Summary
نقدم بروتوكولا للاستفادة مدغشقر الهسهسة الصرصور كنموذج بديل غير الثدييات حيوان إجراء البكتيرية ضراوة والمرضية وسمية العقاقير، وفعالية العقاقير والدراسات الاستجابة المناعية الفطرية.
Abstract
هي المحافظة على جوانب كثيرة من الحصانة الفطرية بين الثدييات والحشرات. حشرة، مدغشقر الهسهسة الصرصور من جنس جرومفادورهينا، يمكن أن تستخدم كنموذج بديل حيوانات لدراسة الفوعة والمضيف الممرض التفاعل والاستجابة المناعية الفطرية وفعالية العقاقير. يتم توفير تفاصيل لتربية، رعاية وتربية الصرصار الهسهسة. نحن أيضا لتوضيح كيف يمكن أن يصاب بالبكتيريا مثل مسببات الأمراض داخل الخلايا بوركهولدريا مالي، بسيودومالي باء، وب ثيلاندينسيس. استخدام الصراصير الهسهسة غير مكلفة ويتغلب على القضايا التنظيمية التي تتناول استخدام الثدييات في البحث. وبالإضافة إلى ذلك، يتم العثور على استخدام نموذج الصرصار الهسهسة نتائج استنساخه ومماثلة لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام نماذج الثدييات. وهكذا، يمثل الصرصار الهسهسة مدغشقر مضيف بديل جذاب التي ينبغي استكشافها عند إجراء الدراسات الحيوانية.
Introduction
وقد تم استخدام الحشرات كبديل غير الثدييات نماذج حيوانية لدراسة المرضية البكتيرية والدفاع المضيف فطرية تكتسب زخما في السنوات الأخيرة. لوجستيا، هذا سبب تكاليفها رخيصة نسبيا والسهولة في الحصول على، ومعالجة ورعاية للحشرات بالمقارنة مع الثدييات. وهناك أيضا لا السياسة التنظيمية التي تحكم استخدام الحشرات في البحوث؛ فلا تخضع اختصاص أو استخدام القيود المبينة بالحيوان أي لجنة أو هيئة حكومية. لا سيما الحشرات كنماذج حيوانية بديلة قابلة لدراسات الفحص الشامل لعوامل الفوعة والتفاعلات المضيف الممرض، وإجراء تقييمات لفعالية العقاقير المضادة للميكروبات. استخدامها يمكن أن تقلل من عدد الثدييات المستخدمة للبحث وبالتالي التغلب على بعض المعضلات الأخلاقية المتأصلة لإجراء التجارب الحيوانية 1،2.
قد الحشرات بمثابة المضيفين بديل لأن هناك درجة عالية من القواسم المشتركة بين نظم المناعة الفطرية من الحشرات والثدييات 1،3. بلاسماتوسيتيس الحشرات والثدييات الضامة phagocytose الكائنات الدقيقة 4. نظيره الحشرات العَدلات هو 5،هيموسيتي6. مسارات انفجر الأكسدة داخل الخلايا في خلايا الثدييات والحشرات ومماثلة؛ يتم إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في كل من أورثولوجوس p47 بطاقات مجانيةphox و p67phox البروتينات 5. الشلالات مما يشير إلى اتجاه مجرى النهر من مستقبلات عدد القتلى في الحشرات والمستقبلات الشبيهة بعدد القتلى و Interleukin-1 في الثدييات تتشابه أيضا؛ كلاهما يؤدي إلى إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات، مثل ديفينسينس 7. وهكذا، يمكن أن تستخدم الحشرات لدراسة الآليات المناعية الفطرية العامة التي يشترك فيها ميتازوانس.
حشرة تسمى مدغشقر الهسهسة الصرصور من جنس جرومفادورهينا، هو واحد من أكبر أنواع الصراصير موجودة عادة الوصول إلى 5 إلى 8 سم عند الاستحقاق. هو أصلي فقط لجزيرة مدغشقر، وتتميز بصوت الهسهسة يجعل-صوت الذي يتم إنتاجه عند الصرصار الهسهسة يطرد الهواء من خلال الفتحات التنفسية spiracles 8ودعا. همسة مميزة بمثابة شكل من أشكال التواصل الاجتماعي بين الهسهسة الصراصير ل المغازلة والعدوان 9 ويمكن سماع عندما تشعر بالانزعاج الذكور في بيئتها. هو التحرك بطيئا مقارنة مدغشقر الهسهسة الصرصور صرصور الأمريكية وغيرها من الأنواع الآفات الحضرية. فمن السهل لرعاية وتربية؛ يمكن أن تنتج الصرصار الهسهسة حوامل ذرية 20 إلى 30 في وقت واحد. طفل الهسهسة الصراصير، تسمى حورية، تصل إلى مرحلة النضج الجنسي في 5 أشهر بعد أن تمر مولتس 6 ويمكن أن ترقى إلى 5 سنوات في البرية وفي الأسر 8.
وقد استخدمت في مدغشقر الهسهسة الصرصور كمضيف بديل للإصابة بمسببات الأمراض داخل الخلايا بوركهولدريا مالي، بسيودومالي باء، و ثايلاندينسيس 10،11. كان مقارنة ضراوة في النموذج القياسي الحيوان ضراوة هذه العوامل الممرضة في الهسهسة الصراصير بوركهولدريا، الهمستر السوري. وجدنا أن الجرعة المميتة 50 في المائة (LD50) بسيودومالي (ب) و مالي (ب) مماثل في كلا نماذج 11. من المثير للاهتمام، ثيلاندينسيس باء، على الرغم من أن أفيرولينت في النموذج القوارض، وقاتلة في الصرصار الهسهسة 11. يبرز هذا الاختلاف فيما يتعلق بالإصابة ثيلاندينسيس الأداة المساعدة من طراز الصرصار الهسهسة؛ ثيلاندينسيس باء مخففة طفرات يمكن حلها أكثر سهولة في الصرصار الهسهسة مما في نماذج القوارض. وعلاوة على ذلك، كما ثيلاندينسيس باء- كثيرا ما يستخدم كالكائن الحي النموذجي ل pseudomallei و مالي 10،12،13، تحديد الطفرات المخففة بأنها يمكن تؤدي إلى أهداف مماثلة في لها أقارب أكثر شراسة.
وعلى الرغم من الاختلاف في الفوعة من ثيلاندينسيس باء في الصرصار الهسهسة مقابل الهامستر السوري، والطفرات في عوامل الفوعة الحرجة، مثل تلك الموجودة في نوع 6 إفراز النظام-1 (T6SS-1)، التي هي مخففة في مالي (ب) و باء-pseudomallei، هي المخففة وبالمثل لثيلاندينسيس 11. كذلك التحقق من صحة النموذج الصرصار الهسهسة في هذا الفرد T6SS طفرات (T6SS-2 T6SS-6) في بسيودومالي (ب)، التي لا تؤثر على ضراوة في الهامستر السوري، تظل ضراوة في الصراصير الهسهسة 11. وهكذا، الصرصار الهسهسة نموذج بديلة قابلة للحياة حيوانية للأنواع بوركهولدريا الثلاثة. ونحن مؤخرا استخدمت الصرصار الهسهسة كنموذج بديل حيوانات لدراسة فعالية العقاقير المضادة للملاريا الكلوروكين (كلك) ضد العدوى بوركهولدريا 10 وسميته.
هنا، يمكننا وصف بتربية ورعاية مدغشقر الهسهسة الصرصور وتقديم تفاصيل عن كيفية تصيب هذه الحشرة مع الأنواع بوركهولدريا الثلاثة. وعلاوة على ذلك، نحن لتوضيح أن الصرصار الهسهسة نموذج بديلة قابلة للتطبيق لدراسة الفوعة وفعالية العقاقير في التهابات بوركهولدريا وأن المرجح أن يمكن أيضا بمثابة مضيف بديل للأخرى المسببة للأمراض البكتيرية في دراسات مماثلة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-الأعمال التحضيرية للحفاظ على مستعمرة الصرصار الهسهسة
- إعداد الأقفاص للصراصير الهسهسة للعيش. تطبيق طبقة رقيقة من الفازلين، حوالي 20 إلى 30 ملم في العرض، إلى محيط الجدران الداخلية قرب الجزء العلوي من القفص لمنع الصراصير الهسهسة من تسلق خارج القفص والهروب.
ملاحظة: الهسهسة الصراصير يمكن أن يسكنون في مجموعة متنوعة من الحاويات التي لها مساحة كبيرة، وهي من الطول الكافي، وأغطية. استخدام الأقفاص الماوس (~ 43 سم × 23 سم × 20 سم). أقفاص متجهة إلى 37 درجة مئوية، ولا يتم تطبيق هلام البترول. - وتشمل كرتون بيض كرتون وضعها رأسا على عقب داخل القفص توفير مكان اختباء للحشرات خجولة بطبيعة الحال. لا تحل محل كرتون البيض المقوى مع واحدة مصنوعة من رغوة البوليسترين لمنع ابتلاع بلاستيك.
- لا توفر الأسرة لتنظيف أسهل وزيادة إبراز الحوريات فقست حديثا.
- الحصول على الغذاء الكلب الجافة التي تحتوي على تركيبة بروتين الخام ~ 20%. خشنا طحن الأغذية الكلب مع الطعام المعالج أو خلاط وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- الحصول على عدة أطباق ضحلة وأحجار الزينة أو اسفنجة للغذاء والماء.
ملاحظة: يتم أطباق بيتري recommeded.
2-الهسهسة تربية ورعاية صرصور
- الحصول على أووتبريد مدغشقر الهسهسة الصراصير (~ 5 سم) من مربي تجاري. الأنواع المستخدمة في هذا البروتوكول هو لافيجاتا جرومفادورهينا. فك مربع الشحن التي تحتوي على الصراصير الهسهسة فور تسلمها.
- اتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية المناسبة لاستخدام معدات الوقاية الشخصية في التعامل مع الحيوانات.
ملاحظة: استخدام قفازات سميكة المتاح للتعامل مع الصراصير كمخالب الصرصار الهسهسة الرصغي حادة. - نقل الصراصير الهسهسة كبيرة تصل إلى 75 (> 3 سم) في قفص كبير. نقل الحوريات فقست حديثا وأصغر (< 3 سم) في قفص منفصل.
ملاحظة: الاحتفاظ بدرجة كبيرة أكثر من 75 كبيرة الهسهسة الصراصير كل قفص الماوس يمكن أن تؤدي إلى تدهور الصحة مستعمرة، ويمكن أن يؤدي أيضا إلى حالات الوفاة. - التعامل مع الصراصير مولتيد حديثا، وهي بيضاء اللون، بلطف وتجنب الضغط عليه. بدلاً من ذلك، السماح للهيكل الخارجي لتلقي بظلالها وتتصلب قبل المناولة.
ملاحظة: ليس من الضروري إزالة العث، شايفيري جرومفادورهولايلابس، التي غالباً ما تصاحب الصراصير الهسهسة عند استلام من مربي. الحفاظ على نظافة الصراصير الهسهسة العث مفيدة وغير مؤذية للبشر. - تغذية الهسهسة الصراصير مع الأرض الجافة الكلب الغذاء في طبق ضحل مرة أو مرتين في أسبوع. توفير ما يكفي من الغذاء الكلب لضمان قدر كاف من الغذاء الصراصير الهسهسة حتى تغذية القادم. تجاهل أي الأغذية التي أصبحت رطبة ومتعفن.
- بالإضافة إلى الكلب الغذاء، توفير قطع حتى الفواكه والخضروات، مثل التفاح أو البطاطا الخس في طبق ضحل. تجاهل الطعام متعفن أو فاسدة.
- توفير مياه الشرب مرة واحدة أو مرتين في أسبوع في طبق ضحل ولكن لا أوفيرفيل الطبق منع انسكاب في القفص. وضع أحجار الزينة صغيرة أو اسفنجة في الطبق لتوفير منصة هبوط للحوريات الصغيرة. استخدام مياه التناضح العكسي، إذا كانت متوفرة.
- تبقى الهسهسة الصراصير في الظلام في درجات حرارة تتراوح بين 21 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية. تبقى الصراصير الهسهسة الكبيرة الموجهة للتجريب في انخفاض درجة حرارة (~ 21 درجة مئوية) لمدة أشهر ~ 2 لتقليل الحمل وتربية. وفي المقابل، تبقى الحوريات عند درجات الحرارة الأعلى (28 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية) التعجيل بالنمو.
ملاحظة: الاحتفاظ أقفاص في درجة حرارة الغرفة (21 درجة مئوية) في ظلام مجلس الوزراء. - توفير الرطوبة بها بما في ذلك مقلاة منفصلة للمياه إذا الهسهسة الصراصير يتم الاحتفاظ بحاضنة.
- تنظيف القفص التي تختص بها البراز الجاف بشكل منتظم أو بواسطة نقل الهسهسة الصراصير إلى قفص نظيف كل 2 إلى 3 أسابيع. الحفاظ على الجزء السفلي من القفص جافة. تنظيف القفص فورا إذا سمح للمياه الزائدة تتراكم وخلط مع البراز في الجزء السفلي من القفص.
3-الصراصير التحضير للتجريب
- نقل العدد المناسب من الصراصير الهسهسة في قفص إلى حاضنة هوميديفيد 37 درجة مئوية 1 إلى 3 أسابيع قبل تجربة للتأقلم. وتشمل مجموعة مراقبة للحقن. هذه الفترة التأقلم أمر بالغ الأهمية لتفادي صدمة الحرارة أثناء التجريب.
- لا تنطبق فازلين أقفاص متجهة إلى 37 درجة مئوية نظراً لارتفاع درجة الحرارة يذوب في جيلي.
- تحقق الصراصير الهسهسة كل أيام 1 إلى 2 لتحل محل المواد الغذائية والمياه وتنظيف القفص.
- الحصول على أواني الطعام البلاستيكية المتاح واضحة مع أغطية لتجميع الصراصير الهسهسة أثناء التجريب. للتهوية، لكمه ثقوب في الغطاء أو الجانب حاوية مع مسمار ومطرقة.
ملاحظة: استخدام حاويات ملولبة على مدى انطباق كاب الحاويات في تحديد مستوى 3 السلامة الأحيائية. ويمكن تعزيز الحاويات كاب الخاطف مع الشريط، إذا لزم الأمر. - في يوم الحقن، توزيع الصراصير الهسهسة أقلمة 6 إلى 12 إلى مجموعات كل حاوية، ضمان المساواة في توزيع حسب الجنس وكتلة الجسم.
- تحديد جنس الفرد الصراصير الهسهسة. تحديد الجنس ببروز الأبواق العثور على الذكور وقلة منها على الإناث.
- وزن الصراصير الهسهسة الفردية. لتسهيل تقدير وزن الصرصار الهسهسة على التوازن، احتوائه داخل قاربين تزن قد تم تاريد.
ملاحظة: من أجل التناسق بين التجارب، استخدام الصراصير الهسهسة مع وزن من 4 إلى 8 ز. ومع ذلك، وجدت أي اختلاف في البقاء على قيد الحياة بعد الإصابة بين الصغيرة (1.5 إلى 2 ز) والصراصير الكبيرة (6 إلى 8 ز) الهسهسة. دراسات المخدرات، استخدام الصراصير الهسهسة بوزن ز ~ 5 للحصول على تركيز المخدرات أكثر اتساقا في هيئة جماعية. - بدلاً من طبق الماء، وتشمل المياه العالية المحتوى الفواكه أو الخضروات، مثل شريحة من التفاح أو البطاطا. تجاهل أغذية فاسدة. لا توفر كميات إضافية من الماء للحفاظ الحاويات الجافة.
- عودة الهسهسة الصراصير إلى 37 درجة مئوية حتى الحقن.
4-البكتيرية الثقافة والأعمال التحضيرية
ملاحظة: هذه الأنواع البكتيرية المستخدمة في هذا البروتوكول مالي (ب) وبسيودومالي ثيلاندينسيس. يجب أن يتم تنفيذ جميع التلاعبات مع مالي (ب) وبسيودومالي (ب) في "الدرجة الثانية" أو "الدرجة الثالثة" خزانات السلامة البيولوجية الموجودة في مستوى السلامة الأحيائية (BSL) مختبر 3. أداء التلاعب مع ثيلاندينسيس (ب) في مجال السلامة البيولوجية مماثلة خزائن تقع أما في مختبر BSL2 أو BSL3. اتبع إجراءات التشغيل الموحدة المؤسسية للعمل BSL3. اتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية لاستخدام معدات الوقاية الشخصية عند التعامل مع البكتيريا.
- إعداد لوحة رئيسية من بوركهولدريا 3 أيام على الأقل قبل الإصابة. استخدام لوريا-بيرتاني (لينوكس) (رطل) أجار pseudomallei (ب) أو (ب) ثيلاندينسيس واستخدام رطل أجار تكملها والغليسيرول 4% مالي (ب). البكتيريا متواصلة من مخزون والغليسيرول 25% المخزنة في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: دائماً متتالية اللوحة الرئيسية مباشرة من المخزون والغليسيرول المجمدة؛ تجنب المرور المسلسل من البكتيريا من لوحة إلى لوحة، قد يتسبب هذا في انخفاض ضراوة. - تطعيم مرق مل 10 إلى 20 رطل مع مستعمرات عدة بسيودومالي (ب) أو (ب) ثيلاندينسيس من اللوحة الرئيسية. وبالمثل تطعيم مرق LB تكملها والغليسيرول 4% مالي (ب).
- اهتزاز ثقافة مرق 175 إلى 250 لفة في الدقيقة في 37 درجة مئوية ح ~ 18.
- الطرد المركزي 2 إلى 3 مل ثقافة في 5,000 س ز لمدة 10 دقائق.
- تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه البكتيرية في الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني، 137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، مم 10 غ2ص4، 1.8 مم خ2ص4، درجة الحموضة 7.4).
- تضعف البكتيريا مع برنامج تلفزيوني لتحقيق بكثافة بصرية (OD) 0.5، يقاس على امتصاص 600 نانومتر في جهاز المطياف الضوئي.
- متسلسل تضعف البكتيريا PBS عشرة إضعاف من OD ابتداء من 0.5. استخدم هذه المعلقات للعدوى.
- تحديد مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي) للعدوى بتمييع المسلسل وتصفيح من 100 ميليلتر مختبرين في أجار وسائط الإعلام. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية ح 24 إلى 48.
5-المخدرات الاستعدادات
- تحديد المبلغ المناسب للمخدرات إيلاء كل هيئة جماعية. الجرعة كلك نظراً إلى الصرصار الهسهسة واستند الجرعة القياسية للثدييات، و 50 مغ/كغ/يوم.
- ريسوسبيند أو تمييع المخدرات اهتمام بالسيارة. على سبيل المثال، يؤدي إلى تمييع كلك في برنامج تلفزيوني بتركيز 12 مغ/مل. ويوفر هذا التركز 300 ميكروغرام من المخدرات إلى ز ~ 6 الهسهسة الصراصير في 25 ميليلتر حقن وحدة التخزين.
- إذا لزم الأمر، تعقيم الحل المخدرات بتمريره من خلال مرشح حقنه 0.22 ميكرومتر.
- تخزين المخدرات الحل عند 4 درجة مئوية حتى الاستخدام. الحارة حل مالا يقل عن 21 درجة مئوية (درجة حرارة الغرفة) قبل حقن المخدرات.
6-جمعية محقن
- تعيين المؤشر لوحدة التخزين المطلوب (25 ميليلتر) عن طريق تناوب المسمار التكيف على ماصة متكررة.
- دفع شريط الإصدار من ماصة المتكررة إلى الداخل وسحب دافع إلى الخارج. ماصة المتكررة جاهز الآن لاستيعاب حقنه محملة.
ملاحظة: معايرة حجم إخراج ماصة المتكررة بقياس كمية المياه إخراج على توازن. - ملء حقنه 1 مل مع التعليق الذي يحتوي على البكتيريا أو المخدرات.
- إرفاق حقنه 26 عقيمة أو إبرة 27 ز × نصف بوصة (أو أقصر).
- الاستفادة من حقنه تطفو فقاعات الهواء إلى الأعلى، وطرد الفقاعات وبعض التعليق في حاوية مليئة بالتبييض 10%.
- التقط حقنه على القصاصة حقنه من ماصة المتكررة بإبرة المجسم مشطوف الحواف متقابلة لأعلى.
- سحب شريط الإصدار إلى الخارج واضغط على زر موزع بشدة القيام بحقن فارغة في حاوية مليئة بالتبييض 10% حتى المكبس حقنه ضد دافع.
- إجراء حقن فارغة إضافية 1 أو 2 لضمان يجري إخراج السائل من المحاقن. ماصة المتكررة جاهز للحقن.
7. حقن صرصور
- أداء جميع الصراصير الحقن في سلامة بيولوجية الدرجة الثانية أو الدرجة الثالثة مجلس الوزراء في BSL2 أو BSL3 استخدام الإعداد المؤسسي أوصى بمعدات الحماية الشخصية.
- تنظيف أسطح العمل في سلامة مجلس الوزراء التي قد تأتي في اتصال مع الصراصير الهسهسة. استخدام التبييض 10% تليها الإيثانول 70% لإزالة التبييض المتبقية. السماح للسطح للهواء الجاف.
- يد واحدة، قبضة الصرصار الهسهسة بجانبها. شل الصراصير الهسهسة فإنه يكون غير قادر على الارتداد أثناء الحقن. ثني الصرصار الهسهسة قليلاً حيث أنه يتم كشفها في الأغشية الجلدية بين ترغا البطن.
- باليد الأخرى، أمسك الماصة المتكررة مثل الإبرة في 0° إلى 30° زاوية من خط الوسط دورسو البطني من الصرصار الهسهسة. ثقب الغشاء الجلدي المجاور 3rdأو 4ال5th ترجم من النهاية الخلفية.
ملاحظة: يضمن دخول الإبرة في الصرصار الهسهسة في زاوية وأشارت إلى أن الإبرة لا من خلال الذهاب والخروج من الصرصار الهسهسة. ويضمن موقع الحقن أن المواد التي طردت يرد داخل تجويف البطن مليئة هيموليمف. ممارسة عقد الصراصير الهسهسة والحقن بالماء قبل إجراء الحقن مع البكتيريا الحية أو المخدرات. - اضغط على زر dispense راسخا لحقن وحدة التخزين. بلطف سحب الإبرة في نفس الزاوية التي تستخدمها للدخول.
- ضع الصرصار الهسهسة حقنه في حاوية منفصلة لتمييزه عن الصراصير الهسهسة التي لم يتم حقنها بعد. تمحو أي هيموليمف قد يكون يرشحان خارجاً من موقع الحقن.
- مواصلة الحقن الأخرى الصراصير الهسهسة ضمن مجموعة باستخدام نفس المحاقن والإبر. إيقاف الحقن قبل وصول المكبس حقنه إلى الجزء السفلي للبرميل لمنع الجرعات غير مكتملة في حقن آخر.
- لحقن متعددة في صرصور الهسهسة واحد، مثل تلك التي مع البكتيريا والمخدرات، حقن في جوانب مختلفة من تيرجوم في الجهة الظهرية من الصراصير الهسهسة. وبدلاً من ذلك، إجراء حقنات متعددة بالحقن على ترغا مختلفة (rd 3 إلى 5th).
- ضمان أن الأغطية للحاويات يتم تثبيتها بشكل أمن. تعزيز الأغطية مع الشريط، إذا لزم الأمر.
- احتضان الهسهسة صراصير في حاضنة هوميديفيد 37 درجة مئوية.
8-تسجيل الهسهسة الصرصور معدلات الاعتلال والوفيات
- أداء جميع الامتحانات الصرصار الهسهسة في سلامة بيولوجية الدرجة الثانية أو الدرجة الثالثة مجلس الوزراء مع المؤسسية يوصي بمعدات الحماية الشخصية. تنظيف السطوح في سلامة مجلس الوزراء مع التبييض 10% تليها إيثانول 70%. تسمح مساحة العمل للهواء الجاف.
- نقاط الهسهسة الصراصير مرة أو مرتين يوميا على مدى فترة من 1 إلى 2 أسابيع استخدام الاعتلال سجل الجدول (الجدول 1).
- إزالة الصراصير الهسهسة الميت من الحاوية وسجل العدد الناجين.
- نقل تبقى حية الهسهسة الصراصير إلى حاوية نظيفة إذا تراكمت الرطوبة الزائدة في الجزء السفلي من الحاوية. بدلاً من ذلك، استخدام المناشف الورقية المتاح لتمحو الرطوبة الزائدة.
- تحل محل أغذية فاسدة اليومية والعودة الهسهسة الصراصير للحاضنة هوميديفيد 37 درجة مئوية.
- في نهاية الدراسة، وضع الناجين الباقين في حقيبة واقية وتجميد في-80 درجة مئوية euthanize.
- تحليل البيانات لتحديد LD50 14 إحصائيا وعن طريق تحليل كابلان-ماير ورتبة سجل للبقاء على قيد الحياة. كما هو الحال مع جميع التجارب الحشرات، قد تحدث بعض الوفيات في السيطرة على المجموعة. وتعزى هذه الوفيات إلى الوفيات الطبيعية للحشرات 15. لمناقشة أكثر تفصيلاً حول كيفية حساب للوفيات في السيطرة على المجموعة، راجع مرجع15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هذا المقطع يوضح النتائج التي تم الحصول عليها عندما كانت الصراصير الهسهسة مدغشقر مع مالي (ب)، (ب) بسيودومالي، أو ثيلاندينسيس (ب)؛ وتبين النتائج أن هذه الحشرة نموذج حيوان أصعب للأنواع المختلفة من بوركهولدريا في دراسة الفوعة وسمية العقاقير والمخدرات فعالية ضد العدوى البكتيرية. نجا الصراصير الهسهسة أكثر في الجماعات التي كانوا مصابين بطفرات الموهن (Δhcp1) مما في المجموعات التي كانوا مصابين wildtype K96243 بسيودومالي باء ، أبوية مالي SR1، أو (ب) ثيلاندينسيس DW503 ( الشكل 1). على العكس من ذلك، قتل العدوى مع طفرات الخبيثة (Δhcp2 أو Δhcp3) الصراصير الهسهسة المثل إلى wildtype pseudomallei باء (الشكل 1). العدوى مع الثدييات بوركهولدريا أفيرولينت، E264 ثيلاندينسيس (ب) ولها مشتقات امينوغليكوزيد الحساسة DW503، وتبين أن النموذج الصرصار الهسهسة مناسبة بشكل خاص لتوضيح الطفرات في (ب) ثايلاندينسيس التي تؤدي إلى توهين (الشكل 2). وبالتالي، فمن أكثر ملائمة حيوان نموذج للدراسات ثيلاندينسيس باء- من نماذج القوارض. زيادة تركيزات أو حقنات متعددة من كلك لم يقتل الصراصير الهسهسة؛ وهذا يوضح أنه يمكن أيضا اختبار سمية العقاقير في طراز الصرصار الهسهسة (الشكل 3). علاوة على ذلك، يظهر فعالية كلك ضد الإصابة ثيلاندينسيس (ب) في الشكل 4. وترد جوانب هامة من الهسهسة الرعاية الصراصير والإصابة في الشكل 5. يمكن استخدام الجدول 1 نقاط الاعتلال من الهسهسة الصراصير خلال التجارب.
رقم 1: الهسهسة الصراصير البقاء على قيد الحياة بعد الحقن بضراوة والموهنة بوركهولدريا . تم حقن الصراصير الهسهسة ثمانية كل مجموعة 25 ميليلتر من تعليق البكتيرية. تم فحص الصراصير الهسهسة للبقاء على قيد الحياة مرة واحدة في يوم لمدة 5 أيام. (أ) تم حقن الصراصير يهس مع أبوية مالي SR1 (ساحة مفتوحة) أو المسخhcp1 Δ (إغلاق مربع) في كفوس 100. (ب) تم حقن الصراصير يهس بنوع البرية K96243 بسيودومالي (ساحة مفتوحة)، Δhcp1 (إغلاق ساحة)، Δhcp2 (مثلث مفتوح)، أو Δhcp3 (دائرة مفتوحة) المسخ في كفوس 10. (ج) تم حقن الصراصير يهس مع الوالدين ثايلاندينسيس DW503 (ساحة مفتوحة) أو المسخhcp1 Δ (إغلاق مربع) في كفوس 100. الرقم نشرت أصلاً في مرجع 11. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : الهسهسة الصراصير البقاء على قيد الحياة بعد حقن لزيادة تركيزات باء-ثيلاندينسيس ل LD50 تصميم. تم حقن الصراصير الهسهسة ثمانية كل مجموعة مع wildtype E264 ثيلاندينسيس (A) أو مشتقات امينوغليكوزيد الحساسة DW503 (ب) والبقاء على قيد الحياة وكان سجل لمدة 7 أيام. وهو LD50 كفوس 3 ل E264 وكفوس 6 ل DW503. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : الهسهسة الصراصير البقاء على قيد الحياة بعد الحقن مع الكلوروكين. تم حقن خمس الصراصير الهسهسة كل مجموعة مرة واحدة (A) أو مرتين في يومين متتاليين (ب) مع 250 (الماس)، سجلت 500 (مربع)، أو 1000 ميكروغرام (مثلث) كلك أو برنامج تلفزيوني (دائرة) والبقاء على قيد الحياة لمدة 7 أيام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: الهسهسة الصرصور البقاء على قيد الحياة بعد الإصابة مع ب-ثيلاندينسيس والعلاج بدواء الكلوروكين. 10 إلى 12 الهسهسة الصراصير كل مجموعة كانوا مصابين ثيلاندينسيس DW503 ولا تعامل (مربع)، والمصابين DW503 ثيلاندينسيس (ب) وتعامل مع (كلك مثلث)، تعامل مع كلك وحدها (الماس)، أو وقاية ودون علاج (دائرة). وقد سجلت البقاء على قيد الحياة لمدة 7 أيام. منحنى البقاء على قيد الحياة، مركب من 4 تجارب منفصلة، يتم التعبير عنها كنسبة مئوية مساوية لمجموع عدد الناجين مقسوماً على العدد الكلي للصراصير الهسهسة لكل معاملة في الأيام التي ذكرت. ونظرا للعدوى زيمبابوي تراوحت من 10 إلى 20 دينار50. الرقم نشرت أصلاً في مرجع 10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5 الرقم: الصور يتعلق بنموذج الصرصار الهسهسة. (أ) ألف أنثى الهسهسة صرصور يفتقر إلى نتوءات رأسا على عقب. يمكن تحديد وجود ابواق الصرصار الهسهسة الذكور (ب). (ج) الهسهسة الصرصور يجب أن تساقط خارج الهيكل الخارجي لها أن تنمو. الحشرة الناشئة هو أبيض اللون ولكن يغمق تدريجيا كما يصلب الهيكل الخارجي الجديد. (د) الهسهسة الصراصير قد يضم في انطباق غطاء وعاء من بلاستيك مع فتحات التهوية خلال تجربة. (ﻫ) BSL3 تحت ظروف، الهسهسة الصراصير موجودة في المسمار كاب الحاويات البلاستيكية. قفص كبير الماوس (F) يستخدم لإيواء مستعمرة الصرصار الهسهسة. وينبغي أن تحتوي على الغذاء والماء ومن كرتون بيض المقوى للاختباء. (ز) الصراصير يهس يتم حقنها بحقنه 1 مل إرفاقه ماصة متكررة. يتم تلقيح الصرصار الهسهسة (ح) عن طريق الحقن من خلال الغشاء الجلدي بين ترغا البطن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| 1 | العادي، والعيش | -نشاط المحمول --قادرة على فهم والتمسك بالاصابع عندما يتم انتقاؤها من الصرصار الهسهسة |
| 2 | السبات العميق، والعيش | -غير متحركة لكن عمليات تتبع الارتباطات عندما محثوث |
| 3 | تحتضر، والعيش | -غير متحركة مع الساقين مطوي -لا تتحرك عندما محثوث --نقل هوائيات و/أو الساقين عندما محثوث |
| 4 | الميت | -غير متحركة مع الساقين مطوي -لا تقم بتحريك هوائيات عندما محثوث -لا تقم بتحريك الساقين عندما محثوث |
الجدول 1: الهسهسة الاعتلال صرصور سجل النظام. وتستند النتيجة الإجمالية لمجموعة من الصراصير الهسهسة الصرصار الهسهسة مع أعلى درجة في المجموعة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أفضل الظروف التجريبية تبدأ بمستعمرة صرصور الهسهسة صحية، الأمر الذي يتطلب الحد الأدنى بل الالتزام بالوقت متسقة. على الرغم من أن يهس الصراصير يمكن الذهاب لفترة زمنية طويلة نسبيا (~ أسابيع) دون طعام أو ماء، ويجب توفير الصيانة قفص أسبوعية أو نصف شهرية. وهذا يشمل فحص الأغذية وإمدادات المياه والتأكد من جفاف القفص. المحافظة على ظروف المعيشة الجافة أهمية خاصة خلال التأقلم والحضانة في ارتفاع درجات الحرارة؛ ونجد أن يموت الصراصير أكثر الهسهسة و بمعدل أسرع في ارتفاع درجات الحرارة عند عدم تم تنظيف الحاويات يوميا.
المفتاح للجرعات متسقة أو تلقيح الصرصار الهسهسة اضغط على زر موزع على ماصة المتكررة بشدة. نوصي بممارسة هذا الأسلوب، وتحميل من المحاقن على ماصة المتكررة، وأداء حقن فارغة. أن الخطوة الأكثر استهلاكاً للوقت الداخلي لعامل جديد للأسلوب عقد أو شل الصرصار الهسهسة أثناء الحقن. ولذلك، نوصي بشدة أيضا ممارسة أسلوب الضغط والحقن الصراصير الهسهسة متعددة قبل تناول مشروع أكثر طموحا. يمكن تحقيق هذا بالحفاظ على مجموعة صغيرة من الصراصير الهسهسة التي تستخدم حصرا لممارسات الحقن. على الرغم من أننا وجدنا أن الحقن يمكن أن يؤديها بسرعة عند عقد الصرصار الهسهسة على التقنيات التي يستعملها الجانب، وأخرى لعقد الهسهسة الصراصير (مثل شل الصرصار الهسهسة على سطح منحنى سلس؛ والتي تجلس في الهسهسة صرصور في الإصبع الأوسط بينما السبابة والإبهام شل أنها) قد يكون من المفضل وينبغي استكشاف مختلف المشغلين.
استخدام نموذج الصرصار الهسهسة ويتيح العديد من المزايا الأخرى نماذج الحشرات (مثل يرقة دودة الشمع Galleria mellonella وذبابة الفاكهة melanogaster المورفولوجية) التي استخدمت سابقا كنماذج حيوانية مع بوركهولدريا العدوى 16،،من1718. على سبيل المثال، الإطار التجريبي للصراصير الهسهسة يتراوح أشهر سنة مما يتيح المرونة للباحثين، في حين أن ليرقة دودة شمع هو 19،خمسة أيام فقط20. ليرقة دودة شمع، فترة خمسة أيام ويتزامن أيضا مع شرنقة انكاسيمينت؛ إزالة شرانق هو عملية كثيفة عمالة التي قد تسبب الصدمات الجسدية ل اليرقات 20. الأهم من ذلك، متحولة ثيلاندينسيس ب- T6SS-1 الذي هو يخفف في كلا الهامستر السوري و الصراصير الهسهسة 11، كان ضراوة في غاليريا، مما يوحي بأن غاليريا ليست نموذجا جيدا لدراسة بعض طفرات مثل T6SS في ثيلاندينسيس (البيانات لا تظهر).
استخدام الصراصير الهسهسة يقدم العديد من المزايا على ذبابة الفاكهة. الصرصار الهسهسة كبيرة وكتلة الجسم كبيرة مع الهيكل الخارجي صعبة التي تسمح له بأن يتم التعامل معها بسهولة من خلال الحقن. وفي المقابل، ذبابة الفاكهة الصغيرة ويتطلب معدات متخصصة للتطعيم. أيضا، بينما الصرصار الهسهسة بطبيعة الحال يعيش في درجات الحرارة التي تشبه أو تتجاوز درجة حرارة الجسم البشري، درجة الحرارة المثلى لذبابة الفاكهة بين 22 إلى 28 درجة مئوية. وهذا يجعل ذبابة الفاكهة للاستخدام المحدود في سياق دراسة العمليات التي تعتمد على درجة حرارة الجسم البشري (مثل تشكيل خلية عملاقة متعدد الأنوية في بوركهولدريا 10).
توجد بعض العيوب باستخدام الهسهسة الصراصير. لم يتم دراسة علم وراثة الصرصار الهسهسة كذلك كتلك التي المورفولوجية أو حتى غاليريا. أيضا له الصرصار الهسهسة كبيرة "أك" أو عامل الإجمالي. إلا أن تظل الصرصار الهسهسة مضيف بديل جذاب وقابلة للاستمرار بوركهولدريا بتوفير مزايا واضحة لاستخدامها في البحوث التي فريدة من نوعها لهذا النوع. كما أننا قد بينت أن مدغشقر الهسهسة الصراصير مضيف مركب يستهدف بوركهولدريا، فإنه من المرجح جداً أيضا بمثابة مضيف بديل لمسببات الأمراض البكتيرية الأخرى ونحن تستخدم حاليا في مثل هذه الدراسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
تشوا ياء، N.A. فيشر، ديشازير دال، وفريدلاندر صباحا تصميم الإجراءات المذكورة في المخطوطة. تشوا J.، N.A. فيشر، والمرسوم العالي فالسينيلي ودال ديشازير إجراء التجارب. وكتب جيه تشوا المخطوطة.
يشكر المؤلفون جوشوا جيه دبليو روان، نورا دال دويل، ر. نيكولاس كارتر وستيفن أ تبري للمساعدة التقنية الممتازة وديفيد ب. فيتيرير وستيفن ج. كيرن للتحليل الإحصائي.
وكان دعم العمل "اقتراح وكالة الحد من تهديد الدفاع" #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F و #CBS. MEDBIO.02.10.RD.034 إلى D.D.
الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي آراء المؤلفين ولا تقرها بالضرورة إلى "الجيش الأميركي".
محتوى هذا المنشور لا تعكس بالضرورة آراء أو سياسات وزارة الدفاع، ولا أذكر الأسماء التجارية، والمنتجات التجارية، أو المنظمات يعني موافقة "الحكومة الأمريكية".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Madagascar hissing cockroach |
Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC | 143668 | |
| Kibbles n Bits, any flavor | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| Snap on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| Screw on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER series repetitive pipette | Dymax Corporation www.dymax.com |
T15469 | |
| Syringe (1 mL) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| Needle (26 or 27G x 1/2) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| Chloroquine diphosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria- Bertani (Lennox) | Becton Dickinson, Sparks, MD | 240230 | |
| Agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
References
- Sifri, C. D., Ausubel, F. M. Cellular Microbiology. Boquet, P., Cossart, P., Normark, S., Rappuoli, R. , ASM Press. 543-563 (2004).
- Silcock, S. Is your experiment really necessary? New Sci. 134 (1817), 32-34 (1992).
- Muller, U., Vogel, P., Alber, G., Schaub, G. A. The innate immune system of mammals and insects. Contrib Microbiol. 15, 21-44 (2008).
- Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1295-1309 (2002).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect Immun. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Mulder, P. G., Shufran, A. Madagascar hissing cockroaches, information and care. Oklahoma Cooperative Extension Service Leaflet L-278. , Oklahoma State University. 4 (2016).
- Nelson, M. C., Fraser, J. Sound production in the cockroach, Gromphadorhina portentosa: Evidence for communication by hissing. Behav Ecol Sociobiol. 6 (4), 305-314 (1980).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infect Immun. 85 (1), e0058616 (2017).
- Fisher, N. A., Ribot, W. J., Applefeld, W., DeShazer, D. The Madagascar hissing cockroach as a novel surrogate host for Burkholderia pseudomallei, B. mallei and B. thailandensis. BMC Microbiol. 12, 117 (2012).
- Haraga, A., West, T. E., Brittnacher, M. J., Skerrett, S. J., Miller, S. I. Burkholderia thailandensis as a model system for the study of the virulence-associated type III secretion system of Burkholderia pseudomallei. Infect Immun. 76 (11), 5402-5411 (2008).
- West, T. E., Frevert, C. W., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonia in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 102 Suppl 1, S119-S126 (2008).
- Finney, D. J. Probit Analysis. , University Press. Cambridge. (1971).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J Am Mosq Control Assoc. 3 (2), 302-303 (1987).
- Schell, M. A., Lipscomb, L., DeShazer, D. Comparative genomics and an insect model rapidly identify novel virulence genes of Burkholderia mallei. J Bacteriol. 190 (7), 2306-2313 (2008).
- Wand, M. E., Muller, C. M., Titball, R. W., Michell, S. L. Macrophage and Galleria mellonella infection models reflect the virulence of naturally occurring isolates of B. pseudomallei, B. thailandensis and B. oklahomensis. BMC Microbiol. 11 (1), 11 (2011).
- Pilatova, M., Dionne, M. S. Burkholderia thailandensis is virulent in Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (11), e49745 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. J Vis Exp. (70), e4392 (2012).
- Eklund, B. E., et al. The orange spotted cockroach (Blaptica dubia, Serville 1839) is a permissive experimental host for Francisella tularensis. PeerJ Preprints. 4, e1524v1522 (2016).
