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Bioengineering

スクラッチ テストによるウシ皮質骨の脆弱性評価

doi: 10.3791/56488 Published: November 30, 2017

Summary

本研究では、微細なスクラッチ テストを使用して sub メソ レベルでウシ皮質骨の破壊じん性を評価します。これは、元の目的は、厳格なと再現可能な手法を提案する巨視的スケール以下破壊靭性を調査します。潜在的なアプリケーションは、骨粗しょう症などの病気が骨の脆弱性の変更を検討しています。

Abstract

骨は組織の 5 つの異なるレベルで複雑な階層的な素材です。高齢化などの要因や骨粗しょう症のような病気は、破壊が発生しやすいこと、骨の脆弱性を増加します。おかげで私たちの社会での骨破壊の大きい社会経済的影響、骨の各階層レベルの機械的性能を評価するために斬新な方法の必要性があります。剛性と強度は、ナノ、マイクロ、メゾ、-すべてのスケールで検出できるし、巨視的-破壊評価のところに限定されてきた巨視的テストします。この制限は、骨破壊の私達の理解を制限し、実験室および臨床研究のスコープを制限します。本研究では、非線形破壊力学と組み合わせてマイクロのスクラッチ テストを用いたメゾスコ ピック長さスケール マイクロから骨の破壊抵抗を調査します。テストは、ウシ皮質骨標本の短い縦方向で実行されます。綿密な実験的プロトコルを開発し、(102) 多数のテストが関連付けられて骨微細構造の不均一性を考慮して皮質骨片の破壊靱性の評価を行います。

Introduction

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本研究ではマイクロ スクラッチ手法1,2,3,4を使用してマイクロ スケール (ラメラ レベル) にメソスケール (ヒツジ) から牛緻密骨の破壊靭性を測定します。 5。骨のき裂発生とき裂を含む破壊過程は異なる構造成分と階層のさまざまなレベルでの組織のための長さのスケールで直接受けます。したがって、小さい長さのスケールで骨破壊を評価する骨の脆弱性の根本的な理解に不可欠です。一方、三点曲げなど従来のテスト コンパクト張力と曲げ試験が牛大腿骨と脛骨巨視的スケール6,7,破壊特性評価のために一般的8です。 一方、顕微鏡のスケールで破壊靭性を測定するビッカースの押し込み破壊された提案9。ビッカースの圧子を使用して放射状の裂け目を生成する微小押込みを行った。さらに、シャープなキューブ コーナー圧10を使用してオリバー ファー ナノインデンテーション破壊靱性法を行った。

上記ナノインデンテーション試験による破壊靱性研究の観察者によって測定したため発生したき裂の長さと破壊靭性を求めるための半経験的モデルだった。ただし、これらのメソッドは、照らし合わせ、主観的なもので、結果、光学顕微鏡や走査電子顕微鏡のき裂長さを測定する必要があるのため観察者のスキルに大きく依存。さらに、スクラッチ テストをナノレベルで行ったが基になる数学モデル物理ベースひび割れによる強度低下を考慮しないし、11の欠陥します。従って、知識のギャップが存在している: 物理学ベースの機械論的モデルに基づいて顕微鏡レベルでの破壊評価手法。知識のこのギャップは、マイクロのスクラッチ テストのアプリケーションをブタの標本5にまず焦点を当てて骨をコンパクトな動機。研究は、さらにウシ皮質骨を理解するため拡張されています。

標本の 2 つの異なる方向が可能: 縦横や短い縦方向。縦の横行は、破壊特性大腿骨の長軸に垂直に対応します。一方、短い縦5大腿骨の長軸に沿って破壊特性に対応します。この研究では短い縦方向の骨の破壊抵抗を特徴付けるためウシ皮質骨にスクラッチ試験を適用します。

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Protocol

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注: ここで説明されているプロトコル イリノイ施設動物ケアおよび使用委員会の動物のケアのガイドラインに従います。

1. 試験片の調達

  1. アメリカ合衆国農務省 USDA 認定食肉処理場から新鮮な収穫のウシ大腿骨を収集し、クーラーにプラスチック気密袋にそれらを輸送します。
    注: ここで行われた調査、大腿骨は 24-30 月古い、トウモロコシ、および重量を量られた約 1,000 - 1,100 ポンドをされた動物から収集されました。
  2. 標本の準備手順の開始まで 20 ° C -で大腿骨を固定します。この温度は、大腿骨の新鮮な12,13,14を保持します。

2 カット、洗浄、および試料の埋め込み

  1. 約 2 時間室温で水を容器で冷凍の大腿骨を解凍します。
  2. 皮質骨の断面積が一様に標本を生成するテーブル トップ ダイヤモンド バンドソーを使用して中間の骨幹地域から複数のディスク約 10-15 mm の厚さをカットします。
  3. 軟部組織や皮質骨の肉を除去するのに解剖キットを使用します。
  4. 手順 2.2 ダイヤモンド wafering ブレードを用いた低速で取得した、大腿骨断面カットを複数ほぼ立方形のセクションを取得する骨の長軸方向の湿潤条件下で見た。
    注: ここでは、標本準備および短い-スクラッチ検査のみ縦標本については、説明します。ただし、切断の方向以外準備手順の横方向の同じまま。
  5. 超音波洗浄器で 20 分の持続期間のため溶液 1.5% アニオン系の洗剤を使用し、5% の漂白剤の標本をきれい。
  6. 皮質骨の標本をアクリル樹脂に埋め込む (ここポリメタクリル酸メチル (PMMA)) ハンドリングと安定性の容易さのため。
    1. 離型剤、金型の壁はコートに試料を埋め込むには、まず。アクリル樹脂や PMMA の製造元の指示に従って、ビーカー中の硬化剤混ぜます。
    2. カットの皮質骨標本の 1 つに配置各金型の表面に傷が下向き。アクリル樹脂の組合せを注ぐこれら標本のホールダーを準備します。標本は 4-5 h までの期間に治療しましょう。
  7. 5 mm 厚ディスクに埋め込まれた標本をカット、低速を使用して傷が表面の公開を見て、マウント径の金属 (アルミニウム) ディスクに標本 34 mm、高さ 5 mm のシアノアクリ レート系接着剤を使用します。
  8. ハンクス バランスの取れた生理食塩水ソリューション (HBSS) を浸したゲージで標本をラップし、4 ° C でさらに使用15,16まで冷蔵庫で冷やします。

3. 研削・研磨のプロトコル

注: 前提に小さい長さのスケールで高精度のテスト標本の滑らかで同点表面であります。プロトコルを研磨前13,17は、大規模な表面粗さ測定における実質的な不正確さに 。課題は低平均表面粗さ 100 未満を達成するためにある広域 3 × 8 mm2表面上の nm。

  1. それぞれ 1 分と 5 分の 400 粒、600 粒の炭化ケイ素の論文を利用して常温でウシ皮質骨標本を挽きます。基本速度 100 rpm および 150 rpm、研磨機、それぞれを保持します。
  2. マシンは、ステップごとに 15 分の持続期間のための 800 のそして 1,200 の屑のペーパーに室温でウシ皮質骨標本を挽きます。基本速度 150 rpm、60 rpm と運転 1 ポンドの負荷のヘッド スピードで研磨機を維持します。
  3. ハード、穴あき、不織布の上と同じ順序で 3 μ、1 μ m、0.25 μ m ダイヤモンド懸濁液ソリューションを使用して室温で 90 分の持続期間のための標本を磨きます。それぞれ各ステップで 300 rpm と 60 rpm、ポリッシャーのベースとヘッド スピードで 1 ポンドの負荷の動作を維持します。
  4. 試料を合成、柔らかいレーヨン布の上 0.05 μ m のアルミナ懸濁液ソリューション 100 rpm と 60 rpm のベースとヘッド スピードで 1 lb 90 分の持続期間のためそれぞれ、また室温を磨きます。
  5. 脱イオン水でビーカーに試料を置くし、研削・研磨に残留物をきれいにし、交差汚染を避けるための連続した各ステップの間に 2 分間超音波風呂でビーカーを置きます。
  6. 光学顕微鏡・ SEM イメージングを使用して表面の特徴を表示します。
    注:図 1ヒツジ、ハバース運河、セメント ラインのように、間質性の領域、および窩は認めウシ皮質骨の標本。これらの撮像方法では、皮質骨片の多孔性、異種、異方性の性質を明らかにします。また、研磨面の品質を評価するために標本の高度な表面検査を行った。代表的な研磨面を図 2に示します。

4. マイクロ スクラッチ テスト

注: マイクロ スクラッチ テストはマイクロ スクラッチ試験機 (図 3) を使用して洗練されたウシ皮質骨の標本で行われます。ロックウェル圧子先端半径 200 μ m と尖角 120 度のダイヤモンドは、研究に使用されます。30 名までの線形進行負荷のアプリケーションでも使用可能します。さらに、計測器が水平荷重、浸透の深さ、傷により生成されるアコースティック ・ エミッション測定高精度センサーを装備にします。楽器は、スクラッチ溝のパノラマをキャプチャできます。

  1. 皮質骨片を試験前に参考材料3としてポリカーボネートを使用してロックウェル圧子先端を調整します。
  2. 皮質骨標本をステージに配置し、マイクロのスクラッチ試験機モジュールに統合されたセットアップ光学顕微鏡によるスクラッチ テストのサイトを選択します。
  3. 30 名の 30 mN と終了のロードの開始の負荷直線進歩的な荷重を適用します。読み込み速度は、60 N/分とスクラッチの長さ 3 mm に設定する必要があります。
  4. 短い縦方向 (図 3 b) のスクラッチ テストのシリーズを実行ウシ皮質骨標本図 3に示す。
  5. それら水和を維持するすべての 3 〜 4 スクラッチ テストのセット後 HBSS で試料表面を濡らします。
  6. 2モデルの非線形破壊力学に基づくスクラッチ試験データを分析します。

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Representative Results

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原子間力顕微鏡は、研磨面の粗さを測定に使用されました。表面粗さが関心の表面の特徴よりも小さい大きさの順序の場合親指のルールとして洗練の 1 つとして試料の資格します。この場合、60 の測定表面粗さ 40 μ x 40 μ m 領域の上の nm は明らかにこの基準内します。

対浸透力の短い縦ウシ皮質骨片に対して代表的なスクラッチ テストの深さのグラフを図 4に示します。垂直の力が所定の増分負荷されている水平力はプローブによって経験される抵抗を測定です。図 5は、フラクチャされた短い縦ウシ皮質骨表面の走査型電子顕微鏡画像を示しています。この画像チッピングや剥離表面と微小割れなど本質的な靭性化機構の発生、き裂の偏向、クラック追従。2モデルの非線形破壊力学に基づく MATLAB スクリプトを使用してマイクロのスクラッチ試験データを分析します。破壊過程の発生前にプラスチックの消費18になります。浸透深さが増加すると、破壊プロセスがアクティブになります。

観察に基づいて、単一き裂伝播図 3bに示すようと考えています。非線形破壊力学モデル1,2にスクラッチ力のスケーリング予測を構築します。同種横等方性組織は、組織レベルで皮質骨用と見なされます。図 6は、短い縦皮質骨片の破壊靱性の力のスケールを示します。延性-脆性遷移は浸透深さを変えることによって導入されました。スクラッチの力と脆性破壊主導政権でEquation 1は量に比例するEquation 2、どこでEquation 3は、プローブ形状機能1,2,3,4 5。したがって、破壊靭性、 Equation 4 1,2,3,4,5定数に向かって収束します。さらに、脆性破壊に対応するKc値は、図 6に示すように、単一のテストのためのプロットをスケーリング力に報告されます。102 微小スクラッチ テストは、図 7に示すように、短い縦ウシ皮質骨標本で実施されました。外れ値のテストは、準備と食塩でストレージの 1 週間後テストされた標本に対応します。非常に長い持続期間のための標本を格納する別の破壊靱性値につながる生理食塩水の溶液から沈殿物を形成するため表面に変更。得られた全体の破壊靭性値は 4.05±0.63 MPaEquation 5。文献報告 5.5 2.5 MPa の範囲での破壊靱性値Equation 56,8。これらの結果は、文献に基づきマイクロ スクラッチ テストから報告された破壊靱性値があることを示します。

Figure 1
図 1: 各レベルで実施した骨片や実験調査の別の階層レベルを示すグラフ。水平軸は、ナノスケール マクロからまで長さスケールに対応し、縦軸は各レベルに対応する実験を行ない、タイム スケールに対応します。(画像クレジット: 度 Mendu)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: 標本および (B) よく磨かれた短い縦骨標本のベースとして使用 (a) アルミニウム ディスクのデジタル写真この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: マイクロ スクラッチ テストウシ皮質骨試験片 (A) マイクロ スクラッチ テストのデジタル写真。120o皮質骨標本をプロービングの頂点角を有するロックウェル プローブは、ポリメチル ・ メタクリ レートに埋め込まれます。短い縦型試験片の破壊の混合モードの出現を示す骨素材を耕すスクラッチ プローブの回路図(B) 。(クレジット: アンジュ テレーズ Akono、アムリタ Kataruka 度 Mendu)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: スクラッチ溝します。スクラッチ溝 (A) のパノラマの光学顕微鏡像。スクラッチ溝の長さに沿って深さと力の(B)対応するプロット。マイクロ スクラッチ テスター ステージに接続されているセンサーによって検出された抵抗の摩擦力に対応する水平力と垂直力は皮質骨標本に適用される進歩的な直線力に対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 走査電子顕微鏡 (SEM) 像。最初の SEM 画像溝クラック偏向、亀裂ブリッジング、繊維の架橋、および倍率の異なるレベル(A) 40 (B) 10,000 X でチッピングなどのマイクロ メカニズムを示す(C) 2,400 X (D) 5, 000 X。フレデリック ・ ザイツ材料科学研究所、イリノイ大学アーバナ シャンペーン校ベックマン研究所で低真空走査型電子顕微鏡を使用してキャプチャ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: スクラッチ力とマイクロ スクラッチ イメージ(A)傷の長さに沿ってスクラッチ力のスケーリングは、破壊靭性値の収束性を示しています。Equation 1は水平力とEquation 3幾何学と浸透深さによって異なりますプローブ形状関数です。(B)短い縦方向の方向で牛骨の微小キズのパノラマの光学顕微鏡画像。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 7
図 7: 破壊靱性。短い縦ウシ皮質骨片の破壊靱性値の 102 マイクロ スクラッチ テストを示すプロットを実施しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

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マイクロのスクラッチ テストは、混合モード破壊3を誘発します。さらに、短い縦ウシ皮質骨片の破壊過程はプローブはさらに深く掘り下げて、アクティブ化されます。3 ミリメートル長い傷プローブ プリズムのボリュームは約 3,600 μ m 長い、600 μ m、幅 480 μ m 深い。この大量に均質化された応答予測を助けた。非線形破壊力学モデルJに基づく破壊耐力を抽出することができました-積分計算1,2,4

ウシ皮質骨の標本は、以前の文書5の使用されたブタの標本と比較した場合をテストするための広い領域を提供します。しかし、ウシ皮質骨の標本にブタから微細構造機能のサイズに対応する違いがあります。これは牛の標本のための新しい研磨プロトコルの開発につながった。さらに、メソッドの開発中に準備ウシ皮質骨片が準備の後 1 週間以内にテストする必要があることが観察されました。これは、テスト結果に影響を与える可能性があります大幅に食塩によるウシの標本に残留物形成を避けるためです。

さらに、短い縦ウシ皮質骨片で試験していた環境条件を制御し、標本準備のプロトコルを標準化します。これは、削減につながった試験結果のばらつきの短い縦豚皮質骨標本5 15% 以前に報告した 23% から今回の短い縦ウシ皮質骨標本の。ただし、図 7外れ値テスト結果は食塩水内のストレージの期間や傷自体の場所のような様々 な理由に起因することができます。それにもかかわらず、骨はメゾ ・ マイクロの長さスケールで異種、変動量は期待されます。

走査電子顕微鏡観察これらスクラッチ テスト中に破壊過程の発生率を示しています。強じん化機構はマイクロ、メソスケールで割れき裂の偏向、き裂、マイクロ スケールでブリッジと繊維はサブミクロン スケールでブリッジと観察された (図 5参照)。これは以前の文学19報告強じん化機構です。したがって、マイクロのスクラッチ テストは、マイクロ スケール、メソスケール採取したウシ皮質骨の破壊特性を決定します。

我々 はここで提案する方法は、標本数が少ないを必要とし、小さい長さのスケールで検体の検査ができます。例えば、一定の縦横比を持ちながら異なるサイズの標本との協力によって、巨視的スケールに延性-脆性遷移を導入します。サイズ効果破壊評価手法によると少なくとも 5 異なる規模の標本は、破壊靭性値20,21を推定する必要があります。したがって、推定 102 破壊靭性値、巨視的テスト約 510 標本のニーズ多く時間とリソースにはが含まれます。したがって、提案手法は速い速度で破壊靭性の見積もりより経済的です。さらに、さまざまな階層レベルで破壊特性の把握と効率的骨の力学を理解することが出来ます。さらに、テスト効率的かつ、再現性のある、環境規制の広い範囲の下で簡単に行なえます。例えば、環境チャンバーで食塩に浸漬テスト標本は培養条件をシミュレートする実施可能性があります。さらに、メソッドは、骨の異方性をキャプチャする縦方向横方向に骨破壊靭性をテストするのにも適用されます。したがって、本手法は、生体組織の破壊評価のための小説です。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この仕事は、土木科、環境工学とイリノイ大学アーバナ シャンペーン校工学部によって支えられました。我々 は度 Mendu の大学院の研究を支援するためラビンドラ Kinra と Kavita Kinra 交わりを認めます。フレデリック ・ ザイツ材料研究所、イリノイ大学アーバナ シャンペーン校ベックマン研究所の施設・設備で走査型電子顕微鏡による研究を行った。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table Top Diamond Band Saw McMaster Carr, Elmhurst, IL Model  C-40 Blade speed of 40 mph; Blade dimensions: 37 inch in diameter, 0.02 inch wide and 0.14 inch deep
Buehler Isomet 5000 Precision Cutter Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 112780 Blade speed in the range of 200-5000 rpm in 50 rpm incrments; 8 inch diamond wafering blade
Branson 5800 Ultrasonic Cleanser (Through) Grainger, Peoria, Illinois 39J365 Bransonic CPXH ultrasonic bath has a tank capacity of 2.5 gal
Buehler Ecomet 250 Grinder - Polisher Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 497250 8 inch base plate with a speed range from 10-500 rpm
Anton Paar, CSM Instruments Micro scratch tester Anton Paar Switzerland AG 163251 Compact Platform, Acoutstic Emission Sensor
JEOL 6060LV general purpose scanning electron microscope JEOL USA, Inc., Peabody, MA Environmental scanning electron microscope which enables imaging at low vacuum levels.
Philips XL30 ESEM FEG  FEI Company Wet mode working of the instrument enables imaging of non conductive samples without altering them 
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Bovine Femur L&M Slaughter house, Georgetown, IL Corn fed, 24-30 month old mature bovine specimens.
Alconox Powdered Precision Cleaner Alconox, Inc., 30 Glenn St., Ste. 309, White Plains, NY, 10603 1104-1 Biodegradable, Non caustic, Interfering-residue free
Acrylic Plastic Casting Electron Microscopy Sciences 24210-02 Polymethyl Methacrylate
CarbiMet SiC Abrasive Paper 400 grit, 8 inch, PSA backed Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 36080400 Grinding - Abrasive Papers
CarbiMet SiC Abrasive Paper 600 grit, 8 inch, PSA backed Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 36080600 Grinding - Abrasive Papers
MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 36080800 Grinding - Abrasive Papers
MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 16081200 Grinding - Abrasive Papers
Texmet P For 8'' Wheel PSA Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 407638 Polishing Cloth
8'' Microcloth PSA Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 407518 Polishing Cloth
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 3 µm Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 406631 Polishing suspension
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 1 µm Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 406630 Polishing suspension
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 0.25 µm Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 406629 Polishing suspension
MasterPrep Polishing Suspension, 0.05µm Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 40-6377-032 Polishing suspension
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14025126 Buffer Solution

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References

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Mendu, K., Kataruka, A., Puthuvelil, J., Akono, A. T. Fragility Assessment of Bovine Cortical Bone Using Scratch Tests. J. Vis. Exp. (129), e56488, doi:10.3791/56488 (2017).More

Mendu, K., Kataruka, A., Puthuvelil, J., Akono, A. T. Fragility Assessment of Bovine Cortical Bone Using Scratch Tests. J. Vis. Exp. (129), e56488, doi:10.3791/56488 (2017).

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