c. albicans que nous avons décrite peuvent être modifiés pour tester un autre pathogène. Cultures en milieu liquide d’une autre bactérie ou champignon peuvent être faites et nourris de c. elegans de manière similaire. En outre, les infections séries peuvent être dosées en premier exposant la larve à un agent pathogène comme décrit et ensuite transférer les animaux sur une nouvelle assiette contenant un agent pathogène distinct après avoir atteint l’âge adulte.

Tout en effectuant ce test, il est important de porter une attention particulière pour le chronométrage. Tout d’abord, lorsque vous remplissez la préparation œufs afin de récolter des œufs pour le dosage, il est essentiel de limiter la quantité de temps que les oeufs sont exposés à l’eau de Javel. La quantité de temps nécessaire pour dissoudre les adultes dans la solution d’eau de Javel pour libérer les œufs varie. Immédiatement après l’administration de la solution d’eau de Javel, la solution de ver doit être surveillée de près, sous un microscope à dissection. Une fois qu’environ 70 % vers se sont désintégrées, alors la solution doit être centrifugée. Si la préparation de l’oeuf ne donne pas de œufs viables, diminuer la concentration d’eau de Javel ou de la durée d’exposition à l’eau de Javel. En remplissant ce test, il est également crucial qu’attention est accordée au transfert vers adultes sur des plaques de nouveau si nécessaire pour éviter la confusion entre les sujets de l’étude avec leur progéniture. Limiter le nombre d’oeufs plaqué au début de l’essai à 25-30 oeufs devrait éviter cela aussi bien. Enfin, transfert vers adultes sur des plaques de nouveau fréquemment aussi diminue les chances vers rampant sur les côtés de la boîte de Pétri et mourir.

Nous avons utilisé le Caenorhabditis elegans comme un hôte modèle polyvalent pour l’étude des relations pathogènes ou commensale entre microbes ou un microbe et son hôte. Notre système peut servir comme outil d’étude microbienne ou interaction hôte-microbe au niveau cellulaire et moléculaire à l’aide d’approches génétiques et inverses, mais aussi pour découvrir de nouvelles molécules pour une intervention thérapeutique. Nous avons démontré la polyvalence de ce système en procédant à un dépistage génétique pour identifier les gènes qui contribuent à la virulence40, ceux liés à la remise en forme microbienne41, ceux qui négocient la réponse de l’hôte aux microbes17, 18, aussi bien en utilisant le modèle pour des applications à haut débit pour la drogue découverte24. Il s’agit d’un bon modèle pour utilisation par les étudiants de premier cycle parce qu’il n’a pas besoin des infrastructures coûteuses pour maintenir des colonies, considérant que les animaux peut être cryoconservés pour de futures applications. Enfin, cela donne une parfaite « intermédiaire » pour des études in vitro et des modèles murins.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été effectué à et soutenu par Worcester Polytechnic Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar (granulated, bacterilogical grade) Apex BioResearch Products 20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) Genesee Scientific 59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted Microscope Axiovision Zeiss
Bacto-Peptone Fisher BioReagants BP1420-500
C. elegans strain Bli-3 Caenorhabditis Genetics Center Bli-3(e767) CB767
Calcium Chloride Fisher Scientific BP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% Sigma C8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) FIsherBrand 14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) Nikon Instrument Inc.
E. coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) GraphPad Software
LB Broth (Miller's) Apex BioResearch Products 11-120
Magnesium Sulfate Fisher Scientific 10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) Falcon 353001
Potassium Phosphate monobasic Sigma P0662-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Sodium Phosphate Fisher Scientific BP332-500
Wildtype C. albicans SC5314 ATCC SC5314
Wildtype C. elegans Caenorhabditis Genetics Center N2

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Génétique numéro 128 interactions microbiennes facteurs de virulence agents pathogènes la défense innée modèle animal Caenorhabditis elegans
Le nématode Caenorhabditis Elegans - un modèle polyvalent <em>In Vivo</em> pour étudier les Interactions hôtes-microorganismes
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Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (128), e56487, doi:10.3791/56487 (2017).

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