Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Rundormer Caenorhabditis Elegans - en allsidig i Vivo modell å studere vert-mikrobe interaksjoner

doi: 10.3791/56487 Published: October 18, 2017

Summary

Her presenterer vi Rundormer Caenorhabditis elegans som allsidig vert modell å studere mikrobiell interaksjon.

Abstract

Vi viser en metode som bruker Caenorhabditis elegans som modell vert for å studere mikrobiell interaksjon. Mikrober er innført via kosten gjør tarmen den primære plasseringen for sykdom. Rundormer tarmen strukturelt og funksjonelt etterligner pattedyr tarmen og gjennomsiktig gjør det mottakelig for mikroskopiske studie av kolonisering. Her viser vi at patogener kan forårsake sykdom og død. Vi kan identifisere mikrobiell mutanter som viser endret virulens. Dets bevarte medfødte respons til biotiske stress gjør C. elegans et utmerket system å undersøke fasetter av verten medfødte immunsystemet interaksjoner. Vi viser at verter mutasjoner i genet dobbelt oksidase ikke kan produsere frie radikaler og ikke kan motstå mikrobiell fornærmelse. Vi viser ytterligere allsidighet av presentert overlevelse analysen ved å vise at det kan brukes til å studere virkningene av hemmere av mikrobiell vekst. Denne analysen kan også brukes til å oppdage fungal virulens faktorer som mål for utviklingen av romanen soppdrepende midler, i tillegg til å gi mulighet til videre avdekke vert-mikrobe interaksjoner. Utformingen av denne analysen egner seg godt til høy gjennomstrømning hele-genome skjermer, mens muligheten til å cryo-bevare ormer for fremtidig bruk gjør det en kostnadseffektiv og attraktive helt dyr modell å studere.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

C. elegans har blitt brukt som en effektiv modell organisme for mer enn 50 år. I 1960 var sørafrikanske biolog Sydney Brenner C. elegans å studere neuronal utvikling, banet vei for en gammel herkomst forskere å studere ulike aspekter av cellen og dyr biologi i nematoder. Denne linjen inneholder nobelprisvinnerne Craig Mello og Andrew Fire for deres RNAi arbeid1, Robert Horvitz og John Sulston for sitt arbeid på orgel utvikling og apoptose2,3,4og Martin Chalfie for sitt arbeid med grønne fluorescerende protein5. Selv om denne modellen organismen er tradisjonelt brukt til å studere molekylære og utviklingspsykologi biologi, de siste 15 årene, har forskere begynt å bruke C. elegans å undersøke ulike human patogener inkludert Pseudomonas biologi aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella entericaog Serratia marcescens6,7,8,9,10. Disse studiene viste at mange av mekanismene som er involvert i interaksjonen som menneske-patogen er bevart i nematoder, men også at det er noen immunitet mekanismer som er unike for denne modellen organisme11,12. I naturen, C. elegans møter en rekke trusler fra inntatt patogener i jorda og dette har gitt en sterk seleksjonspress å utvikle og opprettholde en sofistikert medfødte immunsystemet i sin intestinal lumen. Mange av gener og mekanismer involvert i beskyttelse av intestinal lumen er orkestrert av svært bevart elementene som også finnes i høyere pattedyr11,13. C. elegans representerer derfor en flott modell å studere gastrointestinal patogener som Salmonella enterica14, Shigella boydii15eller Vibrio kolera16.

Her markere vi bemerkelsesverdig allsidigheten C. elegans som modell vert å studere smittsomme stoffer som C. albicans. C. elegans som modell vert gir høy gjennomstrømning screening for virulens som er mindre kostbart og tidkrevende enn en musemodell, som er vanlig å studere candidiasis42.

I denne studien viser vi at modellen og tilhørende overlevelse analysen kan trygt brukes for å studere vert medfødte immunsystemet effektor viktig å motvirke infeksjoner, patogen determinanter som driver virulente, og farmakologiske forbindelser som kan gripe inn i patogenesen. Ulik beskrevet tidligere analyser, denne metoden gir et middel for å studere eksponering til en patogen over levetiden til dyret, fra larvestadiet til voksen alder, heller enn bare voksen til døden43,44. I sammendraget, våre C. elegans - er C. albicans modellen en allsidig og kraftig verktøy som kan brukes ikke bare til å studere de genetisk basene som driver infeksjoner og immunitet, men også å identifisere nye forbindelser for terapeutisk intervensjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. forberedelse av Rundormer vekst Medium (NGM)

  1. For 1 L medier, kombinere 20 g agar, 2.5 g organisk nitrogen kilde (f.eks, bacto-pepton) og 3 g natriumklorid i en 2 L kolbe. Legge til 975 mL sterilt vann.
    1. Add i sterilt rør bar. Hvis bruker en automatisk media måletyper, autoklav rør og media i 15 min; Media bør være autoklaveres for lenger hvis et høyere volum.
  2. Angi på rør tallerken og Avkjøl.
    1. Når media er varm å berøre (ca 60 ° C) tas aseptisk legge 1 mL 1 M MgSO 4 ● H 2 O, 1 mL av 1 M CaCl 2, 25 mL KPO 4 og 1 mL av 0,5% kolesterol i etanol.
    2. Hell media (for hånd, eller automatiske lensepumpen) under laminær strømning i 35 x 10 mm sterilt petri retter. La tørke under panseret i 1-2 dager før bruk.
      Merk: Plater bør lagres på 4 ° C å hindre forurensning.

2. Gjør en orm plukke

  1. kuttet en 1,5 cm stykke aluminium wire. Nøye inn ca 0,5 cm med denne lengden spissen av en Pasteur pipette.
    1. Bruker en Bunsen brenner eller alkohol lampen, smelte glass pipette spissen av sakte roterende det i flammen til ledningen er sikkert overholdt pipette, uten at den opprinnelige figuren pipette tips.

3. Utarbeidelse av E. coli kultur

  1. bruker en steril loop, vaksinere enkelt koloni av E. coli belastning OP50 i 200 mL Luria kjøttkraft. Ruge over natten med skjelvende på 37 ° C.
  2. Flytende kultur er klar til bruk dagen og kan lagres på 4 ° C når den ikke er i bruk.
    Merk: E. coli belastningen, OP50, brukes som en matkilde for C. elegans. Denne kulturen kan brukes for opptil flere måneder når lagret på 4 ° C.

4. Viktig C. elegans vedlikehold

  1. frø forberedt NGM agar plater med E. coli ved å fange ca 50-100 µL forberedt OP50 flytende kultur på midten av tallerkenen.
  2. Dekk plater og la dem tørke ved romtemperatur for 24 timer. Når tørr, plassere plater på 37 ° C over natten for rask vekst eller holde i romtemperatur, hvis lavere vekst.
  3. Legge ormer til platen ved å enten " chunking, " (se protokollen trinn 5 " Chunking og plukke ormer "), plukke ormer individuelt eller plasser ormen egg direkte på platen (se protokollen trinn 6 " Egg forberedelse ").

5. Chunking og plukke ormer

Merk: " Chunking, " refererer til en praksis som er felles i C. elegans vedlikehold. Dette innebærer å kutte en del av NGM agar plate som inneholder ormer og overfører dette stykket på en ny plate, dermed også overføre et stort antall ormer i prosessen. Forurensning kan også bli kuttet ut av plate på denne måten. Når plukke ormer, er det viktig å opprettholde integriteten til agar fordi ormer kan gå tapt i hull i agar. I tillegg er det viktig å tillate plukke avkjøles før du berører platen for å hindre smelter agar eller brenner ormer.

  1. For å raskt overfører store mengder ormer på nye plater, kuttet et stykke NGM agar som inneholder den valgte ormer ved hjelp av en slikkepott. Fjern kutt og legge den med forsiden ned i utkanten av plenen på OP50 på en ny plate.
  2. Overføring ormer individuelt som beskrevet nedenfor i protokollen trinn 8.2, " overlevelse analysen, " bruker en orm plukke. Flammen ledningen i ormen plukke før det er rød. Fjerne den fra flammen og la den avkjøles i noen sekunder.
  3. Bruker ledningen på hakke, forsiktig skrape plenen OP50 kultur dyrket på den nye platen, dekker wire på plukkingen.
  4. Tyktflytende kulturen som dekker tuppen av ledningen gjør ormer stikke til spissen av plukkingen, dermed forsiktig plukke opp valgte ormer bruke en swiping bevegelse.
  5. Når valgte ormer er samlet, legg dem på en ny plate ved å forsiktig dra kultur over agar. Plasser wire i flammen fjerne gjenværende kultur på plukkingen.

6. Egg forberedelse

  1. Sett ca 20 voksen dyr (ca 2-3 dager etter klekking når dyrket ved 20 ° C) ved å plukke eller chunking som beskrevet i protokollen trinn 5, " Chunking og plukke ormer, " på en tallerken seeded med 50 µL av E. coli belastning, OP50.
  2. å samle egg, flom platen med 10 mL av M9 bufferen etter 1-2 dager. Bruke en glass serologisk pipette, virvel og forsiktig agitere innholdet på agar plate å frigjøre egg fast til OP50 eller voksen dyr. Samle all væsken som inneholder egg og voksne.
  3. Overføre M9 og OP50 løsning i en 15 mL konisk tube. Sentrifuge 15 mL konisk tube 2100 x g for 2 min.
  4. Sug opp ca 9 mL av nedbryting uten å forstyrre OP50 pellet.
  5. Resuspend pellets i 2 mL sterilt vann, 1 mL av blekemiddel og 1 mL av 0,25 M NaOH.
  6. Bland forsiktig ved inversjon til fleste (ca 70 prosent) av voksen dyr vises lysed, vanligvis egg beholdes under denne korte blekemiddel behandling på grunn av deres skall. Sentrifuge konisk røret 990 x g for 2 min.
  7. Leveringstanken nedbryting uten å forstyrre pellet. Å avbryte pellet 10 mL av M9 buffer.
  8. Sentrifuge konisk røret i 990 x g for 2 min. leveringstanken nedbryting uten forstyrrende pellets. Nytt utsette pellets med 200 µL av M9 buffer.
    Merk: Egg forberedelse krever flere forsøk. Egg kan bli ødelagt hvis de er utsatt for bleke for lenge. Hvis ikke klekker eggene, enten redusere konsentrasjonen av blekemiddel i løsning eller redusere varigheten av eksponering for blekemiddel.

7. Infeksjon Plate oppsett

  1. dispensere 3-5 mL YPD inn i et sterilt test-rør og vaksinere det med en enkelt koloni av Candida albicans bruker en steril loop.
    1. Sett røret på en rotatory tromme ca 16-18 h 30 ° C.
  2. Etikett en 1,5 mL microfuge tube inneholder C. albicans, og en annen for å inneholde OP50. Ta vekten av hver tomt.
    1. Stedet 500 µL av overnatting C. albicans kultur inn røret merket C. albicans og 1500 µL av natten OP50 kultur (fra trinn 3.1) inn i røret merket OP50.
    2. Sentrifuge for 10 min på 16,100 x g. leveringstanken nedbryting uten forstyrrende pellet.
    3. Re suspendere hver pellets med 500 µL av sterilt vann. Sentrifuge for 5 min på 16,100 x g.
    4. Leveringstanken nedbryting uten å forstyrre pellet. Ta den endelige vekten av microfuge tuber.
    5. Fastslå vekten hver pellet ved å trekke den første vekten av microfuge tuber fra den endelige vekten.
  3. Bruker sterilt vann, å suspendere C. albicans pellets til 10 mg/mL og OP50 pellets til 200 mg/mL. Gjøre en master infeksjon bland ved å kombinere 10 µL av en 50 mg/mL løsning av Streptomycin, 2,5 µL OP50 kultur, 0,5 µL av C. albicans kultur og 7 µL av sterilt vann.
    1. For kontrollen plater, lage en master blanding ved å erstatte volumet av C. albicans kultur med sterilt vann. Frø 20 µL av infeksjon mix eller OP50 kontrolløsning på midten av NGM platene med brønnene.
      Merk: Ca 100 ormer for å finne statistiske betydning under analyse. Denne analysen er vanligvis kjører i tre eksemplarer. Således, en 3.2 x infeksjon blanding og en 3.2 x kontrolløsning gjøres. Disse blander er laget for å være litt over 3 x den opprinnelige slik at en full 20 µL er plantet på hver plate, slik at rom for feil. Dette master mix opprettes fordi pharynx av ormen er for liten under den innledende larver stadiet (L1-L3) å konsumere C. albicans. For eksponering for farmakologisk stoffer som fluconazole ( figur 3B), er agent introdusert til infeksjon blanding. Konsentrasjonen av agent bestemmes empirisk. For eksempel i figur 3B, 50 µM Fluconazole er representert, men 0, 12.5, 25, 50 og 100 µM Fluconazole var også testet med samme protokoll.

8. Analyse av deformert Anal regionen (Dar) fenotypen og overlevelse analysen

  1. Visualiser Dar fenotypen
    Merk: Dar er best visualisert på L3 scenen og utover. Dar presenterer som en liten protrusion i innlegget anal regionen av ormen ( figur 2A), som blir mer fremtredende over tid.
    1. Bekreft hvis et dyr har Dar ved å raskt trykke platen på scenen i disseksjon mikroskopet; dyr uten Dar vil flytte bakover umiddelbart, mens dyr med Dar må enten gjentatte runder for å tappe å reversere deres retning, eller de vil ikke gjøre det hele tatt.
  2. Overlevelse analysen
    1. komplett egg forberedelse som tidligere beskrevet i protokollen trinn 6, " Egg forberedelse ". Teller eggene innenfor disseksjon, og fortynne egg løsningen med M9 til en konsentrasjon av ca 5-6 healthy egg per µL er oppnådd. Bruke en pipette, dispensere 20 µL utvalg som inneholder ca 30 egg på forberedt NGM plate, i området mellom bakteriell kultur og side plate (egg og ormen mat, OP50, er på to forskjellige steder).
    2. Incubate plater ved 20 ° C i 48 timer. Under disseksjon mikroskop, telle antall levende og døde voksen ormer på hver plate og antall ormer med Dar. Registrere prosent med Dar.
    3. Vurdere et dyr død hvis den ikke reagerer blir tappet på hodet av en aluminium wire eller trykke på tallerkenen.
    4. Annenhver dag, overføre gjenværende voksen ormer ved plukking som beskrevet i protokollen trinn 5, " Chunking og plukke ormer, " på en ny infeksjon eller kontroll tallerken. På dette punktet, eventuelt utføre en overlevelse analysen ved å spore antall levende, død og mangler hver dag.
      Merk: Denne analysen kan kjøre i to uker, begynner med egg forberedelse. I tillegg bør egg løsningen ikke bli utlevert til bakteriell kultur, som løsningen kan inneholde spor av blekemiddel som kan drepe OP50. Løsningen skal utlevert ca 0,5 cm fra kanten av platen, som egg kan bli fast mellom sidene av platen og agar. I tillegg, på grunn av den raske spredningen av ormer, overføre voksne på nye plater er avgjørende for å skille dem fra deres avkom.
  3. Analysere overlevelse
    1. analysere resultatene ved hjelp av overlevelse curve analyseprogramvare (se liste over materialer).
    2. Sammenlign overlevelse kurver med metoden Grehan-Breslow-Diversified (forutsatt at dataene fra tidlig overlevelse tid er mer nøyaktig enn senere tider, vekt data følgelig) samt Logrank statistiske verktøy 45.
      Merk: For eksempel i figur 4B -C, overlevelse av ormer behandlet med mutant C. albicans er sammenlignet med de behandlet isogenic vill-type kontroller eller complementarystrains.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En patogenesen analysen (figur 1) bruke C. albicans og C. elegans har tidligere blitt beskrevet av våre lab17,18 og andre labs19,20. Vi viser amenability av bruk av C. elegans C. albicans virulens viser at C. albicans cellene raskt inntatt av ormer og akkumuleres i den intestinal lumen forårsaker langsommere bevegelse, deformert anal regionen (Dar) (figur 2A), hevelse i vulva (figur 2B), oppblåsthet tarmen (figur 3A) og dødelighet (Figur 3, Figur 4). Vi har også måle levetiden av infiserte ormer som et kvantitativt mål fitness. For eksempel live C. elegans infisert med C. albicans 10-12 dager sammenlignet med 20-22 infisert kontrollene. I C. elegans infisert med C. albicans dobbel fortrenging mutant, efg1/efg1 cph1/cph1, som er to viktige virulens faktorer kreves for infeksjon i mus, rotter og menneskelige epithelial modeller21, 23, nematoder overlevde betydelig lengre enn kontroller (figur 3B). Disse eksperimentene tyder på at noen av timene vi lærer i denne enklere modellen om C. albicans virulens kan være gyldig i høyere pattedyr og omvendt.

Vi viser også at Rundormer modell systemet kan farmakologisk modulert (figur 3B). I nærvær av flukonazol, hyppigst forskrevne soppdrepende stoffet, ormer utfordret med C. albicans overlevde betydelig lengre enn kontroller. Dette bevis på prinsippet eksperiment antyder at Rundormer modellen kan brukes til små molekyl screening. Faktisk var vår C. elegans modell medvirkende til å identifisere filastatin, et lite molekyl hemme ulike aspekter av sopp virulens24.

Sykdom fenotyper og mikroskopisk analyse av C. elegans infeksjon
C. elegans ble utsatt for C. albicans over en periode på seks dager og observert for underskriver av infeksjon, progresjon av sykdom og død. Dar fenotypen er mest synlige dag 4 av overlevelse analysen, som nevnt av en fremstående anal regionen ikke er synlig i det infisert dyr (figur 2A). Ormer infisert av C. albicans også kjent for å ha hevelse i regionen vulva (figur 2B). I begge tilfeller er ormen kan ikke fjerne infeksjonen etter å ha nådd denne fasen. For å visualisere kolonisering av C. albicans i intestinal lumen, ble ormer matet vill-type C. albicans merket med RFP, som forårsake områder av kolonisering til fluoresce rød (figur 3A). For å produsere disse bildene, var ormer anesthetized på en 2% agarose pad som inneholder 0,01 M Natriumazid. Ormer ble utsatt for vill-type C. albicans eller RFP-merket C. albicansog overført til 5 µM M9 bufferen på agarose puten. Agarose pad ble deretter dekket med en dekkglassvæske. Ormer ble vist på 200 X og 400 X forstørrelse med en invertert mikroskop med fluorescerende mikroskopi evner. Bildene ble opprettet under differensial forstyrrelser kontrast (Nomarski) og epifluorescence optikk. Fluorescerende bildene ble forbedret med programvare (figur 3A). Tid serien micrographs av infiserte fastslått at C. albicans kolonisert av intestinal lumen av den tredje dagen av analysen17. Infiserte ormer viste mer alvorlig intestinal distensjon enn observert i kontrollen infisert.

Genetiske og farmakologiske verktøy å studere infeksjon
Neste testet vi modellen med genetiske og farmakologiske modulering. Vi testet tidligere dokumenterte virulens faktorer som regulerer hyphal overgang C. albicans25 og har vist seg å være viktig i i vivo infeksjoner av mus og nematoder20,26 . Vi testet evne til ormer å overleve infeksjon forårsaket av C. albicans efg1/efg1 cph1/cph1 dobbel muterte. Efg1 er en svært bevart transkripsjon faktor og en viktig del av syklisk AMP/protein kinase A (PKA) metabolske veien. I C. albicans regulerer veien denne hyphal morphogenesis27, hvit-ugjennomsiktig28, og et arsenal av viktige virulens faktorer. Disse virulens faktorene omfatter Hwp1 og Hwp2, to gjær-spesifikke cellevegg proteiner involvert i adhesjon og biofilm formasjon, Eap1, en cellevegg adhesin involvert i binding til menneskelig epitelceller29, og Sap5, en hydrolytisk enzym involvert i epitel vev invasjonen30. Cph1 er en transkripsjon faktor som regulerer mange metabolske prosesser inkludert parring, filamentation og biofilm dannelse og har vist seg å spille en avgjørende rolle i skadelige epitelceller31 og menneskelige rekonstruert epitel21 . Avbrudd av en av disse genene har en betydelig innvirkning på virulens og samtidige avbrudd i både i cph1/cph1efg1/efg1 resultater i dramatiske virulens reduksjon i ulike dyr modeller inkludert mus25, Drosophila 32, sebrafisk33,34 og møll34. Cph1/cph1efg1/efg1 dobbel mutant anses av C. albicans samfunnet som avirulent belastningen av definisjonen og gullstandarden for validering av romanen modellsystemer. Den efg1Δ og cph1Δ enkelt mutanter viste redusert Dar (~ 10% til ~ 50% henholdsvis) sammenlignet med beslektet wild type, mens efg1Δ cph1Δ dobbel mutant mislyktes å lokke fram de Dar svar17. Disse resultatene recapitulate mønsteret av virulens i mus, der cph1∆ mutant er litt svekket, efg1∆ mutant er significantly dempes og dobbel mutant er helt avirulent25. Ormer infisert med cph1/cph1 efg1 / efg1C. albicans dobbel mutant levd statistisk signifikant lengre enn kontroller (p < 0.01 for både Logg rang og Breslow statistisk test, n = 60) antyder at disse to genene er nødvendig for C. albicans virulens mot C. elegans (figur 3B).

For å utforske muligheten for å bruke vår C. elegans modell for potensielle narkotikarelaterte screening, testet vi effekten av tillegg av fluconazole på den ultimate utfallet av infeksjonen. Vi brukte en rekke ulike konsentrasjoner av fluconazole og fant at 50 µM ga oss de viktigste resultatene. Ormer infisert med C. albicans og 50 µM fluconazole (figur 3B) bodde statistisk signifikant lenger enn kontroller (p < 0,01 på både Logg rang og Breslow statistisk test, n = 60). Denne konsentrasjonen identifiserte empirisk (se notatet på slutten av protokollen trinn 7, "infeksjon plate satt opp"). Disse bevis på prinsippet eksperimenter viste at vår Rundormer modell kan brukes til små molekyl soppdrepende screening. Modellen var instrumental i oppdagelsen av filastatin, et lite molekyl hemme ulike aspekter av sopp virulens som er for tiden under videre prekliniske studier24. Derfor er våre analysen egnet for å utforske virulens strategier C. albicans og farmakologiske agenter.

Studie av medfødte vert svar
Neste, ønsket vi å studere gjensidige vert forsvar mot patogener, siden aspekter av denne medfødt immunitet er bevart i pattedyr11,35. Det er velkjent at C. elegans gir ROS på begge bakteriell og soppinfeksjoner18,36,37 som del av sin forsvarsmekanisme. ROS har en bakteriedrepende effekt på invadere organismer og spiller en viktig rolle i medfødt immunitet. zcf15/zcf15 hyper mottakelighet for ROS i vitro ledet oss til hypothesize at dens redusert virulens i C. elegans skyldtes redusert evne til å tåle vertens generert ROS. For å teste vår hypotese, bestemt vi evne til zcf15/zcf15 å drepe vill-type ormer eller ormer med en svekket evne til å produsere ROS. Representant C. albicans mutant zcf15 som er følsomme for reaktive oksygen arter (figur 4A) viste redusert virulens i vill-type C. elegans. C. elegans svarer til inntak av patogen ved å produsere ekstracellulære ROS i den intestinal lumen via Ce-Duox1, en NADPH oksidase kodet av genet bli-3. Under ROS produksjonen produserer intestinal cellene også intracellulær antioksidanter via DAF-16 å beskytte sitt eget vev fra ROS skadelige effekter36,38. CE-Duox1 er et protein med et N-terminal peroxidase domene, C-terminalen superoxide genererer NADPH-oksidase domene og to sentrale calmodulin bindende områder39. På mikrobiell infeksjon bruker dette proteinet cytosolic NADPH for å generere ekstracellulære giftige ROS i den intestinal lumen å motvirke infeksjonen. Gjennom en rekke biokjemiske analyser i en 2009 studie viste Jain et al. at ROS produseres rikelig på gjærinfeksjon og det bli-3 tap av funksjon via bli-3(e767) dramatisk reduserer muligheten av nematoder å produsere ROS. Som vist i figur 4B, ormer utfordret med zcf15/zcf15 overlevde vesentlig lenger enn wild type eller supplert stammer (p < 0,01 av Logg-rank test) som angir at ZCF15 er nødvendig for virulens. Men når vi utfordret ROS-mangelfull C. elegansbli-3(e767), vi fikk kinetics av drap som var sammenlignbar mellom zcf15/zcf15, wild type og supplert belastning (figur 4C). Dette bevis indikerer at zcf15/zcf15 ikke klarer å drepe nematoder med mindre verten evne til å produsere ROS er kompromittert. Sammen tyder disse resultatene på at ZCF15 kreves for fulle virulens og at dette genet er sannsynlig involvert i den patogene evne til å motstå vert generert ROS. Best av vår kunnskap er dette første gang at ZCF15 har vist seg å være involvert i virusets og ROS motstand.

Figure 1
Figur 1: En skjematisk fremstilling av C. elegans infeksjon. C. elegans er utsatt for en blanding av E. coli belastning OP50 og en patogen og observert over en periode på 4 dager etter nådde voksen alder for underskriver av infeksjon og progresjon av sykdommen.

Figure 2
Figur 2: sykdom fenotyper. (A) deformerte anal regionen (Dar) er synlig (angitt med pil) som hevelse i regionen innlegg anal infiserte ormer (høyre panel) fire dager legge eksponering. Ormer på venstre panel er infisert og tjene som en kontroll. (B) en undergruppe (~ 15%) av infiserte ormer viser en hevelse i vulva (høyre panel, angitt med en pil) sammenlignet med infisert kontroll ormer (venstre panel) som representerer spres infeksjonen resulterer i matricidal død. Alle bilder ble tatt som beskrevet i representant resultater18.

Figure 3
Figur 3: Den C. albicans - C. elegans modellen passer til mikroskopiske manipulasjon, og kan være farmakologisk og genetisk modulert. (A) C. albicans merket med RFP akkumulering i Rundormer intestinal lumen dag 3 innlegg infeksjon. Gjærceller inntatt raskt av ormer og akkumuleres i den intestinal lumen helt intakt, indikerer at de er i stand til å overleve den mekaniske knusing av pharynx. Bildene ble tatt som beskrevet i representant resultater18. (B) Kaplan-Meier overlevelse kurver av nematoder utfordret med vill-type C. albicans, cph1/cph1efg1/efg1 dobbel mutant eller vill-type C. albicans + 50 µM av fluconazole sammenlignet med infisert kontroll ormer.

Figure 4
Figur 4. ZCF15 er nødvendig for å motstå C. elegans generert ROS. (A) ZCF15 er ansvarlig for vill type motstand mot paraquat, som er kjent for å generere frie radikaler. Wild type, knockout eller supplert stammer ble dyrket i flytende kultur overnatting og resuspended til OD = 1. Kulturer ble hver fortynnes 1:5 og belagt på YPD eller YPD som inneholder 1 mM paraquat. C. elegans produserer ROS via bli-3 for å bekjempe patogener som invaderer intestinal lumen38. (B) Kaplan-Meier overlevelse kurver viser at ZCF15 sletting begrenser drapet av vill-type. (C) The Kaplan-Meier overlevelse kurven viser lignende overlevelseskulturer mellom zcf15/zcf15, vill type og supplert belastning når ROS-mangelfull C. elegansbli-3(e767) var smittet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Metodene for assaying C. elegans infeksjon og overlevelse levetid eksponering for C. albicans som vi har beskrevet kan endres for å teste en patogen. Flytende kulturer i en annen bakterier eller sopp kan gjøres og matet til C. elegans på en lignende måte. I tillegg føljetong infeksjoner kan være assayed av første utsette Larvene til en patogen som beskrevet, og deretter overføre dyrene på en ny plate som inneholder en egen patogen etter nådde voksen alder.

Mens drive denne analysen, er det viktig å betale forsiktig oppmerksomhet til timing. Først når fullført egg forberedelser for å høste egg for analysen, er det viktig å begrense tiden eggene er utsatt for bleke. Tiden nødvendig å oppløse voksne i den bleike løsningen å frigjøre egg varierer. Umiddelbart etter administrerer den bleike løsningen, må ormen løsningen nøye overvåket under disseksjon mikroskop. Når omtrent 70% av ormer har oppløst, skal deretter løsningen være centrifuged. Hvis egg forberedelse ikke gir levedyktig egg, redusere konsentrasjonen av blekemiddel eller varigheten av eksponering for blekemiddel. Å fullføre denne analysen, er det også avgjørende at oppmerksomhet til overføring voksen ormer på nye plater for å unngå forvirrende studien fag med deres avkom. Begrense antall egg belagt i starten av analysen til 25-30 egg bør hindre dette også. Til slutt, overføre voksen ormer på nye plater ofte også avtar sjansene av ormer krypende sidene av Petriskål og dø.

Vi har benyttet Caenorhabditis elegans som en allsidig modell vert for å studere patogene eller commensal relasjoner mellom mikrober eller en mikrobe og vertsstasjonen. Systemet kan brukes som et verktøy for å studere mikrobiell eller vert-mikrobe samhandling på mobilnettet og molekylære bruke revers genetisk tilnærminger, men også for å utforske nye molekyler for terapeutisk intervensjon. Vi har vist allsidigheten til dette systemet ved å gjennomføre en genetisk skjerm for å identifisere gener som bidrar til virulens40, de knyttet til mikrobiell fitness41, som megle vert svar mikrober17, 18og bruker modellen for programmer med høy gjennomstrømning drug discovery24. Dette er en god modell for bruk av studentene fordi den ikke trenger dyre infrastruktur til å opprettholde kolonier, vurderer at dyr kan være cryo bevarte for framtidige applikasjoner. Til slutt, dette gir en perfekt "mellommann" for i vitro studier og murine modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble utført på og støttes av Worcester Polytechnic Institute.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar (granulated, bacterilogical grade) Apex BioResearch Products 20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) Genesee Scientific 59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted Microscope Axiovision Zeiss
Bacto-Peptone Fisher BioReagants BP1420-500
C. elegans strain Bli-3 Caenorhabditis Genetics Center Bli-3(e767) CB767
Calcium Chloride Fisher Scientific BP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% Sigma C8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) FIsherBrand 14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) Nikon Instrument Inc.
E. coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) GraphPad Software
LB Broth (Miller's) Apex BioResearch Products 11-120
Magnesium Sulfate Fisher Scientific 10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) Falcon 353001
Potassium Phosphate monobasic Sigma P0662-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Sodium Phosphate Fisher Scientific BP332-500
Wildtype C. albicans SC5314 ATCC SC5314
Wildtype C. elegans Caenorhabditis Genetics Center N2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, (6669), 806-811 (1998).
  2. Ellis, H. M., Horvitz, H. R. Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans. Cell. 44, (6), 817-829 (1986).
  3. Hengartner, M. O., Ellis, R. E., Horvitz, H. R. Caenorhabditis elegans gene ced-9 protects cells from programmed cell death. Nature. 356, (6369), 494-499 (1992).
  4. Sulston, J. E., Horvitz, H. R. Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans. Dev Biol. 56, (1), 110-156 (1977).
  5. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263, (5148), 802-805 (1994).
  6. Kong, C., Yehye, W. A., Abd Rahman, N., Tan, M. W., Nathan, S. Discovery of potential anti-infectives against Staphylococcus aureus using a Caenorhabditis elegans infection model. BMC Complement Altern Med. 14, 4 (2014).
  7. Marsh, E. K., May, R. C. Caenorhabditis elegans, a model organism for investigating immunity. Appl Environ Microbiol. 78, (7), 2075-2081 (2012).
  8. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5, (5), 387-398 (2006).
  9. Sem, X., Rhen, M. Pathogenicity of Salmonella enterica in Caenorhabditis elegans relies on disseminated oxidative stress in the infected host. PLoS One. 7, (9), e45417 (2012).
  10. Irazoqui, J. E., et al. Distinct pathogenesis and host responses during infection of C. elegans by P. aeruginosa and S. aureus. PLoS Pathog. 6, e1000982 (2010).
  11. Kim, D. H., et al. A conserved p38 MAP kinase pathway in Caenorhabditis elegans innate immunity. Science. 297, (5581), 623-626 (2002).
  12. Bae, T., et al. Staphylococcus aureus virulence genes identified by bursa aurealis mutagenesis and nematode killing. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, (33), 12312-12317 (2004).
  13. Couillault, C., et al. TLR-independent control of innate immunity in Caenorhabditis elegans by the TIR domain adaptor protein TIR-1, an ortholog of human SARM. Nat Immunol. 5, (5), 488-494 (2004).
  14. Aballay, A., Drenkard, E., Hilbun, L. R., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans innate immune response triggered by Salmonella enterica requires intact LPS and is mediated by a MAPK signaling pathway. Curr Biol. 13, (1), 47-52 (2003).
  15. Kesika, P., Balamurugan, K. Studies on Shigella boydii infection in Caenorhabditis elegans and bioinformatics analysis of immune regulatory protein interactions. Biochem Biophys Acta. 1824, (12), 1449-1456 (2012).
  16. Cinar, H. N., et al. Vibrio cholerae hemolysin is required for lethality, developmental delay, and intestinal vacuolation in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5, (7), e11558 (2010).
  17. Jain, C., Pastor, K., Gonzalez, A. Y., Lorenz, M. C., Rao, R. P. The role of Candida albicans AP-1 protein against host derived ROS in in vivo models of infection. Virulence. 4, (1), 67-76 (2013).
  18. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryot Cell. 8, (8), 1218-1227 (2009).
  19. Tampakakis, E., Okoli, I., Mylonakis, E. A C. elegans-based, whole animal, in vivo screen for the identification of antifungal compounds. Nat. Protoc. 3, (12), 1925-1931 (2008).
  20. Pukkila-Worley, R., Ausubel, F. M., Mylonakis, E. Candida albicans infection of Caenorhabditis elegans induces antifungal immune defenses. PLoS Pathog. 7, (6), e1002074 (2011).
  21. Dieterich, C., et al. In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology. 148, (Pt 2), 497-506 (2002).
  22. Chen, C. G., et al. Non-lethal Candida albicans cph1/cph1 efg1/efg1 transcription factor mutant establishing restricted zone of infection in a mouse model of systemic infection. Int J Immunopathol Pharmacol. 19, (3), 561-565 (2006).
  23. Ricicova, M., et al. Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology. 156, (Pt 3), 909-919 (2010).
  24. Fazly, A., et al. Chemical screening identifies filastatin, a small molecule inhibitor of Candida albicans adhesion, morphogenesis, and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (33), 13594-13599 (2013).
  25. Lo, H. J., et al. Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. Cell. 90, (5), 939-949 (1997).
  26. Koh, A. Y., Kohler, J. R., Coggshall, K. T., Van Rooijen, N., Pier, G. B. Mucosal damage and neutropenia are required for Candida albicans dissemination. PLoS Pathog. 4, (2), e35 (2008).
  27. McDonough, K. A., Rodriguez, A. The myriad roles of cyclic AMP in microbial pathogens: from signal to sword. Nat Rev Microbiol. 10, (1), 27-38 (2011).
  28. Sonneborn, A., Tebarth, B., Ernst, J. F. Control of white-opaque phenotypic switching in Candida albicans by the Efg1p morphogenetic regulator. Infect Immun. 67, (9), 4655-4660 (1999).
  29. Li, F., Palecek, S. P. EAP1, a Candida albicans gene involved in binding human epithelial cells. Eukaryot Cell. 2, (6), 1266-1273 (2003).
  30. Staib, P., Kretschmar, M., Nichterlein, T., Hof, H., Morschhauser, J. Transcriptional regulators Cph1p and Efg1p mediate activation of the Candida albicans virulence gene SAP5 during infection. Infect Immun. 70, (2), 921-927 (2002).
  31. Korting, H. C., et al. Reduced expression of the hyphal-independent Candida albicans proteinase genes SAP1 and SAP3 in the efg1 mutant is associated with attenuated virulence during infection of oral epithelium. J .Med Microbiol. 52, (Pt 8), 623-632 (2003).
  32. Chamilos, G., et al. Drosophila melanogaster as a facile model for large-scale studies of virulence mechanisms and antifungal drug efficacy in Candida species. J Infect Dis. 193, (7), 1014-1022 (2006).
  33. Brothers, K. M., Newman, Z. R., Wheeler, R. T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot Cell. 10, (7), 932-944 (2011).
  34. Brennan, M., Thomas, D. Y., Whiteway, M., Kavanagh, K. Correlation between virulence of Candida albicans mutants in mice and Galleria mellonella larvae. FEMS Immunol Med Microbiol. 34, (2), 153-157 (2002).
  35. Mallo, G. V., et al. Inducible antibacterial defense system in C. elegans. Curr Biol. 12, (14), 1209-1214 (2002).
  36. Chavez, V., Mohri-Shiomi, A., Maadani, A., Vega, L. A., Garsin, D. A. Oxidative stress enzymes are required for DAF-16-mediated immunity due to generation of reactive oxygen species by Caenorhabditis elegans. Genetics. 176, (3), 1567-1577 (2007).
  37. Moy, T. I., Mylonakis, E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. Cytotoxicity of hydrogen peroxide produced by Enterococcus faecium. Infect Immun. 72, (8), 4512-4520 (2004).
  38. Hoeven, R., McCallum, K. C., Cruz, M. R., Garsin, D. A. Ce-Duox1/BLI-3 generated reactive oxygen species trigger protective SKN-1 activity via p38 MAPK signaling during infection in C. elegans. PLoS Pathog. 7, (12), e1002453 (2011).
  39. Meitzler, J. L., Ortiz de Montellano, P. R. Caenorhabditis elegans and human dual oxidase 1 (DUOX1) "peroxidase" domains: insights into heme binding and catalytic activity. J Biol Chem. 284, (28), 18634-18643 (2009).
  40. Issi, L., et al. Zinc Cluster Transcription Factors Alter Virulence in Candida albicans. Genetics. 205, (2), 559-576 (2017).
  41. Ford, C. B., et al. The evolution of drug resistance in clinical isolates of Candida albicans. Elife. 4, e00662 (2015).
  42. Naglik, J. R., Fidel, P. L., Odds, F. C. Animal models of mucosal Candida infection. FEMS microbiology letters. 283, (2), 129-139 (2008).
  43. Garsin, D. A., et al. A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, (19), 10892-10897 (2001).
  44. Sifri, C. D., Begun, J., Ausubel, F. M., Calderwood, S. B. Caenorhabditis elegans as a Model Host for Staphylococcus aureus Pathogenesis. Infection and immunity. 71, (4), 2208-2217 (2003).
  45. Jain, C., Yun, M., Politz, S. M., Rao, R. P. A pathogenesis assay using Saccharomyces cerevisiae and Caenorhabditis elegans reveals novel roles for yeast AP-1, Yap1, and host dual oxidase BLI-3 in fungal pathogenesis. Eukaryotic cell. 8, (8), 1218-1227 (2009).
Rundormer Caenorhabditis Elegans - en allsidig <em>i Vivo</em> modell å studere vert-mikrobe interaksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (128), e56487, doi:10.3791/56487 (2017).More

Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (128), e56487, doi:10.3791/56487 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter