Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

Published: October 18, 2017 doi: 10.3791/56487
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

Summary

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

Abstract

נדגים שיטה באמצעות Caenorhabditis elegans כמחשב מארח דגם ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי. חיידקים הם הציגו באמצעות הדיאטה עושה המעי המיקום העיקרי למחלה. המעי נמטודות מבחינה מבנית והן מבחינה תפקודית מחקה בתרבית של המעיים, שקוף שהופך אותו לבצע מחקר מיקרוסקופיות של קולוניזציה. הנה אנחנו מראים כי פתוגנים יכול לגרום למחלות ומוות. אנו מסוגלים לזהות חיידקים מוטנטים להראות שונה התקפה אלימה. שלה שנשמרת תגובה הטבועה ביוטיים מדגיש גורם C. elegans מערכת מעולה כדי לחקור היבטים של אינטראקציות החיסון מולדים המארח. אנו מראים כי מארחים עם מוטציות בגן אוקסידאז כפול לא יכול להפיק מינים חמצן תגובתי, אינם מסוגלים לעמוד בפני העלבון מיקרוביאלי. נדגים נוסף צדדיות של וזמינותו להישרדות שהוצגו על-ידי הצגת כי זה יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של מעכבי צמיחת חיידקים. Assay הזה עשוי לשמש גם כדי לגלות את הגורמים התקפה אלימה פטרייתי כמטרות לפיתוח של סוכני פטריות חדשניים, כמו גם לספק הזדמנות לחשוף עוד יותר אינטראקציות מארח-חיידק. העיצוב של זה וזמינותו משאיל את עצמו היטב כדי תפוקה גבוהה מסכי הגנום כולו, בזמן יכולת הקפאה-שימור תולעים לשימוש עתידי הופכת במודל חיה כל חסכונית ואטרקטיבית, ללמוד.

Introduction

C. elegans שימש כאורגניזם מודל חזק במשך יותר מ-50 שנה. בשנות השישים, ביולוג בדרום אפריקה סידני ברנר חלוץ השימוש של C. elegans ללמוד פיתוח עצביים, לסלול את הדרך לשושלת ארוכה של מדענים לחקור היבטים שונים של ביולוגיה תאים של בעלי חיים של נמטודות. זה כולל חתני פרס נובל קרייג מלו, אנדרו פייר עבור העבודה שלהם RNAi1, רוברט הורביץ, ג'ון סלסטון עבודתם על התפתחות האיברים ואפופטוזיס-2,-3,-4, מרטין צ'לפי על עבודתו על חלבון פלואורסצנטי ירוק5. למרות אורגניזם מודל זה שימש באופן מסורתי ללמוד ביולוגיה מולקולרית, התפתחותית, במשך 15 השנים האחרונות, חוקרים החלו להשתמש C. elegans כדי לחקור את הביולוגיה של פתוגנים אנושיים שונים כולל Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus סלמונלה enterica, בסרישיה marcescens6,7,8,9,10. מחקרים אלה חשף כי רבים של המנגנונים המעורבים באינטראקציה פתוגן-האדם נשמרים נמטודות, אלא גם כי ישנם כמה מנגנונים חסינות ייחודיים11,זה אורגניזם מודל12. בטבע, C. elegans נתקל מגוון רחב של איומים מפני פתוגנים בלע להציג באדמה, זה סיפק לחץ סלקטיבי חזקה להתפתח ולפתח לשמור על מערכת חיסונית מולדת מתוחכמת ב שלה לומן מעיים. רבים של גנים המנגנונים המעורבים ההגנה של לומן מעיים הם בניצוחו של אלמנטים והתפאורה מאוד שקיימים גם יונקים גבוהה יותר11,13. C. elegans ולכן מייצג מודל ללמוד פתוגנים מדרכי העיכול כמו סלמונלה enterica14, שיגלה boydii15או ויבריו כולרה16.

כאן אנחנו מדגישים צדדיות יוצא דופן של C. elegans כמחשב מארח דגם ללמוד מדבקים כגון אלביקנס ג. C. elegans כמחשב מארח המודל מאפשר תפוקה גבוהה הקרנה של התקפה אלימה פחות יקר, אורכת זמן רב יותר דגם העכבר, המשמש בדרך כלל ללמוד קנדידה42.

במחקר זה, אנו מראים כי מודל זה ואת וזמינותו להישרדות assosiated אמין ניתן ללמוד מארח מולדת המערכת החיסונית effectors חשוב לנטרל זיהומים, גורמים הפתוגן לנהוג התקפה אלימה, ולא תרופתי תרכובות שיכול. להתערב פתוגנזה. שיטה זו שונה כדי מבחני שתואר לעיל, מספק אמצעים של הלומדים חשיפה חיידק במהלך תקופת החיים של החיה, של הזחל לבגרות, ולא רק לבגרות אל המוות43,44. לסיכום, שלנו, C. elegans - מודל אלביקנס ג הוא כלי רב-תכליתי, עוצמה שניתן להשתמש בהם לא רק ללמוד את היסודות גנטי כי הכונן זיהום וחסינות אלא גם לזהות תרכובות חדשות התערבות טיפולית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה של תולעים נימיות צמיחה בינוני (NGM)

  1. עבור 1 L של מדיה, לשלב 20 גרם אגר, מקור חנקן אורגני 2.5 g (למשל, מה נשארתי-peptone) ו- 3 גר' נתרן כלורי בבקבוקון 2 ל'. להוסיף 975 מ ל מים סטריליים.
    1. הוספה בבר מערבבים סטרילי. אם משתמש של המשפך מדיה אוטומטי, אבובים אוטוקלב ומדיה למשך 15 דקות; המדיה צריך להיות בלוק עבור יותר אם נפח גבוה יותר עשוי.
  2. להגדיר את המדיה בצלחת מערבבים ולאחר להתקרר.
    1. לאחר מדיה חם למגע (כ 60 ° C) גילוח ורחיצה כירורגית להוסיף 1 מ"ל של 1 מ' MgSO 4 ● H 2 O, 1 מ"ל של 1 מ' CaCl 2, 25 מ של KPO 4 ו- 1 מ"ל של 0.5% כולסטרול באתנול.
    2. שופכים מדיה (ידנית או על ידי משאבת אוטומטית) תחת זרימה שכבתית לתוך 35 מ"מ x 10 מ"מ עקר פטרי. אפשר להתייבש תחת מכסה המנוע של 1-2 ימים לפני השימוש.
      הערה: צלחות לאחסנו ב 4 ° C כדי למנוע זיהום.

2. ביצוע של תולעת לבחור

  1. לחתוך חתיכה 1.5 ס מ של חוט אלומיניום. בזהירות להוסיף כ 0.5 ס מ באורך הזה לתוך קצה פיפטה פסטר.
    1. באמצעות מבער בונזן או אלכוהול המנורה, להמיס את הטיפ פיפטה מזכוכית ידי סובבים לאיטם זה ב הלהבה עד הכבל הוא מאובטח דבקה הפיפטה מבלי להתפשר על הצורה המקורית של קצה פיפטה.

3. הכנה של e. coli תרבות

  1. באמצעות לולאה סטרילי, לחסן שמושבה בודדת של e. coli זן OP50 ב 200 מ ל מרק לוריא. דגירה בין לילה ברעידות-37 מעלות צלזיוס.
  2. התרבות נוזלי מוכן לשימוש ביום המחרת, ניתן לאחסן ב 4 ° C כאשר אינו בשימוש.
    הערה: המתח e. coli, OP50, משמש כמקור מזון עבור C. elegans. תרבות זו עשוי לשמש עד כמה חודשים כאשר הוא מאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס

4. חיוני C. elegans תחזוקה

  1. זרע שהכין NGM פלטות אגר עם e. coli אכון כ 50-100 µL של תרבות נוזלי מוכן OP50 במרכז הצלחת.
  2. מכסה צלחות, לאפשר להם לייבוש בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה. לאחר יבש, במקום צלחות בגיל 37 ° C בלילה לצמיחה מהירה או לשמור בטמפרטורת החדר, אם צמיחה איטית יותר רצוי.
  3. להוסיף תולעים לצלחת על-ידי " chunking, " (ראה פרוטוקול שלב 5 " Chunking ותולעים איסוף "), אוסף תולעים בנפרד או הצבת ביצי התולעת ישירות לצלחת (ראה פרוטוקול שלב 6 " ביצה הכנה ").

5. Chunking ותולעים איסוף

הערה: " Chunking, " מתייחס שיטה אשר נפוץ ב- C. elegans תחזוקה. זה כרוך חיתוך מקטע של צלחת אגר NGM המכיל תולעים, מעביר את החתיכה הזאת על גבי צלחת חדשה, וכך גם העברת כמות גדולה של תולעים בתהליך. הזיהום עשוי גם לגזור את הצלחת באופן זה. כאשר בוחרים תולעים, חשוב לשמור על היושרה של אגר כי תולעים יכולים ללכת לאיבוד בתוך חורים אגר. בנוסף, חשוב לאפשר האיסוף להתקרר, לפני שתיגע הלוח כדי למנוע התכה של אגר. או לשרוף את התולעים.

  1. על מנת להעביר במהירות כמויות גדולות של תולעים על גבי לוחיות הרישוי, לחתוך חתיכה של אגר NGM המכיל את התולעים שנבחר בעזרת מרית. להסיר את החלק הגזור ולמקם אותו הפרצוף למטה בקצה הדשא של OP50 על צלחת חדשה.
  2. העברת תולעים בנפרד כמתואר להלן פרוטוקול שלב 8.2, " Assay הישרדות, " באמצעות תולעת לבחור. להבה החוט של התולעת לבחור עד שזה אדום. להסיר אותה הלהבה ולאפשר לו להתקרר למשך כמה שניות.
  3. בעדינות באמצעות הכבל על האיסוף, לגרד את הדשא של התרבות OP50 גדל על הלוח החדש, המכסים את החוט על האיסוף.
  4. התרבות צמיגה המכסים את קצה החוט גורם תולעים לדבוק קצה האיסוף, ובכך בעדינות להרים תולעים שנבחר באמצעות תנועה swiping.
  5. ברגע שנבחר תולעים אסופים, למקם אותם על צלחת חדשה על-ידי העברת בעדינות תרבות מעבר אגר. מניחים את החוט הלהבה כדי להסיר הנותרים תרבות על האיסוף.

6. ביצה הכנה

  1. במקום כ 20 למבוגרים בעלי חיים (כ 2-3 ימים לאחר הבקיעה כאשר גדל ב- 20 ° C) על ידי איסוף או chunking כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 5, " Chunking ותולעים איסוף, " על צלחת עם 50 µL של e. coli זן, OP50.
  2. כדי לאסוף את הביצים, להציף את הצלחת עם 10 מ"ל M9 מאגר לאחר 1-2 ימים. באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית, מערבולת, בעדינות להתסיס את תוכנו בצלחת אגר לשחרר ביצים תקוע OP50 או חיות למבוגרים. לאסוף את כל הנוזל המכיל ביצים עם מבוגרים.
    3. צינור
  3. M9 להעביר פתרון OP50 לתוך חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה צינור חרוטי 15 מ"ל-2,100 g x עבור 2 דק
  4. האחות כ 9 מ של תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר OP50.
  5. Resuspend בגדר 2 מיליליטר מים סטריליים, 1 מ"ל של אקונומיקה ו 1 מ"ל של 0.25 M NaOH.
  6. לערבב בעדינות על ידי היפוך עד הרוב (כ 70 אחוז) של בעלי חיים למבוגרים מופיעות lysed; בדרך כלל, ביצים נשארים בעינם במהלך טיפול קצר אקונומיקה זה בגלל המעטפת שלהם. Centrifuge צינור חרוטי ב 990 g x עבור 2 דק
  7. וביופסיה תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. מחדש להשעות את צניפה ב 10 מ"ל של מאגר M9.
  8. Centrifuge את צינור חרוטי 990 g x עבור 2 דק וביופסיה תגובת שיקוע ללא גלולה מטרידה. מחדש להשעות גלולה עם 200 µL מאגר M9.
    הערה: הכנת ביצה עשויים לדרוש ניסויים מרובים. ביצים עלול להיהרס אם הם נחשפו אקונומיקה יותר מדי זמן. אם לא בוקעות, או להקטין את הריכוז של אקונומיקה בתמיסה או להקטין את משך החשיפה מלבין.

7. הגדרת צלחת זיהום

  1. לוותר על 3-5 מ של YPD לתוך מבחנה סטרילית ולא לחסן אותו עם מושבה בודדת של קנדידה אלביקנס באמצעות לולאה סטרילי.
    1. למקם את הצינורית על תוף על כל ההזמנות עבור-16-18 h ב- 30 ° C.
  2. תווית 1.5 mL microfuge שפופרת אחת להכיל אלביקנס ג, ועוד אחד להכיל OP50. להקליט את המשקל של כל שפופרת ריק.
    1. 500 המקום µL של הלילה אלביקנס ג תרבות לתוך צינור הנקרא אלביקנס ג ו- 1,500 µL של התרבות OP50 לילה (מתוך שלב 3.1) לתוך הצינור הנקרא OP50.
    2. צנטריפוגה 10 דקות ב 16,100 x ג וביופסיה תגובת שיקוע ללא גלולה מטריד.
    3. מחדש להשעות כל גלולה עם 500 µL של מים סטריליים. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב- g x. 16,100
    4. וביופסיה תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. להקליט את המשקל הסופי של צינורות microfuge.
    5. לקבוע את המשקל של כל גלולה על ידי הפחתת המשקל ההתחלתי של הצינורות microfuge לפי המשקל הסופי.
  3. שימוש במים סטריליים, מחדש להשעות בגדר אלביקנס ג ל 10 מ"ג/מ"ל, בגדר OP50 200 מ ג/מ ל. לגרום זיהום ראשי לערבב על ידי שילוב של µL 10 של פתרון 50 מ"ג/מ"ל של סטרפטומיצין, 2.5 µL התרבות OP50, 0.5 µL של תרבות אלביקנס ג ו µL 7 מים סטריליים.
    1. עבור לוחות בקרה, ליצור שילוב אב על-ידי החלפת הנפח של תרבות אלביקנס ג במים סטריליים. זרע µL 20 של זיהום ערבוב או OP50 פתרון שליטה על גבי הלוחות מרכז של NGM באמצעות micropipette.
      הערה: תולעים כ-100 נחוצים כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית במהלך ניתוח. זה וזמינותו מנוהל בדרך כלל כן. לפיכך, של 3.2 x מיקס זיהום, כמו גם של 3.2 x שליטה פתרון מורכב. תערובות אלה עשויים להיות מעט מעל 3 x המקורי כדי להבטיח כי µL מלא 20 הוא נזרע על כל צלחת, ומאפשר מקום לטעויות. מיקס מאסטר זה נוצר בגלל הלוע של התולעת הוא קטן מדי הזחל הראשונית (L1-L3) לצרוך אלביקנס ג. חשיפה סוכנים תרופתי כגון תהליך הזיקוק ( איור 3B), הסוכן הוא הציג את התערובת זיהום. הריכוז של הסוכן של נקבעת מדעית. לדוגמה, ב- 3B איור, 50 מיקרומטר פלוקונאזול מיוצג, אולם 0, 12.5, 25, 50, 100 מיקרומטר פלוקונאזול היו גם נבדק באמצעות פרוטוקול אותו.

8. ניתוח של פנוטיפ מעוותים אזור אנאלי (Dar) ואת וזמינותו להישרדות

  1. Visualize פנוטיפ דאר
    הערה: דאר בצורה הטובה ביותר הוא מדמיין בשלב L3 ומעבר. דאר מציג כמו בליטה קטנה באזור פי הטבעת פוסט של התולעת ( איור 2 א), אשר הופך להיות בולט יותר לאורך זמן.
    1. אשר אם חיה דאר על-ידי הקשה במהירות את הצלחת על הבמה של המיקרוסקופ לנתיחה; בעלי חיים ללא דאר להזיז לאחור באופן מיידי, בעוד בעלי חיים דאר יהיה עליך לחזור על סבבי הקשה להיפוך הכיוון שלהם, או שהם לא יעשה כן בכלל.
  2. Assay הישרדות
    1. הכנת ביצה מלאה כאמור שמתואר פרוטוקול בשלב 6, " ביצה הכנה ". לספור את הביצים מתחת למיקרוסקופ לנתיחה, לדלל את הפתרון ביצה עם M9 עד ריכוז של 5-6 ביציות בריאות לכל µL מושגת. באמצעות פיפטה של, לוותר על 20 מדגם µL המכיל כ- 30 ביצים על גבי צלחת NGM מוכן, באזור בין התרבות חיידקי לצד צלחת (ביצים, מזון לתולעים, OP50, נמצאים בשני מקומות נפרדים).
    2. Incubate צלחות ב 20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לספור את מספר תולעים מתים מבוגרים וחיים על כל צלחת, כמו גם את המספר של תולעים עם דאר. להקליט את האחוז עם דר.
    3. לשקול חיה מתה, אם זה אינו מגיב שמצותתים על הראש על ידי חוט אלומיניום או הקשה על הצלחת.
    4. כל יום להעביר תולעים בוגרות שנותרו על ידי איסוף כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 5, " Chunking ותולעים איסוף, " על צלחת זיהום או הפקד החדש. בשלב זה, במידת הצורך, לבצע וזמינותו של הישרדות על-ידי מעקב אחר מספר תולעים בשידור חי, מת, חסר כל יום.
      הערה: assay זו עשויה לפעול במשך שבועיים, החל מהכנת ביצה. בנוסף, הפתרון ביצה צריכה לא לפי ראות עיניך אל התרבות חיידקי, הפתרון עשוי להכיל עקבות של אקונומיקה אשר יכול להרוג את OP50. הפתרון צריך להיות גם לפי ביצים יכול להיות תקוע בין צידי הלוח, אגר כ 0.5 ס מ מהקצה של הצלחת, ראות עיניך. בנוסף, עקב התפשטות מהירה של תולעים, העברת מבוגרים על גבי לוחיות הרישוי הוא קריטי כדי להפריד אותם הצאצאים שלהם.
  3. לנתח הישרדות
    1. לנתח את התוצאות באמצעות תוכנת ניתוח עקומת הישרדות (עיין רשימת חומרים).
    2. השווה הישרדות עקומות בשיטת Grehan-Breslow-Wilcoxon (בהנחה כי הנתונים מכל הזמנים הישרדות המוקדמים מדויקות יותר מאשר מאוחר יותר פעמים, משקל הנתונים בהתאם) כמו גם כלים סטטיסטיים Logrank 45.
      הערה: כך למשל, ב איור 4B -C, ההישרדות של תולעים מטופלים עם מוטציה אלביקנס ג הוא בהשוואה לאלו שטופלו פקדים פראי-סוג isogenic או complementarystrains.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Assay פתוגנזה (איור 1) באמצעות אלביקנס ג ו- C. elegans בעבר שתואר עד17,שלנו במעבדה18 ו-19,אחרים מעבדות20. נדגים את amenability של השימוש C. elegans ללמוד התקפה אלימה אלביקנס ג מראה כי אלביקנס ג תאים במהירות בלע מהתולעים להצטבר לומן מעיים גורם ומכניקה איטי, מעוותים אנאלי אזור (Dar) (איור 2 א), נפיחות של הפות (איור 2B), distention של המעי (איור 3 א), וכן קטלני (איור 3, איור 4). אנחנו גם למדוד את תוחלת החיים של תולעים נגוע כאמצעי כמותית של כושר. לדוגמה, C. elegans נגוע אלביקנס ג חיים 10-12 ימים בהשוואה ל- 20-22 עבור פקדים נגוע. ב- C. elegans נגוע הנקישה זוגי אלביקנס ג . מוטציה, efg1/efg1 cph1/cph1, שהן שני גורמים מרכזיים התקפה אלימה הדרושים עבור זיהום עכבר, חולדות, האפיתל אנוש מודלים21, 23, נמטודות שרדו באופן משמעותי יותר מאשר פקדים (איור 3B). ניסויים אלה מראים כי חלק מהשיעורים שנלמד במודל זה פשוט על התקפה אלימה אלביקנס ג עשויים להישאר בתוקף ביונקים גבוהה יותר ולהיפך.

אנו גם מראים כי מערכת מודל נמטודות יכול להיות פרמקולוגית מאופנן (איור 3B). בנוכחות פלוקונאזול, ביותר שנקבע בדרך כלל התרופה נגד פטריות, תולעים הם אתגר אלביקנס ג שרדו באופן משמעותי יותר מאשר פקדים. הוכחה עיקרון הניסוי מצביע על כך שניתן להשתמש המודל נמטודות להקרנה מולקולה קטנה. אכן, דגם C. elegans שלנו מילא תפקיד מרכזי בזיהוי filastatin, מולקולה קטנה עיכוב היבטים שונים של התקפה אלימה פטרייתי24.

מחלת פנוטיפים וניתוח מיקרוסקופיים של C. elegans זיהום
C. elegans היו חשופים אלביקנס ג על פני תקופה של שישה ימים, נצפו סימנים של זיהום, ההתקדמות של מחלות ומוות. פנוטיפ דאר מוצגת ביותר עד 4 וזמינותו להישרדות, כאמור על ידי אזור אנאלי בולט שאינו גלוי החיה נגוע (איור 2 א). תולעים נגוע אלביקנס ג ידועים גם להפגין נפיחות באזור הפות (איור 2B). בשני המקרים, התולעת אין אפשרות לנקות את הזיהום לאחר שהגיע בשלב זה. על מנת להמחיש התיישבות אלביקנס ג ב לומן מעיים, תולעים הואכלו פראי-סוג ג אלביקנס המתויגת RFP, אשר גורמות תחומי קולוניזציה כדי לזרוח אדום (איור 3 א). על מנת לייצר את התמונות האלה, תולעים היו מרדימים על משטח agarose 2% המכיל אזיד הנתרן 0.01 M. תולעים היו חשופים פראי-סוג ג אלביקנס או מתויג RFP אלביקנס ג, הועבר לתוך 5 מיקרומטר M9 מאגר על משטח agarose. משטח agarose היה אז מכוסה coverslip. תולעים היו צפו ב 200 X ו 400 X הגדלה באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם יכולות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תמונות נוצרו תחת התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (Nomarski) ואופטיקה epifluorescence. הדימויים פלורסנט היו משופרים באמצעות תוכנה (איור 3 א). זמן micrographs סדרה של תולעים נגוע נקבע כי אלביקנס ג התנחלו לומן מעיים מאת היום השלישי של ה-assay17. תולעים נגוע הראה התנפחות מעיים חמורה יותר מאשר נצפתה בפקד נגוע.

כלים גנטיים תרופתי ללמוד זיהום
בשלב הבא, בדקנו את הדגם בעזרת אפנון גנטי ולא תרופתי. בדקנו גם את הגורמים בעבר מתועדת התקפה אלימה לווסת את המעבר hyphal אלביקנס ג25 , הוכחו להיות חשוב ויוו זיהומים של נמטודות ועכברים20,26 . . בדקנו את היכולת של התולעים לשרוד דלקת הנגרמת על ידי מוטציה כפולה אלביקנס ג efg1/efg1 cph1/cph1 . Efg1 הוא פקטור שעתוק מאוד ששומרו, מרכיב חיוני של מחזורי AMP/חלבון קינאז A (PKA) מסלול מטבולי. ב ג אלביקנס מסלול זה מסדיר מורפוגנזה hyphal27, לבן אטום מיתוג28, ארסנל של גורמי מפתח התקפה אלימה. גורמים אלה התקפה אלימה כוללים Hwp1, Hwp2, שני חלבונים דופן התא שמרים ספציפיים המעורבים אדהזיה ביופילמים, Eap1, adhesin דופן התא מעורב מחייב לתאי האפיתל אנוש29, ואת Sap5, אנזים hydrolytic מעורב רקמת האפיתל הפלישה30. Cph1 הוא גורם שעתוק מווסת תהליכים מטבוליים רבים, כולל הזדווגות, filamentation, ואת ביופילמים, הוכח לשחק תפקיד קריטי לתאי האפיתל מזיק31 האפיתל אנוש המשוחזרת21 . שיבוש או הגנים האלה יש השפעה משמעותית על התקפה אלימה ובהפסקות בו זמנית של שני בתוצאות cph1/cph1efg1/efg1 בהפחתה דרמטית התקפה אלימה במודלים של בעלי חיים שונים, כולל עכברים25, דרוזופילה 32,33,דג זברה34 ו עש34. המוטציה כפול cph1/cph1efg1/efg1 נחשבת על ידי הקהילה אלביקנס ג המתח avirulent על-ידי הגדרת תקן הזהב עבור אימות של הרומן דגם מערכות. Efg1Δ וδ cph1יחיד מוטציות הראה ירידה דאר (~ 10% ו ~ 50%, בהתאמה) לעומת הסוג הפרוע cognate, בעוד efg1Δ cph1Δ זוגי החשבונאי נכשל שמעודדים תגובה דאר17. תוצאות אלו לסכם את התבנית של התקפה אלימה בעכברים, איפה המוטציה cph1∆ הוא מעט הקלוש, המוטציה efg1∆ הוא סיgnificantly הקלוש, החשבונאי זוגי לחלוטין avirulent25. תולעים נגוע cph1/cph1 efg1 / efg1C. אלביקנס מוטציה כפולה חיו סטטיסטית משמעותית יותר פקדים (p < 0.01 עבור יומן דרגה והן Breslow סטטיסטי המבחן, n = 60) רומז כי אלה שני גנים נדרשים עבור ג אלביקנס התקפה אלימה נגד C. elegans (איור 3B).

על מנת לחקור את האפשרות של שימוש שלנו דגם C. elegans להקרנה סמים פוטנציאליים, בדקנו השפעת התוספת של תהליך הזיקוק על התוצאה הסופית של הזיהום. אנחנו נעשה שימוש במגוון של ריכוזים שונים של פלוקונאזול ומצא כי 50 מיקרומטר נתן לנו את התוצאות המשמעותיות ביותר. תולעים נגוע אלביקנס ג ו- 50 פלוקונאזול מיקרומטר (איור 3B) חיו סטטיסטית משמעותית יותר פקדים (p < 0.01-יומן דרגה והן Breslow סטטיסטי המבחן, n = 60). זה הריכוז נקבע מדעית (ראה ההערה בסוף הפרוטוקול שלב 7, "זיהום הצלחת להגדיר"). אלה הוכחה עיקרון הניסויים הראו כי המודל נמטודות שלנו יכול לשמש להקרנה פטריות מולקולה קטנה. המודל היה למעשה פלייבק על גילוי filastatin, מולקולה קטנה עיכוב היבטים שונים של התקפה אלימה פטרייתי זה נמצא כעת בתהליך עוד מחקרים פרה24. בהתאם לכך, וזמינותו שלנו מתאימה עבור חקר את אסטרטגיות התקפה אלימה של אלביקנס ג וסוכני תרופתי.

מחקר של התגובה לארח מולדת
בשלב הבא, רצינו לחקור את ההגנות מארח הדדיים נגד פתוגנים, מאז נשמרים היבטים של זו מולדת חסינות היונקים11,35. זה ידוע כי C. elegans מייצרת ROS על שני זיהומים בקטריאליים ופטריתיים18,36,37 במסגרת מנגנון ההגנה שלה. ROS השפעה biocidal על אורגניזמים פולשים, לשחק תפקיד מרכזי במולדת חסינות. zcf15/zcf15 היפר רגישות ROS במבחנה הובילו אותנו משערים כי שלה התקפה אלימה מופחתת ב- C. elegans היה בשל יכולת מופחתת לעמוד של המחשב המארח שנוצר ROS. כדי לבדוק את ההשערה שלנו, אנחנו נקבע את היכולת של zcf15/zcf15 להרוג את התולעים פראי-סוג או תולעים עם יכולת ראייה כדי לייצר ROS. נציג אלביקנס ג מוטציה zcf15 הרגישה מינים חמצן תגובתי (איור 4A) הראה מופחתת התקפה אלימה בפראי-סוג C. elegans. C. elegans מגיב בליעה של פתוגן על ידי ייצור ROS חוץ-תאית, לומן מעיים באמצעות Ce-Duox1, אוקסידאז nadph ל מקודד על ידי ג'ין מתה על-3. במהלך הייצור ROS, תאי המעי גם להפיק תאיים נוגדי חמצון באמצעות הדף היומי-16 להגן על רקמות משלה ROS מזיק אפקטים36,38. Ce-Duox1 הוא חלבון עם תחום peroxidase N-מסוף, C-מסוף סופראוקסיד ליצירת nadph לאוקסידאז התחום, שני אתרים קלמודולין-איגוד מרכזי39. על זיהום מיקרוביאלי, חלבון זה משתמש nadph ל cytosolic לייצר ROS רעילים חוץ-תאית לומן מעיים כדי לנטרל את הזיהום. במהלך סדרה של מבחני הביוכימי במחקר 2009, ג'ייניים. et al. הראה כי ROS מיוצרים בשפע על זיהום, את מתה על-3 אובדן התפקוד באמצעות bli-3(e767) מפחיתה באופן דרמטי את היכולת של נמטודות לייצר ROS. כפי שמוצג באיור 4B, תולעים עם zcf15/zcf15 שרדה באופן משמעותי יותר מאשר סוג הפרוע או זנים המלווים (p < 0.01 בבחינה יומן-דרגה) המציין כי ZCF15 נדרש עבור התקפה אלימה. עם זאת, כאשר אנו תיגר חשוכת-ROS ג elegansbli-3(e767), השגנו קינטיקה של הרציחות שהיו דומות בין zcf15/zcf15, פראי סוג המלווים זן (איור 4C). עדות זו מציינת את zcf15/zcf15 להיכשל להרוג נמטודות אלא אם נפגעת היכולת של המחשב המארח לייצר ROS. תוצאות אלה יחדיו, מראים כי ZCF15 נדרש עבור שיתואר, כי הגן הזה כנראה מעורב של המחלה יכולתו להתנגד מארח שנוצר ROS. לפי מיטב ידיעתנו, זו הפעם הראשונה בה ZCF15 הוכח להיות מעורב פתוגניות והתנגדות ROS.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכמטי של C. elegans זיהום. C. elegans נחשפים שילוב של e. coli זן OP50 חיידק, שנמדדו על פני תקופה של 4 ימים לאחר שהגיע לבגרות עבור סימנים של זיהום התקדמות המחלה.

Figure 2
איור 2: מחלת פנוטיפים. (א) אזור Deformed אנאלי (Dar) מוצגת (מסומן בחץ) כמו נפיחות באזור הנגוע תולעים (לוח נכון) פוסט אנאלי ארבעה ימים פוסט החשיפה. התולעים בלוח השמאלי נגוע, לשמש פקד. (B) א משנה (~ 15%) של הצג תולעים נגוע נפיחות של הפות (נכון לוח, המצוין עם חץ) לעומת נגוע השליטה תולעים (החלונית הימנית) המייצג המופץ דלקת וכתוצאה מכך מוות matricidal. כל התמונות צולמו כפי שמתואר את התוצאות נציג18.

Figure 3
איור 3: אלביקנס ג - דגם C. elegans הוא לבצע מניפולציות מיקרוסקופיים, יכול להיות פרמקולוגית, גנטית מאופנן. (א) ג אלביקנס המתויגת ההצטברות RFP הזיהום פוסט יום 3 נמטודות לומן מעיים. תאי שמרים במהירות בלע מהתולעים, להצטבר לומן מעיים תקינה לחלוטין, המציין כי הם מסוגלים לשרוד ריסוק מכני של הלוע. התמונות צולמו כפי שמתואר את התוצאות נציג18. (B) קפלן-מאייר עקומות הישרדות של נמטודות תגר עם פראי-סוג אלביקנס ג, cph1/cph1efg1/efg1 מוטציה כפולה או פראי-סוג אלביקנס ג + 50 מיקרומטר של פלוקונאזול בהשוואה נגוע השליטה תולעים.

Figure 4
באיור 4. ZCF15 מחויבת למרות C. elegans שנוצר ROS. (א) ZCF15 אחראי על התנגדות פראי סוג paraquat, אשר ידוע ליצירת מינים חמצן תגובתי. פראי סוג, הסתרה או זנים המלווים היו בוגרים בתרבות נוזלי לילה, resuspended למנת יתר = 1. תרבויות היו כל מדוללת של 1:5, מצופה YPD או YPD המכיל paraquat 1 מ מ. C. elegans לייצר ROS דרך רבנות בלי-3 על מנת להתמודד עם גורמי מחלה לפלוש את לומן מעיים38. (B) קפלן-מאייר הישרדות עקומות להראות כי מחיקה ZCF15 מגביל את הריגתו של פראי-סוג התולעים. (ג) עקומת הישרדות קפלן-מאייר מראה תעריפים דומים של הישרדות בין zcf15/zcf15, פראי סוג זן המלווים כאשר חשוכת-ROS elegansbli-3(e767) ג נדבקו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתן לשנות את שיטות assaying C. elegans זיהום והישרדות לאורך כל החיים חשיפה אלביקנס ג אשר תארנו לבחון פתוגן אחר. נוזלי תרביות של חיידקים או פטריות אחר ייתכן וגם למאכל C. elegans באופן דומה. בנוסף, ייתכן לבדיקה זיהומים טורי על-ידי קודם חשיפת הזחל ל one פתוגן כמתואר ולאחר מכן להעביר את החיות על צלחת חדשה המכילה חיידק נפרד לאחר שהגיע לבגרות.

כשניצח assay הזה, חשוב לשים לב זהירה של תזמון. ראשית, כאשר השלמת הכנת ביצה כדי למסוק ביצים עבור וזמינותו, זה קריטי כדי להגביל את כמות הזמן שהביצים נחשפים אקונומיקה. משך הזמן הדרוש כדי להמיס מבוגרים בפתרון אקונומיקה כדי לשחרר את הביצים משתנה. מיד לאחר מתן הפתרון אקונומיקה, הפתרון תולעת חייב להיות התבוננו מקרוב תחת מיקרוסקופ לנתיחה. לאחר כ- 70% של התולעים יש התפורר, אז הפתרון צריך להיות centrifuged. אם הכנת ביצה אינה נותנת ביציות פעילות, להקטין את הריכוז של אקונומיקה או את משך החשיפה אקונומיקה. בהשלמת assay הזה, זה גם הכרחי כי תשומת לב ניתנת תולעים בוגרות המעביר על גבי לוחיות הרישוי לפי הצורך כדי להימנע מבלבל נושאי הלימוד עם הצאצאים שלהם. הגבלת מספר ביצים מצופה בתחילת וזמינותו ל 25-30 ביצים צריך למנוע זאת גם כן. לבסוף, העברת תולעים בוגרות על גבי לוחיות הרישוי לעתים קרובות גם מקטין את הסיכויים של תולעים מטפס על צדי הפטרי ומתים.

לנו יש מנוצל Caenorhabditis elegans כמו מחשב מארח רב-תכליתי דגם ללמוד פתוגניים או commensal קשרי גומלין בין חיידקים או חיידק, המארח שלו. המערכת שלנו יכול לשמש ככלי מחקר מיקרוביאלי או מארח-חיידק האינטראקציה ברמה תאית ומולקולרית שימוש בגישות גנטיות ואחורה, אלא גם לחקר מולקולות חדשות התערבות טיפולית. הראו צדדיות של מערכת זו על-ידי עריכת מסך גנטיות לזיהוי גנים התורמים התקפה אלימה40, אלה קשורה כושר מיקרוביאלי41, אלה לתווך מארח בתגובה חיידקים17, 18, כמו גם באמצעות המודל עבור יישומי תפוקה גבוהה עבור גילוי סמים24. הסיבה לכך היא דוגמנית טובה לשימוש על ידי סטודנטים לתואר ראשון הוא אינו צריך תשתית יקר כדי לשמור על מושבות, בהתחשב בעובדה כי בעלי חיים יכול להיות הקפאה-נשמר עבור יישומים עתידיים. בסופו של דבר, זה מספק מקום מושלם "המתווכת" מחקרים במבחנה ומודלים מאתר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו ביצע, נתמך על ידי המכון הפוליטכני וורצ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar (granulated, bacterilogical grade) Apex BioResearch Products 20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) Genesee Scientific 59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted Microscope Axiovision Zeiss
Bacto-Peptone Fisher BioReagants BP1420-500
C. elegans strain Bli-3 Caenorhabditis Genetics Center Bli-3(e767) CB767
Calcium Chloride Fisher Scientific BP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% Sigma C8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) FIsherBrand 14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) Nikon Instrument Inc.
E. coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) GraphPad Software
LB Broth (Miller's) Apex BioResearch Products 11-120
Magnesium Sulfate Fisher Scientific 10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) Falcon 353001
Potassium Phosphate monobasic Sigma P0662-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Sodium Phosphate Fisher Scientific BP332-500
Wildtype C. albicans SC5314 ATCC SC5314
Wildtype C. elegans Caenorhabditis Genetics Center N2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  2. Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44 (6), 817-829 (1986).
  3. Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature. 356 (6369), 494-499 (1992).
  4. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56 (1), 110-156 (1977).
  5. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  6. Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model. BMC Complement Altern Med. 14, 4 (2014).
  7. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity. Appl Environ Microbiol. 78 (7), 2075-2081 (2012).
  8. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
  9. Sem, X., Rhen, M. Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host. PLoS One. 7 (9), e45417 (2012).
  10. Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, e1000982 (2010).
  11. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297 (5581), 623-626 (2002).
  12. Bae, T., et al. Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12312-12317 (2004).
  13. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5 (5), 488-494 (2004).
  14. Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway. Curr Biol. 13 (1), 47-52 (2003).
  15. Kesika, P., Balamurugan, K. Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions. Biochem Biophys Acta. 1824 (12), 1449-1456 (2012).
  16. Cinar, H. N., et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (7), e11558 (2010).
  17. Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection. Virulence. 4 (1), 67-76 (2013).
  18. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryot Cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).
  19. Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds. Nat. Protoc. 3 (12), 1925-1931 (2008).
  20. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. 7 (6), e1002074 (2011).
  21. Dieterich, C., et al. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology. 148 (Pt 2), 497-506 (2002).
  22. Chen, C. G., et al. Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection. Int J Immunopathol Pharmacol. 19 (3), 561-565 (2006).
  23. Ricicova, M., et al. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology. 156 (Pt 3), 909-919 (2010).
  24. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 13594-13599 (2013).
  25. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90 (5), 939-949 (1997).
  26. Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog. 4 (2), e35 (2008).
  27. McDonough, K. A., Rodriguez, A. The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat Rev Microbiol. 10 (1), 27-38 (2011).
  28. Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator. Infect Immun. 67 (9), 4655-4660 (1999).
  29. Li, F., Palecek, S. P. EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryot Cell. 2 (6), 1266-1273 (2003).
  30. Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection. Infect Immun. 70 (2), 921-927 (2002).
  31. Korting, H. C., et al. Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium. J .Med Microbiol. 52 (Pt 8), 623-632 (2003).
  32. Chamilos, G., et al. Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J Infect Dis. 193 (7), 1014-1022 (2006).
  33. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot Cell. 10 (7), 932-944 (2011).
  34. Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunol Med Microbiol. 34 (2), 153-157 (2002).
  35. Mallo, G. V., et al. Inducible antibacterial defense system in C. elegans. Curr Biol. 12 (14), 1209-1214 (2002).
  36. Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans. Genetics. 176 (3), 1567-1577 (2007).
  37. Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infect Immun. 72 (8), 4512-4520 (2004).
  38. Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans. PLoS Pathog. 7 (12), e1002453 (2011).
  39. Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem. 284 (28), 18634-18643 (2009).
  40. Issi, L., et al. Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans. Genetics. 205 (2), 559-576 (2017).
  41. Ford, C. B., et al. The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans. Elife. 4, e00662 (2015).
  42. Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS microbiology letters. 283 (2), 129-139 (2008).
  43. Garsin, D. A., et al. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (19), 10892-10897 (2001).
  44. Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis. Infection and immunity. 71 (4), 2208-2217 (2003).
  45. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryotic cell. 8 (8), 1218-1227 (2009).

Tags

גנטיקה גיליון 128 אינטראקציות חיידקים הגורמים התקפה אלימה הפתוגן ההגנה מולדת המודל החייתי Caenorhabditis elegans
נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי <em>In Vivo</em> ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The… More

Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (128), e56487, doi:10.3791/56487 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter