Summary
אנו מציגים את פרוטוקול לנצל את המדגסקר שריקה מקק בתור מודל אלטרנטיבי של בעלי חיים שאינם מידע יונקים לבצע התקפה אלימה חיידקי, פתוגנזה, רעילות התרופה, יעילות התרופה ולאחר מחקרים תגובה חיסונית מולדת.
Abstract
היבטים רבים של מולדת חסינות נשמרים בין יונקים וחרקים. חרק, ממדגסקר שריקה מקק מן הסוג Gromphadorhina, יכול להיות מנוצל כמו במודל חיה חלופיים לצורך המחקר של התקפה אלימה, אינטראקציה פתוגן-פונדקאי, תגובה חיסונית מולדת יעילות התרופה. פרטים לגידול, טיפוח והשבחה של השריקה המקק הינם מסופקים. אנחנו גם מדגימים איך זה יכול להיות נגוע עם חיידקים כגון פתוגנים תאיים Burkholderia mallei, נולד ב- pseudomallei, נולד ב- thailandensis. השימוש המקק השריקה זולה, מתגבר על בעיות רגולטוריות התמודדות עם השימוש של יונקים במחקר. בנוסף, תוצאות נמצאו באמצעות מודל מקק השריקה הם דומים לאלו שהושגו באמצעות מודלים בתרבית של הדירים. לפיכך, המקק השריקה מדגסקר מייצג מארח הפונדקאית אטרקטיבי שיש לבחון בעת עריכת מחקרים שנעשו בבעלי חיים.
Introduction
השימוש של חרקים כמו חלופי שאינו מידע יונקים חייתיים ללמוד פתוגנזה חיידקי והגנה מארח מולדת צובר תאוצה בשנים האחרונות. לוגיסטית, זאת בשל העלות זולה יחסית שלהם ואת ההקלות קבלת טיפול, דאגה חרקים לעומת יונקים. יש גם אין מדיניות רגולטוריים המפקחים על השימוש חרקים במחקר; הוא אינו כפוף לתחומו או מגבלות שנקבעו על ידי בעל חיים להשתמש סוכנות הוועדה או הממשלה. חרקים בתור פונדקאית חייתיים נתונות במיוחד הקרנה מקיפה ללימודי הגורמים התקפה אלימה אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, הערכות של יעילות התרופה אנטי מיקרוביאליים. השימוש בהם יכול להפחית את המספר של יונקים המשמש למחקר ובכך להתגבר על חלק דילמות אתיות הגלום להתנהגותו של ניסויים בבעלי חיים 1,2.
חרקים עשוי לשמש פונדקאית המארחים כי יש רמה גבוהה של אחידות בין מערכות החיסון מולדים של 1,של חרקים, יונקים-3. Plasmatocytes חרק וגם בתרבית של מקרופאגים phagocytose מיקרואורגניזמים 4. לכנף חרקים נויטרופילים הוא 5,hemocyte6. פרץ חמצוני תאיים מסלולים חרק, בתרבית של תאים דומים; מינים חמצן תגובתי והן מופקים על ידי orthologous p47phox ו- p67phox חלבונים 5. למפל איתות במורד הזרם של רצפטורים אגרה חרקים, רצפטורים כמו אגרה, Interleukin-1 יונקים הם גם דומה להפליא; שניהם תוצאה של הייצור של פפטידים מיקרוביאלית, כגון defensins 7. לפיכך, חרקים יכול להיות מנוצל כדי לחקור מנגנונים חיסוניים מולדת כללי שמשותפות metazoans.
חרק הנקרא ממדגסקר שריקה מקק מן הסוג Gromphadorhina, הוא אחד המינים הג'וק הגדול ביותר שקיים, להגיע בדרך כלל 5-8 ס מ בעת הפירעון. היא רק ילידי האי מדגסקר, מאופיין על ידי קול השריקה שזה גורם - צליל המופק בעת המקק השריקה גירשה אוויר דרך פתחים הנשימה נקרא spiracles 8. היס ייחודי מגישה כסוג של תקשורת חברתית בקרב שריקה מקקים חיזור ותוקפנות 9 , ניתן לשמוע כאשר זכר מופר בסביבה שלה. מדגסקר שריקה מקק זז לאט בהשוואה תיקן אמריקני את ומינים מזיקים עירוניים אחרים. קל לטפל, להתרבות; מקק השריקה בהריון יכול לייצר צאצאים 20-30 בכל פעם. תינוק שריקה מקק, הנקרא נימפה, מגיע לבגרות מינית בתוך 5 חודשים אחרי שעברו 6 ומתנשל לדרגה הבאה, לחיות עד 5 שנים הן בטבע והן בשבי 8.
אנחנו נעזרו ממדגסקר שריקה מקק כמארח של הפונדקאית זיהום עם פתוגנים תאיים Burkholderia mallei, נולד ב- pseudomalleiו- thailandensis נולד ב- 10,11. התקפה אלימה של אלה פתוגנים ב שריקה מקקים נמשל לאלימות ולגרימת שלהם במודל החייתי של בחינת ביצועים עבור Burkholderia, האוגר הסורי. מצאנו כי מנה קטלנית 50% (LD50) נולד ב- pseudomallei , נולד ב- mallei היה דומה בשני מודלים 11. מעניין, נולד ב- thailandensis, למרות avirulent במודל מכרסמים, הוא קטלני הג'וק השריקה 11. ההבדל ביחס thailandensis דרב זיהום מדגישה את התועלת של המודל מקק השריקה; Thailandensis נולד ב- attenuating מוטציות ניתן לפתור בקלות רבה יותר בהמקק השריקה מאשר דגמים מכרסמים. יתר על כן, כפי thailandensis דרב משמש לעתים קרובות אורגניזם מודל עבור נולד ב- pseudomallei ו- mallei נולד ב- 10,12,13, זיהוי מוטציות attenuating זה יכול להוביל מטרות דומות וקרוביו יותר מידבק.
למרות ההבדל התקפה אלימה של thailandensis דרב בהמקק השריקה נגד האוגר הסורי, מוטציות בגן הגורמים התקפה אלימה קריטיים, כגון אלה סוג 6 הפרשת המערכת-1 (T6SS-1), אשר הם attenuating, נולד ב- mallei , נולד ב- pseudomallei, הם בדומה attenuating thailandensis נולד ב- 11. השריקה מקק מודל נוסף מאומת כי הפרט T6SS (T6SS-2 ל- T6SS-6) בו מוטציות pseudomallei דרב, אשר להם כל השפעה על התקפה אלימה על אוגרים סוריים, נשארים מידבק המקקים השריקה 11. לפיכך, השריקה המקק הוא מודל בעלי חיים הפונדקאית קיימא עבור שלושה מינים Burkholderia . אנחנו לאחרונה מנוצל המקק השריקה כמו במודל חיה הפונדקאית לבחון את היעילות של כלורוקין סמים נגד מלריה (CLQ) נגד זיהום Burkholderia 10 ו שלה רעילות.
כאן, אנו מתארים את גידול וטיפול של מדגסקר שריקה מקק ולספק פרטים על איך להדביק את המזיק הזה עם שלושה מינים Burkholderia . יתר על כן, אנו ממחישים את המקק השריקה הוא מודל הפונדקאית קיימא ללמוד התקפה אלימה, יעילות התרופה זיהומים Burkholderia , כי סביר להניח יכול לשמש כמחשב מארח הפונדקאית עבור אחרים פתוגנים חיידקיים במחקרים דומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תכשירים לשמירה על מושבה מקק השריקה
- להכין כלוב המקקים השריקה לחיות. למרוח שכבה דקה של וזלין, כ 20-30 מ מ רוחב, על ההיקף של הקירות הפנימיים בסמוך לחלקו העליון של הכלוב כדי למנוע את הג'וקים השריקה לטפס הכלוב, בריחה.
הערה: שריקה ג'וקים יכולים להיות בבניין מגוון מכולות זה יש רווח גדול בקומה, הן של גובה מספיק, ויש העפעפיים. להשתמש בעכבר הכלובים (~ 43 ס"מ על 23 ס"מ x 20 ס"מ). עבור הכלובים המיועדים 37 ° C, אינן חלות וזלין. - כוללים קרטון קרטון ביצים מניחים הפוך בתוך הכלוב כדי לספק מקום מסתור עבור החרקים ביישן מטבעי. לא מחליפים את תבנית ביצים קרטון עם אחד העשויים פוליסטירן מוקצף כדי למנוע בליעה של פלסטיק.
- אינם מספקים מצעים עבור קל יותר לנקות, כדי להגדיל את התצוגה של נימפות בימיו.
- להשיג מזון כלבים יבש אשר מכיל הרכב של הפרוטאין הגולמי ~ 20%. גס לטחון את האוכל של הכלב עם מעבד מזון או בלנדר, לאחסן ב 4 º C.
- להשיג מספר מנות רדוד, אקווריום אבנים או ספוג מים ומזון.
הערה: צלחות פטרי הם מומלץ.
2. השריקה מקק טיפוח והשבחה
- להשיג outbred מדגסקר שריקה ג'וקים (~ 5 ס מ) מ תרבית מסחרי. המין בשימוש פרוטוקול זה הוא Gromphadorhina laevigata. לפרוק את תיבת המשלוח המכילה את הג'וקים השריקה מיד עם קבלת.
- פעל לפי ההנחיות מוסדי מתאים לשימוש של ציוד מגן אישי בטיפול בבעלי חיים.
הערה: השתמש עבה כפפות חד פעמיות עבור טיפול תיקנים כמו ציפורניים tarsal של מקק השריקה החדה. - העברה עד 75 מקקים השריקה גדול (> 3 ס מ) לכל כלוב גדול. העברת הנימפות עתה בקעו וכבר קטן יותר (< 3 ס מ) לכלוב נפרד.
הערה: שמירה באופן משמעותי יותר מ 75 גדול שריקה מקקים לכל כלוב עכבר יכול להוביל הידרדרות בריאותו של המושבה, יכול גם לגרום למותם. - לטפל מקק לאחרונה molted, אשר הוא אפור בצבע, בעדינות ולהימנע ללחוץ עליה. לחלופין, אפשר שלד חיצוני להכהות להקשיח לפני הטיפול.
הערה: אין צורך להסיר קרדית, Gromphadorholaelaps schaeferi, המלוות לעיתים קרובות השריקה ג'וקים עם קבלת מן המגדלים. קרדית מועיל לשמור את הג'וקים השריקה נקי, מזיק לבני אדם. - הזנה שריקה ג'וקים עם קרקע מזון כלבים יבש בקערה רדודה פעם או פעמיים בשבוע. מספקים מספיק מזון לכלבים כדי לוודא הג'וקים השריקה אין די מזון עד ההאכלה הבאה. להתעלם כל מזון הפך רטוב לחות ועובש.
- בנוסף מזון לכלבים, מספקים טחונים פירות וירקות, כגון תפוחים, תפוחי אדמה או חסה, בקערה רדודה. להשליך מזון מעופש או רקובים.
- מספקים את מי השתייה פעם או פעמיים בשבוע בקערה רדודה, אך אל תמלא יותר מדי את המנה כדי למנוע זליגת בכלוב. הכנס המנה כדי לספק משטח נחיתה קטן נימפות אקווריום קטן אבנים או ספוג. השתמש מים אוסמוזה הפוכה, אם זמין.
- לשמור על שריקה מקקים בחושך בטמפרטורות הנעות בין 21 ° C ל-30 מעלות צלזיוס. שמור גדול מקקים השריקה המיועדים ניסויים בטמפרטורה נמוכה יותר (~ 21 ° C) ~ 2 חודשים להקטין את הרבייה והריון. לעומת זאת, שמור נימפות בטמפרטורות גבוהות יותר (28 ° C עד 30 ° C) לזרז את הצמיחה.
הערה: שמור הכלובים בטמפרטורת החדר (21 ° C) אפל הקבינט. - לספק לחות על-ידי הכללת במחבת נפרדת של מים, אם שריקה מקקים נשמרים בתוך אינקובטור.
- לנקות את הכלוב על ידי חפנה את צואה יבשה באופן קבוע או על ידי העברת שריקה תיקנים כדי כלוב נקי כל 2-3 שבועות. שמור את תחתית הכלוב היבש. לנקות את הכלוב מיד אם המים העודפים מותר לערבב עם צואה בתחתית הכלוב ולצבור.
3. מקק הכנה לניסויים
- העברת מספר מתאים של מקקים השריקה בכלוב חממה humidified 37 ° C 1 עד 3 שבועות לפני ניסוי עבור והפיזיולוגי. כולל קבוצת בקרה עבור הזרקה. תקופה זו להתאקלמות היא קריטית עבור הימנעות הלם טמפרטורה במהלך ניסויים.
- אל תחיל וזלין לכלובים המיועדים 37 ° C כי הטמפרטורה גבוהה יותר ממיסה את הג'לי.
- בדוק את הג'וקים השריקה כל 1-2 ימים להחליף מזון ומים. ולנקות את הכלוב.
- להשיג את מיכלי מזון פלסטיק חד פעמיות ברורה בשלמותם קיבוץ המקקים השריקה במהלך ניסויים. אוורור, לנקב חורים המכסה או בצידי המיכל עם מסמר, פטיש.
הערה: שימוש מכולות בורג מכסה על הצמד קאפ מכולות בהגדרת אבטחה ברמה 3. כובע הצמד מכולות יכול לחזק עם הקלטת, במידת הצורך. - ביום של הזרקת, להפיץ מקקים השריקה שחייה בטמפרטורה משתנה 6-12 קבוצות לכל מיכל, להבטיח חלוקה שוויונית על ידי סקס, מסת הגוף.
- לקבוע את המין של הפרט מקקים השריקה. לקבוע את המין על ידי חשיבותו של קרניים נמצאו על הזכרים ועל העדר הימנו על הנקבות.
- שוקלים את הג'וקים השריקה בודדים. כדי להקל על שקילת מקק השריקה על האיזון, הקף אותו בתוך שתי סירות שוקלים את זה יש כבר tared.
הערה: עקביות בין ניסויים, השתמש תיקנים השריקה עם משקל של 4 עד 8 g. עם זאת, אין הבדל בהישרדות לאחר ההדבקה נמצאו בין קטן (1.5-2 גרם) ג'וקים השריקה גדול (6-8 גרם). ללימודים סמים, השתמש תיקנים השריקה עם משקל של ~ 5 g בריכוז התרופה עקבית יותר לכל הגוף המונית. - במקום צלחת המים, כולל מים גבוהה תוכן פירות או ירקות, כמו פרוסת תפוח או תפוחי אדמה. להתעלם אוכל רקוב. אינם מספקים מים נוספת לשמור על המכולה יבש.
- לחזור מקקים השריקה 37 ° C עד זריקות.
4. חיידקי תרבות, ההכנות
הערה: המין בקטריאלי בשימוש פרוטוקול זה הם mallei נולד ב- pseudomallei נולד ב-, נולד ב- thailandensis. כל המניפולציות ועם mallei נולד ב- pseudomallei נולד ב- חייב להתבצע ב- Class II או ארונות בטיחות ביולוגית השיעור השלישי ממוקם ברמת אבטחה (BSL) מעבדה 3. לבצע מניפולציות עם thailandensis דרב בבטיחות ביולוגי דומה ארונות ממוקם גם במעבדה BSL2 או BSL3. בצע הליך מקובל מוסדיים לעבודה BSL3. בצע המוסדיים הנחיות לשימוש של ציוד מגן אישי בעת טיפול חיידקים.
- להכין צלחת הבסיס של Burkholderia לפחות 3 ימים לפני זיהום. השתמש לוריא-Bertani (לנוקס) (LB) אגר נולד ב- pseudomallei או thailandensis דרב , שימוש LB אגר בתוספת 4% גליצרול עבור mallei דרב. פס מחיידקים מניה גליצרול 25% המאוחסנים ב- 80 ° c
הערה: תמיד צובעות את הצלחת המאסטר ישירות מן המלאי גליצרול קפוא; למנוע מעבר סדרתי של החיידק מן צלחת על צלחת כמו זו עלולה לגרום מופחתת התקפה אלימה. - לחסן 10 עד 20 מ ל LB מרק עם מספר מושבות נולד ב- pseudomallei או thailandensis דרב מהצלחת הראשית. באופן דומה לחסן LB מרק בתוספת 4% גליצרול עבור mallei דרב.
- לנער את התרבות מרק-175 עד 250 סל"ד ב 37 ° C עבור ~ 18 h.
- צנטריפוגה 2-3 מ"ל של תרבות ב g x 5,000 למשך 10 דקות.
- למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר חיידקי בתוך תמיסת מלח סטרילית פוספט buffered (PBS, 137 מ מ NaCl, מ מ 2.7 אשלגן כלורי, 10 מ מ נה2PO4, מ מ 1.8 ח'2PO4, pH 7.4).
- לדלל את החיידקים עם PBS כדי להשיג צפיפות אופטית (OD) של 0.5, נמדד ב ספיגת על 600 nm בספקטרופוטומטר.
- באופן סדרתי לדלל החיידקים ten-fold PBS ב מ OD ההתחלתי של 0.5. השתמש תרחיפים אלה עבור זיהום.
- לקבוע את המושבה יוצרי יחידות (CFU) inoculum על ידי דילול טורי, ציפוי של 100 aliquots µL במדיה אגר. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות.
5. סמים ההכנות
- לקבוע את הכמות המתאימה של התרופה תינתן לכל הגוף המונית. המינון CLQ שניתנה המקק השריקה התבססה על מינון רגיל עבור יונקים, אשר הוא 50 מ"ג/ק"ג/יום.
- Resuspend או לדלל את התרופה עניין ברכב. לדוגמה, לדלל CLQ ב- PBS ב ריכוז של 12 מ"ג/מ"ל. ריכוז זה מספק 300 µg של התרופה כדי g ~ 6 שריקה מקק ב µL 25 מוזרק נפח.
- במידת הצורך, לעקר את הפתרון סמים על ידי העברתו דרך מסנן 0.22 של מזרק מיקרומטר.
- לאחסן את הפתרון סמים ב 4 ° C עד השימוש. חממו את הפתרון סמים לפחות 21 מעלות (טמפרטורת החדר) לפני זריקות.
6. הרכבה של מזרק
- הגדר את המצביע כדי לנפח הרצוי (25 µL) על-ידי סיבוב הבורג התאמה על פיפטה חוזרות.
- לדחוף פנימה הבר שחרור של פיפטה החוזרות על עצמן ולמשוך הסוחר כלפי חוץ. פיפטה חוזרות עכשיו הוא מוכן לאכלוס מזרק טעון.
הערה: כיילו את אמצעי האחסון נפלט באמצעות פיפטה החוזרות על עצמן על ידי מדידת כמות המים נפלט על איזון. - ממלאים מזרק 1 מ"ל ההשעיה המכיל חיידקים או סמים.
- לצרף מזרק סטרילי 26 או 27 G x ½ אינץ ' (או קצרים יותר) של מחט.
- הקש על המזרק כדי להציף את בועות האוויר למעלה ולהוציא הבועות ומתלים קצת לתוך מיכל מלא עם 10% מלבין.
- הצמד את המזרק אל הסרטון מזרק של פיפטה החוזרות על עצמן עם שפוע המחט פונה כלפי מעלה.
- משוך בשורת השחרור כלפי חוץ ולחץ על לחצן מנפק בחוזקה כדי לבצע זריקות ריקה לתוך מיכל מלא עם אקונומיקה 10% עד הבוכנה מזרק נגד הסוחר.
- לבצע 1 או 2 זריקות ריקים נוספים כדי להבטיח להיות הוצאת נוזל החוצה המזרק. פיפטה החוזרות על עצמן מוכן לזריקות.
7. מקק זריקות
- לבצע כל מקק זריקות Class II או III בכיתה בטיחות ביולוגית הקבינט ב- BSL2 או BSL3 הגדרה באמצעות המוסדיים מומלץ ציוד מגן אישי.
- ניקוי משטחי עבודה בבטיחות ארון זה עשוי לבוא במגע עם המקקים השריקה. משתמשת במלבין 10% ואחריו אתנול 70% כדי להסיר שאריות אקונומיקה. לאפשר למשטח אוויר יבש.
- עם יד אחת, אחיזה המקק השריקה לצידו. לשתק מקק השריקה כך שאין ביכולתה ובצינתם במהלך ההזרקה. לכופף את המקק השריקה מעט כך הקרומים עורית בין terga בטן חשופים.
- עם היד השנייה, החזק את פיפטה חוזרות כך המחט היא על 0° זווית 30 מעלות מעל האמצע dorso-הגחוני / של השריקה המקק. לנקב את הקרום עורית סמוכים של 3rd, 4thאו 5th tergum מהקצה האחורי.
הערה: הפוסט של המחט לתוך המקק השריקה בזווית המצוין מבטיחה המחט לא לעבור דרך יציאה של השריקה המקק. ההזרקה מבטיחה כי החומר בשניה נכלל בתוך חלל הבטן מלאה hemolymph. תרגול מחזיק את הג'וקים השריקה, הזרקת מים לפני שיחתמו זריקות עם חיידקים חיים או סמים. - לחצו על הכפתור dispense בחוזקה כדי להזריק את אמצעי האחסון. למשוך בעדינות את המחט באותה הזווית המשמשים להזנת.
- המקום המקק השריקה מוזרק במיכל נפרד כדי להבדילה המקקים השריקה זה לא עדיין היה להזריק. . תנגב את כל hemolymph כי אולי יש נדפה החוצה מן ההזרקה.
- המשך הזרקת אחרים מקקים השריקה בתוך קבוצה באמצעות מזרק באותה המחט. להפסיק להזריק לפני המשאבה מזרק מגיע לתחתית החבית למניעת מינון לא הושלמה ב הזריקה האחרונה.
- עבור מספר זריקות מקק השריקה יחיד, כגון אלה עם חיידקים, סמים, להזריק-צדדים שונים של tergum בצד הגבי של המקקים השריקה. לחלופין, לבצע זריקות מרובות באמצעות הזרקת-terga שונים (3rd 5th).
- ודא כי המכסים של המכולות מהודקות. מחזקים את המכסים עם הקלטת, במידת הצורך.
- דגירה שריקה המקקים חממה humidified-37 מעלות צלזיוס.
8. הקלטה שריקה מקק התחלואה והתמותה
- לבצע כל בחינות מקק השריקה Class II או III בכיתה בטיחות ביולוגית ארון עם המוסדיים מומלץ ציוד מגן אישי. ניקוי המשטחים בבטיחות ארון עם 10% מלבין ואחריו 70% אתנול. לאפשר מרחב העבודה אוויר יבש.
- ציון השריקה מקקים פעם או פעמיים בכל יום על פני תקופה של שבועות 1 עד 2 באמצעות התחלואה ניקוד טבלה (טבלה 1).
- הסר ג'וקים מתים השריקה מהגורם והקלט מספר הניצולים.
- העברת הנותר חי שריקה מקקים במיכל נקי אם לחות עודפת צבר בתחתית המיכל. לחלופין, השתמש מגבות חד פעמיות כדי לנגב את לחות עודפת.
- להחליף אוכל רקוב יומיות ולחזור שריקה תיקנים כדי החממה humidified-37 מעלות צלזיוס.
- בסוף המחקר, מקום הניצולים שנותרו בשקית הביולוגי ומקפיאים ב-80 מעלות צלזיוס לבצע המתת חסד.
- מבחינה סטטיסטית לנתח את הנתונים14 כדי לקבוע LD50 ועל ידי קפלן-מאייר וניתוח יומן-דרגה להישרדות. כמו עם כל ניסויים חרקים, כמה מקרי מוות עלולה להתרחש בקבוצת הביקורת. מקרי מיוחסות התמותה הטבעית של חרקים 15. לדיון מפורט יותר על איך חשבון מקרי מוות בקבוצת הביקורת, ראה הפניה15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיף זה ממחיש את התוצאות התקבלו כאשר ג'וקים השריקה מדגסקר נדבקו בנגיף נולד ב- mallei, נולד ב- pseudomallei, או thailandensis דרב; התוצאות מציגות כי המזיק הזה הוא צייתן מודל בעלי חיים מינים שונים של Burkholderia בלימוד התקפה אלימה, רעילות התרופה ואת יעילות התרופה נגד זיהום חיידקי. עוד ג'וקים השריקה שרד בקבוצות נדבקו בנגיף המוטציות הקלוש (Δhcp1) מאשר בקבוצות היו נגועים wildtype pseudomallei נולד ב- K96243, הורים mallei נולד ב- SR1 או thailandensis נולד ב- DW503 ( איור 1). לעומת זאת, זיהום עם מוטציות מידבק (Δhcp2 או Δhcp3) נהרג המקקים השריקה באופן דומה כדי wildtype pseudomallei דרב (איור 1). זיהום עם יונקים Burkholderia avirulent, נולד ב- thailandensis E264 נגזרת רגיש שלה aminoglycoside DW503, להציג השריקה מקק מודל זו מתאימה במיוחד שחקרתי מוטציות בגן Thailandensis נולד ב- זה להוביל הנחתה (איור 2). לכן, זה יותר מתאים בעלי חיים דגם ללימודי thailandensis דרב מאשר מודלים מכרסמים. הגדלת ריכוז או מספר זריקות של CLQ לא הרג את הג'וקים השריקה; זה מדגים רעילות התרופה יכול להיבדק גם במודל מקק השריקה (איור 3). יתרה מזאת, היעילות של CLQ נגד זיהום thailandensis דרב מוצג באיור4. היבטים חשובים של שריקה מקק טיפול ולדלקת מוצגים באיור5. טבלה 1 יכול לשמש כדי להבקיע את התחלואה של שריקה מקקים במהלך הניסויים.
איור 1: שריקה מקק הישרדות לאחר ההזרקה עם ארסית, הקלוש Burkholderia . שמונה מקקים השריקה לכל קבוצה הוזרקו 25 µL של חיידקי השעיה. מקקים השריקה שנבדקו להישרדות פעם ביום במשך 5 ימים. (א) Hissing ג'וקים הוזרקו הורים mallei נולד ב- SR1 (כיכר פתוחה) או Δhcp1 החשבונאי (סגור מרובע)-100 CFUs. (B) Hissing ג'וקים הוזרקו פראי סוג pseudomallei נולד ב- K96243 (כיכר פתוח), Δhcp1 (סגור מרובע), Δhcp2 (משולש פתוח), או Δ מוטציהhcp3 (עיגול פתוח)-10 CFUs. (ג) Hissing ג'וקים הוזרקו הורים thailandensis נולד ב- DW503 (כיכר פתוחה) או Δhcp1 מוטציה (סגור מרובע)-100 CFUs. איור שפורסם במקור ההפניה 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : שריקה מקק הישרדות לאחר ההזרקה של ריכוז נולד ב- thailandensis עבור LD50 נחישות. שמונה מקקים השריקה לכל קבוצה הוזרקו wildtype thailandensis נולד ב- E264 (א) או הנגזרת רגיש aminoglycoside DW503 (B) ההישרדות היה הבקיע במשך 7 ימים. LD50 הוא CFUs 3 עבור E264 ו CFUs 6 עבור DW503. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : שריקה מקק הישרדות לאחר ההזרקה עם כלורוקין. חמישה מקקים השריקה לכל קבוצה הוזרקו פעם (A) או פעמיים על שני ימים רצופים (B) עם 250 (יהלום), (מרובע), 500 או 1000 µg (משולש) CLQ או PBS (עיגול), הישרדות היה הבקיע במשך 7 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: שריקה מקק ההישרדות לאחר זיהום עם Thailandensis דרב וטיפול עם כלורוקין. מקקים השריקה 10 עד 12 לכל קבוצה היו נגועים DW503 thailandensis נולד ב- לא מטופלים (ריבוע), נגוע thailandensis נולד ב- DW503 ואת שטופלו CLQ ( משולש), שטופלו CLQ לבד (יהלום), או היו uninfected, לא מטופל (עיגול). הישרדות הוקלט במשך 7 ימים. עקומת הישרדות, ללא הפרדות צבע של 4 ניסויים נפרדים, מבוטא כאחוז שווה למספר הכולל של ניצולים מחולק על ידי המספר הכולל של מקקים השריקה לטיפול בכל הימים המצוין. Inoculum CFU נתן נע בין 10 ל- 20 LD50. איור שפורסם במקור ההפניה 10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: תמונות הקשורות המודל מקק השריקה. (א) A נקבה שריקה מקק חסר בליטות על ראשו. (B) A זכר השריקה מקק יכול להיות מזוהה על ידי הנוכחות של קרניים. (ג) A מקק השריקה חייב הנשירה מחוץ החיצוני שלה לגדול. החרק המתעוררים בצבע לבן אבל בהדרגה מכהה כמו שלד חיצוני חדש מתקשה. (ד) שריקה מקקים עשוי להיות בבניין כובע הצמד מיכל פלסטיק עם חורים לאוורור במהלך ניסוי. (E) תחת BSL3 תנאים, שריקה מקקים שוכנות בורג קאפ מיכלי פלסטיק. כלוב עכבר גדול (F) A משמש בית מושבה מקק השריקה. הוא צריך להכיל מזון, מים, קרטון קרטון ביצים עבור מסתור. (G) Hissing ג'וקים מוזרקים עם מזרק 1 מ"ל המצורפת פיפטה חוזרות. מקק השריקה (H) A הוא מחוסן בזריקה דרך קרום עורית בין terga בטן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| 1 | בשידור חי, נורמלי | -אקטיבי נייד -היכולת לתפוס ולהחזיק אצבעות כאשר מקק השריקה נאסף |
| 2 | לחיות, אדיש | -משותק אך סריקות בעת דחק |
| 3 | לחיות, אדעך | -עם רגליים שישכיבו אותו -ואינו זז בעת דחק -אנטנות ו / או הרגליים להעביר בעת דחק |
| 4 | מת | -עם רגליים שישכיבו אותו -אנטנות לא זז בעת דחק -רגליים לא זז בעת דחק |
טבלה 1: שריקה תחלואה מקק שיטת הניקוד. הציון הכולל לקבוצה של מקקים השריקה מבוסס על המקק השריקה עם הניקוד הגבוה ביותר בקבוצה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תנאים אופטימליים ניסיוני להתחיל מושבה מקק בריא השריקה, המחייב מינימלית אבל במועד העקבי מחויבות. למרות שריקה ג'וקים יכולים ללכת במשך תקופה ארוכה יחסית של זמן (~ שבועות) ללא מזון ומים, יש לספק כלוב שבועיות או דו-שבועיות תחזוקה. זה כולל בדיקת אספקת מים ואוכל את שהייתך הכלוב היבש. שמירה על תנאי מחייה יבש חשוב במיוחד במהלך והפיזיולוגי, דגירה בטמפרטורות גבוהות יותר; אנו מוצאים כי השריקה יותר ג'וקים מתים, בקצב מהיר יותר בטמפרטורות גבוהות יותר כאשר מכולות לא נוקו מדי יום.
המפתח מינון עקבי או חיסון של השריקה המקק הוא לחץ על פיפטה החוזרות על עצמן לחצן מנפק בחוזקה. מומלץ להתאמן בטכניקה זו, טעינה של המזרק אל פיפטה חוזרות וביצוע זריקות ריק. הצעד הכי הגוזלות זמן ההליך למפעיל חדש בטכניקה הוא מחזיק או שיתק את המקק השריקה במהלך ההזרקה. לכן, אנו גם ממליצים לתרגל את הטכניקה של החזקת ולאחר הזרקת מקקים השריקה מרובים לפני עלייתם פרויקט שאפתניות יותר. זו יכולה להיות מושגת על ידי שמירה על קבוצה קטנה של מקקים השריקה המשמש באופן בלעדי עבור שיטות הזרקה. אמנם מצאנו כי הזרקת יכול להתבצע במהירות כאשר מחזיק המקק השריקה שלה טכניקות הצד, אחרים עבור החזקת השריקה ג'וקים (למשל שיתק מקק השריקה על משטח מעוקלים חלקה; יושבת על שריקה מקק על האצבע האמצעית בזמן האצבע והאגודל לשתק אותו) עשוי להיות המועדפת, צריך להיחקר על ידי מפעילי שונים.
השימוש של המודל מקק השריקה מעניקה מספר יתרונות על חרקים דגמים אחרים (למשל הזחל תולעת שעווה Galleria mellonella , זבוב הפירות melanogaster דרוזופילה) שימשו בעבר כמו מודלים בעלי חיים עם Burkholderia זיהום 16,17,18. לדוגמה, חלון ניסיוני עבור מקק השריקה נע בין חודשים לשנים ומאפשר גמישות רבה לחוקרים, ואילו עבור זחל תולעת שעווה זה רק חמישה ימים 19,20. עבור זחל תולעת שעווה, תקופת חמישה ימים גם עולה בקנה אחד עם פקעת למטרתו; הסרת הגלמים הוא תהליך עבודה אינטנסיבי עלול לגרום טראומה פיזית הזחלים 20. וחשוב מכך, מוטציה thailandensis נולד ב- T6SS-1 זה הוא הקלוש בשני האוגר הסורי את השריקה מקק 11, היה מדבק ב Galleria, רומז Galleria הוא לא מודל לחקר מוטציות מסוימות כגון T6SS, נולד ב- thailandensis (נתונים לא מוצג).
השימוש המקק השריקה מציג מספר יתרונות על זבוב הפירות. השריקה המקק הוא גדול, של מסה גוף משמעותי עם שלד קשים ומאפשרת לו לטפל בקלות במהלך זריקות. לעומת זאת, זבוב הפירות קטן ואינו דורש ציוד מיוחד עבור חיסון. כמו כן, בעוד המקק השריקה באופן טבעי חי בטמפרטורות דומים או יעלה על טמפרטורת גוף נורמלית, טמפרטורה אופטימלית עבור זבוב הפירות היא בין 22-28 מעלות צלזיוס. זה הופך את זבוב הפירות שימוש מוגבל בהקשר של הלומדים תהליכים התלויים טמפרטורת גוף נורמלית (כגון היווצרות תאי ענק רב nucleated Burkholderia 10).
קיימים כמה חסרונות לשימוש של שריקה מקקים. הגנטיקה של השריקה המקק לא נלמדים גם לאלה של דרוזופילה או אפילו Galleria. המקק השריקה וכוללות גם ניכר "איכס" או גורם ברוטו. עם זאת, המקק השריקה נשאר מארח הפונדקאית אטרקטיבי בר -קיימא עבור Burkholderia על-ידי אספקת יתרונות ברורים לשימוש שלה מחקר ייחודיים המינים. כמופיע לנו יש את זה ממדגסקר שריקה המקק הוא מארח הפונדקאית צייתן Burkholderia, זה מאוד סביר יכול לשמש גם כמחשב מארח הפונדקאית עבור אחרים פתוגנים חיידקיים, אנחנו נמצאים כעת ניצול זה מחקרים כאלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ג'יי צ'ואה, פישר נ. א, ד DeShazer, בבוקר פרידלנדר עיצב ההליכים המתוארים בכתב היד. ג'יי צ'ואה, נ. א פישר, ש Falcinelli, ד DeShazer לבצע את הניסויים. צ'ואה ג' כתב היד.
המחברים תודה יהושע ג' וו רואן, נורה ד' דויל, ניקולס ר קרטר ו סטיבן Tobery א לקבלת סיוע טכני מעולה ואת דוד עמ' Fetterer סטיבן ג'יי קרן לשם ניתוח סטטיסטי.
העבודה נתמכה על ידי ההגנה איום הפחתת סוכנות הצעה #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F, #CBS. MEDBIO.02.10.RD.034 כדי לתאולוגיה
דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן אלו של המחברים, בהכרח לא אושרה על ידי צבא ארצות הברית.
התוכן של פרסום זה אינן משקפות בהכרח את ההשקפות או מדיניות של משרד ההגנה, ולא הזכיר של שמות מסחריים, מוצרים מסחריים, או ארגונים מעיד על ממשלת ארה ב.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Madagascar hissing cockroach |
Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC | 143668 | |
| Kibbles n Bits, any flavor | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| Snap on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| Screw on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER series repetitive pipette | Dymax Corporation www.dymax.com |
T15469 | |
| Syringe (1 mL) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| Needle (26 or 27G x 1/2) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| Chloroquine diphosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria- Bertani (Lennox) | Becton Dickinson, Sparks, MD | 240230 | |
| Agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
References
- Sifri, C. D., Ausubel, F. M. Cellular Microbiology. Boquet, P., Cossart, P., Normark, S., Rappuoli, R. , ASM Press. 543-563 (2004).
- Silcock, S. Is your experiment really necessary? New Sci. 134 (1817), 32-34 (1992).
- Muller, U., Vogel, P., Alber, G., Schaub, G. A. The innate immune system of mammals and insects. Contrib Microbiol. 15, 21-44 (2008).
- Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1295-1309 (2002).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect Immun. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Mulder, P. G., Shufran, A. Madagascar hissing cockroaches, information and care. Oklahoma Cooperative Extension Service Leaflet L-278. , Oklahoma State University. 4 (2016).
- Nelson, M. C., Fraser, J. Sound production in the cockroach, Gromphadorhina portentosa: Evidence for communication by hissing. Behav Ecol Sociobiol. 6 (4), 305-314 (1980).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infect Immun. 85 (1), e0058616 (2017).
- Fisher, N. A., Ribot, W. J., Applefeld, W., DeShazer, D. The Madagascar hissing cockroach as a novel surrogate host for Burkholderia pseudomallei, B. mallei and B. thailandensis. BMC Microbiol. 12, 117 (2012).
- Haraga, A., West, T. E., Brittnacher, M. J., Skerrett, S. J., Miller, S. I. Burkholderia thailandensis as a model system for the study of the virulence-associated type III secretion system of Burkholderia pseudomallei. Infect Immun. 76 (11), 5402-5411 (2008).
- West, T. E., Frevert, C. W., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonia in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 102 Suppl 1, S119-S126 (2008).
- Finney, D. J. Probit Analysis. , University Press. Cambridge. (1971).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J Am Mosq Control Assoc. 3 (2), 302-303 (1987).
- Schell, M. A., Lipscomb, L., DeShazer, D. Comparative genomics and an insect model rapidly identify novel virulence genes of Burkholderia mallei. J Bacteriol. 190 (7), 2306-2313 (2008).
- Wand, M. E., Muller, C. M., Titball, R. W., Michell, S. L. Macrophage and Galleria mellonella infection models reflect the virulence of naturally occurring isolates of B. pseudomallei, B. thailandensis and B. oklahomensis. BMC Microbiol. 11 (1), 11 (2011).
- Pilatova, M., Dionne, M. S. Burkholderia thailandensis is virulent in Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (11), e49745 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. J Vis Exp. (70), e4392 (2012).
- Eklund, B. E., et al. The orange spotted cockroach (Blaptica dubia, Serville 1839) is a permissive experimental host for Francisella tularensis. PeerJ Preprints. 4, e1524v1522 (2016).
