Summary
Vi presenterar ett protokoll för att utnyttja Madagaskar väsande kackerlacka som en alternativ icke däggdjur djurmodell att genomföra bakteriell virulens, patogenes, drug toxicitet, drogen effekt och medfödda immunsvar studier.
Abstract
Många aspekter av den medfödda immuniteten bevaras mellan däggdjur och insekter. En insekt, Madagaskar väsande kackerlacka från släktet Gromphadorhina, kan användas som en alternativ djurmodell för att studera virulens, värd-patogen interaktion, medfödda immunsvar och läkemedlet effekt. Detaljer för uppfödning, skötsel och avel av den väsande kackerlackan tillhandahålls. Vi illustrerar också hur det kan vara smittad med bakterier såsom de intracellulära patogenerna Burkholderia mallei, B. pseudomallei, och B. thailandensis. Användning av den väsande kackerlackan är billig och övervinner regleringsfrågor som behandlar användningen av däggdjur i forskning. Dessutom är resultat hittades med väsande kackerlacka modell reproducerbara och liknande som erhålls med hjälp av däggdjur modeller. Således representerar den Madagaskar väsande kackerlackan en attraktiv surrogat värd som bör undersökas vid djurstudier.
Introduction
Användning av insekter som alternativa icke däggdjur djurmodeller studera bakteriell patogenes och medfödda värd försvar har varit fart under de senaste åren. Logistiskt, beror detta på deras relativt billig kostnad och lättheten i att erhålla, hantering och skötsel av insekter jämfört med däggdjur. Det finns också ingen reglerande politik som styr användningen av insekter i forskning; Det är inte föremål faller eller begränsningarna av något djur använder kommittén eller statlig myndighet. Insekter som surrogat djurmodeller är särskilt mottagliga för omfattande screening studier för virulensfaktorer, värd-patogen interaktioner och bedömningar av antimikrobiella läkemedlet effekt. Deras användning kan minska antalet däggdjur används för forskning därigenom övervinna några av de etiska dilemman som inneboende beteende av djurförsök 1,2.
Insekter kan fungera som surrogat värdar eftersom det finns en hög grad av enhetlighet mellan de medfödda immunförsvar av insekter och däggdjur 1,3. Både insekt plasmatocytes och däggdjur makrofager phagocytose mikroorganismer 4. Insekt motstyckena till neutrofila är hemocyte 5,6. Intracellulära oxidative burst vägar i insekt och däggdjursceller är likartade. reaktiva syreradikaler i båda produceras av orthologous p47phox och p67phox proteiner 5. Signalering kaskader nedströms Toll receptorer i insekter och Toll-liknande receptorer och Interleukin-1 hos däggdjur är också anmärkningsvärt likartade. båda resulterar i produktion av antimikrobiella peptider, som defensins 7. Insekter kan således utnyttjas för att studera generella medfödd immun mekanismer som delas av metazoans.
En insekt som heter Madagaskar väsande kackerlacka från släktet Gromphadorhina, är en av de största kackerlacka arter som finns, når normalt 5-8 cm på förfallodagen. Det är infödda endast till den ön Madagaskar och kännetecknas av det väsande ljudet som det gör - ett ljud som produceras när den väsande kackerlackan förvisar luft genom luftvägarna öppningar kallas externa 8. Den distinkta väsa fungerar som en form av social kommunikation bland väsande kackerlackor för uppvaktning och aggression 9 och kan höras när en manlig är störd i sin livsmiljö. Madagaskar väsande kackerlacka är långsamma jämfört med den amerikanska kackerlackan och andra urbana skadedjur. Det är lätt att ta hand om och föda upp; en gravid väsande kackerlacka kan producera 20 till 30 avkomma i taget. En baby som väsande kackerlacka, kallas en nymf, når könsmognad i 5 månader efter genomgår 6 molts och kan leva upp till 5 år både i naturen och i fångenskap 8.
Vi har utnyttjat Madagaskar väsande kackerlacka som surrogat värd för infektion med intracellulära patogener Burkholderia mallei, B. pseudomalleioch B. thailandensis 10,11. Virulens hos dessa patogener i väsande kackerlackor jämfördes med deras virulens i den benchmark djurmodell för Burkholderia, syrisk hamster. Vi fann att den dödliga dosen för 50% (LD50) av B. pseudomallei och B. mallei var liknande i båda modeller 11. Intressant, är B. thailandensis, även om Avirulenta i gnagare modellen, dödliga i väsande kackerlacka 11. Denna skillnad med avseende på B. thailandensis infektion understryker nyttan av väsande kackerlacka modell; B. thailandensis förmildrande mutanter kan lättare lösas i den väsande kackerlackan än i djurmodeller. Dessutom som B. thailandensis används ofta som kunde modell organismen för B. pseudomallei och B. mallei 10,12,13, identifiera förmildrande mutationer i det leda till liknande mål i dess mer virulent släktingar.
Trots skillnaden i virulens B. thailandensis i den väsande kackerlackan kontra syrisk hamster, mutationer i kritiska virulensfaktorer, såsom de i typ 6 utsöndring system-1 (T6SS-1), som förmildrande i B. mallei och B. pseudomallei, är likaså förmildrande för B. thailandensis 11. Väsande kackerlacka modellen valideras ytterligare i det enskilda T6SS mutanter (T6SS-2 till T6SS-6) i B. pseudomallei, som har ingen bäring på virulens i syriska hamstrar, förbli virulent i väsande kackerlackor 11. Således är den väsande kackerlackan en livskraftig surrogat djurmodell för tre Burkholderia arter. Vi utnyttjas nyligen den väsande kackerlackan som ett surrogat djurmodell att undersöka effekten av den mot malaria läkemedel klorokin (CLQ) mot Burkholderia infektion 10 och dess toxicitet.
Här, vi beskriver uppfödning och skötsel av Madagascar väsande kackerlacka och ge Detaljer om hur att infektera denna insekt med tre Burkholderia arter. Dessutom visar vi att den väsande kackerlackan är en livskraftig surrogat-modell för att studera virulens och drogen effekt hos Burkholderia infektioner och att det sannolikt också kan fungera som en surrogat värd för andra bakteriella patogener i liknande studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förberedelser för att upprätthålla en väsande kackerlacka koloni
- Förbereda burar för väsande kackerlackor att leva i. Applicera ett tunt lager vaselin, cirka 20 till 30 mm i bredd, att omkretsen av de inre väggarna nära toppen av buren för att förhindra väsande kackerlackor från klättring ut ur buren och flyr.
Obs: Väsande kackerlackor kan inhysas i en mängd olika behållare som har en stor golvyta, är av tillräcklig höjd och har lock. Använda mus burar (~ 43 x 23 cm x 20 cm). För burar avsedda för 37 ° C, gäller inte vaselin. - Inkludera en kartong äggkartong placeras upp och ner inuti buren för att ge ett gömställe för naturligt blyg insekter. Inte att ersätta den kartong äggkartong med en gjord av styrencellplast att undvika intag av plast.
- Ge inte sängkläder för enklare rengöring och för att öka synligheten för nykläckta nymferna.
- Erhålla torr Hundfoder som innehåller en sammansättning av ~ 20% råprotein. Grovt slipa hundmat med en matberedare eller mixer och förvaras vid 4 ° C.
- Skaffa flera grunda rätter och akvarium stenar eller en svamp för mat och vatten.
Obs: petriskålar är recommeded.
2. väsande kackerlacka skötsel och avel
- Erhålla utkonkurrerat dö ut Madagaskar väsande kackerlackor (~ 5 cm) från en kommersiell uppfödare. De arter som används i detta protokoll är Gromphadorhina laevigata. Packa upp kartongen som innehåller väsande kackerlackor omedelbart efter mottagandet.
- Följ lämpliga institutionella riktlinjer för användning av personlig skyddsutrustning vid hantering av djur.
Obs: Använd tjock engångshandskar för hantering av kackerlackor som en väsande kackerlacka tarsal klor är vassa. - Överför upp till 75 stora väsande kackerlackor (> 3 cm) per stor bur. Överföra nyligen kläckta och mindre nymfer (< 3 cm) till en separat bur.
Obs: Att hålla betydligt mer än 75 stora väsande kackerlackor per mus bur kan leda till försämrade hälsa av kolonin och kan även leda till dödsfall. - Hantera en nyligen molted kackerlacka, som är benvit färg, försiktigt och Undvik att klämma. Alternativt kan exoskelett att mörkna och härda före hantering.
Obs: Det är inte nödvändigt att ta bort kvalstren, Gromphadorholaelaps schaeferi, som ofta åtföljer väsande kackerlackor vid mottagandet från uppfödare. De välgörande kvalster hålla väsande kackerlackor ren och är ofarliga för människor. - Foder väsande kackerlackor med marken torr hundmat i ett grunt fat en eller två gånger i veckan. Ge tillräckligt hundmat att väsande kackerlackor har tillräckligt med mat fram till nästa utfodring. Kassera all mat som blivit våt och mögliga.
- Förutom hundmat, ge styckade frukter och grönsaker, såsom äpplen, potatis eller sallad, i en flat tallrik. Kassera mögliga eller ruttna mat.
- Tillhandahålla dricksvatten en eller två gånger i veckan i en flat tallrik men Överfyll inte skålen för att förhindra spill i buren. Placera antingen små akvarium stenar eller en svamp i skålen att tillhandahålla en landning pad för små nymfer. Använd omvänd osmos vatten, om tillgängligt.
- Hålla väsande kackerlackor i mörker vid temperaturer från 21 ° C till 30 ° C. Hålla stora väsande kackerlackor avsedda för experimenterande vid lägre temperatur (~ 21 ° C) för ~ 2 månader att minska avel och graviditet. Däremot hålla nymfer vid högre temperaturer (28 ° C till 30 ° C) för att påskynda tillväxten.
Obs: Håll burar vid rumstemperatur (21 ° C) i ett mörkt skåp. - Ge fukt genom inklusive en separat kastrull med vatten om väsande kackerlackor hålls i en inkubator.
- Städa buren av kamma hem ut torr avföring regelbundet eller genom att överföra väsande kackerlackor till en ren bur varje 2 till 3 veckor. Hålla botten av buren torr. Städa buren omedelbart om överflödigt vatten tillåts ansamlas och blanda med avföringen på botten av buren.
3. kackerlacka förberedelse för experiment
- Överföra lämpligt antal väsande kackerlackor i en bur till en 37 ° C befuktade inkubator 1 till 3 veckor innan ett experiment för acklimatisering. Omfatta en kontrollgrupp för injektion. Denna acklimatisering period är kritiskt för att undvika temperaturchock under experiment.
- Gäller inte vaselin till burar avsedda för 37 ° C eftersom den högsta temperaturen smälter gelén.
- Kontrollera de väsande kackerlackorna varje 1 till 2 dagar för att ersätta mat och vatten och rengöra buren.
- Få tydliga disponibel plast matbehållare med lock för att gruppera väsande kackerlackor under experiment. För ventilation, stansa hål i locket eller sidan av behållaren med en spik och hammare.
Obs: Använd skruvlock behållare över snapin cap behållare i inställningen biosäkerhet nivå 3. Snap cap behållare kan förstärkas med tejp, om det behövs. - På dagen för injektion, distribuera 6 till 12 nedeerbörd väsande kackerlackor i grupper per behållare, garanterar jämn fördelning av kön och kroppsmassa.
- Bestämma könet på enskilda väsande kackerlackor. Avgöra kön av framträdande av horn på hanar och avsaknaden därav på honor.
- Väga enskilda väsande kackerlackor. För att underlätta vägning av en väsande kackerlacka på balansen, bifoga den inom två väga båtar som har varit tarerats.
Obs: För konsekvens mellan experiment, använda väsande kackerlackor med en vikt på 4 till 8 g. Dock ingen skillnad i överlevnad efter infektion har hittats mellan små (1,5-2 g) och stora (6 till 8 g) väsande kackerlackor. För drogen studier, använda väsande kackerlackor med en vikt på ~ 5 g för att få en mer konsekvent drog koncentration per kropp massa. - I stället för vatten fat, inkludera hög vatten innehåll frukt eller grönsaker, till exempel en bit äpple eller potatis. Kasta ruttna mat. Ge inte extra vatten för att hålla behållaren torr.
- Returnera väsande kackerlackor till 37 ° C fram till injektioner.
4. bakterieodling och preparat
Obs: De bakteriearter som används i detta protokoll är B. mallei, B. pseudomallei och B. thailandensis. Alla manipulationer med B. mallei och B. pseudomallei måste utföras i klass II eller klass III biologiska säkerhetsskåp finns i en biosäkerhet nivå (BSL) 3 laboratorium. Utföra manipulationer med B. thailandensis i liknande biologisk säkerhet skåp finns antingen i en BSL2 eller BSL3 laboratorium. Följ institutionella normalförfarande för BSL3 arbete. Följ anvisningar för användning av personlig skyddsutrustning vid hantering av bakterier.
- Förbereda en tryckplåt av Burkholderia minst 3 dagar före infektion. Använda Luria-Bertani (Lennox) (LB) agar för B. pseudomallei eller B. thailandensis och använda LB agar kompletterad med 4% glycerol för B. mallei. Strimma bakterier från en 25% glycerol materiel förvaras vid-80 ° C.
Obs: Strimma alltid master plattan direkt från fryst glycerol lager; undvika seriell passage av bakterier från platta till platta eftersom detta kan orsaka minskad virulens. - Inokulera 10 till 20 mL LB buljong med flera kolonier av B. pseudomallei eller B. thailandensis från master plattan. Likaså Inokulera LB buljong kompletteras med 4% glycerol för B. mallei.
- Skaka den buljong kulturen vid 175-250 rpm vid 37 ° C för ~ 18 h.
- Centrifugera 2 3 mL av kulturen på 5 000 x g i 10 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera bakteriell pelleten i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1,8 mM KH2PO4, pH 7,4).
- Späd ut bakterierna med PBS att uppnå en optisk densitet (OD) 0,5, mätt vid en absorbans vid 600 nm i en spektrofotometer.
- Seriellt späd bakterierna tiofaldig i PBS från start OD 0,5. Använd dessa suspensioner för infektion.
- Bestämma den kolonin bildar enheter (CFU) av inokulatet genom seriell utspädning och plätering 100 µL alikvoter på agar media. Inkubera plattorna vid 37 ° C i 24 till 48 h.
5. läkemedel
- Bestämma lämplig mängd läkemedel ges per kropp massa. CLQ doseringen ges till den väsande kackerlackan baserades på den vanliga doseringen för däggdjur, vilket är 50 mg/kg/dag.
- Återsuspendera eller späd läkemedlet sevärdheter i fordon. Till exempel späd CLQ i PBS med en koncentration på 12 mg/mL. Denna koncentration ger 300 µg av läkemedel till en ~ 6 g väsande kackerlacka i en 25 µL injiceras volym.
- Om nödvändigt, sterilisera drog lösningen genom passering genom ett 0,22 µm spruta filter.
- Förvara läkemedlet lösningen vid 4 ° C fram till användning. Värm lösningen drog till minst 21 ° C (rumstemperatur) före injektioner.
6. montering av injektorn
- Ställa markören till önskad volym (25 µL) genom att vrida justerskruven på repetitiva pipett.
- Tryck baren release av repetitiva pipetten inåt och dra mataren utåt. Repetitiva pipetten är nu redo att ta emot en laddad spruta.
Obs: Kalibrera volymen utkastade av repetitiva pipetten genom att mäta mängden vatten som kastas ut på en balans. - Fyll en 1 mL spruta med fjädring som innehåller antingen bakterier eller läkemedel.
- Anslut sprutan till en steril 26 eller 27 G x ½ tum (eller kortare) nål.
- Tryck på sprutan för att flyta luftbubblor till toppen och utvisa bubblor och vissa fjädring i en behållare fylld med 10% blekmedel.
- Fäst sprutan på sprutan klippet av repetitiva pipetten med nål avfasningen uppåt.
- Dra fältet release utåt och tryck på knappen dispenser ordentligt för att utföra tom injektioner i en behållare fylld med 10% blekmedel tills sprutkolven är mot pådrivaren.
- Utför 1 eller 2 extra tomt injektioner för att säkerställa att matas ut vätska ur sprutan. Repetitiva pipetten är klar för injektioner.
7. kackerlacka injektioner
- Utföra alla kackerlacka injektioner i klass II eller klass III biologiska säkerhetsdragskåp i en BSL2 eller BSL3 inställningen använder institutionella rekommenderas personlig skyddsutrustning.
- Rena arbetsytor säkerhet skåp som kan komma i kontakt med väsande kackerlackor. Använd 10% blekmedel följt av 70% etanol för att avlägsna kvarvarande blekmedel. Låt ytan till luft torka.
- Med ena handen, greppa den väsande kackerlackan vid dess sida. Immobilisera en väsande kackerlacka så att det inte går att rekyl under injektionen. Böj den väsande kackerlackan något så att de kutana membran mellan de buk tergiter utsätts.
- Med den andra handen, håll repetitiva pipetten så att nålen är 0 ° till 30° vinkel från dorso-ventrala mittlinjen av den väsande kackerlackan. Punktera kutan membranet intill 3rd, 4: eeller 5th tergum från bakre utgången.
Obs: Inmatning av nålen till den väsande kackerlackan på vinkeln anges garanterar att nålen inte går igenom och avsluta den väsande kackerlackan. Injektionsstället säkerställer att de utkastade materialet är innesluten i bukhålan fylld med hemolymph. Praktiken hålla väsande kackerlackor och injicera med vatten innan företaget injektioner med levande bakterier eller drogmissbruk. - Tryck på knappen dispensering ordentligt för att injicera volymen. Ta försiktigt ut nålen i samma vinkel som används för inmatning.
- Placera den injicerade väsande kackerlackan i en separat behållare att skilja den från de väsande kackerlackor som inte ännu injicerats. Torka bort eventuella hemolymph som kan ha sipprade ut från injektionsstället.
- Fortsätta injicering andra väsande kackerlackor inom en grupp med samma spruta och nål. Sluta injicera innan sprutkolven når botten av tunnan att förhindra ofullständig dosering i den sista injektionen.
- För flera injektioner i en enda väsande kackerlacka, såsom de med bakterier och drog, injicera på olika sidor av en tergum på ryggsidan av väsande kackerlackor. Alternativt utföra flera injektioner genom att injicera på olika tergiter (3rd till 5th).
- Se till att locken på behållarna är ordentligt fastsatta. Förstärka locken med tejp, om det behövs.
- Inkubera väsande kackerlackor i en fuktad 37 ° C inkubator.
8. inspelning väsande kackerlacka sjuklighet och dödlighet
- Utföra alla väsande kackerlacka undersökningar i klass II eller klass III biologiska säkerhetsdragskåp med institutionella rekommenderas personlig skyddsutrustning. Ren ytor i säkerhet skåp med 10% blekmedel följt av 70% etanol. Låt arbetsområdet till luft torka.
- Poäng väsande kackerlackor en eller två gånger dagligen under en period på 1 till 2 veckor med den sjuklighet som scoring tabell (tabell 1).
- Ta bort döda väsande kackerlackor från behållaren och registrera antalet överlevande.
- Överför återstående levande väsande kackerlackor till en ren behållare om överskottsfukt har samlats på botten av behållaren. Alternativt, Använd engångspappersprodukter handdukar för att torka bort överflödig fukt.
- Byta ut ruttna mat dagligen och återvändande väsande kackerlackor till befuktade 37 ° C inkubatorn.
- I slutet av studien, placera återstående överlevande i en biohazard påse och frysa vid-80 ° C till eutanasi.
- Statistiskt analysera data14 för att avgöra LD50 och Kaplan-Meier och Log-Rank analys för överlevnad. Som med alla insekt experimenterande, kan några dödsfall uppstå i kontrollgruppen. Dessa dödsfall hänförs till den naturliga mortaliteten insekter 15. För en mer detaljerad diskussion om hur man konto för dödsfall i kontrollgruppen, se referens15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta avsnitt illustrerar resultaten som erhölls när Madagaskar väsande kackerlackor var infekterade med B. mallei, B. pseudomallei, eller B. thailandensis; resultaten visar att denna insekt är en lätthanterlig djurmodell för olika arter av Burkholderia studera virulens, drug toxicitet och drogen effekt mot bakteriell infektion. Mer väsande kackerlackor överlevde i grupper som var infekterade med försvagat mutanter (Δhcp1) än i grupper som var infekterade med vildtyp B. pseudomallei K96243, föräldrarnas B. mallei SR1 eller B. thailandensis () DW503 (Se figur 1). Omvänt, infektion med virulent mutanter (Δhcp2 eller Δhcp3) dödade väsande kackerlackor på samma sätt som vildtyp B. pseudomallei (figur 1). Infektion med det Avirulenta Burkholderia däggdjursart, B. thailandensis E264 och dess aminoglykosid känsliga derivata DW503, visar att den väsande kackerlacka modellen är särskilt lämplig för att belysa mutationer i B. thailandensis som leder till dämpning (figur 2). Därför är det en mer passande djur modell för B. thailandensis studier än gnagare modeller. Ökande koncentrationer eller flera injektioner av CLQ döda inte väsande kackerlackor; Detta illustrerar att drug toxicitet kan också testas i väsande kackerlacka modell (figur 3). Vidare är effekten av CLQ mot B. thailandensis infektion visas i figur 4. Viktiga aspekter av väsande kackerlacka vård och infektion visas i figur 5. Tabell 1 kan användas för att Poäng dödligheten i väsande kackerlackor under experiment.
Figur 1: Väsande kackerlacka överlevnad efter injektion med virulent och försvagade Burkholderia . Åtta väsande kackerlackor per grupp injicerades med 25 µL av bakteriesuspensionen. Väsande kackerlackor kontrollerades för överlevnad en gång om dagen i 5 dagar. (A) Hissing kackerlackor injicerades med föräldrarnas B. mallei SR1 (torg) eller den Δhcp1 mutant (stängt kvadrat) på 100 CFUs. (B) Hissing kackerlackor injicerades med vildtyp B. pseudomallei K96243 (torg), Δhcp1 (stängt square), Δhcp2 (öppen triangel), eller Δhcp3 (öppen cirkel) mutant på 10 CFUs. (C) Hissing kackerlackor injicerades med föräldrarnas B. thailandensis DW503 (torg) eller Δhcp1 mutant (stängt kvadrat) på 100 CFUs. Figur ursprungligen publicerad i referens 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Väsande kackerlacka överlevnad efter injektion av ökande koncentrationer av B. thailandensis för LD50 beslutsamhet. Åtta väsande kackerlackor per grupp injicerades med vildtyp B. thailandensis E264 (A) eller aminoglykosid känsliga derivatan DW503 (B) och överlevnad var gjorde för 7 dagar. LD50 är 3 CFUs för E264 och 6 CFUs för DW503. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Väsande kackerlacka överlevnad efter injektion med klorokin. Fem väsande kackerlackor per grupp injicerades en gång (A) eller två gånger på två dagar (B) med 250 (diamant), 500 (torg), eller 1 000 µg (triangel) CLQ eller PBS (cirkel) och överlevnad var gjorde för 7 dagar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Väsande kackerlacka överlevnad efter infektion med B. thailandensis och behandling med klorokin. 10 till 12 väsande kackerlackor per grupp var infekterade med B. thailandensis DW503 och inte (torget), infekterade med B. thailandensis DW503 och behandlade med CLQ) triangel), behandlade med CLQ ensam (diamant), eller var infekterade och obehandlade (cirkel). Överlevnad spelades i 7 dagar. Survival kurvan, sammansatt av 4 separata experiment, uttrycks som en procentandel som är lika med det totala antalet överlevande dividerat med det totala antalet väsande kackerlackor för varje behandling på dagarna som anges. Det CFU inokulatet gett varierade från 10 till 20 LD50. Figur ursprungligen publicerad i referens 10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Bilder med anknytning till den väsande kackerlacka modellen. (A) A kvinna väsande kackerlacka saknar utskjutande delar på huvudet. (B), en manlig väsande kackerlacka kan identifieras genom närvaron av horn. (C) en väsande kackerlacka måste molt ur dess exoskelett att växa. Framväxande insekten är vit i färgen, men mörknar gradvis som nya exoskelett hårdnar. (D) väsande kackerlackor kan inrymmas i en snap cap plastbehållare med ventilationshål under ett experiment. (E) Under BSL3 villkor, väsande kackerlackor är inrymda i skruv cap plastbehållare. (F), A stor mus bur är används för att hysa en väsande kackerlacka koloni. Den bör innehålla mat, vatten och en kartong äggkartong för att gömma. (G) Hissing kackerlackor injiceras med en 1 mL spruta bifogas repetitiva pipett. (H) A väsande kackerlacka inokuleras genom injektion genom kutan membranet mellan de buk tergiter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 1 | Leva, normalt | -aktivt mobila -kunna förstå och hålla fast fingrarna när väsande kackerlacka plockas |
| 2 | Levande, slö | -orörliga men kryper när stack |
| 3 | Levande, döende | -orörlig med benen spikfickor -flyttas inte när stack -antenner och / eller ben flytta när stack |
| 4 | Döda | -orörlig med benen spikfickor -antenner flytta inte när stack -Ben inte flytta när stack |
Tabell 1: väsande kackerlacka sjuklighet poängsystem. Den totala poängen för en grupp av väsande kackerlackor är baserad på den väsande kackerlackan med högsta poäng i gruppen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimal försöksbetingelser börjar med en hälsosam väsande kackerlacka koloni, som kräver en minimal men konsekvent tid engagemang. Även om väsande kackerlackor kan gå under en relativt lång tid (~ veckor) utan mat och vatten, varje vecka eller varannan vecka bur underhåll måste tillhandahållas. Detta inkluderar kontroll av mat och vatten och se till att buren är torr. Att upprätthålla torr levnadsvillkor är särskilt viktigt under acklimatisering och inkubation vid högre temperaturer. finner vi att mer väsande kackerlackor dör och snabbare vid högre temperaturer när behållare inte var städas varje dag.
Nyckeln till konsekvent dosering eller inokulering av den väsande kackerlackan är att trycka på knappen dispenser på repetitiva pipetten ordentligt. Vi rekommenderar att praktisera denna teknik, lastning av sprutan på repetitiva pipetten och utföra tom injektioner. Det mest tidsödande steget av förfarandet för en operatör nya tekniken är holding eller immobilisera den väsande kackerlackan under injektionen. Därför rekommenderar vi också mycket öva tekniken att hålla och injicera flera väsande kackerlackor innan itu ett ambitiösare projekt. Detta kan uppnås genom att upprätthålla en liten grupp av väsande kackerlackor som används uteslutande för injektion metoder. Även om vi har funnit att injektion kan utföras snabbt när du håller den väsande kackerlackan på dess sida, andra tekniker för jordbruksföretaget väsande kackerlackor (e.g. immobilisera en väsande kackerlacka på en böjd yta; perching den väsande kackerlacka på långfingret medan pekfinger och tumme immobilisera det) kan vara att föredra och bör undersökas av olika aktörer.
Användning av väsande kackerlacka modell ger flera fördelar jämfört med andra insekters modeller (t.ex. vax masken larven Galleria mellonella och bananflugan Drosophila melanogaster) som har använts tidigare som djurmodeller med Burkholderia infektion 16,17,18. Exempelvis varierar experimentella fönstret för en väsande kackerlacka från månader till år vilket ger flexibilitet att forskarna, medan det för en vax masken larv är endast fem dagar 19,20. För en vax masken larv sammanfaller fem dagars perioden också med cocoon fodral; borttagning av kokonger är en arbetskrävande process som kan orsaka fysiskt trauma till larver 20. Viktigare, en B. thailandensis T6SS-1 mutant som är försvagade i både syriska hamster och väsande kackerlacka 11, var virulent i Galleria, vilket tyder på att Galleria inte är en bra modell för studier av vissa mutanter såsom T6SS i B. thailandensis (inga data anges).
Användningen av den väsande kackerlackan presenterar flera fördelar jämfört med bananflugan. Den väsande kackerlackan är stor och av en betydande kroppsmassa med en tuff exoskelett som gör att den kan hanteras enkelt under injektioner. Däremot bananflugan är liten och kräver specialutrustning för inympning. Också, medan den väsande kackerlackan naturligt bor i temperaturer som liknar eller överstiger människans kroppstemperatur, den optimala temperaturen för bananflugan är mellan 22 till 28 ° C. Detta gör bananflugan begränsad användning i samband med att studera processer som är beroende av människans kroppstemperatur (till exempel flera kärnförsedda jätte-cellbildande Burkholderia 10).
Det finns vissa nackdelar med att användningen av väsande kackerlackor. Genetiken av den väsande kackerlackan studeras inte samt som Drosophila eller ens Galleria. Den väsande kackerlackan har också en betydande ”ick” eller brutto faktor. Den väsande kackerlackan förblir dock en attraktivt och livskraftigt surrogat värd för Burkholderia genom att ge tydliga fördelar till dess användning i forskning som är unika för arten. Som vi har visat att Madagaskar väsande kackerlacka är en lätthanterlig surrogat värd för Burkholderia, det mycket troligt kan också fungera som en surrogat värd för andra bakteriella patogener och vi för närvarande utnyttjar det i sådana studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
J. Chua, N.A. Fisher, D. DeShazer och A.M. Friedlander utformad procedurerna som beskrivs i manuskriptet. J. Chua, N.A. Fisher, S.D. Falcinelli och D. DeShazer utfört experimenten. J. Chua skrev manuskriptet.
Författarna vill tacka Joshua J. W. Roan, Nora D. Doyle, Nicholas R. Carter och Steven A. Tobery för utmärkt teknisk assistans och David P. Fetterer och Steven J. Kern för statistisk analys.
Arbetet stöddes av den försvar hot minskning byrån förslag nr CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F och #CBS. MEDBIO.02.10.Rd.034 till D.D.
Yttranden, tolkningar, slutsatser och rekommendationer är författarnas och är inte nödvändigtvis godkändes av den amerikanska armén.
Innehållet i denna publikation återspeglar inte nödvändigtvis åsikter eller politik av Department of Defense, eller nämner av varunamn, kommersiella produkter eller organisationer antyda av den amerikanska regeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Madagascar hissing cockroach |
Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC | 143668 | |
| Kibbles n Bits, any flavor | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| Snap on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| Screw on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER series repetitive pipette | Dymax Corporation www.dymax.com |
T15469 | |
| Syringe (1 mL) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| Needle (26 or 27G x 1/2) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| Chloroquine diphosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria- Bertani (Lennox) | Becton Dickinson, Sparks, MD | 240230 | |
| Agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
References
- Sifri, C. D., Ausubel, F. M. Cellular Microbiology. Boquet, P., Cossart, P., Normark, S., Rappuoli, R. , ASM Press. 543-563 (2004).
- Silcock, S. Is your experiment really necessary? New Sci. 134 (1817), 32-34 (1992).
- Muller, U., Vogel, P., Alber, G., Schaub, G. A. The innate immune system of mammals and insects. Contrib Microbiol. 15, 21-44 (2008).
- Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1295-1309 (2002).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect Immun. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Mulder, P. G., Shufran, A. Madagascar hissing cockroaches, information and care. Oklahoma Cooperative Extension Service Leaflet L-278. , Oklahoma State University. 4 (2016).
- Nelson, M. C., Fraser, J. Sound production in the cockroach, Gromphadorhina portentosa: Evidence for communication by hissing. Behav Ecol Sociobiol. 6 (4), 305-314 (1980).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infect Immun. 85 (1), e0058616 (2017).
- Fisher, N. A., Ribot, W. J., Applefeld, W., DeShazer, D. The Madagascar hissing cockroach as a novel surrogate host for Burkholderia pseudomallei, B. mallei and B. thailandensis. BMC Microbiol. 12, 117 (2012).
- Haraga, A., West, T. E., Brittnacher, M. J., Skerrett, S. J., Miller, S. I. Burkholderia thailandensis as a model system for the study of the virulence-associated type III secretion system of Burkholderia pseudomallei. Infect Immun. 76 (11), 5402-5411 (2008).
- West, T. E., Frevert, C. W., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonia in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 102 Suppl 1, S119-S126 (2008).
- Finney, D. J. Probit Analysis. , University Press. Cambridge. (1971).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J Am Mosq Control Assoc. 3 (2), 302-303 (1987).
- Schell, M. A., Lipscomb, L., DeShazer, D. Comparative genomics and an insect model rapidly identify novel virulence genes of Burkholderia mallei. J Bacteriol. 190 (7), 2306-2313 (2008).
- Wand, M. E., Muller, C. M., Titball, R. W., Michell, S. L. Macrophage and Galleria mellonella infection models reflect the virulence of naturally occurring isolates of B. pseudomallei, B. thailandensis and B. oklahomensis. BMC Microbiol. 11 (1), 11 (2011).
- Pilatova, M., Dionne, M. S. Burkholderia thailandensis is virulent in Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (11), e49745 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. J Vis Exp. (70), e4392 (2012).
- Eklund, B. E., et al. The orange spotted cockroach (Blaptica dubia, Serville 1839) is a permissive experimental host for Francisella tularensis. PeerJ Preprints. 4, e1524v1522 (2016).
