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Genetics

O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil na Vivo para estudar interações do anfitrião-micróbio

Published: October 18, 2017 doi: 10.3791/56487
Automatic Translation
1, 1, 1
1Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

Summary

Aqui, apresentamos o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo de acolhimento versátil para estudar a interação microbiana.

Abstract

Vamos demonstrar um método usando Caenorhabditis elegans como um anfitrião modelo para estudar a interação microbiana. Micróbios são introduzidos através da dieta, tornando o intestino o local principal para a doença. O nematoide intestino estrutural e funcionalmente imita os intestinos de mamíferos e é transparente, tornando-se passível de estudo microscópico da colonização. Aqui nós mostramos que patógenos podem causar doenças e morte. Somos capazes de identificar microbianos mutantes que mostram a virulência alterada. Sua resposta inata conservada a estresses bióticos faz c. elegans , um excelente sistema para sondar as facetas de interações imune inata do hospedeiro. Mostramos que hosts com mutações no gene oxidase dual não podem produzir espécies reactivas de oxigénio e são incapazes de resistir insulto microbiano. Vamos demonstrar ainda mais a versatilidade do ensaio apresentado sobrevivência, mostrando que ele pode ser usado para estudar os efeitos de inibidores do crescimento microbiano. Este ensaio também pode ser usado para descobrir os fatores de virulência de fungos como alvos para o desenvolvimento de novos agentes antifúngicos, bem como fornecer uma oportunidade para descobrir novas interações do anfitrião-micróbio. O design deste teste se presta bem para alta taxa de transferência do inteiro-genoma telas, enquanto a capacidade de vermes de crio-preservação para uso futuro torna um modelo todo animal rentável e atraente para estudar.

Introduction

C. elegans tem sido usado como um organismo modelo poderoso para mais de 50 anos. Na década de 1960, o biólogo Sul-Africano Sydney Brenner foi pioneira no uso de c. elegans , para estudar o desenvolvimento neuronal, pavimentando o caminho para uma longa linhagem de cientistas para estudar os vários aspectos da biologia celular e animal em nematoides. Esta linhagem inclui Prêmio Nobel laureates Craig Mello e Andrew Fire para o seu trabalho de RNAi1, Robert Horvitz e John Sulston por seu trabalho no desenvolvimento de órgãos e apoptose2,3,4e Martin Chalfie por seu trabalho na proteína fluorescente verde5. Embora este organismo modelo tem sido tradicionalmente usado para estudar a biologia molecular e do desenvolvimento, nos últimos 15 anos, os pesquisadores começaram a usar c. elegans para investigar a biologia de vários patógenos humanos incluindo Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, Staphylococcus aureuse Salmonella typhi6,7,8,9,10. Estes estudos revelaram que muitos dos mecanismos envolvidos na interação humano-patógeno são conservados em nematódeos, mas também que existem alguns mecanismos de imunidade que são exclusivos para este organismo de modelo11,12. Na natureza, c. elegans encontra uma variedade de ameaças de patógenos ingeridos presentes no solo e isso proporcionou uma forte pressão seletiva para evoluir e manter um sofisticado sistema imune inato no seu lúmen intestinal. Muitos dos genes e mecanismos envolvidos na proteção do lúmen intestinal são orquestrados por elementos altamente conservada que também existem em maior mamíferos11,13. C. elegans , portanto, representa um grande modelo para estudar a patógenos gastrointestinais como a Salmonella typhi14, Shigella boydii15ou Vibrio cholera16.

Aqui destacamos a versatilidade notável de c. elegans como um host de modelo para o estudo de agentes infecciosos, tais como c. albicans. C. elegans como um anfitrião modelo permite o rastreio de alto rendimento de virulência que é menos caro e demorado do que um modelo do rato, que é comumente usado para estudar a candidíase42.

Neste estudo, mostramos que este modelo e o ensaio de sobrevivência de assosiated podem ser confiável usados para estudar inata efetores hospedeiro imune importantes para combater infecções, determinantes do patógeno que impulsionam a virulência, e compostos farmacológicos que podem intervir na patogênese. Diferentes tipos de ensaios descritos anteriormente, este método fornece um meio de exposição a um agente patogénico a estudar sobre a vida do animal, desde a fase larval para a idade adulta, ao invés de apenas idade adulta a morte de43,44. Em resumo, nosso c. elegans - modelo de c. albicans é uma ferramenta versátil e poderosa que pode ser usada não somente para estudar as bases genéticas que levam a infecção e imunidade, mas também para identificar novos compostos para a intervenção terapêutica.

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Protocol

1. preparação de nematódeo crescimento médio (NGM)

  1. para 1 L de mídia, combinar agar 20g, fonte de nitrogênio orgânico de 2,5 g (por exemplo, bacto peptona) e 3 g de cloreto de sódio em um frasco de 2 L. 975 ml de água estéril.
    1. Adicionar em uma barra de agitação estéril. Se usando um dosador automático de mídia, tubulação de autoclave e mídia por 15 min; mídia deve ser autoclavada para mais se for feito um maior volume.
  2. Conjunto de mídia na placa de agitação e deixe arrefecer.
    1. Uma vez que a mídia está quente ao toque (aproximadamente 60 ° C) em condições de esterilidade, adicione 1 mL de 1m MgSO 4 ● H 2 O, 1 mL de 1 M CaCl 2, 25ml de KPO 4 e 1 mL de colesterol de 0,5% em etanol.
    2. Despeje mídia (manualmente ou por bomba automática) sob fluxo laminar em 35 x 10 mm pratos de petri estéril. Deixe para secar sob o capô, por 1-2 dias antes do uso.
      Nota: As placas devem ser armazenadas a 4 ° C para evitar a contaminação.

2. Fazendo um Worm Pick

  1. corte um pedaço de 1,5 cm de fio de alumínio. Introduza cuidadosamente cerca de 0,5 cm de comprimento na ponta de uma pipeta Pasteur.
    1. Usando um bico de Bunsen ou lâmpada de álcool, derreter a ponta da pipeta de vidro, lentamente, girando-o na chama até que o fio é firmemente aderido a pipeta, sem comprometer a forma original da ponta da pipeta.

3. Preparação da cultura de e. coli

  1. utilizando uma ansa estéril, inocular a colônia única da estirpe de Escherichia coli OP50 em 200 mL de caldo de Luria. Incubar durante uma noite com tremor em 37 ° C.
  2. a cultura do líquido está pronta para o uso no dia seguinte e podem ser armazenada a 4 ° C, quando não estiver em uso.
    Nota: A cepa de Escherichia coli, OP50, é usada como fonte de alimento para c. elegans. Esta cultura pode ser utilizada para até vários meses, quando armazenado a 4 ° C.

4. Essencial manutenção de c. elegans

  1. semente preparado placas de ágar NGM com e. coli manchando aproximadamente 50-100 µ l de cultura líquida de OP50 preparada no centro da placa.
  2. Placas de cobre e deixe-os secar à temperatura ambiente por 24 h. Depois de seco, coloque as placas a 37 ° C durante a noite para crescimento rápido ou manter à temperatura ambiente, se for desejado crescimento mais lento.
  3. Adicionar minhocas à placa por qualquer " a fragmentação, " (ver protocolo passo 5 " Chunking e pegando vermes "), pegar vermes individualmente ou colocação worm ovos diretamente sobre a placa (ver protocolo passo 6 " ovo preparação ").

5. CHUNKING e pegando vermes

Nota: " Chunking, " refere-se a uma prática que é comum em manutenção de c. elegans. Isto envolve cortar uma secção da placa de ágar de NGM que contém vermes e transferir esta peça em um prato novo, assim também transferência de grande quantidade de vermes no processo. Contaminação também pode ser cortada da placa dessa maneira. Ao escolher os vermes, é importante manter a integridade do ágar, pois vermes podem ser perdidos em buracos de agar. Além disso, é importante para permitir que o escolhido para esfriar antes de tocar no prato para evitar derretimento o ágar ou queimando os vermes.

  1. Para transferir rapidamente grandes quantidades de vermes nas novas chapas, corte um pedaço de ágar NGM contendo os sem-fins selecionados usando uma espátula. Retire o pedaço e coloque a cara no chão à beira do gramado de OP50 num prato novo.
  2. Transferência individualmente conforme descrito abaixo, na etapa de protocolo 8.2, vermes " ensaio de sobrevivência, " usando um verme escolher. Chama o fio no worm escolher até o vermelho. Removê-lo da chama e deixe-a esfriar por alguns segundos.
  3. Usando o fio sobre a palheta, lixe ligeiramente o gramado da cultura OP50 crescido na placa nova, cobrindo o fio sobre o pick.
  4. a cultura viscosa cobrindo a ponta do fio faz vermes furar a ponta da palheta, assim suavemente pegar vermes selecionados usando um movimento percorrendo.
  5. Uma vez selecionados vermes reunidos, colocá-los em um prato novo swiping suavemente a cultura através de agar. Coloque o fio na chama para remover o restante cultura sobre o pick.

6. Preparação de ovos

  1. Coloque aproximadamente 20 animais adultos (aproximadamente 2-3 dias após a eclosão, quando cultivada a 20 ° C) por escolher ou fragmentação conforme descrito na etapa de protocolo 5, " Chunking e escolhendo Worms, " em um prato, inoculado com 50 µ L da estirpe de Escherichia coli, OP50.
  2. Para recolher os ovos, inundar a placa com 10 mL de tampão de M9 após 1-2 dias. Usando uma pipeta sorológica de vidro, agite e agite suavemente o conteúdo na placa de ágar para liberar ovos presos OP50 ou animais adultos. Recolher todo o líquido contendo os ovos e adultos.
  3. Transferência M9 e OP50 solução em um 15ml cónico tubo. Centrifugar o tubo cônico de 15 mL a 2.100 x g por 2 min.
  4. Aspire aproximadamente 9 mL do sobrenadante sem perturbar o sedimento OP50.
  5. Resuspenda o pellet em 2 mL de água estéril, 1 mL de água sanitária e 1 mL de NaOH 0,25 de M.
  6. Misture suavemente por inversão, até que a maioria (aproximadamente 70 por cento) dos animais adultos aparece lisada; normalmente, ovos permanecem intactos durante este tratamento de lixívia curto por causa de seu escudo. Centrifugar o tubo cônico a 990 x g por 2 min.
  7. Aspirado sobrenadante sem perturbar o sedimento. Ressuspender o pellet em 10 mL de tampão de M9.
  8. Centrifugar o tubo cônico em 990 x g por 2 min. aspirado sobrenadante sem perturbador da pelota. Ressuspender o sedimento com 200 µ l de tampão de M9.
    Nota: A preparação do ovo pode exigir vários ensaios. Os ovos podem ser destruídos se eles são expostos para branquear por muito tempo. Se os ovos não eclodem, diminuir a concentração de água sanitária em solução ou diminuir a duração da exposição para branquear.

7. Configuração de placa de infecção

  1. dispensar 3-5 mL de YPD num tubo de ensaio estéril e inoculá-lo com uma única colônia de Candida albicans utilizando uma ansa estéril.
    1. Colocar o tubo sobre um tambor rotatórios para aproximadamente 16-18 h em 30 ° C.
  2. Rótulo um 1,5 mL microcentrífuga tubo para conter a c. albicans e outra para conter OP50. Registrar o peso de cada tubo vazio.
    1. Lugar 500 µ l de noite cultura de c. albicans em tubo rotulado de c. albicans e 1.500 µ l da cultura OP50 durante a noite (a partir de passo 3.1) no tubo rotulado OP50.
    2. Centrifugar durante 10 minutos a 16.100 x sobrenadante de g. aspirado sem sedimento perturbador.
    3. Re-suspender cada pellet com 500 µ l de água estéril. Centrifugar durante 5 min à 16.100 g. x
    4. Aspirado sobrenadante sem perturbar o sedimento. Gravar o peso final dos tubos de microcentrífuga.
    5. Determinar o peso de cada pellet subtraindo o peso inicial dos tubos de microcentrífuga do peso final.
  3. Usando água estéril, Ressuspender o sedimento de c. albicans a 10 mg/mL e a pelota OP50 a 200 mg/mL. Fazer uma infecção mestre mix pela combinação de 7 µ l de água estéril, 2,5 µ l de OP50 cultura, 0,5 µ l de cultura de c. albicans e 10 µ l de uma solução de 50 mg/mL de estreptomicina.
    1. Para placas de controle, criar uma mistura de mestre, substituindo o volume da cultura de c. albicans com água estéril. Sementes de 20 µ l de mistura de infecção ou solução de controle OP50 nas chapas de centro de NGM usando uma micropipeta.
      Nota: Aproximadamente 100 minhocas são necessários para determinar a significância estatística durante a análise. Este ensaio é executado normalmente em triplicado. Assim, feita uma 3.2 x mistura de infecção, bem como um 3.2 x solução de controle. Estas misturas são feitas para serem ligeiramente mais de 3 x o original para garantir que um total de 20 µ l é semeada em cada prato, permitindo espaço para erros. Esta mistura de mestre é criada porque a faringe do worm é muito pequena, durante os estágios larvais iniciais (L1-L3) para consumir c. albicans. Para exposição a agentes farmacológicos tais como fluconazol ( Figura 3B), o agente é introduzido à mistura de infecção. A concentração do agente é determinada empiricamente. Por exemplo, na Figura 3B, 50 µM Fluconazole é representada, no entanto 0, 12.5, 25, 50 e 100 µM fluconazol também foram testados usando o mesmo protocolo.

8. Análise do fenótipo deformado região Anal (Dar) e sobrevivência do ensaio

  1. Visualize o fenótipo de Dar
    Nota: Dar é melhor visualizado na fase L3 e além. Dar apresenta-se como uma pequena saliência na região anal post do worm ( Figura 2A), que se torna mais proeminente ao longo do tempo.
    1. Confirmar se um animal tem Dar tocando rapidamente a placa no palco do microscópio dissecação; animais sem Dar vontade de mover para trás imediatamente, enquanto animais com Dar serão necessário repetidas rodadas de escutas para reverter sua direção, ou eles Não vai fazê-lo em tudo.
  2. Ensaio de sobrevivência
    1. preparação de ovo completo conforme descrita anteriormente na etapa de protocolo 6, " ovo preparação ". Conte com o ovo no âmbito de dissecação e diluir a solução de ovo com M9 até que seja alcançada uma concentração de aproximadamente 5-6 ovos saudáveis por µ l. Utilizando uma pipeta, dispensar 20 µ l da amostra contendo aproximadamente 30 ovos na chapa de NGM preparado, na área entre a cultura bacteriana e do lado da placa (ovos e comida de verme, OP50, estão em dois pontos distintos).
      2. Incubar as placas a 20 ° C, durante 48 h de
    2. . Sob um microscópio de dissecação, conte o número de vermes vivos e mortos adultos em cada prato, bem como o número de minhocas com a Dar. Gravar a porcentagem com Dar.
    3. Considerar um animal morto, se ele não responder a ser batido na cabeça por um fio de alumínio ou toque na placa.
    4. Todos os dias, transferir germes adultos restantes por colheita conforme descrito na etapa de protocolo 5, " Chunking e escolhendo Worms, " em um prato novo de infecção ou controle. Neste ponto, se necessário, realizar um ensaio de sobrevivência do número de vermes vivos, mortos e desaparecidos de rastreamento de cada dia.
      Nota: Este ensaio poderá ser executada por duas semanas, começando com a preparação do ovo. Além disso, a solução de ovo não deve ser dispensada para a cultura bacteriana, como a solução pode conter vestígios de água sanitária que pode matar o OP50. A solução também deve ser dispensado de aproximadamente 0,5 cm da borda da placa, como ovos podem ficar preso entre os lados da placa e o ágar-ágar. Além disso, devido à rápida proliferação de vermes, transferência de adultos nas novas chapas é fundamental para separá-los dos seus descendentes.
  3. Sobrevivência analisar
    1. analisar resultados usando software de análise de curva de sobrevivência (consulte a lista de materiais).
    2. Compare sobrevivência curvas usando o método Grehan-Breslow-Wilcoxon (supondo que os dados dos primeiros tempos de sobrevivência são mais precisos do que tempos mais tarde, peso adequadamente os dados) bem como de ferramentas estatísticas de Logrank 45.
      Nota: Por exemplo, na Figura 4B -C, a sobrevivência das minhocas tratados com mutante c. albicans é comparada com aqueles tratados com controles de tipo selvagem isogénicas ou complementarystrains.

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Representative Results

Um ensaio de patogênese (Figura 1) usando a c. albicans e c. elegans tem sido descrito anteriormente por nosso laboratório17,18 e outros laboratórios19,20. Demonstramos a acessibilidade de usando o c. elegans para estudar a virulência de c. albicans , mostrando que as células de c. albicans são ingeridas rapidamente pelos vermes e acumular-se no lúmen intestinal causando mais lenta locomoção, deformado anal região (Dar) (Figura 2A), inchaço da vulva (Figura 2B), distensão do intestino (Figura 3A) e letalidade (Figura 3, Figura 4). Também medimos o tempo de vida de vermes infectados como uma medida quantitativa da aptidão. Por exemplo, c. elegans infectado com c. albicans ao vivo 10-12 dias, em comparação com 20-22 para controles não infectados. Em c. elegans infectado com a c. albicans , duplo nocaute mutante, efg1/efg1 cph1/cph1, que são dois fatores de virulência chave necessárias para infecção no rato, ratos e humanos epiteliais modelos21, 23, nematoides sobreviveram significativamente mais controles (Figura 3B). Essas experiências sugerem que algumas das lições que aprendemos neste modelo mais simples sobre a virulência de c. albicans podem permanecer válidas nos mamíferos superiores e vice-versa.

Também mostramos que o sistema de modelo nematoides pode ser farmacologicamente modulado (Figura 3B). Na presença de fluconazol, o medicamento antifúngico mais comumente prescrito, vermes desafiados com c. albicans sobreviveram significativamente mais de controles. Esta prova de experiência princípio sugere que o modelo de nematoides pode ser usado para triagem de pequenas moléculas. Na verdade, nosso modelo de c. elegans foi fundamental na identificação de filastatin, uma pequena molécula que inibe a vários aspectos da virulência fúngica24.

Fenótipos de doença e análise microscópica do C. elegans infecção
C. elegans foram expostos a c. albicans durante um período de seis dias e observado para sinais de infecção, a progressão da doença e morte. O fenótipo de Dar é mais visível por dia 4 do ensaio de sobrevivência, como foi observado por uma região anal saliente que não é visível no animal não infectado (Figura 2A). Vermes infectados por c. albicans também são conhecidos por apresentar inchaço na região da vulva (Figura 2B). Em ambos os casos, o worm é incapaz de limpar a infecção depois de atingir esse estágio. Para visualizar a colonização de c. albicans no lúmen intestinal, vermes foram alimentados selvagem-tipo c. albicans com RFP, que causam áreas de colonização que fluorescem a vermelho (Figura 3A). Para produzir estas imagens, vermes foram anestesiados num bloco de agarose 2% contendo azida sódica 0,01 M. Worms foram expostos a selvagem-tipo c. albicans ou RFP-etiquetado c. albicanse transferidos para o buffer de M9 5 µM na rampa de agarose. A almofada de agarose foi então coberta com uma lamela. Minhocas foram vistas em 200x e ampliação de X 400 usando um microscópio invertido com capacidades de microscopia fluorescente. Imagens foram criadas sob a óptica de epifluorescência e contraste de interferência diferencial (Nomarski). As imagens fluorescentes foram aprimoradas usando software (Figura 3A). Micrografias de série de tempo de vermes infectados determinou que a c. albicans colonizada do lúmen intestinal pelo terceiro dia do ensaio17. Vermes infectados mostraram distensão intestinal mais grave do que o observado no controle não infectado.

Genéticas e farmacológicas ferramentas para estudar a infecção
Em seguida, testamos o modelo usando modulação genética e farmacológica. Testamos também fatores de virulência anteriormente documentado que regulam a transição das hifas de c. albicans25 e tem demonstrados ser importante em infecções na vivo de ratos e nematoides20,26 . Testamos a capacidade dos vermes para sobreviver infecção causada por c. albicans efg1/efg1 cph1/cph1 duplo mutante. Efg1 é um fator de transcrição altamente conservada e um componente essencial da via metabólica do AMP cíclico/proteína quinase A (PKA). Em c. albicans , esta via regula morfogénese hifais27,28e um arsenal de fatores de virulência chave de comutação branco-opaco. Estes fatores de virulência incluem Hwp1 e Hwp2, dois parede celular de leveduras específicas proteínas envolvidas na adesão e formação de biofilmes, Eap1, uma adesina parede celular envolvido na ligação a células epiteliais humanas29e Sap5, uma enzima hidrolítica envolvida invasão de tecido epitelial30. Cph1 é um fator de transcrição que regula muitos processos metabólicos incluindo acasalamento, filamentação e formação de biofilmes e foi mostrado para jogar um papel crítico em danificar células epiteliais31 e epitélio reconstruído humano21 . Interrupção de qualquer um destes genes tem um impacto significativo na virulência e interrupção simultânea de ambos em cph1/cph1efg1/efg1 resultados em redução dramática de virulência em vários modelos animais incluindo ratos25, da drosófila 32,33,de zebrafish34 e traça34. O mutante duplo cph1/cph1efg1/efg1 é considerado pela comunidade de c. albicans como a estirpe avirulentas por definição e o padrão ouro para validação de sistemas modelo romance. O efg1Δ e Δ cph1única mutantes mostrou diminuição da Dar (~ 10% e ~ 50%, respectivamente) comparado com o tipo de wild cognato, enquanto o mutante duplo Δ de cph1 efg1Δ falhou eliciar a resposta de Dar17. Estes resultados recapitular o padrão de virulência em ratos, onde o cph1∆ mutante é ligeiramente atenuado, o mutante efg1∆ é significantly atenuada, e o duplo mutante é completamente avirulentas25. Vermes infectados com cph1/cph1 efg1 / efg1C. albicans duplo mutante viveu estatisticamente significativamente mais do que controles (p < 0,01 para ambos Log Rank e Breslow teste estatístico, n = 60) sugerindo que esses dois genes são necessários para C. albicans virulência contra c. elegans (Figura 3B).

A fim de explorar a possibilidade de usar o nosso modelo de c. elegans de despistagem de drogas potenciais, testamos o efeito da adição de fluconazol no resultado final da infecção. Usamos uma variedade de diferentes concentrações de fluconazol e constatou que 50 µM nos deu os resultados mais significativos. Vermes infectados com c. albicans e 50 µM fluconazol (Figura 3B) viveram estatisticamente significativamente mais do que controles (p < 0,01 em ambos Log Rank e Breslow teste estatístico, n = 60). Esta concentração foi determinada empiricamente (consulte a observação no final da etapa de protocolo 7, 'placa de infecção configurar'). Essas provas de experimentos de princípio mostraram que nosso modelo nematoide pode ser usado para triagem de antifúngicos pequena molécula. O modelo na verdade foi fundamental na descoberta da filastatin, uma pequena molécula que inibe a vários aspectos da virulência fúngica que atualmente está passando por mais estudos pré-clínicos24. Nesse sentido, nosso ensaio é adequado para explorar as estratégias de virulência de c. albicans e agentes farmacológicos.

Estudo da resposta inata do hospedeiro
Em seguida, nós queríamos estudar as defesas do hospedeiro recíproca contra patógenos, uma vez que os aspectos desta imunidade inata são conservados em mamíferos11,35. É sabido que o c. elegans produz ROS sobre ambas as infecções bacterianas e fúngicas18,36,37 como parte de seu mecanismo de defesa. ROS têm um efeito biocido sobre invadindo organismos e desempenham um papel importante na imunidade inata. zcf15/zcf15 hiper susceptibilidade de ROS em vitro levou-na hipótese de que sua reduzida virulência em c. elegans foi devido a uma redução da capacidade para suportar que do host gerado ROS. Para testar nossa hipótese, determinamos a capacidade de zcf15/zcf15 para matar o selvagem-tipo worms ou vermes com uma deficiente capacidade de produzir ROS. Representante de c. albicans mutantes zcf15 sensível a espécies reativas de oxigênio (Figura 4A) mostrou reduzida virulência em selvagem-tipo c. elegans. C. elegans responde à ingestão de patógenos através da produção de ROS extracelular no lúmen intestinal através do Ce-Duox1, uma oxidase de NADPH codificada pelo gene bli-3. Durante a produção de ROS, as células intestinais também produzem antioxidantes intracelulares através do DAF-16 para proteger seus próprios tecidos de ROS prejudiciais efeitos36,38. CE-Duox1 é uma proteína com um domínio N-terminal do peroxidase, um domínio de NADPH-oxidase geradora de superóxido C-terminal e dois locais de ligação de calmodulina central39. Após infecção microbiana, esta proteína usa NADPH citosólico para gerar extracelular ROS tóxicos no lúmen intestinal para combater a infecção. Ao longo de uma série de ensaios bioquímicos em um estudo de 2009, Jain et al mostrou que ROS são produzidos abundantemente sobre a infecção do fermento e que a perda de função através de bli-3(e767) bli-3 reduz drasticamente a capacidade de nematoides de produzir ROS. Como mostrado na Figura 4B, vermes desafiados com zcf15/zcf15 sobreviveram significativamente mais do que o tipo selvagem ou complementadas cepas (p < 0,01 pelo teste log-rank) indicando que o ZCF15 é necessário para virulência. No entanto, quando nós desafiou ROS-deficiente c. elegansbli-3(e767), obtivemos a cinética de assassinatos que eram comparáveis entre zcf15/zcf15, tipo selvagem e complementado estirpe (Figura 4). Esta evidência indica que zcf15/zcf15 não conseguem matar nematoides, a menos que a capacidade do host para produzir ROS está comprometida. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que ZCF15 é necessária para a virulência completa e que este gene provavelmente está envolvido na capacidade do patógeno para resistir ao anfitrião gerado ROS. O melhor de nosso conhecimento, esta é a primeira vez que ZCF15 foi mostrado para ser envolvidos na patogenicidade e resistência de ROS.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática da infecção por c. elegans . C. elegans são expostos a uma mistura de estirpe de Escherichia coli OP50 e um patógeno e observados durante um período de 4 dias depois de atingir a idade adulta para sinais de infecção e progressão da doença.

Figure 2
Figura 2: fenótipos doença. (A) Deformed região anal (Dar) é visível (indicado com uma seta) como um inchaço na região anal post de vermes infectados (painel direito), quatro dias pós exposição. Os vermes no painel esquerdo são não infectados e servem como um controle. (B), um subconjunto (~ 15%) de vermes infectados mostrar um inchaço da vulva (painel à direita, indicado com uma seta) em comparação aos sem-fins de controle não infectados (painel esquerdo) que representa a infecção disseminada, resultando na morte de informante. Todas as imagens foram tiradas conforme descrito na18resultados representativos.

Figure 3
Figura 3: A c. albicans - modelo c. elegans é passível de manipulação microscópica e pode ser farmacologicamente e geneticamente modulado. (A) c. albicans marcados com acumulação de RFP na infecção post nematoide lúmen intestinal dia 3. Células de levedura são ingeridas rapidamente pelos vermes e acumular-se no lúmen intestinal intacto, indicando que eles são capazes de sobreviver o esmagamento mecânico da faringe. Imagens foram tomadas como descrito na18resultados representativos. (B) curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier de nemátodos desafiados com selvagem-tipo c. albicans, duplo mutante cph1/cph1efg1/efg1 ou selvagem-tipo c. albicans + 50 µM de fluconazol em comparação aos sem-fins de controle não infectados.

Figure 4
Figura 4. ZCF15 é necessário para suportar o c. elegans gerados ROS. (A) ZCF15 é responsável pela resistência de tipo selvagem ao paraquat, que é conhecido por gerar espécies reativas de oxigênio. Tipo selvagem, nocaute ou complementadas estirpes foram crescidas em cultura líquida durante a noite e ressuspensa de OD = 1. Culturas foram cada diluído 1:5 e banhado em YPD ou YPD contendo paraquat de 1 mM. C. elegans produzir ROS através de bli-3 a fim de combater patógenos que invadem o lúmen intestinal38. (B) curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier mostram que exclusão ZCF15 limita a morte do selvagem-tipo de vermes. (C) curva de sobrevivência de Kaplan-Meier The mostra taxas semelhantes de sobrevivência entre zcf15/zcf15, tipo selvagem e estirpe complementado quando ROS-deficiente c. elegansbli-3(e767) foram infectados.

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Discussion

Os métodos para análise do c. elegans infecção e sobrevivência sobre exposição de vida a c. albicans que descrevemos podem ser modificados para testar outro patógeno. Culturas líquidas de outra bactéria ou fungo podem ser feitas e alimentadas a c. elegans de forma semelhante. Além disso, infecções seriais podem ser analisadas primeiro, expondo a larva de um patógeno conforme descrito, e depois transferir os animais para uma nova placa contendo um patógeno separado depois de atingir a idade adulta.

Durante a realização deste ensaio, é importante prestar atenção ao tempo. Em primeiro lugar, ao concluir a preparação de ovo a fim de colher os ovos para o ensaio, é fundamental para limitar a quantidade de tempo que os ovos são expostos para branquear. A quantidade de tempo necessário para dissolver adultos na solução de água sanitária para liberar os ovos varia. Imediatamente depois de administrar a solução de água sanitária, a solução worm deve ser vigiada de perto sob um microscópio de dissecação. Uma vez que cerca de 70% dos vermes tem desintegrou-se, então, a solução deve ser centrifugada. Se preparação de ovo não produz ovos viáveis, diminua a concentração de água sanitária ou a duração da exposição de lixívia. Na conclusão deste ensaio, é também crucial que atenção é dada aos vermes adultos transferidor em novas placas conforme necessário para evitar confundir os sujeitos do estudo com seus descendentes. Limitando o número de ovos chapeado no início do ensaio a 25-30 ovos deve evitar isto também. Finalmente, transferência de vermes adultos nas novas chapas frequentemente também diminui as chances de vermes subindo dos lados da caixa de Petri e morrendo.

Utilizamos o Caenorhabditis elegans como um anfitrião modelo versátil para estudar relações patogénicas ou comensais entre micróbios ou um micróbio e o hospedeiro. Nosso sistema pode ser usado como uma ferramenta para estudo microbiano ou interação do anfitrião-micróbio no nível celular e molecular usando abordagens genéticas direta e inversa, mas também para explorar novas moléculas para a intervenção terapêutica. Nós demonstramos a versatilidade deste sistema mediante a realização de uma tela genética para identificar genes que contribuem para a virulência40, aqueles ligados à aptidão microbiana41, aqueles que medeiam a resposta do hospedeiro a micróbios17, 18, bem como usando o modelo para aplicações de alto rendimento para descoberta de drogas24. Este é um bom modelo para ser usado por alunos de graduação porque não necessita de infra-estrutura cara manter colônias, Considerando que os animais podem ser crio-preservado para aplicações futuras. Finalmente, este prevê um perfeito "intermediário" em vitro estudos e modelos murino.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi realizado no e apoiado pelo Instituto Politécnico de Worcester.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar (granulated, bacterilogical grade) Apex BioResearch Products 20-248
Aluminum Wire (95% Pt, 32 Gauge) Genesee Scientific 59-1M32P
Axiovision Zeiss Inverted Microscope Axiovision Zeiss
Bacto-Peptone Fisher BioReagants BP1420-500
C. elegans strain Bli-3 Caenorhabditis Genetics Center Bli-3(e767) CB767
Calcium Chloride Fisher Scientific BP51-250
Cholesterol, Sigma Grade, minimum 99% Sigma C8667-25G
Disposable Culture Tubes (20 x 150 mm) FIsherBrand 14-961-33
Dissection Microscope (NI-150 High Intensity Illuminator) Nikon Instrument Inc.
E. coli Caenorhabditis Genetics Center OP50
GraphPad Prism (Survival Curve Analysis Software) GraphPad Software
LB Broth (Miller's) Apex BioResearch Products 11-120
Magnesium Sulfate Fisher Scientific 10034-99-8
Medium Petri Dishes (35 X 10 mm) Falcon 353001
Potassium Phosphate monobasic Sigma P0662-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Sodium Phosphate Fisher Scientific BP332-500
Wildtype C. albicans SC5314 ATCC SC5314
Wildtype C. elegans Caenorhabditis Genetics Center N2

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Genética edição 128 interações microbianas fatores de virulência patógeno defesa inata modelo animal Caenorhabditis elegans
O nemátode Caenorhabditis Elegans - um modelo versátil <em>na Vivo</em> para estudar interações do anfitrião-micróbio
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Issi, L., Rioux, M., Rao, R. The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions. J. Vis. Exp. (128), e56487, doi:10.3791/56487 (2017).

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