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Bioengineering

Avaliação da fragilidade do osso Cortical bovino, usando testes de zero

doi: 10.3791/56488 Published: November 30, 2017

Summary

Este estudo avalia a tenacidade à fratura de osso cortical bovino a nível sub-meso usando exames microscópicos de zero. Este é um original, objetivo, rigoroso, e reprodutível método proposto para sondar a tenacidade à fratura abaixo a escala macroscópica. Potenciais aplicações estão a estudar alterações fragilidade óssea devido a doenças como a osteoporose.

Abstract

Osso é um material complexo hierárquico com cinco níveis distintos de organização. Fatores como o envelhecimento e doenças como a osteoporose aumentam a fragilidade do osso, tornando-se sujeito a fratura. Devido ao grande impacto sócio-económico de fratura óssea na nossa sociedade, há uma necessidade de novas formas de avaliar o desempenho mecânico de cada nível hierárquico do osso. Embora a rigidez e resistência podem ser analisados em todas as escalas – nano, micro, meso-, e macroscópica – avaliação de fratura está até agora confinada aos ensaios macroscópicos. Essa limitação restringe a nossa compreensão de fratura óssea e restringe o escopo de laboratório e estudos clínicos. Nesta pesquisa, investigamos a resistência da fratura de osso do microscópico para as escalas de comprimento mesoscópica usando micro arranhão testes, combinadas com a mecânica da fratura linear. Os testes são realizados na orientação longitudinal curta em espécimes de osso cortical bovino. Um protocolo experimental meticuloso é desenvolvido e um grande número (102) de testes são realizados para avaliar a tenacidade à fratura de espécimes de osso cortical, enquanto a contabilidade para a heterogeneidade associada com a microestrutura do osso.

Introduction

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Neste estudo, podemos medir a tenacidade à fratura de osso compacto bovino na mesoescala (osteomas) para a microescala (nível lamelar) usando uma nova técnica de zero micro1,2,3,4, 5. Processos de fratura incluindo propagação iniciação e crack no osso sejam diretamente influenciados pelas escalas de comprimento devido a diferentes componentes estruturais e organização em diferentes níveis de hierarquia. Portanto, avaliar a fratura óssea em menores escalas de comprimento é essencial rendendo um entendimento fundamental de fragilidade óssea. Por um lado, compacto de testes convencionais, tais como três pontos de flexão, tensão, e testes de flexão são comumente realizadas em bovino fêmur e tíbia para caracterização de fratura em escala macroscópica6,7, 8. por outro lado, para medir a tenacidade à fratura em escala microscópica, fratura de recuo do Vicker foi proposto9. Micro recuo foi executado usando do indenter da Vicker para gerar rachaduras radiais. Além disso, o método de dureza Oliver Pharr nanoindentação fratura foi realizado usando um cubo afiada canto do indenter10.

Os estudos de resistência de fratura nanoindentação baseado acima, os comprimentos das fissuras gerados foram medidos pelo observador e um modelo semi-empíricos foi utilizado para calcular a tenacidade à fratura. No entanto, esses métodos são reprodutíveis, subjetivo, e os resultados são altamente dependentes da habilidade do observador, devido à necessidade de medir os comprimentos de rachadura usando microscopia ótica ou microscopia eletrônica. Além disso, zero testes foram conduzidos em escala nanométrica, mas o modelo matemático subjacente não é baseado em física que não leva em conta a redução da resistência devido a rachaduras e defeitos11. Assim, existe uma lacuna de conhecimento: um método para avaliação de fratura em nível microscópico com base em um modelo mecanicista baseado em física. Esta lacuna de conhecimento motivado a aplicação de micro arranhão testes para compactar osso focando primeiro espécimes suínos5. O estudo foi ainda mais estendido agora para entender o osso cortical bovino.

Duas orientações diferentes dos espécimes são possíveis: transversal longitudinal e a curta distância longitudinal. Longitudinal transversal corresponde a fratura Propriedades perpendiculares ao eixo longitudinal do fêmur. Considerando que, a curto, longitudinal corresponde às propriedades fratura ao longo do eixo longitudinal do fêmur5. Neste estudo, aplicamos testes zero de ossos corticais bovina para caracterizar a resistência de fratura do osso no sentido longitudinal curta.

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Protocol

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Nota: O protocolo descrito aqui, segue as diretrizes de cuidados com animais do Comité de uso e cuidados de Animal institucionais de Illinois.

1. o modelo contratos

  1. Coletar recém-colhidas fêmures bovina de um departamento de Estados Unidos de agricultura USDA-certificada matadouro e transportá-los em sacos de plástico de ar apertado em um refrigerador.
    Nota: Para o estudo realizado aqui, fêmures foram coletadas de animais que foram 24 a 30 meses, alimentado com milho e pesava cerca de 1.000 - 1.100 libras.
  2. Congele os fêmures no 20 ° C até o início do processo de preparação de espécime. Esta temperatura mantém os fêmures fresco12,13,14.

2. corte, limpeza e incorporando os espécimes

  1. Descongele os fêmures congelados em um recipiente com água por cerca de 2 h à temperatura ambiente.
  2. Corte vários discos de cerca de 10-15 mm de espessura da região média da diáfise usando uma serra de fita mesa top diamante para produzir espécimes com área de seção transversal uniforme do osso cortical.
  3. Use um kit de dissecação para remover qualquer tecido mole ou carne anexado ao osso cortical.
  4. As seções transversais dos fêmures obtidas na etapa 2.2 usando uma lâmina de diamante-wafering em uma velocidade baixa serra sob condições de chuva ao longo do eixo longitudinal do osso para obter várias seções aproximadamente cuboidal.
    Nota: Aqui, apenas a preparação das amostras e zero testes realizados sobre o short – amostras longitudinais são discutidas. No entanto, exceto para a direção do corte, o procedimento de preparação permanece o mesmo para a orientação transversal.
  5. Limpe os espécimes em uma solução preparada usando 1,5% aniônico limpa e água sanitária de 5% para uma duração de 20 min em um líquido de limpeza ultra-sônico.
  6. Incorporar os espécimes de osso cortical em resina acrílica (neste documento methacrylate de polymethyl (PMMA)) para facilitar a manipulação e a estabilidade.
    1. Para incorporar os espécimes, primeiro revesti as paredes do molde com um agente de liberação. Em seguida, misture a resina acrílica e o endurecedor num copo, de acordo com as instruções dadas pelo fabricante do PMMA.
    2. Coloque um dos espécimes cortar osso cortical em cada molde com a superfície a ser riscado virado para baixo. Deite a mistura de resina acrílica para estes preparados suportes de amostra. Deixe os espécimes cura para uma duração de até 4-5 h.
  7. Cortar os espécimes incorporados em discos de espesso de 5 mm, expondo a superfície a ser riscado, usando a baixa velocidade vi e montar os espécimes para discos de metal (alumínio) de diâmetro 34 mm e altura 5 mm usando adesivo de cianoacrilato.
  8. Embrulhe os espécimes em um indicador embebido em novelos balanceada salina solução (HBSS) e refrigerar a 4 ° C até o uso mais de15,16.

3. esmerilhamento e polimento de protocolos

Nota: Um pré-requisito para testes de alta precisão em escalas de comprimento pequeno é uma superfície lisa e nivelada de espécimes. Anterior de polimento protocolos13,17 resultar em uma grande rugosidade da superfície, levando a considerável imprecisão na medição. O desafio reside em conseguir baixa média rugosidade da superfície, menos de 100 nm, sobre uma superfície de2 de 3 x 8 mm de grande área.

  1. Moa as amostras de osso cortical bovino à temperatura ambiente utilizando grão 400 e 600 trabalhos de carboneto de silício de grão por 1 min e 5 min, respectivamente. Manter o moedor-polidor a base velocidades de 100 rpm e 150 rpm, respectivamente.
  2. Máquina de moer os espécimes de osso cortical bovino à temperatura ambiente sobre os documentos de grão 800 e 1.200 para uma duração de 15 min para cada etapa. Manter o moedor-polidor em uma velocidade base de 150 rpm, velocidade da cabeça de 60 rpm e operando com carga de 1 lb.
  3. Polonês os espécimes usando 3 µm e 1 µm 0,25 µm soluções de suspensão de diamante na mesma ordem em um duro, perfurado, pano não tecido para uma duração de 90 min à temperatura ambiente. Manter a carga de funcionamento de cada etapa em 1 lb com as velocidades de base e cabeça do polidor a 300 rpm e 60 rpm, respectivamente.
  4. Polir a amostra usando solução de suspensão 0,05 µm da alumina em um pano macio, sintética rayon para uma duração de 90 min no 1 lb com base e cabeça a velocidade de 100 rpm e 60 rpm, respectivamente, também à temperatura ambiente.
  5. Colocar as amostras em um copo com água desionizada e colocar o béquer em um banho ultra-sônico por 2 min entre cada etapa consecutiva de esmerilhamento e polimento para limpar os resíduos e evitar a contaminação cruzada.
  6. Ver os as características de superfície usando microscopia ótica e SEM imagem.
    Nota: Como mostrado na Figura 1, osteomas, canais de Havers, linhas de cimento, regiões intersticiais e lacunas foram observadas em espécimes do osso cortical bovino. Esses métodos de imagem revelam a natureza porosa, heterogênea e anisotrópica de espécimes de osso cortical. Além disso, avançado exame de superfície das amostras foi realizada para avaliar a qualidade da superfície polida. Uma superfície polida representativa é mostrada na Figura 2.

4. micro teste de alergia

Nota: Micro arranhão de testes é realizado sobre as amostras de osso cortical bovino polido usando um micro testador de zero (Figura 3). Um diamante do indenter de Rockwell com um raio de 200 µm e apex ângulo de 120° é usado para o estudo. O instrumento permite a aplicação de uma carga linear progressiva até 30 s. Além disso, o instrumento é equipado com sensores de alta precisão para medir a carga horizontal, profundidade de penetração e emissões acústicas geradas devido a coçar. O instrumento pode capturar os panoramas de sulcos zero.

  1. Antes de ensaios de amostras de osso cortical, calibre a ponta do indenter de Rockwell usando policarbonato como material de referência3.
  2. Colocar a amostra de osso cortical no palco e escolha o site de teste de alergia, usando o microscópio ótico configurar integrado ao módulo de micro testador de zero.
  3. Aplicar uma carga linear progressiva com uma carga inicial de 30 mN e final de carga de 30 s. A taxa de carregamento deve ser definida como 60 N/min e o comprimento de zero a 3 mm.
  4. Executar a série de testes de zero sobre o curta longitudinal (Figura 3b) amostras de osso cortical bovino, conforme ilustrado na Figura 3.
  5. Molhe a superfície do espécime com HBSS após um conjunto de todos os três a quatro testes de zero para mantê-los hidratados.
  6. Analise os dados de teste cutâneo com base na mecânica da fratura não-linear modelagem2.

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Representative Results

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Microscopia de força atômica foi usada para medir a rugosidade da superfície polida. Como regra geral, o espécime qualifica-se como um bem polido se a aspereza de superfície é uma ordem de magnitude menor do que as características da superfície de interesse. Neste caso, a aspereza de superfície medida de 60 nm sobre uma área de µm 40 µm x 40 inscreve-se claramente este critério.

A Figura 4 mostra a força contra penetração gráficos de profundidade de representante zero testes realizados na amostra curta osso cortical bovino longitudinal. Enquanto a força vertical é a carga incremental prescrita, a força horizontal é a resistência medida experimentada pela sonda. A Figura 5 mostra as imagens de microscopia eletrônica de varredura varredura de superfície fraturada curto longitudinal bovino cortical óssea. Esta imagem mostra a lascar e descamação da superfície e ocorrência de mecanismos de endurecimento intrínsecos como micro rachaduras, deflexão de crack e quebrar a ponte. Os dados de teste de alergia micro são analisados usando scripts MATLAB baseados na mecânica da fratura não-linear modelagem2. Antes da ocorrência do processo de fratura, haveria dissipação plástico18. À medida que aumenta a profundidade de penetração, processos de fratura são ativados.

Com base na observação microscópica, consideramos que uma única rachadura de propagação como mostrado na Figura 3b. Construímos uma mecânica de fratura não-linear modelo1,2 para prever o dimensionamento da força de zero. Uma microestrutura homogênea de isotrópica transversal é considerada para o osso cortical no nível do tecido. A Figura 6 mostra o dimensionamento da força da tenacidade à fratura das amostras de osso cortical longitudinal curta. Uma transição dúctil-para-frágil é introduzida, variando a profundidade de penetração. No regime frágil e orientado a fratura, a força zero Equation 1 é proporcional à quantidade Equation 2 , onde Equation 3 é a sonda forma função1,2,3,4, 5. Portanto, a tenacidade à fratura, Equation 4 1,2,3,4,5 converge em direção a uma constante. Além disso, um valor de Kc que corresponde a uma fratura frágil é relatado na força de dimensionamento trama para um único teste, conforme mostrado na Figura 6. micro 102 zero testes foram conduzidos em espécimes curto osso cortical bovino longitudinal conforme mostrado na Figura 7. Outlier testes correspondem os espécimes que foram testados após uma semana de preparação e armazenamento da solução salina. Armazenar a amostra para uma longa duração alterado a superfície devido à formação de precipitado da solução salina levando a valores de dureza diferente da fratura. O valor de dureza total fratura obtido é 4.05±0.63 MPaEquation 5. A literatura relatou valores de dureza fratura na faixa de 2,5 a 5,5 MPaEquation 56,8. Esses resultados mostram que os valores de dureza fratura relatados a partir dos testes de zero a micro estão de acordo com a literatura.

Figure 1
Figura 1: um gráfico mostrando os diferentes níveis hierárquicos de amostras de osso e as investigações experimentais realizadas em cada nível. O eixo horizontal corresponde a escala de comprimento variando de macroescala a nanoescala e o eixo vertical corresponde à escala de tempo no qual são realizados os experimentos correspondentes a cada nível. (Crédito da imagem: Kavya Mendu). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: fotografias digitais de discos de alumínio (a), usados como uma base para os espécimes e amostra de osso longitudinal curta (B) bem polido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Micro arranhar o teste Fotografia digital do micro zero teste sobre a amostra de osso cortical bovino (A). Uma sonda de Rockwell com um ângulo de vértice de 120ó sondando a amostra de osso cortical incorporado em polimetacrilato de metila. (B) esquema de uma sonda zero lavrar o material ósseo mostrando o advento de um modo misto de fratura em uma amostra longitudinal curta. (Créditos: Ange-Therese Akono, Amrita Kataruka e Kavya Mendu). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: sulco zero. Imagem de microscopia óptica do panorama do sulco zero (A). (B) correspondente a trama da força contra a profundidade ao longo do comprimento do sulco zero. Força horizontal corresponde a força de fricção resistiva detectada pelos sensores anexados à fase micro testador de zero e a força vertical corresponde à força linear progressiva aplicada sobre a amostra de osso cortical. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: digitalização de imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV). Imagens SEM da risque groove mostrando micro mecanismos como rachadura deflexão, rachadura ponte, ponte de fibra e lascar-se em níveis diferentes de ampliação (A) 40 X (B) 10.000 X (C) 2.400 X (D) 5, 000 X. Capturado usando o baixo vácuo, microscópio eletrônico de varredura no Frederick Seitz Material Science Laboratory e Beckman Institute, Universidade de Illinois em Urbana-Champaign. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Scratch força e micro imagem zero. (A) escala da força zero ao longo do comprimento da risque mostra a convergência de tenacidade à fratura. Equation 1 é a força horizontal e Equation 3 é a função de forma de sonda que depende da profundidade de penetração e geometria. Imagem de microscopia óptica panorâmica (B) de um micro arranhão no osso bovino na direcção longitudinal curta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: fratura tenacidade. Plot mostrando fratura valores de dureza dos 102 micro arranhão testes realizados sobre os espécimes curto osso cortical bovino longitudinal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Testes de zero micro induzir uma fratura de modo misto3. Além disso, nas amostras curtas longitudinais osso cortical bovino, processos de fratura são ativados como a sonda cava mais fundo. Para um arranhão de longo de 3 mm, o volume prismático sondado é cerca de 3.600 µm de comprimento, 600 µm de largura e 480 µm profundo. Este grande volume ajudou em prever uma resposta homogeneizada. Um modelo de mecânica de fratura não-linear permitiu-nos extrair a resistência da fratura baseada o J-cálculo integral1,2,4.

Amostras de osso cortical bovino prevejam a uma área maior quando comparado com os espécimes de suínos que foram utilizados para a publicação anterior5. No entanto, há uma correspondente diferença no tamanho das características da microestrutura de suínos para amostras de osso cortical bovino. Isto levou ao desenvolvimento de um novo protocolo de polimento para os espécimes bovinos. Além disso, durante o desenvolvimento do método, foi observado que as amostras de osso cortical bovino preparado precisam ser testados dentro de uma semana após o preparo. Isso é para evitar a formação de resíduos sobre os espécimes bovinos devido a solução salina, que drasticamente pode afetar os resultados do teste.

Além disso, os testes realizados sobre os espécimes curto longitudinal osso cortical bovino tinham condições ambientais controladas e padronizado de protocolos de preparação de espécime. Isto levou a uma redução na variabilidade dos resultados dos testes dos 23% relatado anteriormente para curto longitudinal porcina osso cortical espécimes5 a 15% para os espécimes de curto osso cortical bovino longitudinal neste estudo. No entanto, na Figura 7, resultados do teste de outlier podem ser atribuídos a várias razões, como a duração do armazenamento em água salina ou localização da risque em si. No entanto, dado que o osso é heterogêneo no meso - e microscópico de escalas de comprimento, uma certa quantidade de variabilidade é esperada.

Microscopia eletrônica mostra a incidência de processos de fratura durante estes testes de zero. Mecanismos de endurecimento, tais como micro rachaduras na escala meso, deflexão de crack e crack-ponte na microescala e fibra-ponte à escala sub mícron foram observados (ver Figura 5). Isto está em conformidade com os mecanismos toughening relatados anteriormente na literatura19. Assim, o micro arranhão testes determinar as propriedades de fratura de espécimes de osso cortical bovino de meso escala para micro escala.

O método que propomos aqui requer um pequeno número de espécimes e permite que o teste dos espécimes em menores escalas de comprimento. Por exemplo, transição dúctil para frágil é introduzida à escala macroscópica por trabalhar com amostras de tamanhos diferentes, tendo uma proporção constante. De acordo com a técnica de avaliação de fratura do tamanho efeito, pelo menos 5 amostras de tamanhos diferentes são necessários para estimar o valor de dureza uma fratura20,21. Assim, para estimar a fratura 102 dureza valores, macroscópica precisa testar amostras de cerca de 510 que envolve um monte de tempo e recursos. Assim, este método que propomos estima a tenacidade à fratura em um ritmo mais rápido e mais econômico. Além disso, compreender as características de fratura em diferentes níveis hierárquicos permite-nos compreender a mecânica do osso mais eficientemente. Além disso, testes é eficiente, Reproduzível e podem facilmente ser realizado sob uma ampla gama de controles ambientais. Por exemplo, amostras de testes submergidas em uma solução salina em uma câmara ambiental podem ser efectuadas para simular condições em vitro . Além disso, o método será também aplicado para testar a tenacidade à fratura óssea na direcção longitudinal e transversal para capturar anisotropia no osso. Assim, nosso método é que um romance significa para a avaliação de fratura de tecidos biológicos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo departamento de Civil e engenharia ambiental e da faculdade de engenharia da Universidade de Illinois em Urbana-Champaign. Reconhecemos a Ravindra Kinra e Kavita Kinra Fellowship para apoio a pós-graduação de Kavya Mendu. Investigação de microscopia eletrônica de varredura foi realizada nas instalações do laboratório de pesquisa de Material Frederick Seitz e Beckman Institute na Universidade de Illinois em Urbana-Champaign.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table Top Diamond Band Saw McMaster Carr, Elmhurst, IL Model  C-40 Blade speed of 40 mph; Blade dimensions: 37 inch in diameter, 0.02 inch wide and 0.14 inch deep
Buehler Isomet 5000 Precision Cutter Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 112780 Blade speed in the range of 200-5000 rpm in 50 rpm incrments; 8 inch diamond wafering blade
Branson 5800 Ultrasonic Cleanser (Through) Grainger, Peoria, Illinois 39J365 Bransonic CPXH ultrasonic bath has a tank capacity of 2.5 gal
Buehler Ecomet 250 Grinder - Polisher Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 497250 8 inch base plate with a speed range from 10-500 rpm
Anton Paar, CSM Instruments Micro scratch tester Anton Paar Switzerland AG 163251 Compact Platform, Acoutstic Emission Sensor
JEOL 6060LV general purpose scanning electron microscope JEOL USA, Inc., Peabody, MA Environmental scanning electron microscope which enables imaging at low vacuum levels.
Philips XL30 ESEM FEG  FEI Company Wet mode working of the instrument enables imaging of non conductive samples without altering them 
Name Company Catalog Number Comments
Consumables
Bovine Femur L&M Slaughter house, Georgetown, IL Corn fed, 24-30 month old mature bovine specimens.
Alconox Powdered Precision Cleaner Alconox, Inc., 30 Glenn St., Ste. 309, White Plains, NY, 10603 1104-1 Biodegradable, Non caustic, Interfering-residue free
Acrylic Plastic Casting Electron Microscopy Sciences 24210-02 Polymethyl Methacrylate
CarbiMet SiC Abrasive Paper 400 grit, 8 inch, PSA backed Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 36080400 Grinding - Abrasive Papers
CarbiMet SiC Abrasive Paper 600 grit, 8 inch, PSA backed Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 36080600 Grinding - Abrasive Papers
MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 36080800 Grinding - Abrasive Papers
MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 16081200 Grinding - Abrasive Papers
Texmet P For 8'' Wheel PSA Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 407638 Polishing Cloth
8'' Microcloth PSA Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 407518 Polishing Cloth
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 3 µm Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 406631 Polishing suspension
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 1 µm Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 406630 Polishing suspension
Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 0.25 µm Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 406629 Polishing suspension
MasterPrep Polishing Suspension, 0.05µm Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 40-6377-032 Polishing suspension
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14025126 Buffer Solution

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References

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Avaliação da fragilidade do osso Cortical bovino, usando testes de zero
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Mendu, K., Kataruka, A., Puthuvelil, J., Akono, A. T. Fragility Assessment of Bovine Cortical Bone Using Scratch Tests. J. Vis. Exp. (129), e56488, doi:10.3791/56488 (2017).More

Mendu, K., Kataruka, A., Puthuvelil, J., Akono, A. T. Fragility Assessment of Bovine Cortical Bone Using Scratch Tests. J. Vis. Exp. (129), e56488, doi:10.3791/56488 (2017).

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