Summary
Мы представляем протокол использовать Мадагаскар шипящий таракан как альтернативную модель не млекопитающих животных для проведения вирулентности бактерий, патогенез, токсичности препарата, эффективность препарата и врожденный иммунный ответ исследований.
Abstract
Многие аспекты врожденного иммунитета консервируют между млекопитающих и насекомых. Насекомое, Мадагаскар шипящий таракан от рода Gromphadorhina, могут быть использованы как альтернативную модель животных для изучения вирулентности, хост возбудитель взаимодействия, врожденный иммунный ответ и эффективность препарата. Детали для выращивания, ухода и разведение шипящий таракан предоставляются. Мы также иллюстрируют, как он может быть инфицирован бактерий, таких как внутриклеточных возбудителей Burkholderia поражённого, б. pseudomallei и б. thailandensis. Использование шипящий таракан недорог и преодолевает нормативные вопросы, связанные с использованием млекопитающих в исследованиях. Кроме того найденных с помощью модели шипящий таракан, воспроизводимость и похожие на тех, полученные с помощью моделей млекопитающих. Таким образом шипящий таракан Мадагаскара представляет привлекательный суррогатной хост, который следует использовать при проведении исследований на животных.
Introduction
Использование насекомых в качестве альтернативных не млекопитающих животных моделей для изучения бактериальных патогенеза и врожденной принимающей обороны набирает силу в последние годы. Технически это объясняется их относительно невысокую стоимость и легкость в получении, обработке и заботить для насекомых, по сравнению с млекопитающих. Существует также не регуляторной политики, регулирующие использование насекомых в исследованиях; Это не является предметом компетенции или ограничения, изложенные на любое животное использовать Комитет или правительственным учреждением. Насекомых, как суррогат Животные модели особенно поддаются всеобъемлющей скрининговых исследований Факторы вирулентности, хост возбудитель взаимодействий, и оценок эффективности антимикробной наркотиков. Их использование может уменьшить количество млекопитающих, используется для исследований, тем самым преодолеть некоторые из этических дилемм, присущие для проведения экспериментов на животных 1,2.
Насекомые могут служить хостов суррогатного потому, что существует высокая степень общности между врожденной иммунной системы, насекомых и млекопитающих 1,3. Plasmatocytes насекомых и млекопитающих макрофаги фагоцитировать микроорганизмов 4. Насекомое двойники к нейтрофилов это кровяные 5,6. Внутриклеточные окислительный взрыв пути в клетках млекопитающих и насекомых похожи; реактивнооксигенных видов в обоих производятся p47 orthologousphox и p67 белки-phox 5. Сигнальные каскады вниз по течению платных рецепторов в насекомых и Толл подобные рецепторы и интерлейкина-1 в млекопитающих также являются на удивление схожими; как результат производства антимикробных пептидов, например дефензинов 7. Таким образом насекомые могут быть использованы для изучения общего врожденные иммунные механизмы, которые разделяют размером.
Насекомое называется Мадагаскар шипящий таракан от рода Gromphadorhina, является одним из крупнейших видов таракан, что существует, обычно достигая 5 до 8 см в зрелости. Это родной только на острове Мадагаскар и характеризуется шипящий звук, что он делает - звук, который производится, когда шипящий таракан выгоняет воздух через дыхательные отверстия называется дыхальца 8. Характерный свист служит формой социальной коммуникации между шипение тараканов для ухаживания и агрессии 9 и можно услышать, когда мужчина нарушается в своей среде обитания. Шипящий таракан Мадагаскара медленно движущихся по сравнению с американский таракан и других городских вредителей. Это легко заботиться и породы; беременная шипящий таракан может производить потомство 20-30 в то время. Шипящий таракан, называется Нимфа, достигает половой зрелости в 5 месяцев ребенок после прохождения 6 линяет и могут жить до 5 лет в дикой природе и в неволе 8.
Мы использовали Мадагаскар шипящий таракан как суррогат хост для инфекции с внутриклеточных возбудителей Burkholderia поражённого, б. pseudomalleiи б. thailandensis 10,11. Вирулентность этих патогенов в шипящие тараканов было по сравнению с их вирулентности в животной модели ориентир для Burkholderia, сирийского хомяка. Мы обнаружили, что летальная доза 50% (LD50) б. pseudomallei и б. поражённого был похож на обе модели 11. Интересно, что б. thailandensis, хотя avirulent в грызунов модели, смертельной в шипящий таракан 11. Это различие в отношении б. thailandensis инфекции подчеркивает полезность шипящий таракан модели; B. thailandensis смягчающих мутантов может быть более легко решена в шипящий таракан чем грызунов моделей. Кроме того как б. thailandensis часто используется как модельный организм для б. pseudomallei и б. поражённого 10,12,13, определения смягчающих мутации в нем могли бы привести к аналогичные цели в более вирулентную родственников.
Несмотря на различие в вирулентности б. thailandensis в шипящий таракан против сирийского хомяка, мутации в критических вирулентности таких факторов, как те в секреции система тип 6-1 (T6SS-1), которые смягчающие в B. поражённого и B. pseudomallei, являются аналогичным образом смягчающие B. thailandensis 11. Шипящий таракан модель Далее проверяется в том, что отдельные T6SS мутантов (T6SS-2 T6SS-6) в б. pseudomallei, которые не имеют отношения к вирулентности в сирийские хомяки, остаются опасной в шипящий тараканов 11. Таким образом шипящий таракан представляет собой жизнеспособный суррогатной животных модель для трех видов Burkholderia . Недавно мы использовали шипящий таракан как суррогат животных модель для изучения эффективности противомалярийных наркотиков хлорохин (CLQ) против Burkholderia инфекции 10 и его токсичность.
Здесь мы описываем воспитания и ухода Мадагаскар шипящий таракан и представить подробную информацию о том, как заразить это насекомое с тремя видами Burkholderia . Кроме того мы показываем которые шипящий таракан является жизнеспособной суррогатной модель для изучения вирулентности и эффективность препарата в Burkholderia инфекции и что он вероятно также может служить узлом суррогат для других бактериальных патогенов в аналогичных исследований.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. подготовка для поддержания колонии шипящий таракан
- Подготовка клетки для шипение тараканов жить. Нанесите тонкий слой вазелина, примерно 20-30 мм в ширину, окружность внутренние стены в верхней части клетки препятствующие шипящие тараканы от восхождения из клетки и побега.
Примечание: Шипение тараканы могут быть размещены в различных контейнерах, которые имеют большой площади, имеют достаточную высоту и крышки. Использовать мышь клетки (~ 43 см x 23 см x 20 см). Для клеток, предназначенных для 37 ° C не применять вазелин. - Включать картонной коробке картонной яйцо вниз помещены внутри клетки предоставлять укрытия для естественно застенчивый насекомых. Не заменять картонной яйцо коробки с одним из пенополистирола для предотвращения употребления пластика.
- Не предоставляют постельное белье для облегчает очистку и увеличить видимость только что вылупившихся нимфы.
- Получите сухой корм, который содержит состав ~ 20% сырого протеина. Грубо grind корм с кухонный комбайн или блендер и хранить при 4 ° C.
- Получите несколько неглубоких блюд и аквариум камни или губку для производства продовольствия и воды.
Примечание: Петри являются recommeded.
2. шипящий таракан уход и разведение
- Получение беспородных Мадагаскара шипя тараканов (~ 5 см) от коммерческих заводчика. Виды, используемые в настоящем Протоколе является Gromphadorhina обыкновенный. Распакуйте коробку, содержащий шипение тараканов сразу после получения.
- Выполните соответствующие институциональные руководящие принципы для использования средств индивидуальной защиты при обработке животных.
Примечание: Используйте густой одноразовые перчатки для обработки тараканов, как преплюсневой когти шипящий таракан остры. - Передача до 75 крупных шипение тараканов (> 3 см) в большой клетке. Перевод недавно вылупившиеся и меньше нимф (< 3 см) в отдельной клетке.
Примечание: Сохранение значительно более чем 75 крупных шипение тараканов в клетке мыши может привести к ухудшению здоровья, колонии и может также привести к смерти. - Обрабатывать недавно расплавленная таракан, который является кремовый цвет, нежно и избежать, сжимая его. Кроме того позволяют экзоскелет темнеют и затвердевать до обработки.
Примечание: Нет необходимости для удаления клещей, Gromphadorholaelaps schaeferi, который часто сопровождать шипящим тараканов по получении от заводчиков. Благотворное клещей чистоту шипение тараканов и безвредны для человека. - Корма шипение тараканов с землей сухой корм для собак в мелкой тарелке один или два раза в неделю. Обеспечить достаточно собака продовольствия для обеспечения достаточного питания шипение тараканов до следующего кормления. Отказаться от любой пищи, которая стала влажной и плесенью.
- В дополнение к корм предоставляют порезанные овощи и фрукты, как яблоки, картофель или салат, в мелкой тарелке. Выбросите заплесневелые или гнилой пищи.
- Обеспечить питьевой водой один раз или два раза в неделю в мелкое блюдо, но не переполняйте блюдо для предотвращения утечки в клетке. Место небольшой аквариум камни или губкой в блюдо предоставить площадку посадки для малых нимф. Использование обратного осмоса вода, если таковые имеются.
- Шипение сохранить тараканов в темноте при температуре 21 ° C до 30 ° C. Имейте большой шипение тараканов, предназначенных для экспериментов при более низкой температуре (~ 21 ° C) ~ 2 месяцев уменьшить селекции и беременности. В отличие от этого держите нимфы при более высоких температурах (28 ° C до 30 ° C) для ускорения роста.
Примечание: Держите клетки при комнатной температуре (21 ° C) в темном кабинета. - Обеспечить влажности, включая отдельную кастрюлю воды если шипение, что тараканы находятся в инкубаторе.
- Чистой клетке, черпая из Сухие фекалии, регулярно или путем передачи шипение тараканов чистый клетке каждые 2-3 недели. Держите в нижней части клетки сухой. Чистить клетку немедленно если избыток воды разрешено накапливать и смешать с экскрементами в нижней части клетки.
3. Таракан подготовка для экспериментов
- Переведите соответствующее количество шипение тараканов в клетке увлажненные инкубатора 37 ° C 1 до 3 недель до эксперимента для адаптационного. Включить группу управления для инъекций. Этот адаптационного периода имеет решающее значение для недопущения температурного шока во время экспериментов.
- Не применять вазелин в клетки, предназначенные для 37 ° C, потому что более высокой температуры плавится желе.
- Проверьте шипение тараканов каждые 1-2 дней заменить продовольствия и воды и чистой клетке.
- Получите четкие одноразовые пластиковые контейнеры для продуктов с крышками для группирования шипение тараканов во время экспериментов. Для вентиляции пробивки отверстий в крышке или на стороне контейнера с гвоздем и молота.
Примечание: Используйте колпачок контейнеров через оснастку крышка контейнеров в параметре третьего уровня биобезопасности. Контейнеры оснастки колпачок может быть укреплено с лентой, при необходимости. - В день, инъекции распространять акклиматизированных шипение тараканов 6-12 в группы на контейнер, обеспечивая равномерное распределение по полу и массы тела.
- Определите пол отдельных шипение тараканов. Определите пол, известность рога найдены на мужчин и отсутствие их на женщин.
- Вес отдельных шипение тараканов. Чтобы облегчить весом шипящий таракан на баланс, заключите его в течение двух лодки весят, которые были тарированного.
Примечание: Для обеспечения согласованности между эксперименты, используйте шипение тараканов с весом 4-8 g. Однако никакой разницы в выживание после инфекции были найдены между малыми (1,5-2 g) и большие (6-8 g) шипение тараканов. Для исследования наркотиков, используйте шипение тараканов с весом ~ 5 g для получения более последовательной концентрации препарата в тело массы. - Вместо воды блюдо включают в себя высокой воды содержание фрукты или овощи, такие, как кусок apple или картофеля. Отказаться от гнилой пищи. Не дают дополнительной воды, чтобы держать контейнер сухой.
- Возвращение шипение тараканов до 37 ° C до инъекции.
4. бактериальные культуры и подготовка
Примечание: Бактериальных видов, используемых в настоящем Протоколе, B. поражённого, б. pseudomallei и б. thailandensis. Все манипуляции с B. поражённого и б. pseudomallei должны быть выполнены в класса II или класса III шкафы биологической безопасности расположенных в уровне биобезопасности (BSL) 3 лаборатории. Выполнять манипуляции с б. thailandensis в аналогичных биологической безопасности шкафы расположены либо в BSL2 или BSL3 лаборатории. Следуйте институциональных Стандартная операционная процедура по BSL3 работы. Следуйте институциональных руководящих принципов для использования средств индивидуальной защиты при обработке бактерий.
- Подготовка мастер тарелку Burkholderia по крайней мере 3 дня до инфекции. Используйте Лурия-Бертани (Леннокс) (LB) агар для б. pseudomallei и б. thailandensis и использование LB агар дополнена глицерина 4% для B. поражённого. Полоса бактерий от 25% акций глицерина, хранятся при температуре-80 ° C.
Примечание: Всегда полоска пластину мастер непосредственно из замороженных глицерин запасов; Избегайте последовательный проход бактерий от пластины на пластину как это может вызвать снижение вирулентности. - Прививать 10-20 мл LB отвара с несколько колоний от главной пластины б. pseudomallei и б. thailandensis . Аналогичным образом инокуляции LB отвара дополнена глицерина 4% для B. поражённого.
- Встряхните бульон культуры в 175 до 250 об/мин при 37 ° C для ~ 18 h.
- Центрифуга для 2-3 мл культуры на 5000 g x 10 мин.
- Отменить супернатант и Ресуспензируйте бактериальных Пелле в стерильных фосфатный буфер (PBS, 137 мм NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мм Na2PO4, 1.8 мм х2PO4, рН 7,4).
- Разбавить бактерий с PBS для достижения оптической плотности (OD) 0.5, измеренная на поглощение на 600 Нм в спектрофотометре.
- Серийно разбавляют бактерии десятикратного PBS в от начала ОД 0.5. Используйте эти подвески для инфекции.
- Определите колонии формирование единиц (CFU) посевным материалом путем последовательного растворения и покрытие 100 мкл аликвоты на агаре СМИ. Инкубируйте пластин при 37 ° C в течение 24-48 ч.
5. препараты
- Определить необходимое количество препарата следует за тело массы. Дозировка CLQ, дано шипящий таракан была основана на стандартной дозировке для млекопитающих, который составляет 50 мг/кг/день.
- Ресуспензируйте или развести препарат интерес в транспортном средстве. Например разбавляют CLQ в PBS в концентрации 12 мг/мл. Эта концентрация обеспечивает 300 мкг препарата ~ 6 g шипение что таракан в 25 мкл вводят объем.
- При необходимости, стерилизуйте раствора препарата, проходя через фильтр шприц 0,22 мкм.
- Хранят раствор препарата при температуре 4 ° C до использования. Теплый решение по крайней мере 21 ° C (комнатной температуры) до инъекции наркотиков.
6. Ассамблея инжектора
- Установите указатель на нужную громкость (25 мкл), повернув регулировочный винт на повторяющихся пипетки.
- Нажмите релиз бар повторяющихся пипеткой внутрь и выньте толкатель наружу. Повторяющихся пипеткой теперь готов для размещения загруженного шприца.
Примечание: Калибровка объем выбрасывается повторяющихся пипетки, измеряя количество воды, выбрасывается на баланс. - Заполните шприц 1 мл суспензии, содержащей бактерии или наркотиков.
- Присоединить шприц для стерильных 26 или 27 G x ½ дюйма (или меньше) иглы.
- Нажмите шприц плыть пузырьки воздуха в верхней и изгнать пузыри и некоторые подвеска в контейнер наполненный Блич 10%.
- Оснастки шприца шприц клип повторяющихся пипетку с скос иглы вверх.
- Потяните штангу отпуска наружу и нажмите кнопку распределитель твердо выполнять пустой инъекции в контейнер наполненный Блич 10% пока поршень шприца против толкателя.
- Выполнить 1 или 2 дополнительные пустые инъекции для обеспечения жидкость выброшенного из шприца. Повторяющихся пипеткой готова для инъекций.
7. Таракан инъекции
- Выполнение всех тараканов инъекции в класса II или класса III биологической безопасности кабинета в BSL2 или BSL3 параметр с помощью институциональных рекомендуется индивидуального защитного снаряжения.
- Очистки рабочих поверхностей в кабинет безопасности, которые могут соприкасаться с шипящим тараканов. Отбеливать 10% следуют 70% этанола для удаления остаточного отбеливатель. Дайте высохнуть поверхности в воздух.
- С одной стороны сцепление шипящий таракан на ее стороне. Иммобилизации шипящий таракан, таким образом, что он неспособен отдачи во время инъекции. Слегка согните шипящий таракан, так, что кожная мембраны между брюшной Терга подвергаются.
- С другой стороны Держите повторяющихся пипетки, таким образом, чтобы игла находится на 0° под углом 30° от средней dorso вентральной шипящий таракан. Прокол кожного мембраны, рядом с 3rd, 4-йили 5-й полиморфизм от заднего конца.
Примечание: Запись иглы в шипящий таракан в угол указывается гарантирует, что игла не пройти и выйти из шипящий таракан. Место инъекции гарантирует, что выброшенного материала содержится внутри брюшной полости заполнены с гемолимфа. Практика проведения шипение тараканов и инъекций с водой до проведения инъекции с живых бактерий или наркотиков. - Нажмите кнопку дозировки твердо придать объем. Аккуратно снять иглу на тот же угол, как используется для записи.
- Место вводят шипящий таракан в отдельном контейнере, чтобы отличить его от шипение тараканов, которые еще не были введены. Стереть любые гемолимфа, которые могут сочилась из от укола.
- Далее, инъекций других шипение тараканов в группы, используя те же шприц и иглу. Остановите путем инъекций поршень шприца до нижней части ствола для предотвращения неполной дозирования в последней инъекции.
- Для нескольких инъекций в одной шипящий таракан, например с бактериями и наркотиков залить на разных сторонах полиморфизм на спинной стороне шипение тараканов. Кроме того выполните множественные инъекции путем инъекций в разные Терга (3rd 5th).
- Убедитесь, что крышки контейнеры надежно закреплены. Укрепляют крышки с лентой, при необходимости.
- Инкубируйте шипение тараканов в инкубаторе увлажненные 37 ° C.
8. запись шипящий таракан заболеваемости и смертности
- Выполните все шипящий таракан экзамены в класса II или класса III биологической безопасности, шкаф с институциональной рекомендуется индивидуальное защитное оборудование. Очистите поверхности в кабинете безопасности с хлоркой 10% следуют на 70% спирте. Разрешить рабочей области, чтобы воздух сухой.
- Оценка шипение тараканы один или два раза ежедневно в течение 1 до 2 недель с помощью заболеваемости скоринга таблицу (Таблица 1).
- Удаление мертвых шипение тараканов из контейнера и записывать количество выживших.
- Передачи, оставшихся жить шипение тараканов чистый контейнер, если избыток влаги в нижней части контейнера. Кроме того используйте одноразовые бумажные полотенца стереть избыток влаги.
- Замените гнилой пищи ежедневно и возвращения шипение тараканов в инкубатор увлажненные 37 ° C.
- В конце исследования место уцелевших в мешке биологической и заморозить при температуре-80 ° C до усыпить.
- Статистически анализа данных14 определить LD50 и анализ Каплана-Мейера и лог-ранг для выживания. Как с всеми насекомых экспериментов, некоторые смерти может произойти в контрольной группе. Эти смерти обусловлено естественной смертности насекомых 15. Более подробно о том, как на счет смертей в контрольной группе Ссылка15см.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот раздел показывает результаты, которые были получены при Мадагаскар шипение тараканы были заражены B. поражённого, б. pseudomallei, или б. thailandensis; результаты показывают, что это насекомое шансов справиться с возникающими животной модели для различных видов Burkholderia в изучении вирулентности, лекарственной токсичности и эффективность препарата против бактериальной инфекции. Более шипение тараканов выжил в группах, которые были заражены аттенуированные мутантов (Δhcp1) чем в группах, которые были заражены wildtype B. pseudomallei K96243, родительские B. поражённого SR1, или б. thailandensis DW503 ( Рисунок 1). И наоборот инфекции с вирулентными мутантами (Δhcp2 или Δhcp3) убил шипение тараканы подобно к wildtype B. pseudomallei (рис. 1). Инфекции с avirulent Burkholderia млекопитающих, б. thailandensis E264 и его аминогликозидов чувствительных производные DW503, показывают, что шипящий таракан модель является особенно подходит для выяснения мутации в B. thailandensis которые приводят к затухания (рис. 2). Таким образом это более фитинга животных модель для исследования B. thailandensis чем грызунов модели. Увеличение концентрации или множественные инъекции CLQ не убивал шипение тараканы; Это иллюстрирует, что токсичности препарата также могут быть тестированны в шипящий таракан модели (рис. 3). Кроме того эффективность CLQ против б. thailandensis инфекции показано на рисунке 4. Важные аспекты шипящий таракан ухода и инфекции показаны на рисунке 5. Таблица 1 может использоваться для оценка заболеваемости шипящий тараканов во время экспериментов.
Рисунок 1: Шипящий таракан выживание после инъекции с вирулентными и ослабленных Burkholderia . Восемь шипение тараканов в группе вводили с 25 мкл бактериальных подвески. Шипение тараканы были проверены для выживания один раз в день в течение 5 дней. (A) Hissing тараканов вводили с родительского B. поражённого SR1 (площади) или Δhcp1 мутанта (закрытые квадратные), на 100 CFUs. (B) Hissing тараканов вводили с дикого типа б. pseudomallei K96243 (площади), Δhcp1 (закрытой площади), Δhcp2 (открытый треугольник), илиhcp3 (открытый круг) мутант Δ на 10 CFUs. (C) Hissing тараканов вводили с родительского б. thailandensis DW503 (площади) или Δhcp1 мутанта (закрытой площади) на 100 CFUs. Рисунок первоначально опубликовано в журнале ссылку 11. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Шипящий таракан выживание после инъекции увеличения концентрации B. thailandensis для LD50 решимость. Восемь шипение тараканов в группе вводили с wildtype б. thailandensis E264 (A) или аминогликозидов чувствительных производные DW503 (B) и выживания забил за 7 дней. LD50 -3 CFUs для E264 и 6 CFUs для DW503. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Шипящий таракан выживание после инъекции с хлорохином. Пяти шипение тараканов каждой группы вводили один раз (A) или дважды на двух последовательных дней (B) с 250 (алмаз), (квадрат), 500 или 1000 мкг (треугольник) CLQ или PBS (круг) и выживания забил за 7 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Шипящий таракан выживание после инфекции с B. thailandensis и лечение хлорохином. 10-12 шипение тараканы каждой группы были заражены DW503 B. thailandensis и не лечить (квадрат), инфицированных с б. thailandensis DW503 и лечение с CLQ ( треугольник), получавших CLQ только (алмаз), или были неинфицированных и не лечить (круг). Выживание был записан за 7 дней. Кривая выживания, композитный 4 отдельных экспериментов, выражается в процентах, равное количество выживших, деленное на общее количество шипение тараканов для каждого лечения в дни указывается. Посевным материалом CFU дано варьировались от 10 до 20 LD50. Рисунок первоначально опубликовано в журнале ссылку 10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: Изображения, относящиеся к модели шипящий таракан. (A) A девушки шипящий таракан не хватает выступы на свою голову. (B) мужской шипящий таракан может определяться наличием рога. (C) A шипящий таракан должны линьки из его экзоскелет расти. Возникающих насекомое белого цвета, но постепенно темнеет, как новый экзоскелет твердеет. (D) шипение тараканы могут быть размещены в оснастку колпачок пластиковый контейнер с вентиляционными отверстиями во время эксперимента. (E) под BSL3 условий, шипящий тараканы располагаются в винт крышки пластиковые контейнеры. (F) A большие мыши Кейдж используется для размещения шипящий таракан колонии. Он должен содержать, продовольствие, воду и яйцо картонные коробки для сокрытия. (G) Hissing тараканов вводятся с 1 мл шприц, придает повторяющихся пипетки. (H) A шипящий таракан прививку путем инъекции через кожный мембрану между брюшной Терга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| 1 | Живой, нормальный | -активно мобильных -возможность понять и удержать пальцы, когда взял шипящий таракан |
| 2 | Живой, вялой | -неподвижный но обходы когда ткнул |
| 3 | Живой, умирающий | -неподвижный с ног, заправленные -не перемещайте когда ткнул -усики и ноги двигаться, когда ткнул |
| 4 | Мертвых | -неподвижный с ног, заправленные -усики не двигаться, когда ткнул -ноги не двигаются когда ткнул |
Таблица 1: шипящий таракан заболеваемости балльной системы. Общая оценка для группы шипение тараканов основан на шипящий таракан с наибольшим количеством очков в группе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Оптимальные условия экспериментальных начинаются с здорового шипящий таракан колонии, которая требует минимальный, но последовательной время обязательства. Хотя шипение тараканов может пойти на относительно длительного периода времени (~ недель) без пищи и воды, должна предоставляться обслуживание еженедельно или два раза в неделю клетке. Это включает в себя проверку продовольствия и водоснабжения и обеспечения того, чтобы клетка сухой. Сохранение условий сухой жизни особенно важно во время адаптационного и инкубации при более высоких температурах; Мы считаем, что более шипение тараканы погибают и более быстрыми темпами при более высоких температурах, когда контейнеры не были очищены каждый день.
Ключ для последовательного дозирования или модифицирования шипящий таракан является нажать кнопку распылитель на повторяющихся пипеткой твердо. Мы рекомендуем практиковать эту технику, Загрузка из шприца повторяющихся пипеткой, а также выполнение пустой инъекции. Наиболее трудоемким шаг процедуры оператор new в технику проведения или иммобилизирующие шипящий таракан во время инъекции. Таким образом мы также рекомендуем практикующих технику проведения и инъекционных несколько шипение тараканов прежде чем более амбициозный проект. Это может быть достигнуто путем поддержания небольшой группы шипение тараканов, которая используется исключительно для инъекций. Хотя мы обнаружили, что инъекции может быть выполнена быстро при проведении шипящий таракан на ее стороны, другие методы для проведения шипение тараканов (например иммобилизирующие шипящий таракан на гладкой изогнутые поверхности; усаживаться шипение Таракан на средний палец в то время как указательный палец и большой палец обездвижить его) может быть предпочтительным и следует изучить различные операторы.
Использование модели шипящий таракан дает несколько преимуществ над другими насекомых модели (например, червь личинки восковой Galleria mellonella и плодовой мушки Drosophila melanogaster), которые ранее использовались как Животные модели с Burkholderia инфекции 16,17,18. Например экспериментальный окно шипящий таракан колеблется от месяцев до лет, обеспечивая гибкость для исследователей, тогда как для личинки червя воск это только пять дней 19,20. Для червь личинки восковой пятидневный период также совпадает с кокон оболочки; Удаление коконов-это трудоемкий процесс, который может привести к физической травмы в личинки 20. Что еще более важно мутант T6SS б. thailandensis -1, которое гасится в обоих сирийского хомяка и шипящий таракан 11, был вирулентные в Galleria, предполагая, что Galleria не является хорошей моделью для изучения Некоторые мутантов как T6SS в б. thailandensis (данные не показаны).
Использование шипящий таракан представляет несколько преимуществ над плодовой мухи. Шипящий таракан большой и существенный тела массы с жестким экзоскелетона, что позволяет ему быть легко обрабатываются во время инъекции. В противоположность этому плодовая муха небольшой и требует специализированного оборудования для прививки. Кроме того тогда как естественно шипящий таракан живёт в температурах, которые похожи на или превышать температуру человеческого тела, оптимальная температура для дрозофилы — от 22 до 28 ° C. Это делает плодовой мушки ограниченного использования в контексте изучения процессов, которые зависят от температуры человеческого тела (например, формирование многосторонних ядерных гигантоклеточная Burkholderia 10).
Существуют некоторые недостатки использования шипение тараканов. Не генетики шипящий таракан также изучаются как дрозофила или даже Galleria. Шипящий таракан также имеет существенное «ИК» или грубые фактором. Однако шипящий таракан остается привлекательным и жизнеспособной суррогатной хост для Burkholderia , предоставляя явные преимущества ее использования в исследованиях, которые являются уникальными для видов. Как мы показали что Мадагаскар шипящий таракан является узел шансов справиться с возникающими суррогат для Burkholderia, это весьма вероятно также может служить узлом суррогат для других бактериальных патогенов и мы в настоящее время используют в таких исследованиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
J. Чуа, н.а. Фишер, D. DeShazer и утра Friedlander разработаны процедуры, описанные в манускрипте. J. Чуа, н.а. Фишер, с.д. Фальчинелли и D. DeShazer выполненных экспериментов. J. Чуа написал рукопись.
Авторы благодарят Joshua J. W. Roan, Nora D. Doyle, Николас р. Картер и Стивен а. Tobery за отличную техническую помощь и Fetterer P. Дэвид и Стивен J. Керн для статистического анализа.
Работа получила поддержку от обороны угрозы сокращения агентства предложение #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F и #CBS. MEDBIO.02.10.Rd.034 д.д.
Мнения, толкований, выводы и рекомендации принадлежат авторам и не обязательно армией США.
Содержание этой публикации, не обязательно отражают взгляды или политику министерства обороны, ни упоминание названия торговых марок, коммерческих продуктов, или организаций означает одобрения правительства США.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Madagascar hissing cockroach |
Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC | 143668 | |
| Kibbles n Bits, any flavor | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| Snap on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| Screw on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER series repetitive pipette | Dymax Corporation www.dymax.com |
T15469 | |
| Syringe (1 mL) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| Needle (26 or 27G x 1/2) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| Chloroquine diphosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria- Bertani (Lennox) | Becton Dickinson, Sparks, MD | 240230 | |
| Agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
References
- Sifri, C. D., Ausubel, F. M. Cellular Microbiology. Boquet, P., Cossart, P., Normark, S., Rappuoli, R. , ASM Press. 543-563 (2004).
- Silcock, S. Is your experiment really necessary? New Sci. 134 (1817), 32-34 (1992).
- Muller, U., Vogel, P., Alber, G., Schaub, G. A. The innate immune system of mammals and insects. Contrib Microbiol. 15, 21-44 (2008).
- Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1295-1309 (2002).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect Immun. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Mulder, P. G., Shufran, A. Madagascar hissing cockroaches, information and care. Oklahoma Cooperative Extension Service Leaflet L-278. , Oklahoma State University. 4 (2016).
- Nelson, M. C., Fraser, J. Sound production in the cockroach, Gromphadorhina portentosa: Evidence for communication by hissing. Behav Ecol Sociobiol. 6 (4), 305-314 (1980).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infect Immun. 85 (1), e0058616 (2017).
- Fisher, N. A., Ribot, W. J., Applefeld, W., DeShazer, D. The Madagascar hissing cockroach as a novel surrogate host for Burkholderia pseudomallei, B. mallei and B. thailandensis. BMC Microbiol. 12, 117 (2012).
- Haraga, A., West, T. E., Brittnacher, M. J., Skerrett, S. J., Miller, S. I. Burkholderia thailandensis as a model system for the study of the virulence-associated type III secretion system of Burkholderia pseudomallei. Infect Immun. 76 (11), 5402-5411 (2008).
- West, T. E., Frevert, C. W., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonia in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 102 Suppl 1, S119-S126 (2008).
- Finney, D. J. Probit Analysis. , University Press. Cambridge. (1971).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J Am Mosq Control Assoc. 3 (2), 302-303 (1987).
- Schell, M. A., Lipscomb, L., DeShazer, D. Comparative genomics and an insect model rapidly identify novel virulence genes of Burkholderia mallei. J Bacteriol. 190 (7), 2306-2313 (2008).
- Wand, M. E., Muller, C. M., Titball, R. W., Michell, S. L. Macrophage and Galleria mellonella infection models reflect the virulence of naturally occurring isolates of B. pseudomallei, B. thailandensis and B. oklahomensis. BMC Microbiol. 11 (1), 11 (2011).
- Pilatova, M., Dionne, M. S. Burkholderia thailandensis is virulent in Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (11), e49745 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. J Vis Exp. (70), e4392 (2012).
- Eklund, B. E., et al. The orange spotted cockroach (Blaptica dubia, Serville 1839) is a permissive experimental host for Francisella tularensis. PeerJ Preprints. 4, e1524v1522 (2016).
