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Genetics

निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस-एक बहुमुखी Vivo मॉडल में मेजबान-सूक्ष्म बातचीत का अध्ययन करने के लिए

doi: 10.3791/56487 Published: October 18, 2017

Summary

यहां, हम निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस एक बहुमुखी मेजबान मॉडल के रूप में पेश करने के लिए माइक्रोबियल संपर्क का अध्ययन ।

Abstract

हम एक मॉडल मेजबान के रूप में एक माइक्रोबियल बातचीत का अध्ययन करने के लिए Caenorhabditis एलिगेंस का उपयोग विधि प्रदर्शित करता है । रोगाणुओं आंत रोग के लिए प्राथमिक स्थान बनाने आहार के माध्यम से पेश कर रहे हैं । निमेटोड आंत संरचनात्मक और कार्यात्मक स्तनधारी आंतों की नकल है और यह औपनिवेशीकरण के सूक्ष्म अध्ययन के लिए उत्तरदायी बनाने पारदर्शी है । यहां हम बताते है कि रोगजनकों रोग और मृत्यु का कारण बन सकती है । हम बदल डाह दिखाने कि माइक्रोबियल म्यूटेंट की पहचान करने में सक्षम हैं । इसके बायोटिक तनाव को संरक्षित जंमजात प्रतिक्रिया सी. एलिगेंस मेजबान जंमजात प्रतिरक्षा बातचीत के पहलुओं की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली बनाता है । हम बताते है कि दोहरे oxidase जीन में उत्परिवर्तनों के साथ मेजबान प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का उत्पादन नहीं कर सकते है और माइक्रोबियल अपमान का विरोध करने में असमर्थ हैं । हम आगे दिखा रहा है कि यह माइक्रोबियल विकास के अवरोधकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता द्वारा प्रस्तुत अस्तित्व परख की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन । यह परख भी उपंयास रोधी एजेंटों के विकास के लिए लक्ष्य के रूप में कवक डाह कारकों को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही साथ एक को आगे को उजागर मेजबान-सूक्ष्म बातचीत का अवसर प्रदान करते हैं । इस परख के डिजाइन ही अच्छी तरह से उच्च प्रवाह पूरे जीनोम स्क्रीन को उधार देता है, जबकि भविष्य के उपयोग के लिए क्रायो-कीड़े की रक्षा करने की क्षमता यह एक लागत प्रभावी और आकर्षक पूरे पशु मॉडल के अध्ययन के लिए बनाता है ।

Introduction

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C. एलिगेंस से अधिक ५० वर्षों के लिए एक शक्तिशाली मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है । 1960 के दशक में, दक्षिण अफ्रीका के जीवविज्ञानी सिडनी ब्रेनर का उपयोग करने के लिए C. एलिगेंस का बीड़ा उठाया है ंयूरॉन विकास, वैज्ञानिकों की एक लंबी वंश के लिए जिस तरह फ़र्श का अध्ययन करने के लिए सेल और पशु जीव विज्ञान के विभिंन पहलुओं में सूत्रकृमि । इस वंश नोबेल पुरस्कार विजेताओं क्रेग मेलो और एंड्रयू आग उनके RNAi काम के लिए1, रॉबर्ट Horvitz और जॉन Sulston अंग विकास और apoptosis2,3,4, और मार्टिन Chalfie पर अपने काम के लिए शामिल ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर अपने काम के लिए5। हालांकि इस मॉडल जीव परंपरागत रूप से आणविक और विकास जीवविज्ञान का अध्ययन किया गया है, पिछले 15 वर्षों में, शोधकर्ताओं ने Pseudomonas सहित विभिन्न मानव रोगजनकों के जीव विज्ञान की जांच करने के लिए सी. एलिगेंस का उपयोग करने के लिए शुरू कर दिया है aeruginosa, Staphylococcus स्ताफ्य्लोकोच्चुस, साल्मोनेला enterica, और Serratia marcescens6,7,8,9,10. इन अध्ययनों से पता चला कि मानव-रोगज़नक़ बातचीत में शामिल तंत्र के कई सूत्रकृमि में संरक्षित कर रहे हैं, लेकिन यह भी है कि वहां कुछ प्रतिरक्षा तंत्र है कि इस मॉडल जीव11,12के लिए अद्वितीय हैं । प्रकृति में, C. एलिगेंस मिट्टी में मौजूद घूस रोगजनकों से खतरों की एक किस्म मुठभेड़ों और यह एक मजबूत चयनात्मक विकसित करने के लिए और अपनी आंतों लुमेन में एक परिष्कृत जंमजात प्रतिरक्षा प्रणाली को बनाए रखने के दबाव प्रदान की गई है । जीन और आंत्र लुमेन के संरक्षण में शामिल तंत्र के कई अत्यधिक संरक्षित तत्वों है कि भी उच्च स्तनधारी11,13में मौजूद द्वारा किया जाता है । C. एलिगेंस इसलिए साल्मोनेला enterica14, शिगेला boydii15, या Vibrio हैजा16जैसे गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल रोगजनकों का अध्ययन करने के लिए एक महान मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है ।

यहां हम एक मॉडल मेजबान के रूप में इस तरह के सी. albicansके रूप में संक्रामक एजेंटों का अध्ययन करने के लिए सी. एलिगेंस की उल्लेखनीय बहुमुखी प्रतिभा पर प्रकाश डाला । C. एलिगेंस एक मॉडल मेजबान के रूप में डाह के लिए उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है कि कम खर्चीला और समय लेने वाली एक माउस मॉडल है, जो आमतौर पर कैंडिडिआसिस४२अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है की तुलना में ।

इस अध्ययन में, हम बताते है कि इस मॉडल और assosiated अस्तित्व परख मज़बूती से संक्रमण प्रतिक्रिया करने के लिए महत्वपूर्ण मेजबान सहज प्रतिरक्षा प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, रोगज़नक़ निर्धारकों कि ड्राइव डाह, और औषधीय यौगिकों कि कर सकते हैं रोगजनन में हस्तक्षेप करते हैं । पहले वर्णित परख के लिए भिंन है, इस विधि पशु के जीवनकाल में एक रोगज़नक़ के लिए जोखिम का अध्ययन करने का एक साधन प्रदान करता है, लार्वा मंच से वयस्कता के लिए, बजाय केवल वयस्कता मौत४३,४४। संक्षेप में, हमारे सी. एलिगेंस - सी. albicans मॉडल एक बहुमुखी और शक्तिशाली उपकरण है कि न केवल आनुवंशिक आधार है कि ड्राइव संक्रमण और उन्मुक्ति का अध्ययन करने के लिए, लेकिन यह भी चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए नए यौगिकों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Protocol

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< p class = "jove_title" > 1. निमेटोड ग्रोथ मीडियम (NGM) को तैयार करना

  1. मीडिया के 1 l के लिए, 20 ग्राम आगर, २.५ ग्राम कार्बनिक नाइट्रोजन स्रोत ( जैसे , bacto-peptone) और 3 ग्राम सोडियम क्लोराइड को 2 एल कुप्पी में मिलाएं । जोड़ें ९७५ मल के बाँझ पानी.
    1. एक बाँझ हलचल बार में जोड़ें. यदि एक स्वत: मीडिया डालना, आटोक्लेव टयूबिंग और 15 मिनट के लिए मीडिया का उपयोग; मीडिया अधिक मात्रा में किया जाता है, तो अब के लिए autoclaved होना चाहिए ।
  2. प्लेट हलचल पर मीडिया सेट, और शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    1. एक बार मीडिया को छूने के लिए गर्म है (लगभग ६० & #176; ग) aseptically 1 M MgSO 4 & #9679; ज 2 O, 1 मिलीलीटर की 1m CaCl 2 , 25 मिलीलीटर की केपीओ 4 , और इथेनॉल में ०.५% कोलेस्ट्रॉल की 1 मिलीलीटर ।
    2. डालना मीडिया (हाथ से, या स्वचालित पंप द्वारा) में लामिना प्रवाह के तहत ३५ mm x 10 mm बाँझ पेट्री व्यंजन । उपयोग करने से पहले 1-2 दिनों के लिए हूड के तहत शुष्क करने की अनुमति दें ।
      नोट: संदूषण को रोकने के लिए प्लेटें 4 & #176; C पर संग्रहित करना चाहिए ।
< p class = "jove_title" > 2. एक कीड़ा उठा कर

  1. एल्यूमीनियम तार का एक १.५ cm टुकड़ा काट । ध्यान से एक पाश्चर पिपेट. की नोक में इस लंबाई के लगभग ०.५ सेमी डालें
    1. एक Bunsen बर्नर या अल्कोहल लैंप का उपयोग कर, कांच पिपेट टिप पिघल धीरे से यह लौ में घूर्णन जब तक तार सुरक्षित रूप से पिपेट का पालन किया है, पिपेट टिप के मूल आकार समझौता किए बिना ।
< p class = "jove_title" > 3. ई. कोलाई संस्कृति की तैयारी

  1. एक बाँझ पाश का उपयोग कर, लगाना के के एकल कॉलोनी ई. कोलाई OP50 में Luria शोरबा २०० मिलीलीटर । ३७ पर झटकों के साथ रात भर मशीन & #176; ग.
  2. तरल संस्कृति अगले दिन उपयोग के लिए तैयार है और 4 में संग्रहित किया जा सकता है & #176; C जब उपयोग में नहीं है ।
    नोट: ई. कोलाई तनाव, OP50, C. एलिगेंस. के लिए एक खाद्य स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है इस संस्कृति को 4 & #176; C.
  3. पर संग्रहित करते समय कई महीनों तक प्रयोग किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 4. आवश्यक ग. एलिगेंस मेंटेनेंस

  1. बीज तैयार NGM ई. कोलाई के साथ लगभग ५०-१०० & #181. प्लेट के केंद्र पर तैयार तरल संस्कृति के एल. OP50
  2. प्लेट कवर और उंहें 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर शुष्क करने की अनुमति एक बार सूखा, जगह प्लेटें ३७ & #176; सी तेजी से वृद्धि के लिए रात भर या कमरे के तापमान पर रखने के लिए, यदि धीमी वृद्धि वांछित है ।
  3. प्लेट में कीड़े डालकर या तो & #34; घ्यावेत, & #34; (see प्रोटोकॉल step 5 & #34; चंकी और उठा कीड़े & #34;), कीड़े व्यक्तिगत रूप से उठा, या सीधे प्लेट पर कीड़ा अंडे रखने (देखें प्रोटोकॉल कदम 6 & #34; एग वडा & #34;).
< p class = "jove_title" > 5. chunky और उठा कीड़े

< p class = "jove_content" > NOTE: & #34; चूंक, & #34; एक ऐसे अभ् यास को संदर्भित करता है जो C. एलिगेंस रखरखाव में सामां य है । इस NGM आगर थाली के एक वर्ग है कि कीड़े शामिल काटने शामिल है, और एक नई थाली पर इस टुकड़े को स्थानांतरित, इस प्रकार भी इस प्रक्रिया में कीड़े की एक बड़ी संख्या में स्थानांतरित । इस तरीके से संदूषण को प्लेट से भी काटा जा सकता है । जब कीड़े उठा, यह आगर की अखंडता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि कीड़े आगर में छेद में खो सकते हैं । इसके अलावा, यह लेने के लिए प्लेट को छूने से पहले शांत करने के लिए आगर पिघलने या कीड़े जलने को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है ।

  1. आदेश में जल्दी से नई प्लेटों पर कीड़े की बड़ी मात्रा में हस्तांतरण करने के लिए, एक रंग का उपयोग कर चयनित कीड़े युक्त NGM के एक टुकड़े में कटौती । कट टुकड़ा निकालें और जगह यह एक नई थाली पर OP50 के लॉन के किनारे पर नीचे का सामना ।
  2. स्थानांतरण कीड़े व्यक्तिगत रूप से प्रोटोकॉल चरण ८.२ में नीचे वर्णित के रूप में, & #34; जीवन रक्षा परख, & #34; एक कीड़ा लेने का उपयोग कर । कीड़ा उठाओ में तार लौ जब तक यह लाल है । यह लौ से निकालें और यह कुछ सेकंड के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  3. लेने पर तार का उपयोग कर, धीरे OP50 नई थाली पर हो संस्कृति के लॉन परिमार्जन, लेने पर तार को कवर ।
  4. चिपचिपा संस्कृति तार की नोक को कवर करता है कीड़े लेने की नोक से चिपके रहते हैं, इस प्रकार धीरे से चयनित कीड़े उठाओ एक स्वाइप गति का उपयोग कर ।
  5. एक बार चयनित कीड़े इकट्ठे हुए हैं, उंहें एक नई थाली पर धीरे से आगर में संस्कृति swiping द्वारा जगह है । उठाओ पर शेष संस्कृति को दूर करने के लिए लौ में तार प्लेस.
< p class = "jove_title" > 6. एग वडा

  1. लगभग 20 वयस्क जानवरों (लगभग 2-3 दिन सेने के बाद जब 20 में उगाया & #176; C) या तो खरीदना या खंड में वर्णित के रूप में प्रोटोकॉल चरण 5, & #34; chunky और उठा कीड़े, & #34; एक प्लेट पर ५० के साथ वरीयता प्राप्त & #181; एल के ई. कोलाई तनाव, OP50.
  2. अंडे इकट्ठा करने के लिए, 1-2 दिनों के बाद M9 बफर के 10 मिलीलीटर के साथ प्लेट बाढ़ । एक गिलास सीरम पिपेट, भंवर का प्रयोग और धीरे आगर प्लेट पर सामग्री आंदोलन के लिए OP50 या वयस्क जानवरों के लिए अटक अंडे जारी । सभी अंडे और वयस्कों युक्त तरल ले लीजिए ।
  3. हस्तांतरण M9 और OP50 समाधान एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में । 2 min.
  4. के लिए २,१०० x g पर 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब के केंद्रापसारक
  5. महाप्राण लगभग 9 supernatant के मिलीलीटर OP50 गोली परेशान बिना ।
  6. बाँझ पानी की 2 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड, ब्लीच के 1 मिलीलीटर, और ०.२५ मीटर NaOH.
  7. के 1 मिलीलीटर
  8. वयस्क जानवरों के बहुमत (लगभग ७० प्रतिशत) तक उलटा द्वारा धीरे मिश्रण लीजड दिखाई देते हैं; आमतौर पर, अंडे क्योंकि उनके खोल की इस छोटी ब्लीच उपचार के दौरान बरकरार रहेगा । 2 min.
  9. के लिए ९९० x g पर शंकु ट्यूब केंद्रापसारक गोली से परेशान बिना
  10. महाप्राण supernatant । M9 बफर के 10 मिलीलीटर में गोली पुनः निलंबित.
  11. ९९० एक्स जी में शंकु ट्यूब परेशान गोली के बिना 2 मिनट महाप्राण supernatant के लिए केंद्रापसारक । पुन: निलंबित गोली के साथ २०० & #181; L च्या M9 बफर.
    नोट: अंडा तैयारी एकाधिक परीक्षणों की आवश्यकता हो सकती है । अंडे नष्ट हो सकता है अगर वे भी लंबे समय के लिए ब्लीच करने के लिए उजागर कर रहे हैं । यदि अंडे नहीं हैच, या तो समाधान में ब्लीच की एकाग्रता में कमी या ब्लीच करने के लिए जोखिम की अवधि में कमी ।
< p class = "jove_title" > 7. संक्रमण प्लेट सेट अप

  1. एक बाँझ परीक्षण ट्यूब में YPD के 3-5 मिलीलीटर तिरस्कृत और लगाना Candida albicans एक बाँझ पाश का उपयोग कर एक एकल कॉलोनी के साथ यह .
    1. पर ट्यूब एक rotatory ड्रम के लिए लगभग 16-18 ज पर 30 & #176; ग.
  2. लेबल एक १.५ मिलीलीटर microfuge ट्यूब सी albicans , और एक और OP50 शामिल करने के लिए । प्रत्येक खाली ट्यूब का वजन रिकॉर्ड.
    1. Place ५०० & #181; म रात भर ग. albicans संस्कृति म ट्यूब त्यसपछि ग. albicans र १,५०० & #181; l रातोंरात OP50 संस्कृति (चरण ३.१ से) के एल ट्यूब में लेबल OP50.
    2. परेशान गोली.
    3. के बिना १६,१०० x जी महाप्राण supernatant पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक
    4. पुन: एक गोली ५०० के साथ निलंबित & #181; बाँझ पानी के एल. १६,१०० x g.
    5. पर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक गोली से परेशान बिना
    6. महाप्राण supernatant । microfuge ट्यूबों के अंतिम वजन रिकॉर्ड ।
    7. अंतिम वजन से microfuge ट्यूबों के प्रारंभिक वजन घटाकर प्रत्येक गोली के वजन निर्धारित करते हैं ।
  3. बाँझ पानी का उपयोग, पुन: निलंबित सी albicans गोली करने के लिए 10 मिलीग्राम/एमएल, और OP50 गोली २०० मिलीग्राम/ एक मास्टर संक्रमण मिश्रण बनाने के द्वारा 10 & #181; l के एक ५० मिलीग्राम/एमएल Streptomycin के समाधान, २.५ & #181; l के OP50 संस्कृति, ०.५ & #181; l के ग. albicans संस्कृति, र 7 & #181; l के बाँझो पानी. कंट्रोल प्लेट्स के लिए
    1. , ग. albicans कल्चर की मात्रा को बाँझ पानी के साथ बदलकर मास्टर मिक्स बना लें. बीज 20 & #181; संक्रमण मिश्रण या OP50 नियंत्रण समाधान NGM प्लेटों के केंद्र पर एक micropipette.
      का उपयोग कर के एल नोट: लगभग १०० कीड़े विश्लेषण के दौरान सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं । यह परख आम तौर पर तपसिल में चला जाता है । इस प्रकार, एक 3.2 x संक्रमण मिश्रण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक 3.2 x नियंत्रण समाधान किया जाता है । ये घोला जा सकता है कि एक पूर्ण 20 & #181; L प्रत्येक प्लेट पर वरीयता प्राप्त है, त्रुटि के लिए कमरे की अनुमति सुनिश्चित करने के लिए मूल 3x से थोड़ा अधिक किया जाता है । इस मास्टर मिश्रण बनाया है, क्योंकि कृमि के ग्रसनी ग. albicans का उपभोग करने के लिए प्रारंभिक लार्वा चरणों (L1-L3) के दौरान बहुत छोटा है । इस तरह के fluconazole के रूप में औषधीय एजेंटों के लिए जोखिम के लिए (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा बी ), एजेंट संक्रमण मिश्रण करने के लिए शुरू की है. एजेंट की एकाग्रता empirically निर्धारित है । उदाहरण के लिए, < सुदृढ वर्ग में = "xfig" > चित्र 3 बी , ५० & #181; M Fluconazole का प्रतिनिधित्व किया है, तथापि 0, १२.५, 25, ५० और १०० & #181; M Fluconazole भी इसी प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए परीक्षण किए गए.
< p class = "jove_title" > 8. विकृत गुदा क्षेत्र का विश्लेषण (dar) Phenotype और अस्तित्व परख

  1. कल्पना डार Phenotype
    नोट: डार सबसे अच्छा L3 चरण और परे में visualized है । डार कृमि के बाद के क्षेत्र में एक छोटे से दखल के रूप में प्रस्तुत (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ), जो समय के साथ और अधिक प्रमुख हो जाता है.
    1. पुष्टि अगर एक जानवर जल्दी से विच्छेदन माइक्रोस्कोप के मंच पर थाली दोहन द्वारा डार है; डार के बिना जानवरों को पीछे की ओर तुरंत कदम होगा, जबकि डार के साथ जानवरों या तो उनकी दिशा रिवर्स करने के लिए दोहन की दोहराया दौर की जरूरत होगी, या वे ऐसा बिल्कुल नहीं करेंगे ।
  2. अस्तित्व परख
    1. पूरा अंडा तैयारी के रूप में पहले से वर्णित प्रोटोकॉल चरण 6, & #34; एग वडा & #34;. विच्छेदन गुंजाइश के तहत अंडे की गणना, और M9 के साथ अंडा समाधान पतला जब तक लगभग 5-6 स्वस्थ अंडे के प्रति एक एकाग्रता & #181; L हासिल किया है. एक पिपेट का प्रयोग, औषधालय 20 & #181; L नमूना तैयार NGM प्लेट पर लगभग 30 अंडे युक्त, बैक्टीरियल संस्कृति और प्लेट के पक्ष के बीच क्षेत्र में (अंडे और कीड़ा खाना, OP50, दो अलग स्थानों में हैं).
    2. मशीन पर 20 & #176; ग के लिए ४८ ज. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, प्रत्येक प्लेट पर जीवित और मृत वयस्क कीड़े की संख्या, साथ ही डार के साथ कीड़े की संख्या गिनती । डार.
    3. के साथ प्रतिशत रिकॉर्ड
    4. एक जानवर मर अगर यह एक एल्यूमीनियम तार से सिर पर टेप या थाली पर दोहन जा रहा है का जवाब नहीं है पर विचार करें ।
    5. हर दूसरे दिन, स्थानांतरण शेष वयस्क कीड़े के रूप में प्रोटोकॉल चरण 5 में वर्णित उठा कर, & #34; chunky और उठा कीड़े, & #34; एक नए संक्रमण या नियंत्रण प्लेट पर. इस बिंदु पर, यदि आवश्यक हो, जीना, मर चुका है, और लापता कीड़े प्रत्येक दिन की संख्या पर नज़र रखने के द्वारा एक अस्तित्व परख प्रदर्शन ।
      नोट: यह परख दो सप्ताह के लिए चला सकते हैं, अंडे की तैयारी के साथ शुरुआत । इसके अलावा, अंडा समाधान बैक्टीरियल संस्कृति पर वितरित नहीं किया जाना चाहिए, के रूप में समाधान ब्लीच जो OP50 मार सकता है के निशान शामिल हो सकते हैं । समाधान भी थाली के किनारे से लगभग ०.५ सेमी दूर तिरस्कृत किया जाना चाहिए, के रूप में अंडे थाली के पक्षों और आगर के बीच में फंस सकता है । इसके अतिरिक्त, कीड़े के तेजी से प्रसार के कारण, नई प्लेटों पर वयस्कों स्थानांतरित करने के लिए उन्हें अपनी संतति से अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  3. विश्लेषण अस्तित्व
    1. जीवन रक्षा वक्र विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग परिणामों का विश्लेषण (सामग्री की सूची को देखें) ।
    2. Grehan-Breslow-Wilcoxon विधि का उपयोग कर जीवन रक्षा curves की तुलना (यह सोचते है कि जल्दी अस्तित्व समय से डेटा बाद में समय से अधिक सटीक रहे हैं, वजन तदनुसार डेटा) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Logrank सांख्यिकीय उपकरण < सुप वर्ग = "xref" > ४५ .
      नोट: उदाहरण के लिए, < सशक्त वर्ग में = "xfig" > चित्रा 4B -c , उत्परिवर्ती c. albicans के साथ इलाज किया कीड़े का अस्तित्व isogenic जंगली के साथ इलाज उन लोगों की तुलना में है-प्रकार नियंत्रण या complementarystrains.

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Representative Results

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एक रोगजनन परख (चित्रा 1) सी. albicans और सी. एलिगेंस का उपयोग कर पहले हमारे प्रयोगशाला17,18 और अंय प्रयोगशालाओं19,20द्वारा वर्णित किया गया है । हम सी. एलिगेंस का उपयोग करने के लिए c. albicans डाह दिखा रहा है कि सी. albicans कोशिकाओं को जल्दी कीड़े द्वारा किया जाता है और आंतों लुमेन में जमा के कारण धीमी गतिवान, विकृत गुदा का प्रयोग की सुविधा का प्रदर्शन क्षेत्र (Dar) (चित्र 2a), योनी की सूजन (चित्रा 2 बी), आंत की नजरबंदी (आंकड़ा3 ए), और घातकता (चित्रा ३, चित्रा ४). हम भी स्वास्थ्य के एक मात्रात्मक उपाय के रूप में संक्रमित कीड़े के जीवन काल को मापने । उदाहरण के लिए, c. एलिगेंस संक्रमित नियंत्रण के लिए 20-22 की तुलना में c. albicans live 10-12 दिन । सी. एलिगेंस में सी. albicans के साथ संक्रमित डबल नॉक आउट उत्परिवर्ती, efg1/efg1 cph1/cph1, जो दो प्रमुख डाह कारकों माउस में संक्रमण के लिए आवश्यक हैं, चूहों और मानव उपकला मॉडल21, 23, सूत्रकृमि नियंत्रण (आंकड़ा 3 बी) की तुलना में काफी लंबे समय तक बच । इन प्रयोगों का सुझाव है कि कुछ सबक हम C. albicans डाह के बारे में इस सरल मॉडल में जानने के उच्च स्तनधारी और इसके विपरीत में मांय रह सकता है ।

हम यह भी बताते है कि निमेटोड मॉडल प्रणाली औषधीय संग्राहक (चित्र बी) किया जा सकता है । fluconazole की उपस्थिति में, सबसे अधिक निर्धारित रोधी दवा, कीड़े के साथ चुनौती दी सी. albicans काफी लंबे समय से नियंत्रण से बच । सिद्धांत प्रयोग का यह प्रमाण पता चलता है कि निमेटोड मॉडल का इस्तेमाल छोटे अणु परखने के लिए किया जा सकता है. दरअसल, हमारे सी एलिगेंस मॉडल filastatin, कवक डाह के विभिंन पहलुओं को बाधित एक छोटे अणु24की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी ।

रोग phenotypes और सूक्ष्म विश्लेषण के C. एलिगेंस संक्रमण
सी. एलिगेंस छह दिनों की अवधि में सी. albicans के संपर्क में थे और संक्रमण, रोग की प्रगति, और मौत के लक्षण के लिए मनाया । डार phenotype अस्तित्व परख के 4 दिन से सबसे अधिक दिखाई दे रहा है, के रूप में एक फैला हुआ गुदा क्षेत्र है कि संक्रमित जानवर (चित्रा 2a) में दिखाई नहीं है द्वारा उल्लेख किया । C. albicans द्वारा संक्रमित कीड़े भी योनी क्षेत्र में सूजन प्रदर्शित करने के लिए जाना जाता है (चित्रा बी) । दोनों ही मामलों में कीड़ा इस मुकाम तक पहुंचने के बाद संक्रमण को साफ नहीं कर पा रहा है । आदेश में आंत्र लुमेन में सी. albicans की औपनिवेशीकरण कल्पना करने के लिए, कीड़े तंग आ गया जंगली प्रकार सी. albicans आरएफपी, जो औपनिवेशीकरण के क्षेत्रों के कारण fluoresce लाल (चित्रा 3) के साथ टैग की गईं । आदेश में इन छवियों का उत्पादन करने के लिए, कीड़े एक 2% agarose ०.०१ एम सोडियम azide युक्त पैड पर anesthetized थे । कीड़े या तो वंय प्रकार सी. albicans या आरएफपी-टैग सी. albicans, और M9 पैड पर 5 µ एम agarose बफर में स्थानांतरित करने के लिए सामने आ रहे थे । agarose पैड तो एक coverslip के साथ कवर किया गया था । कीड़े फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप क्षमताओं के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग 200X और 400X आवर्धन पर देखा गया । छवियां विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (Nomarski) और epifluorescence प्रकाशिकी के तहत बनाए गए थे । फ्लोरोसेंट छवियों सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बढ़ाया गया (चित्र 3ए) । समय श्रृंखला संक्रमित कीड़े की माइक्रोग्राफ निर्धारित किया है कि सी albicans परख17के तीसरे दिन आंतों लुमेन बृहदांत्र । संक्रमित कीड़े संक्रमित नियंत्रण में मनाया से अधिक गंभीर आंत्र तनाव दिखाई दिया ।

आनुवंशिक और औषधीय उपकरण संक्रमण का अध्ययन करने के लिए
अगले, हम आनुवंशिक और औषधीय मॉडुलन का उपयोग कर मॉडल का परीक्षण किया. हम भी पहले प्रलेखित डाह कारकों है कि सी albicans25 के hyphal संक्रमण को विनियमित और चूहों और सूत्रकृमि20,26 के vivo संक्रमण में महत्वपूर्ण होने के लिए दिखाया गया है परीक्षण किया . हम कीड़े की क्षमता का परीक्षण करने के लिए सी. albicans efg1/efg1 cph1/cph1 डबल उत्परिवर्ती की वजह से संक्रमण बच Efg1 एक उच्च प्रतिलेखन कारक है और चक्रीय AMP/प्रोटीन कळेनासे एक (PKA) चयापचय मार्ग का एक आवश्यक घटक संरक्षित है । C. albicans में इस मार्ग hyphal morphogenesis27, सफेद-अपारदर्शी स्विचन28, और प्रमुख डाह कारकों की एक शस्त्रागार नियंत्रित करता है । इन डाह कारकों में शामिल है Hwp1 और Hwp2, दो खमीर-विशिष्ट कोशिका दीवार में शामिल प्रोटीन आसंजन और फिल्म गठन, Eap1, एक कोशिका दीवार adhesin में शामिल मानव उपकला कोशिकाओं के लिए बाध्यकारी29, और Sap5, एक hydrolytic एंजाइम में शामिल उपकला ऊतक आक्रमण30. Cph1 एक प्रतिलेखन कारक है कि संभोग, रेशा, और फिल्म गठन सहित कई चयापचय प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है और हानिकारक उपकला कोशिकाओं को31 और मानव पुनर्निर्माण उपकला में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है21 . या तो इन जीनों के विघटन डाह और दोनों के एक साथ विघटन पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है cph1/cph1efg1/efg1 परिणामों में नाटकीय डाह कमी में चूहों सहित विभिंन पशु मॉडलों में25, Drosophila ३२, zebrafish३३,३४ व मोठ३४. cph1/cph1efg1/efg1 डबल उत्परिवर्ती सी. albicans समुदाय द्वारा परिभाषा द्वारा avirulent तनाव और उपंयास मॉडल सिस्टम के सत्यापन के लिए सोने के मानक के रूप में माना जाता है । efg1Δ और cph1Δ एकल म्यूटेंट कम डार दिखाया (~ 10% और ~ ५०%, क्रमशः) cognate जंगली प्रकार के साथ तुलना में है, जबकि efg1Δ cph1Δ डबल उत्परिवर्ती डार की प्रतिक्रिया17में वृद्धि करने में विफल रहा । ये परिणाम चूहों में डाह के पैटर्न दोहराऊंगा, जहां cph1 ∆ उत्परिवर्ती थोड़ा तनु है, efg1 ∆ उत्परिवर्ती एसआई हैgnificantly तनु, और डबल उत्परिवर्ती पूरी तरह से25avirulent है । कीड़े cph1/cph1 efg1/efg1C. albicans डबल उत्परिवर्ती के साथ संक्रमित रहते थे सांख्यिकीय काफी लंबे समय से नियंत्रण (p & #60; ०.०१ दोनों लॉग रैंक और Breslow सांख्यिकीय परीक्षण के लिए, n = 60) सुझाव है कि इन दोनों जीनों के लिए आवश्यक है सी । albicans डाह के खिलाफ सी. एलिगेंस (चित्र बी).

आदेश में संभावित दवा स्क्रीनिंग के लिए हमारे सी. एलिगेंस मॉडल का उपयोग करने की संभावना का पता लगाने के लिए, हम संक्रमण के अंतिम परिणाम पर fluconazole के अलावा के प्रभाव का परीक्षण किया । हम fluconazole के विभिंन सांद्रता की एक किस्म का इस्तेमाल किया और पाया कि ५० µ एम हमें सबसे महत्वपूर्ण परिणाम दिया । C. albicans और ५० µ m fluconazole (आंकड़ा बी) से संक्रमित वर्म्स सांख्यिकीय रूप से काफी लंबे समय से नियंत्रण (p & #60; ०.०१ दोनों लॉग रैंक और Breslow सांख्यिकीय परीक्षण, n = 60) में रहते थे । यह एकाग्रता empirically निर्धारित किया गया था (प्रोटोकॉल चरण 7 के अंत में नोट देखें, "संक्रमण प्लेट सेट अप"). सिद्धांत प्रयोगों के इन सबूतों से पता चला कि हमारे निमेटोड मॉडल का इस्तेमाल छोटे अणु रोधी स्क्रीनिंग के लिए किया जा सकता है. मॉडल वास्तव में filastatin, कवक डाह के विभिंन पहलुओं है कि वर्तमान में आगे के लिए नैदानिक अध्ययन के दौर से गुजर रहा है एक छोटे अणु बाधा की खोज में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई24। तदनुसार, हमारे परख सी albicans और औषधीय एजेंटों की डाह रणनीतियों की खोज के लिए उपयुक्त है ।

जन्मजात मेजबान प्रतिक्रिया का अध्ययन
अगले, हम रोगज़नक़ों के खिलाफ पारस्परिक मेजबान सुरक्षा का अध्ययन करना चाहता था, इस जंमजात प्रतिरक्षा के पहलुओं के बाद से स्तनधारी11,३५में संरक्षित कर रहे हैं । यह अच्छी तरह से ज्ञात है कि C. एलिगेंस अपने रक्षा तंत्र के भाग के रूप में18,३६,३७ जीवाणु और फफूंद संक्रमणों पर ROS पैदा करता है । ROS जीवों पर आक्रमण और जन्मजात उन्मुक्ति में एक प्रमुख भूमिका निभाने पर एक biocidal प्रभाव है । zcf15/zcf15 हाइपर संवेदनशीलता ROS करने के लिए इन विट्रो हमारे नेतृत्व में परिकल्पना है कि अपने सी डाह में कम एलिगेंस एक कम करने के लिए मेजबान के उत्पंन ROS झेलने की क्षमता के कारण था । हमारी परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हम एक बिगड़ा ROS उत्पादन करने की क्षमता के साथ या तो जंगली प्रकार के कीड़े या कीड़े को मारने के लिए zcf15/zcf15 की क्षमता निर्धारित किया है । प्रतिनिधि C. albicans उत्परिवर्ती zcf15 कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के प्रति संवेदनशील है (चित्रा 4a) जंगली में कम डाह-type C. एलिगेंसदिखाया । C. एलिगेंस के माध्यम से आंत्र लुमेन में extracellular ROS उत्पादन द्वारा रोगज़नक़ की घूस का जवाब-Duox1, एक NADPH जीन oxidase-3द्वारा कोडित bli । ROS उत्पादन के दौरान, आंतों की कोशिकाओं को भी डीएएफ-16 के माध्यम से intracellular antioxidants उत्पादन ROS हानिकारक प्रभाव३६,३८से अपने स्वयं के ऊतकों की रक्षा करने के लिए । Ce-Duox1 एक एन के साथ एक प्रोटीन-टर्मिनल peroxidase डोमेन, एक सी-टर्मिनल सुपरऑक्साइड-NADPH-oxidase डोमेन और दो केंद्रीय calmodulin-बाइंडिंग साइटों३९पैदा है । माइक्रोबियल संक्रमण पर, इस प्रोटीन cytosolic NADPH आंत्र लुमेन में extracellular विषाक्त ROS उत्पंन करने के लिए संक्रमण प्रतिक्रिया का उपयोग करता है । एक २००९ अध्ययन में जैव रासायनिक परख की एक श्रृंखला के दौरान, जैन एट अल । पता चला है कि ROS प्रचुर मात्रा में खमीर संक्रमण पर उत्पादित कर रहे है और bli-3 bli के माध्यम से समारोह के नुकसान-3 (e767) नाटकीय रूप से सूत्रकृमि उत्पादन ROS की क्षमता कम कर देता है । के रूप में चित्रा 4Bमें दिखाया गया है, कीड़े zcf15/zcf15 के साथ चुनौती दी काफी लंबे जंगली प्रकार या पूरक उपभेदों से बच (p & #60; ०.०१ लॉग रैंक परीक्षण द्वारा) यह दर्शाता है कि zcf15 डाह के लिए आवश्यक है । हालांकि, जब हम ROS की कमी सी. elegansbli-3 (e767) को चुनौती दी, हम हत्याओं कि zcf15/zcf15, जंगली प्रकार और पूरित तनाव (आंकड़ा 4c) के बीच तुलनीय थे की कैनेटीक्स प्राप्त की । यह सबूत इंगित करता है कि zcf15/zcf15 सूत्रकृमि को मारने में विफल जब तक मेजबान ROS उत्पादन करने की क्षमता से समझौता किया है । एक साथ लिया, इन परिणामों का सुझाव है कि ZCF15 पूर्ण डाह के लिए आवश्यक है और है कि इस जीन की संभावना है रोगज़नक़ ROS उत्पंन प्रतिरोध करने की क्षमता में शामिल है । हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, यह पहली बार है कि ZCF15 को pathogenicity और ROS प्रतिरोध में शामिल किया गया है दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्र 1: C. एलिगेंस संक्रमण का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । सी. एलिगेंस ई. कोलाई तनाव OP50 और एक रोगज़नक़ का मिश्रण करने के लिए उजागर कर रहे है और संक्रमण और रोग की प्रगति के लक्षण के लिए वयस्कता तक पहुंचने के बाद 4 दिनों की अवधि में मनाया ।

Figure 2
चित्र 2: रोग phenotypes । () विकृत गुदा क्षेत्र (डार) दिखाई है (एक तीर के साथ संकेत) के रूप में संक्रमित कीड़े (सही पैनल) चार दिनों के बाद जोखिम के पद गुदा क्षेत्र में सूजन । बाएं पैनल पर कीड़े संक्रमित हैं और एक नियंत्रण के रूप में सेवा करते हैं । () एक सबसेट (~ 15%) संक्रमित कीड़े की योनी की सूजन दिखाने के (सही पैनल, एक तीर के साथ संकेत) unसंक्रमित नियंत्रण कीड़े की तुलना में (बाएं पैनल) है कि प्रसार matricidal मौत में जिसके परिणामस्वरूप संक्रमण का प्रतिनिधित्व करता है । सभी छवियों प्रतिनिधि परिणाम18में वर्णित के रूप में लिया गया था ।

Figure 3
चित्र 3: c. albicans - c. एलिगेंस मॉडल सूक्ष्म हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी है, और औषधीय और आनुवंशिक रूप से संग्राहक किया जा सकता है । (A) C. albicans निमेटोड आंत्र लुमेन दिन 3 पोस्ट संक्रमण में आरएफपी संचय के साथ टैग । खमीर कोशिकाओं को जल्दी से कीड़े द्वारा किया जाता है और आंतों लुमेन में संचित पूरी तरह से बरकरार है, यह दर्शाता है कि वे ग्रसनी के यांत्रिक कुचल जीवित रहने में सक्षम हैं । चित्र प्रतिनिधि परिणाम18में वर्णित के रूप में लिया गया । () कापलान-Meier अस्तित्व घटता सूत्रकृमि के साथ चुनौती दी वंय-प्रकार c. albicans, cph1/cph1efg1/efg1 डबल उत्परिवर्ती या जंगली-प्रकार सी. albicans + ५० µ के एम संक्रमित नियंत्रण कीड़े की तुलना में fluconazole ।

Figure 4
चित्र 4. ZCF15 को झेलने के लिए सी. एलिगेंस जनित ROS की आवश्यकता होती है. () ZCF15 paraquat, जो प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों उत्पन्न करने के लिए जाना जाता है के लिए जंगली प्रकार के प्रतिरोध के लिए जिंमेदार है । जंगली प्रकार, पीटा या पूरक उपभेदों तरल संस्कृति में रातोंरात बड़े हो गए थे और आयुध डिपो के लिए reसस्पैंड = 1 । संस्कृतियों एक पतला 1:5 और YPD या 1 मिमी paraquat युक्त YPD पर चढ़ाया गया । C. एलिगेंस bli-3 के माध्यम से ROS का उत्पादन रोगज़नक़ों कि आंतों लुमेन३८आक्रमण का मुकाबला करने के लिए । () कापलान-Meier अस्तित्व घटता दिखा कि ZCF15 हटाने सीमा जंगली प्रकार के कीड़े की हत्या । () कापलान-Meier अस्तित्व वक्र zcf15/zcf15, जंगली प्रकार के बीच अस्तित्व के समान दरों से पता चलता है, और पूरक तनाव जब ROS की कमी सी. elegansbli-3 (e767) संक्रमित थे ।

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Discussion

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सी. एलिगेंस संक्रमण और जीवन भर जोखिम पर सी. albicans है कि हम वर्णित है एक और रोगज़नक़ परीक्षण संशोधित किया जा सकता है के लिए अस्तित्व परख के लिए तरीके । एक और बैक्टीरिया या कवक के तरल संस्कृतियों किया जा सकता है और एक समान तरीके से C. एलिगेंस को खिलाया । इसके अतिरिक्त, सीरियल संक्रमण पहले एक रोगज़नक़ के लिए लार्वा को उजागर द्वारा परख किया जा सकता है के रूप में वर्णित है, और फिर एक नई थाली पर पशुओं के स्थानांतरण वयस्कता तक पहुंचने के बाद एक अलग रोगज़नक़ युक्त ।

जबकि इस परख का आयोजन, यह समय के लिए सावधान ध्यान देना जरूरी है । सबसे पहले, जब अंडे की तैयारी को पूरा करने के क्रम में परख के लिए अंडे फसल, यह समय अंडे ब्लीच करने के लिए उजागर कर रहे है की मात्रा को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है । अंडे जारी करने के लिए ब्लीच समाधान में वयस्कों को भंग करने के लिए आवश्यक समय की मात्रा बदलता है । तुरंत ब्लीच समाधान प्रशासन के बाद, कीड़ा समाधान बारीकी से एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे देखा जाना चाहिए । एक बार लगभग ७०% कीड़े की महत्त्वाकांक्षा है, तो समाधान केंद्रापसारक होना चाहिए । यदि अंडा तैयारी व्यवहार्य अंडे उपज नहीं है, या तो ब्लीच की एकाग्रता या ब्लीच करने के लिए जोखिम की अवधि कम । इस परख को पूरा करने में, यह भी महत्वपूर्ण है कि ध्यान के रूप में नई प्लेटों पर वयस्क कीड़े स्थानांतरित करने के लिए अपनी संतान के साथ भ्रमित अध्ययन विषयों से बचने की जरूरत दी है । 25-30 अंडे के लिए परख के शुरू में चढ़ाया अंडे की संख्या सीमित इस रूप में अच्छी तरह से रोकने चाहिए । अंत में, नई प्लेटों पर वयस्क कीड़े स्थानांतरित अक्सर भी कीड़े की संभावना को कम कर पेट्री पकवान और मरने के पक्ष रेंगने ।

हम रोगाणुओं या एक सूक्ष्म और उसके मेजबान के बीच रोगजनक या खानेवाला संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक बहुमुखी मॉडल मेजबान के रूप में Caenorhabditis एलिगेंस का उपयोग किया है । हमारी प्रणाली के लिए एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है माइक्रोबियल या मेजबान सूक्ष्म संपर्क सेलुलर और आणविक स्तर पर आगे और रिवर्स आनुवंशिक दृष्टिकोण का उपयोग लेकिन यह भी चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए नए अणुओं की खोज के लिए । हम एक आनुवंशिक स्क्रीन आयोजित करने के लिए जीन की पहचान करने के लिए कि डाह४०, उन माइक्रोबियल स्वास्थ्य४१, उन है कि मध्यस्थता मेजबान प्रतिक्रिया करने के लिए17से जुड़े लोगों को पहचानने के लिए इस प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन किया है, 18, के रूप में अच्छी तरह से दवा की खोज के लिए उच्च प्रवाह अनुप्रयोगों के लिए मॉडल का उपयोग24 यह स्नातक छात्रों द्वारा उपयोग के लिए एक अच्छा मॉडल है क्योंकि यह महंगी बुनियादी सुविधाओं के लिए कालोनियों को बनाए रखने की जरूरत नहीं है, पर विचार है कि जानवरों क्रायो-भविष्य अनुप्रयोगों के लिए संरक्षित किया जा सकता है । अंत में, यह एक परिपूर्ण प्रदान करता है "के बीच जाओ" के लिए इन विट्रो अध्ययन और murine मॉडल ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम पर प्रदर्शन किया और Worcester पॉलिटेक्निक संस्थान द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar (granulated, bacterilogical grade) Apex BioResearch Products 20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) Genesee Scientific 59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted Microscope Axiovision Zeiss
Bacto-Peptone Fisher BioReagants BP1420-500
C. elegans strain Bli-3 Caenorhabditis Genetics Center Bli-3(e767) CB767
Calcium Chloride Fisher Scientific BP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% Sigma C8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) FIsherBrand 14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) Nikon Instrument Inc.
E. coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) GraphPad Software
LB Broth (Miller's) Apex BioResearch Products 11-120
Magnesium Sulfate Fisher Scientific 10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) Falcon 353001
Potassium Phosphate monobasic Sigma P0662-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Sodium Phosphate Fisher Scientific BP332-500
Wildtype C. albicans SC5314 ATCC SC5314
Wildtype C. elegans Caenorhabditis Genetics Center N2

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निमेटोड Caenorhabditis एलिगेंस-एक बहुमुखी <em>Vivo मॉडल में</em> मेजबान-सूक्ष्म बातचीत का अध्ययन करने के लिए
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Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (128), e56487, doi:10.3791/56487 (2017).More

Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (128), e56487, doi:10.3791/56487 (2017).

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