Summary
Qui, presentiamo il nematode Caenorhabditis elegans come un modello versatile host per studiare l'interazione microbica.
Abstract
Dimostriamo un metodo utilizzando Caenorhabditis elegans come un host di modello per studiare l'interazione microbica. I microbi vengono introdotti attraverso la dieta rendendo l'intestino il luogo primario per la malattia. L'intestino del nematode strutturalmente e funzionalmente imita gli intestini dei mammiferi ed è trasparente che lo rende suscettibile di uno studio al microscopio della colonizzazione. Qui vi mostriamo che gli agenti patogeni possono causare la malattia e la morte. Siamo in grado di identificare microbiche mutanti che mostrano alterata virulenza. Sua risposta innata conservata a stress biotici rende c. elegans un eccellente sistema per sondare le sfaccettature delle interazioni immune innata ospite. Indichiamo che padroni di casa con le mutazioni nel gene raddoppiano ossidasi non può produrre le specie reattive dell'ossigeno e sono in grado di resistere insulto microbico. Noi dimostrare ulteriormente la versatilità del dosaggio sopravvivenza presentato mostrando che può essere utilizzato per studiare gli effetti degli inibitori della crescita microbica. Questo dosaggio può anche essere usato per scoprire i fattori di virulenza fungine come bersagli per lo sviluppo di nuovi agenti antifungini, nonché a fornire l'opportunità di scoprire ulteriori interazioni ospite-microbo. Il design di questo test si presta bene a throughput elevato schermi intero genoma, mentre la possibilità di crioconservare worm per un utilizzo futuro lo rende un modello animale intero conveniente e attraente per studiare.
Introduction
C. elegans è stato utilizzato come organismo modello potente per più di 50 anni. Nel 1960, biologo sudafricano Sydney Brenner ha sperimentato l'uso di c. elegans per studiare lo sviluppo neuronale, aprendo la strada a una lunga stirpe di scienziati per studiare vari aspetti della biologia delle cellule e animali nei nematodi. Questo lignaggio include vincitori del premio Nobel Craig Mello e Andrew Fire per il loro lavoro di RNAi1, Robert Horvitz e John Sulston per il loro lavoro per lo sviluppo dell'organo e apoptosi2,3,4e Martin Chalfie per il suo lavoro sulla proteina fluorescente verde5. Anche se questo organismo di modello è stato tradizionalmente usato per studiare la biologia molecolare e dello sviluppo, negli ultimi 15 anni, i ricercatori hanno cominciato ad usare c. elegans per studiare la biologia di vari agenti patogeni umani, tra cui Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericae Serratia marcescens6,7,8,9,10. Questi studi hanno rivelato che molti dei meccanismi coinvolti nell'interazione umano-patogeno sono conservati in nematodi, ma anche che ci sono alcuni meccanismi di immunità che sono unici per questo modello organismo11,12. In natura, c. elegans incontra una varietà di minacce da ingerito agenti patogeni presenti nel terreno e questo ha fornito una forte pressione selettiva per evolvere e mantenere un sofisticato sistema immunitario innato nel suo lume intestinale. Molti dei geni e meccanismi coinvolti nella protezione del lume intestinale sono orchestrati da elementi altamente conservata che esistono anche in più alti mammiferi11,13. C. elegans rappresenta quindi un ottimo modello per studiare gli agenti patogeni gastrointestinali come Salmonella enterica14, Shigella boydii15o vibrione del colera16.
Qui si evidenzia la notevole versatilità di c. elegans come un host di modello per lo studio di agenti infettivi quali c. albicans. C. elegans come un host di modello consente di screening su vasta scala per la virulenza che è meno costoso e che richiede tempo che un modello del topo, che è comunemente usato per studiare la candidosi42.
In questo studio, mostriamo che questo modello e l'analisi di sopravvivenza manuale può essere utilizzati in modo affidabile per lo studio di host innata gli effettori immunitari importanti per contrastare le infezioni, fattori determinanti di agente patogeno che guidano la virulenza, e composti farmacologici che possono intervenire nella patogenesi. Dissimile da saggi descritti in precedenza, questo metodo fornisce un mezzo per studiare l'esposizione ad un agente patogeno per tutta la durata dell'animale, dalla fase larvale di età adulta, piuttosto che solo nell'età adulta a morte43,44. In sintesi, il nostro c. elegans - modello c. albicans è uno strumento potente e versatile che può essere utilizzato non solo per studiare le basi genetiche che guidano l'infezione e l'immunità, ma anche di identificare nuovi composti per intervento terapeutico.
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Protocol
1. preparazione del Nematode crescita medio (NGM)
- per 1 L di media, unire 20 g di agar, fonte di azoto organico 2,5 g (ad es., bacto-peptone) e 3 g di cloruro di sodio in un pallone da 2 L. Aggiungere 975 mL di acqua sterile.
- Aggiungi in un ancoretta sterile. Se si utilizza un versatore automatico dei supporti, la tubazione di autoclave e la media per 15 min; media dovrebbe essere sterilizzato nell'autoclave per più se viene effettuato un volume più alto.
- Impostare media sulla piastra di mescolare e lasciare per raffreddare.
- Una volta media è calda al tatto in modo asettico (circa 60 ° C) aggiungere 1 mL di 1 M MgSO 4 ● H 2 O, 1 mL di 1 M CaCl 2, 25 mL di KPO 4 e 1 mL di colesterolo di 0,5% in etanolo.
- Versare media (a mano, o di pompa automatica) sotto flusso laminare in 35 x 10 mm Petri sterili. Lasciare per asciugare sotto cappa per 1-2 giorni prima dell'uso.
Nota: Piastre devono essere conservate a 4 ° C per evitare la contaminazione.
2. Facendo un Worm Pick
- tagliare un pezzo di filo di alluminio 1,5 cm. Inserire la punta di una pipetta di Pasteur attentamente circa 0,5 cm di questa lunghezza.
- Utilizza un bruciatore di Bunsen o lampada dell'alcool, sciogliere la punta della pipetta di vetro ruotandolo lentamente nella fiamma fino a quando il filo è rispettato in modo sicuro la pipetta, senza compromettere la forma originale della punta della pipetta.
3. Preparazione della cultura di e. coli
- con un'ansa sterile, inoculare singola colonia di e. coli ceppo OP50 in 200 mL di brodo di Luria. Incubare per una notte con agitazione a 37 ° C.
- La coltura liquida è pronta per l'uso il giorno seguente e possono essere conservata a 4 ° C quando non in uso.
Nota: Il ceppo di e. coli, OP50, viene utilizzato come una fonte di cibo per elegans del c. Questa cultura può essere utilizzata per fino a diversi mesi se conservato a 4 ° C.
4. Essenziale di c. elegans manutenzione
- seme preparato piatti di agar NGM con e. coli individuando circa 50-100 µ l di preparati OP50 coltura liquida al centro del piatto.
- Piastre di copertura e lasciarli asciugare a temperatura ambiente per 24 h. Una volta asciutto, posizionare le piastre a 37 ° C durante la notte per una crescita rapida o conservare a temperatura ambiente, se non si desidera una crescita più lenta.
- Aggiungere vermi alla piastra da uno " chunking, " (Vedi protocollo passo 5 " Chunking e Picking worm "), picking vermi individualmente o disporre le uova di verme direttamente sulla piastra (Vedi protocollo passo 6 " uovo preparazione ").
5. Chunking e Picking worm
Nota: " Chunking, " si riferisce ad una pratica che è comune nella manutenzione di c. elegans. Si tratta di taglio di una sezione della piastra di agar NGM che contiene worm e trasferendo questo pezzo su un piatto nuovo, trasferendo così anche un gran numero di vermi nel processo. Contaminazione può anche essere tagliato fuori il piatto in questo modo. Quando la raccolta vermi, è importante mantenere l'integrità dell'agar perché vermi possono essere perso in fori nell'agar. Inoltre, è importante consentire il prelievo si raffreddi prima di toccare la piastra per evitare che l'agar di fusione o bruciare i vermi.
- Al fine di trasferire rapidamente grandi quantità di vermi sulle nuove piastre, tagliare un pezzo di agar NGM contenente i vermi selezionati utilizzando una spatola. Rimuovere il pezzo tagliato e appoggiarlo sul bordo del prato di OP50 su un piatto nuovo.
- Trasferimento worm singolarmente, come descritto di seguito nel passaggio di protocollo 8.2, " analisi di sopravvivenza, " usando un verme pick. Fiamma il filo nel verme prendere fino a quando è rosso. Rimuoverlo dal fuoco e lasciarla raffreddare per pochi secondi.
- Utilizzando il filo nel prelievo, raschiare delicatamente il prato della cultura OP50 coltivata sulla nuova piastra, che copre il filo nel prelievo.
- La cultura viscosa che copre la punta del filo rende worm bastone fino alla punta del plettro, così delicatamente raccogliere vermi selezionati usando un movimento swiping.
- Una volta selezionati vermi sono raccolte, metterli su un piatto nuovo scorrendo delicatamente coltura agar. Posizionare il filo in fiamma per rimuovere cultura rimanente nel prelievo.
6. Preparazione di uova
- posto circa 20 animali adulti (circa 2-3 giorni dopo la schiusa, quando coltivate a 20 ° C) da prelievo o suddivisione in blocchi come descritto nel protocollo passaggio 5, " Chunking e Picking worm, " su un piatto seminato con 50 µ L di e. coli ceppo, OP50.
- Per raccogliere le uova, inondare la piastra con 10 mL di buffer di M9 dopo 1-2 giorni. Utilizzando una pipetta sierologica di vetro, turbolenza e agitare delicatamente il contenuto sulla piastra di agar a rilasciare le uova attaccate alla OP50 o animali adulti. Raccogliere tutto il liquido che contiene le uova e gli adulti. Tubo di
- trasferire M9 e OP50 soluzione in un 15 mL conico. Centrifugare la provetta conica da 15 mL a 2.100 x g per 2 min.
- Aspirare circa 9 mL di surnatante senza disturbare il pellet OP50.
- Risospendere il pellet in 2 mL di acqua sterile, 1 mL di candeggina e 1 mL di NaOH di 0.25 M.
- Mescolare delicatamente capovolgendo fino a quando la maggioranza (circa il 70 per cento) di animali adulti appaiono lisata; in genere, le uova rimangono intatte durante questo trattamento breve candeggina a causa delle loro coperture. Centrifugare la provetta conica a 990 x g per 2 min.
- Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 10 mL di buffer di M9.
- Centrifugare la provetta conica in 990 x g per 2 min. aspirare il surnatante senza pellet inquietante. Risospendere il pellet con 200 µ l di tampone di M9.
Nota: Preparazione uovo può richiedere prove multiple. Le uova possono essere distrutte se sono esposti per candeggiare per troppo tempo. Se non si schiudono le uova, o diminuire la concentrazione di candeggina in soluzione o diminuire la durata dell'esposizione alla candeggina.
7. Set-up piatto infezione
- dispensare 3-5 mL di YPD in una provetta sterile e inoculare esso con una singola colonia di Candida albicans con un'ansa sterile.
- Posizionare il tubo su un tamburo rotatorio per circa 16-18 h a 30 ° C.
- Etichetta uno 1,5 mL microfuge tubo per contenere i albicans del c. e un altro per contenere OP50. Registrare il peso di ogni provetta vuota.
- Posto 500 µ l del pernottamento albicans del c. cultura nella provetta etichettata albicans del c. e 1.500 µ l della cultura OP50 durante la notte (dal punto 3.1) nella provetta etichettata OP50.
- Centrifuga per 10 min a 16.100 x aspirare il surnatante g. senza pellet inquietante.
- Ri-sospendere ogni pallina con 500 µ l di acqua sterile. Centrifugare per 5 min 16.100 x g.
- Aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Registrare il peso finale dei tubi del microfuge.
- Determinare il peso di ogni pallina sottraendo il peso iniziale dei tubi dal peso finale del microfuge.
- Con acqua sterile, risospendere il pellet di albicans del c. a 10 mg/mL e il pellet OP50 a 200 mg/mL. Rendere un'infezione master mix combinando 10 µ l di una soluzione di 50 mg/mL di streptomicina, 2,5 µ l di cultura OP50, 0,5 µ l di albicans del c. cultura e 7 µ l di acqua sterile.
- Per placche di comando, è necessario creare un mix master sostituendo il volume della cultura di albicans del c. con acqua sterile. Seme di 20 µ l di miscela di infezione o soluzione di controllo OP50 sulle piastre centro di NGM utilizzando una micropipetta.
Nota: Circa 100 vermi sono necessari per determinare la significatività statistica durante l'analisi. Questo test viene in genere eseguito in triplice copia. Così, un 3.2 x mix infezione nonché un 3.2 x soluzione di controllo è fatto. Queste miscele sono fatte per essere leggermente oltre 3 volte l'originale per garantire che un pieno 20 µ l è seminato in ogni piatto, lasciando spazio per l'errore. Questo mix master è creato perché la faringe del worm è troppo piccola durante le fasi iniziali di larvale (L1-L3) a consumare c. albicans. Per l'esposizione agli agenti farmacologici quali fluconazolo ( Figura 3B), l'agente è stato introdotto per la miscela di infezione. La concentrazione dell'agente è determinata empiricamente. Ad esempio, in Figura 3B, 50 µM Fluconazole è rappresentata, tuttavia 0, 12,5, 25, 50 e 100 µM Fluconazole erano anche testato usando lo stesso protocollo.
- Per placche di comando, è necessario creare un mix master sostituendo il volume della cultura di albicans del c. con acqua sterile. Seme di 20 µ l di miscela di infezione o soluzione di controllo OP50 sulle piastre centro di NGM utilizzando una micropipetta.
8. Analisi del fenotipo di regione anale deformato (Dar) e analisi di sopravvivenza
- Visualize il fenotipo di Dar
Nota: Dar meglio viene visualizzato nella fase L3 e oltre. Dar si presenta come una piccola sporgenza della regione anale post del worm ( Figura 2A), che diventa più evidente nel corso del tempo.- Conferma se un animale ha Dar rapidamente toccando la piastra sul palco del microscopio di dissezione; animali senza Dar volontà spostare all'indietro immediatamente, mentre gli animali con il Dar che verranno sia bisogno ripetuti giri di maschiatura per invertire la loro direzione, o non farlo affatto.
- Analisi di sopravvivenza
- preparazione completa uovo come precedentemente descritto nel protocollo passaggio 6, " uovo preparazione ". Contare le uova nell'ambito di dissezione e diluire la soluzione di uovo con M9 finché non si ottiene una concentrazione di circa 5-6 uova sane per µ l. Usando una pipetta, dispensare 20 µ l di campione contenente circa 30 uova sul piatto preparato di NGM, nella zona tra la coltura batterica e il lato della piastra (uova e vite senza fine alimentare, OP50, sono in due punti distinti).
- Piastre Incubate a 20 ° C per 48 h. Sotto un microscopio di dissezione, contare il numero di vermi vivi e morti adulti su ogni piatto, così come il numero di vermi con Dar. Registrare la percentuale con Dar.
- Considera un animale morto, se non risponde di essere sfruttato sulla testa di un filo di alluminio o toccando la piastra.
- Ogni altro giorno, trasferire i vermi adulti restanti scegliendo come descritto nel protocollo passaggio 5, " Chunking e Picking worm, " su un piatto di infezione o controllo di nuovo. A questo punto, se necessario, eseguire un'analisi di sopravvivenza di rilevamento del numero di vermi dal vivo, morti e mancante ogni giorno.
Nota: Questo test può eseguire per due settimane, cominciando con preparazione di uova. Inoltre, la soluzione di uovo non dovrebbe essere erogata sulla cultura batterica, come la soluzione può contenere tracce di candeggina che può uccidere il OP50. La soluzione dovrebbe essere erogato circa 0,5 cm dal bordo della piastra, come le uova possono restare bloccate tra i lati della piastra e l'agar. Inoltre, a causa della rapida proliferazione di vermi, trasferendo gli adulti sulle nuove piastre è fondamentale per separarli dalla loro progenie.
- Analizzare sopravvivenza
- analizzare risultati utilizzando software di analisi di sopravvivenza curva (vedere elenco dei materiali). Curve di
- Confronta sopravvivenza utilizzando il metodo Grehan-Breslow-Wilcoxon (supponendo che i dati dai primi tempi di sopravvivenza sono più accurati di epoche successive, peso di conseguenza i dati) così come di strumenti statistici di Logrank 45.
Nota: Ad esempio, in Figura 4B -C, la sopravvivenza di vermi trattati con mutante c. albicans è rispetto a quelli trattati con isogeni selvaggio-tipo controlli o complementarystrains.
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Representative Results
Un'analisi di patogenesi (Figura 1) usando i albicans del c. e c. elegans precedentemente è stato descritto dal nostro laboratorio17,18 e altri laboratori19,20. Dimostriamo la disponibilità dell'utilizzo di c. elegans per studiare la virulenza di albicans del c. mostrando che le cellule di c. albicans rapidamente vengono ingerite dai vermi e si accumulano nel lume intestinale causando locomozione più lento, deformato anale regione (Dar) (Figura 2A), gonfiore della vulva (Figura 2B), distensione dell'intestino (Figura 3A) e della letalità (Figura 3, Figura 4). Misuriamo anche la durata dei vermi infetti come una misura quantitativa di fitness. Per esempio, c. elegans infettati con c. albicans vive 10-12 giorni rispetto ai 20-22 per comandi non infetti. Nel c. elegans infettati con c. albicans doppia knock out mutante, efg1/efg1 cph1/cph1, che sono due fattori di virulenza chiave necessarie per l'infezione nel topo, ratto e cellule umane epiteliali modelli21, 23, nematodi sopravvissero significativamente più lunghi rispetto ai controlli (Figura 3B). Questi esperimenti suggeriscono che alcune delle lezioni che si impara in questo modello più semplice sulla virulenza di albicans del c. può rimanere valido nei mammiferi superiori e viceversa.
Mostriamo anche che il sistema di modello del nematode può essere farmacologicamente modulata (Figura 3B). In presenza di fluconazolo, il più comunemente prescritto farmaco antifungino, vermi sfidati con c. albicans è sopravvissuto significativamente più lunghi rispetto ai controlli. Questa prova dell'esperimento di principio suggerisce che il modello del nematode può essere utilizzato per lo screening di piccole molecole. Infatti, il nostro modello di c. elegans era strumentale nell'identificazione di filastatin, una piccola molecola d'inibizione di vari aspetti della virulenza fungina24.
Fenotipi di malattia e l'analisi al microscopio di C. elegans infezione
C. elegans sono stati esposti a albicans del c. in un periodo di sei giorni e osservati per segni di infezione, la progressione di malattia e di morte. Il fenotipo di Dar è più visibile di giorno 4 di analisi della sopravvivenza, come notato da una regione anale sporgente che non è visibile nell'animale infetto (Figura 2A). Vermi infettati da c. albicans anche notoriamente presentano gonfiore nella regione vulva (Figura 2B). In entrambi i casi, il worm è in grado di eliminare l'infezione dopo aver raggiunto questa fase. Al fine di visualizzare la colonizzazione dei albicans del c. nel lume intestinale, vermi sono stati alimentati il selvaggio-tipo albicans del c. con RFP, etichettati che causano aree di colonizzazione di reagiscono in rosso (Figura 3A). Per produrre queste immagini, vermi sono stati anestetizzati su un pad di agarosio 2% contenente 0,01 M di sodio azide. Vermi sono stati esposti a selvaggio-tipo albicans del c. o RFP-etichetta c. albicanse trasferiti nel buffer di 5 µM M9 sul pad di agarosio. Il pad dell'agarosi è stato poi coperto con un vetrino coprioggetti. Vermi sono stati visti a 200x e 400 ingrandimenti utilizzando un microscopio invertito con funzionalità di microscopia fluorescente. Immagini sono state create sotto contrasto differenziale di interferenza (Nomarski) e ottica epifluorescenza. Le immagini fluorescenti sono state migliorate utilizzando software (Figura 3A). Micrografie serie tempo di vermi infetti determinato che c. albicans colonizzato il lume intestinale entro il terzo giorno del dosaggio17. Worm infetta ha mostrato la distensione intestinale più severa quello osservato nel controllo non infetto.
Strumenti genetici e farmacologici per studiare l'infezione
Successivamente, abbiamo testato il modello utilizzando la modulazione farmacologica e genetica. Abbiamo testato anche fattori di virulenza precedentemente documentati che regolano la transizione ifale dei albicans del c.25 e hanno dimostrati di essere importante nelle infezioni in vivo di topi e nematodi20,26 . Abbiamo testato la capacità dei vermi di sopravvivere infezione causata da c. albicans efg1/efg1 cph1/cph1 doppio mutante. Efg1 è un fattore di trascrizione altamente conservata e una componente essenziale della via metabolica AMP ciclico/proteina chinasi A (PKA). In c. albicans questa via regola ifale morfogenesi27,28e un arsenale di fattori di virulenza chiave di commutazione bianco-opaco. Questi fattori di virulenza includono Hwp1 e Hwp2, due scorze di lievito specifico proteine coinvolte nell'adesione e formazione di biofilm, Eap1, un'adesina di parete cellulare coinvolto nel legame a cellule epiteliali umane29e WEB5, un enzima idrolitico tessuto epiteliale invasione30. Cph1 è un fattore di trascrizione che regola molti processi metabolici, tra cui accoppiamento, FILAMENTAZIONE e la formazione di biofilm e ha dimostrato di giocare un ruolo critico nel danneggiare cellule epiteliali31 ed epitelio umano ricostruito21 . Rottura di uno di questi geni ha un impatto significativo sulla virulenza e la rottura simultanea di entrambi in cph1/cph1efg1/efg1 risultati nella virulenza drammatica riduzione in vari modelli animali, tra cui topi25, della drosofila 32, zebrafish33,34 e falena34. Cph1/cph1efg1/efg1 doppio mutante è considerato dalla comunità di albicans del c. come il ceppo non virulenti di definizione e il gold standard per la convalida di sistemi modello di romanzo. Il efg1Δ e cph1Δ singoli mutanti hanno mostrati una riduzione Dar (~ 10% e ~ 50%, rispettivamente) rispetto al wild type cognate, mentre il mutante doppia efg1Δ cph1Δ non è riuscito a suscitare il Dar risposta17. Questi risultati ricapitolano il pattern della virulenza nei topi, dove il mutante di cph1∆ è leggermente attenuato, il mutante di efg1∆ è significantly attenuato e doppio mutante è completamente avirulente25. Infettato da worm efg1 cph1/cph1 / efg1C. albicans doppio mutante vissuto statisticamente significativamente più a lungo rispetto ai controlli (p < 0,01 per test statistico sia Log Rank e Breslow, n = 60) suggerendo che questi due geni sono necessari per C. albicans virulenza contro c. elegans (Figura 3B).
Al fine di esplorare la possibilità di utilizzare il nostro modello di c. elegans per lo screening di stupefacenti potenziale, abbiamo testato l'effetto dell'aggiunta di fluconazole sull'esito finale dell'infezione. Abbiamo usato una varietà di differenti concentrazioni di fluconazolo e trovato che 50 µM ci ha dato i risultati più significativi. Vermi infettati con c. albicans e 50 µM fluconazole (Figura 3B) vissero statisticamente significativamente più lungo rispetto ai controlli (p < 0.01 a test statistico sia Log Rank e Breslow, n = 60). Questa concentrazione è stata determinata empiricamente (vedere la nota alla fine del passaggio del protocollo 7, "piastra di infezione set up"). Questi prova degli esperimenti di principio ha mostrato che il nostro modello del nematode può essere utilizzato per lo screening di piccole molecole antifungine. Il modello in realtà era strumentale nella scoperta di filastatin, una piccola molecola che inibisce vari aspetti della virulenza fungina che sta subendo ulteriori studi preclinici24. Di conseguenza, la nostra analisi sono adatto per esplorare le strategie di virulenza dei albicans del c. e agenti farmacologici.
Studio della risposta innata ospite
Successivamente, abbiamo voluto studiare le difese ospite reciproco contro gli agenti patogeni, poiché gli aspetti di questa immunità innata sono conservati in mammiferi11,35. È noto che il c. elegans produce ROS su entrambe le infezioni batteriche e fungine18,36,37 come parte del suo meccanismo di difesa. ROS hanno un effetto biocida su organismi invasori e svolgono un ruolo importante nell'immunità innata. zcf15/zcf15 Iper suscettibilità a ROS in vitro ci ha portato ad ipotizzare che la sua virulenza ridotta in c. elegans era a causa di una ridotta capacità di resistere che dell'host generato ROS. Per verificare la nostra ipotesi, abbiamo determinato la capacità di zcf15/zcf15 di uccidere o di selvaggio-tipo vermi o worm con una capacità alterata di produrre ROS. Rappresentante c. albicans mutante zcf15 che è sensibile alle specie reattive dell'ossigeno (Figura 4A) ha mostrate ridotta virulenza di selvaggio-tipo di c. elegans. C. elegans risponde ad ingestione di patogeni producendo ROS extracellulare nel lume intestinale tramite Ce-Duox1, un'ossidasi di NADPH codificata dal gene bli-3. Durante la produzione di ROS, le cellule intestinali producono anche antiossidanti intracellulari via DAF-16 per proteggere i propri tessuti dal ROS dannosi effetti36,38. CE-Duox1 è una proteina con un dominio di perossidasi del N-terminale, un dominio di NADPH-ossidasi superossido-generazione C-terminale e due siti di legame per calmodulina centrale39. Dopo l'infezione microbica, questa proteina utilizza NADPH citosolico per generare ROS tossiche extracellulare nel lume intestinale per contrastare l'infezione. Per tutta una serie di saggi biochimici in uno studio del 2009, Jain et al ha dimostrato che ROS sono abbondantemente prodotta dopo l'infezione di lievito e che la perdita di funzione tramite bli-3(e767) bli-3 riduce drasticamente la capacità di nematodi di produrre ROS. Come mostrato in Figura 4B, vermi sfidati con zcf15/zcf15 è sopravvissuto significativamente più lunghi di wild type o ceppi integrati (p < 0,01 dal log-rank test) che indica che ZCF15 è necessaria per la virulenza. Tuttavia, quando abbiamo sfidato ROS-carenti c. elegansbli-3(e767), abbiamo ottenuto la cinetica delle uccisioni che erano paragonabili tra zcf15/zcf15, wild type e ceppo completato (Figura 4). Questa evidenza indica che zcf15/zcf15 non riescono a uccidere nematodi a meno che non sia compromessa la capacità dell'host di produrre ROS. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che ZCF15 è richiesto per la virulenza completo e che questo gene è probabilmente coinvolto nella capacità del patogeno di resistere host generato ROS. Al meglio della nostra conoscenza, questo è la prima volta che ZCF15 ha dimostrato di essere coinvolti nella patogenicità e resistenza di ROS.
Figura 1: Rappresentazione schematica dell'infezione di c. elegans . C. elegans sono esposti ad un mix di e. coli ceppo OP50 e un agente patogeno e osservato per un periodo di 4 giorni dopo aver raggiunto l'età adulta per segni di infezione e la progressione della malattia.
Figura 2: fenotipi patologici. (A) regione anale Deformed (Dar) è visibile (indicato con una freccia) come un gonfiamento nella regione post anale di vermi infetti (pannello di destra) quattro giorni dopo l'esposizione. I vermi sul pannello di sinistra sono non infetti e servono come un controllo. (B), un sottoinsieme (~ 15%) di vermi infetti Visualizza un gonfiore della vulva (pannello di destra, indicato con una freccia) rispetto ai vermi di controllo non infetto (pannello sinistro) che rappresenta l'infezione diffusa conseguente morte matricida. Tutte le immagini sono state prese come descritto nei risultati rappresentativi18.
Figura 3: Gli albicans del c. - modello di c. elegans è favorevole alla manipolazione al microscopio e possa essere modulato farmacologicamente e geneticamente. (A) c. albicans taggati con accumulo di RFP nell'infezione post giorno 3 del nematode lume intestinale. Cellule di lievito sono ingerite rapidamente dai vermi e si accumulano nel lume intestinale completamente intatto, che indica che essi sono in grado di sopravvivere la frantumazione meccanica della faringe. Immagini sono state prese come descritto nei risultati rappresentativi18. (B) curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier di sfidati con selvaggio-tipo albicans del c., cph1/cph1efg1/efg1 doppio mutante o selvaggio-tipo albicans del c. + 50 µM di fluconazolo rispetto al controllo non infetto vermi nematodi.
Nella figura 4. ZCF15 è necessario resistere c. elegans generato ROS. (A) ZCF15 è responsabile della resistenza di tipo selvaggio al paraquat, che è conosciuto per generare le specie reattive dell'ossigeno. Wild type, Ko o ceppi integrate sono state coltivate in coltura liquida durante la notte e sedimento al OD = 1. Colture erano ogni diluito 1:5 e piastrate su YPD o YPD contenenti paraquat di 1 mM. C. elegans produrre ROS via bli-3 al fine di combattere gli agenti patogeni che invadono il lume intestinale38. (B) le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier mostrano che ZCF15 eliminazione limita l'uccisione di selvaggio-tipo vermi. (C) curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier The Mostra simili tassi di sopravvivenza tra zcf15/zcf15, wild-type e ceppo completato quando ROS-carenti c. elegansbli-3(e767) sono stati infettati.
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Discussion
I metodi per analizzante infezione di c. elegans e sopravvivenza sopra esposizione in vita a albicans del c. che abbiamo descritto possono essere modificati per testare un altro agente patogeno. Colture liquide di un altro batteri o funghi possono essere formate e alimentate al c. elegans in modo simile. Inoltre, possono essere dosate seriale infezioni prima esponendo la larva di un agente patogeno come descritto, e quindi trasferire gli animali su un nuovo piatto contenente un agente patogeno separato dopo aver raggiunto l'età adulta.
Durante lo svolgimento di questo test, è importante prestare particolare attenzione al tempismo. In primo luogo, quando completato uovo preparazione al fine di raccogliere le uova per il dosaggio, è fondamentale per limitare la quantità di tempo che le uova sono esposti per candeggiare. La quantità di tempo necessario per sciogliere gli adulti nella soluzione di candeggina per rilasciare le uova varia. Immediatamente dopo la somministrazione della soluzione di candeggina, la soluzione di verme deve essere osservata da vicino sotto un microscopio di dissezione. Una volta che circa il 70% dei vermi hanno disintegrato, la soluzione dovrebbe essere centrifugata. Se preparazione uovo non produce le uova vitali, diminuire la concentrazione di candeggina o la durata dell'esposizione alla candeggina. Nel completare questo test, è anche fondamentale che è attenzione al trasferimento vermi adulti sulle nuove piastre come necessario per evitare di confondere gli oggetti di studio con loro progenie. Limitando il numero di uova placcato all'inizio del dosaggio di 25-30 uova dovrebbe evitare questo pure. Infine, trasferimento di vermi adulti sulle nuove piastre frequentemente inoltre diminuisce la probabilità di vermi strisciare fino ai lati del piatto petri e morendo.
Abbiamo utilizzato Caenorhabditis elegans come un host versatile modello per studiare le relazioni patogene o commensale tra microbi o un microbo e il relativo host. Nostro sistema può essere utilizzato come strumento di studio microbica o interazione ospite-microbo a livello cellulare e molecolare, utilizzando approcci genetici in avanti e indietro, ma anche per esplorare nuove molecole per intervento terapeutico. Abbiamo dimostrato la versatilità di questo sistema effettuando una schermata genetica per identificare i geni che contribuiscono alla virulenza40, quelle legate al fitness microbica41, quelli che mediano la risposta ospite a microbi17, 18, anche utilizzando il modello per applicazioni ad elevato throughput per droga scoperta24. Si tratta di un buon modello per uso da parte di studenti universitari perché non ha bisogno di costose infrastrutture per mantenere colonie, considerando che gli animali possono essere crio-conservate per future applicazioni. Infine, questo fornisce un perfetto "intermediario" per gli studi in vitro e in modelli murini.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Quest'opera è stata eseguita presso e supportata da Worcester Polytechnic Institute.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar (granulated, bacterilogical grade) | Apex BioResearch Products | 20-248 | |
| Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) | Genesee Scientific | 59-1M32P | |
| Axiovision Zeiss Inverted Microscope | Axiovision Zeiss | ||
| Bacto-Peptone | Fisher BioReagants | BP1420-500 | |
| C. elegans strain Bli-3 | Caenorhabditis Genetics Center | Bli-3(e767) CB767 | |
| Calcium Chloride | Fisher Scientific | BP51-250 | |
| Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% | Sigma | C8667-25G | |
| Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) | FIsherBrand | 14-961-33 | |
| Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) | Nikon Instrument Inc. | ||
| E. coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | |
| GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) | GraphPad Software | ||
| LB Broth (Miller's) | Apex BioResearch Products | 11-120 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | 10034-99-8 | |
| Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) | Falcon | 353001 | |
| Potassium Phosphate monobasic | Sigma | P0662-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Sodium Phosphate | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| Wildtype C. albicans SC5314 | ATCC | SC5314 | |
| Wildtype C. elegans | Caenorhabditis Genetics Center | N2 |
References
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