Summary
우리는 세균 독성, 병 인, 약물 독성, 약물 효능, 그리고 타고 난 면역 반응 연구를 수행 하는 대체 비 포유류 동물 모델으로 치찰음의 바퀴벌레는 마다가스카르를 활용 하는 프로토콜 제시.
Abstract
타고 난 면제의 여러 측면은 포유류와 곤충 사이 보존 됩니다. 곤충, 치찰음의 바퀴벌레 속 Gromphadorhina 에서 마다가스카르의 독성, 호스트 병원 체 상호 작용, 타고 난 면역 반응 및 약물 효능 연구에 대 한 대체 동물 모델로 활용할 수 있습니다. 양육에 대 한 세부 정보, 관리 및 쉿 하는 바퀴벌레의 번 식 제공 됩니다. 우리는 또한 그것 Burkholderia mallei, B. pseudomallei, 및 B. thailandensis세포내 병원 체과 같은 박테리아로 감염 될 수 있는 어떻게 보여 줍니다. 쉿 하는 바퀴벌레의 사용은 저렴 하 고 포유류 연구를 사용 하 여 처리 하는 규제 문제를 극복. 또한, 쉿 하는 바퀴벌레 모델을 사용 하 여 찾은 결과 재현할 수 있으며 포유류 모델을 사용 하 여 얻은 비슷합니다. 따라서, 마다가스카르 쉿 바퀴벌레 동물 연구를 할 때 탐구 해야 하는 매력적인 대리 호스트를 나타냅니다.
Introduction
세균 병 인 타고 난 호스트 방어를 공부 하 고 대체 비 포유류 동물 모델으로 곤충의 사용 최근 몇 년 동안에 추진력을 얻고 있다. 물류, 이것은 그들의 상대적으로 저렴 한 비용 및 획득, 처리, 및 포유류에 비해 곤충에 대 한 배려에 용이성 때문. 또한 연구에 있는 곤충의 사용 규제 정책이 있다 그것은 범위에 따라 또는 제한이 어떤 동물에 의해 규정 된 설정 위원회 또는 정부 기관에 사용. 대리 동물 모델으로 곤충 특히 독성 요인, 호스트 병원 체 상호 작용 및 항균 약물 효능 평가 대 한 종합 심사 연구 의무가 있습니다. 그들의 사용은 그로 인하여 일부 동물 실험 1,2의 행위에 내재 된 윤리적 딜레마를 극복 하는 연구에 사용 하는 포유류의 수를 줄일 수 있습니다.
곤충 곤충과 포유류 1,3의 타고 난 면역 체계 사이 공용성의 높은 학위 때문에 대리 호스트 될 수 있습니다. Plasmatocytes 곤충 및 포유류 세포 phagocytose 미생물 4. neutrophil에 곤충 대응 hemocyte 5,6입니다. 곤충과 포유류 세포에서 세포내 산화 파열 경로 비슷합니다; 둘 다에서 반응성 산소 종 orthologous p47phox 와 p67phox 단백질 5에 의해 생산 됩니다. 곤충 및 수용 체 통행세 같이 수용 체 통행세와 포유류에서 Interleukin-1 신호 계곡 하류는 또한 비슷해; 둘 다 defensins 7등 항균 성 펩 티 드의 생산 귀 착될. 따라서, 곤충 연구 metazoans에 의해 공유 되는 일반적인 타고 난 면역 메커니즘을 활용할 수 있습니다.
치찰음의 바퀴벌레 속 Gromphadorhina 에서 마다가스카르 라는 곤충 존재, 일반적으로 만기에 5 ~ 8 cm를 도달 하는 가장 큰 바퀴벌레 종 중 하나입니다. 마다가스카르의 섬에만 기본 이며 그것은-쉿 소리 쉿 하는 바퀴벌레 spiracles 8라는 호흡 구멍을 통해 공기를 추방 하는 때 생산 되는 소리가 특징 이다. 독특한 엘리베이터 치찰음의 바퀴벌레 구애와 침략 9 간의 사회적 커뮤니케이션의 한 형태로 제공 하 고 남성은 그것의 서식 지에서 방해 하는 때 들릴 수 있다. 마다가스카르 쉿 하는 바퀴벌레는 미국 바퀴벌레 및 다른 도시 해충 종에 비해 느린 이동입니다. 그것은 쉽게에 대 한 관심과 사육; 임신 치찰음의 바퀴벌레는 한 번에 20 ~ 30 자손을 생산할 수 있다. 치찰음의 바퀴벌레, 요정, 라는 도달 성적인 성숙에 5 개월 아기 후 6 molts를 진행 하 고 야생에서와 포로 8에서 5 년까지 살 수.
우리 Burkholderia mallei, B. pseudomallei, 세포내 병원 체 감염 및 B. thailandensis 10,11. 에 대 한 대리 호스트 치찰음의 바퀴벌레는 마다가스카르 활용 치찰음의 바퀴벌레에이 균의 독성은 Burkholderia, 시리아 햄스터에 대 한 벤치 마크 동물 모델에서 그들의 독성에 비교 되었다. 우리는 50% 치 사 량 (LD50) B. pseudomallei 의 B. mallei 두 모델 11에서 유사 했다 발견. 흥미롭게도, B. thailandensis, 설치류 모델에서 avirulent는 치찰음 바퀴벌레 11치명적인입니다. B. thailandensis 감염에 관하여이 차이 밑줄, 치찰음 바퀴벌레 모델의 유틸리티 B. thailandensis 돌연변이 약하게 설치류 모델에서 보다 치찰음 바퀴벌레에 더 쉽게 해결할 수 있습니다. 또한, B. thailandensis 로 자주 사용으로 B. pseudomallei 와 B. mallei 10,12,13, 그것에 약하게 돌연변이 식별에 대 한 모델 유기 체 수 있습니다. 악성의 친척에 비슷한 대상으로 이어질.
시리아 햄스터에 비해 치찰음 바퀴벌레에 B. thailandensis 의 독성에 차이, 돌연변이 유형 6 분 비 시스템-1 (T6SS-1), 그와 같은 중요 한 독성 요인에도 불구 하 고는 B. mallei 에 약하게 되 고 B. pseudomallei, 있다 마찬가지로 B. thailandensis 11약하게. 쉿 하는 바퀴벌레 모델 개별 T6SS 돌연변이 (T6SS-T6SS-6 2) B. pseudomallei에 시리아 햄스터에 독성에 아무런 베어링을가지고, 치찰음 바퀴벌레 11악성 유지에 더 유효성이 검사 됩니다. 따라서, 쉿 하는 바퀴벌레 세 Burkholderia 종에 대 한 실행 가능한 대리 동물 모델 이다. 우리는 최근 Burkholderia 감염 10 과 그 독성에 대 한 안티 말라리아 약물 클로로퀸 (CLQ)의 효능을 검사 하는 서로게이트 동물 모델으로 쉿 하는 바퀴벌레를 활용.
여기, 우리가 설명 양육 그리고 배려는 마다가스카르의 치찰음의 바퀴벌레와 3 Burkholderia 종 가진이 곤충을 감염 하는 방법에 정보를 제공. 또한, 우리는 쉿 하는 바퀴벌레는 공부 독성 및 약물 효능 Burkholderia 감염에는 그것은 가능성이 될 수 있습니다 또한 비슷한 연구에서 다른 세균성 병원 체에 대 한 대리 호스트 실행 가능한 대리 모델을 보여 줍니다.
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Protocol
1. 치찰음 바퀴벌레 식민지를 유지 하기 위한 준비
- 감 금 소에 살고 치찰음 바퀴벌레에 대 한 준비. 감 금 소에서 등산과 탈출에서 치찰음 바퀴벌레를 방지 하기 위해 감 금 소의 위쪽 내부 벽의 둘레에 석유 젤리, 폭, 약 20 ~ 30 m m의 얇은 레이어를 적용 됩니다.
참고: 치찰음의 바퀴벌레 다양 한 있는 대형 바닥 공간, 충분 한 높이의 뚜껑 컨테이너에에서 보관 수 있습니다. 마우스 케이지를 사용 하 여 (~ 43 cm x 23 cm x 20 cm). 감 금 소에 대 한 37 ° C에 대 한 운명, 석유 젤리는 적용 되지 않습니다. - 자연스럽 게 수 줍 어 곤충에 대 한 숨어있는 장소를 제공 하기 안에 거꾸로 배치 판지 계란 판지 포함. 폴리스 티 렌 거품의 플라스틱의 섭취를 방지 하기 위해 만든 한 골 판지 계란 판지를 대체 하지 않습니다.
- 쉽게 정리 하 고 새로 부 화 nymphs의 가시성을 높이기에 침구를 제공 하지 않습니다.
- 건조 한 개밥 ~ 20%의 조 단백질의 구성 포함 된 얻을. 덜 갈기 음식 프로세서 또는 믹서 기 개밥 및 4 ° c.에 저장
- 여러 가지 얕은 요리 및 수족관 돌 또는 음식과 물에 대 한 스폰지를 얻을.
참고: 접시는 추천.
2. 치찰음의 바퀴벌레 관리 및 번 식
- Outbred 마다가스카르 쉿 하는 바퀴벌레 (~ 5 cm)는 상업적인 종 축에서 얻을. 이 프로토콜에서 사용 하는 종 Gromphadorhina laevigata입니다. 수령 즉시 치찰음 바퀴벌레를 포함 하는 배송 상자를 풀으십시오.
- 동물 처리에 개인 보호 장비의 사용에 대 한 적절 한 제도적 지침을 따릅니다.
참고: 치찰음의 바퀴벌레의 tarsal 발톱 날카로운로 바퀴벌레를 처리 하기 위한 두꺼운 일회용 장갑을 사용 합니다. - 최대 75 큰 치찰음 바퀴벌레를 전송 (> 3 cm) 큰 감 금 소 당. 새롭게 부 화 하 고 작은 nymphs 전송 (< 3 cm) 별도 감 금 소에.
참고: 유지 75 보다 훨씬 더 큰 치찰음의 바퀴벌레 마우스 케이지 당 식민지의 건강 악화으로 이어질 수 및 또한 죽음 귀 착될 수 있었다. - 부드럽게 컬러로, 하얀은 새로 molted 바퀴벌레를 처리 하 고 그것을 당기고 피하십시오. 또는, 어둡게 하 고 처리 하기 전에 강화 외 골격을 하실 수 있습니다.
참고: 그것는 진드기, Gromphadorholaelaps schaeferi 를 종종 종 축에서 수령 시 치찰음 바퀴벌레를 제거할 필요가 없습니다. 도움이 진드기 쉿 하는 바퀴벌레를 청결 한 유지 하 고 인 간에 게 무해 하다. - 치찰음 바퀴벌레 먹이 지상 건조 한 개밥 얕은 접시에 일주일에 한 두 번. 쉿 하는 바퀴벌레는 충분 한 음식을 사용 하 여 다음 수 유까지 되도록 충분 한 개밥을 제공 합니다. 우기와 썩 되는 어떤 음식을 삭제 합니다.
- 개 음식 뿐만 아니라 컷-업 과일, 야채, 사과, 감자, 또는 얕은 접시에 상 추 등을 제공 합니다. 폐기 썩 또는 썩은 음식.
- 얕은 접시에 일주일에 한 두 번 식용 수를 제공 하지만 장에 흘림을 방지 하기 위해 접시 연극 하지 마십시오. 작은 님프에 대 한 상륙 패드를 제공 하기 위해 접시에 작은 수족관 돌 또는 스폰지를 놓습니다. 역삼 투 물를 사용 하 여 사용 가능한 경우.
- 온도 21 ° C에서 30 ° c.에 배열에서 어둠 속에서 바퀴벌레 치찰음 유지 계속 큰 치찰음 바퀴벌레 번 식와 임신 ~ 2 개월 (~ 21 ° C) 낮은 온도에서 실험에 대 한 운명. 반면, 성장을 촉진 하 더 높은 온도 (28 ° C ~ 30 ° C)에서 님프를 유지.
참고: 캐비닛 실내 온도 (21 ° C)는 어둠 속에 감 금 소를 유지. - 치찰음의 바퀴벌레는 인큐베이터에 보관 하는 경우 물 별도 팬을 포함 하 여 습도 제공 합니다.
- 정기적으로 또는 전송 하 여 치찰음 바퀴벌레 깨끗 한 케이지를 2 ~ 3 주마다 건조 배설물 밖으로 떠 서 여 감 금 소를 청소. 감 금 소의 바닥 건조 유지. 과잉의 물을 축적 하는 감 금 소의 바닥에 배설물과 혼합 수 있다면 즉시 케이지 청소.
3. 바퀴벌레 실험에 대 한 준비
- 적절 한 수 장에 치찰음 바퀴벌레의 전송 37 ° C 습도 인큐베이터 새 환경 순응 실험에 앞서 1 ~ 3 주. 주입에 대 한 컨트롤 그룹을 포함 합니다. 이 새 환경 순응 기간 실험 동안 온도 충격을 피하기 위해 중요 하다.
- 석유 젤리 케이지 때문에 높은 온도 녹아 젤리 37 ° C에 대 한 운명에 적용 되지 않습니다.
- 확인 치찰음 바퀴벌레 1 ~ 2 일 마다 음식과 물을 대체 하 고 감 금 소를 청소.
- 분명 일회용 플라스틱 음식 용기 실험 동안 쉿 하는 바퀴벌레를 그룹화 하는 데 뚜껑을 얻을. 환기, 뚜껑 또는 못을 가진 컨테이너의 측면에 구멍을 펀치와 망치.
참고: 스냅인을 통해 사용 나사 뚜껑 컨테이너 컨테이너 biosafety 수준 3 설정에서 모자. 필요한 경우 테이프, 스냅 캡 용기를 강화 수 있습니다. - 주입의 하루에 6 ~ 12 acclimatized 치찰음 바퀴벌레 섹스에 의해 동등 하 게 분배 되도록 하는 컨테이너, 당 그룹으로 고 신체 질량.
- 개별 치찰음 바퀴벌레의 섹스를 확인 합니다. 남성과 여성에 그 부족에 뿔의 굴지에 의해 섹스를 확인 합니다.
- 개별 치찰음 바퀴벌레 무게. 촉진 하기 위해 균형에 치찰음 바퀴벌레의 무게, tared 된 두 무게 보트 내에서 묶습니다.
참고: 실험 간의 일관성을 위해 4-8 g의 무게로 치찰음의 바퀴벌레를 사용 합니다. 그러나, 감염 후 생존에 차이가 작은 (1.5 ~ 2 g), 대형 (6-8 g) 치찰음 바퀴벌레 사이 발견 되었습니다. 약물 연구를 사용 하 여 치찰음 바퀴벌레 ~ 5 g의 무게와 몸 당 보다 일관성 있는 약물 농도 대량. - 물 접시 대신 높은 물 콘텐츠 과일 또는 야채, 사과 또는 감자의 조각 등을 포함 합니다. 썩은 음식을 삭제 합니다. 컨테이너를 건조 유지에 추가 물을 제공 하지 않습니다.
- 주사까지 37 ° C에 치찰음의 바퀴벌레를 반환 합니다.
4. 세균성 문화 및 준비
참고: 세균성 종이이 프로토콜에 사용 되는 B. mallei, B. pseudomallei, 및 B. thailandensis. B. mallei 와 B. pseudomallei 모든 조작 클래스 II에서 수행 해야 합니다 또는 클래스 III 생물 안전 캐비닛 biosafety 수준 (BSL)에 3 실험실. 조작을 수행 B. thailandensis 비슷한 생물 안전 캐비닛 BSL2 또는 BSL3 실험실에 위치. BSL3 작업에 대 한 기관 표준 운영 절차를 따릅니다. 박테리아를 처리할 때 개인 보호 장비의 사용에 대 한 제도적 지침을 따릅니다.
- 최소 3 일 전에 감염 Burkholderia 의 마스터 플레이트를 준비 합니다. Luria Bertani (레 녹 스) (파운드)를 사용 하 여 B. pseudomallei 또는 B. thailandensis agar 및 사용 파운드 agar 4% 글리세롤 B. mallei에 대 한 보충. 저장-80 ° c.에 25% 글리세롤 재고에서 행진 박테리아
참고: 항상 냉동된 글리세롤 주식;에서 직접 마스터 플레이트를 행진 직렬 통과 하는 박테리아의 피할 에서 플레이트에 플레이트가 감소 된 독성을 발생할 수 있습니다. - 10 ~ 20 mL 파운드 국물 마스터 플레이트에서 B. pseudomallei 또는 B. thailandensis 의 여러 식민지와 예방 마찬가지로 파운드 국물 B. mallei에 대 한 4% 글리세롤과 보충 접종.
- ~ 18 h 37 ° C에서 175 ~ 250 rpm 국물 문화를 흔들어.
- 10 분 동안 5000 x g에서 문화 2 ~ 3 mL 원심
- 삭제는 상쾌한 고 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 m m KCl, 10mm 나2포4, 1.8 m m KH2포4, pH 7.4)에 세균 펠 릿 resuspend.
- 0.5, 600에서 흡 광도 측정에의 한 광학 밀도 (OD)를 달성 하기 위해 PBS 가진 박테리아를 희석 한 분 광 광도 계에 nm.
- 순차적으로 희석 박테리아 0.5의 시작 마약에서 ten-fold에 PBS. 이러한 정지를 사용 하 여 감염에 대 한.
- 식민지는 inoculum 단위의 (CFU) 직렬 희석에 의해 형성 하 고 agar 미디어에 100 µ L aliquots의 도금을 결정 합니다. 24 ~ 48 h에 대 한 37 ° C에서 접시를 품 어.
5. 약 준비
- 체 당 주어진 약물의 적절 한 금액을 결정 질량. 쉿 하는 바퀴벌레에 게 주어진 CLQ 복용량은 50 mg/kg, 포유류에 대 한 표준 복용량에 근거 했다/일.
- Resuspend 또는 차량에 대 한 관심의 약물을 희석. 예를 들어 12 mg/mL의 농도에서 CLQ PBS에 희석. 이 농도의 치찰음의 바퀴벌레 25 µ L에서 주입 볼륨 ~ 6 g을 약 300 µ g를 제공 합니다.
- 필요한 경우, 0.22 μ m 주사기 필터를 통해 그것을 전달 하 여 약물 솔루션을 소독.
- 사용 될 때까지 4 ° C에서 약 솔루션을 저장 합니다. 적어도 21 ° c (실내 온도) 주사 전에 약물 솔루션 따뜻한.
6입니다. 인젝터의 조립
- 반복적인 피 펫에 조정 나사를 회전 하 여 원하는 볼륨 (25 µ L)에 대 한 포인터를 설정 합니다.
- 푸 셔를 바깥쪽으로 당겨 하 고 반복적인 피 펫의 릴리스 바를 안쪽으로 밀어. 반복적인 피 펫 이제 로드 주사기를 수용할 준비가 되어 있습니다.
참고: 보정 볼륨 균형에 배출 하는 물의 양을 측정 하 여 반복적인 피 펫으로 나옵니다. - 박테리아 또는 약물을 포함 하는 서 스 펜 션에 1 mL 주사기를 채우십시오.
- 살 균 26에 주사기를 연결 또는 27 G x ½ 인치 (또는 더 짧은) 바늘.
- 상단에 기포를 플 로트 하 여 10% 표 백제로 채워진 콘테이너로 거품 및 일부 정지 추방 주사기를 누릅니다.
- 향하도록 바늘 경사와 반복적인 피 펫의 주사기 클립에 주사기를 스냅 합니다.
- 릴리스 바 바깥쪽으로 당겨 고 빈 주사 주사기 플런저는 미는 사람에 대 한 때까지 10% 표 백제로 채워진 콘테이너로 수행을 단단히 디스펜서 버튼을 눌러
- 액체 주사기에서 배출 되는 보장 하기 위해 추가 빈 주사 1 또는 2 수행 합니다. 반복적인 피 펫은 주사에 대 한 준비.
7. 바퀴벌레 주사
- 클래스 II 또는 클래스 III 생물 안전 캐비닛에 BSL2에서에서 모든 바퀴벌레 주사를 수행 하거나 권장 BSL3 설정을 사용 하 여 기관 개인 보호 장비.
- 깨끗 한 작업 표면은 안전 캐비닛에 쉿 하는 바퀴벌레와 접촉 하 여 올 수 있습니다. 뒤에 70% 에탄올 10% 표 백제를 사용 하 여 잔여 표 백제를 제거. 건조 공기를 표면을 수 있습니다.
- 한 손으로, 그것의 측면에 의해 치찰음의 바퀴벌레를 잡습니다. 되도록 주입 중 반동 수 치찰음 바퀴벌레를 고정 하 고 구부려 치찰음 바퀴벌레 약간 그래서 복 부 terga 사이 피부 막 노출 됩니다.
- 다른 한편으로는, 되도록 바늘 0 °에 30 ° 각도로 쉿 하는 바퀴벌레의 dorso 복 부 중간에서 반복적인 피 펫 붙. 찔린 피부 막 후부 끝에서 3rd, 4번째또는 5번째 tergum에 인접 한 합니다.
참고: 항목 표시 각도에서 치찰음 바퀴벌레에 바늘의 바늘 않습니다 하지 통과 하 고 쉿 하는 바퀴벌레를 종료할 보장 합니다. 사출 사이트 꺼낸된 소재 hemolymph 채워진 복 부 구멍 안에 포함 된 보장 합니다. 쉿 하는 바퀴벌레를 들고 사업 라이브 박테리아 또는 약물 주입 하기 전에 물으로 주입 연습. - 디스 펜스 버튼 볼륨을 주입을 단단히 밀어. 부드럽게 항목에 대 한 사용으로 같은 각도로 바늘을 철회 한다.
- 주입 하지 아직 치찰음 바퀴벌레에서 그것을 구별 하는 별도 용기에 주입된 치찰음 바퀴벌레를 놓습니다. 주사 사이트에서 분출 할 수 있습니다 어떤 hemolymph를 닦아내십시오.
- 계속 같은 주사기와 바늘을 사용 하 여 그룹 내에서 다른 치찰음 바퀴벌레를 주입 합니다. 주입 주사기 플런저 마지막 주입에 불완전 한 주입을 방지 하기 위해 배럴의 바닥에 도달 하기 전에 중지 합니다.
- 여러 주사 약, 박테리아와 같은 단일 치찰음 바퀴벌레에 대 한 쉿 하는 바퀴벌레의 등 쪽 측에 tergum의 다른 측면에서 주사. 또는, 다른 terga (3 5일을rd )에 주입 하 여 여러 주사를 수행 합니다.
- 컨테이너의 뚜껑은 단단히 고정 되어 있는지 확인 합니다. 필요한 경우 테이프, 뚜껑을 강화.
- 치찰음의 바퀴벌레 습도 37 ° C 배양 기에서 품 어.
8입니다. 녹화 치찰음의 바퀴벌레 병 적 상태와 사망률
- 개인 보호 장비를 권장 클래스 III 또는 클래스 II 생물 안전 캐비닛 기관에서 모든 치찰음 바퀴벌레 검사를 수행 합니다. 뒤에 70% 에탄올 10% 표 백제와 함께 안전 캐비닛에 표면 청소. 작업 영역 공기를 건조 하실 수 있습니다.
- 점수 표 (표 1) 사망률을 사용 하 여 1 ~ 2 주 동안 매일 치찰음 바퀴벌레 번 점수.
- 컨테이너에서 죽은 쉿 하는 바퀴벌레를 제거 하 고 생존자의 수를 기록.
- 컨테이너의 하단에 과도 일 분 축적 하는 경우 깨끗 한 컨테이너에 바퀴벌레 치찰음 라이브 남은 전송. 또는, 일회용 종이 수건을 사용 하 여 과도 일 분을 닦아.
- 썩은 음식 매일 반환 치찰음의 바퀴벌레 습도 37 ° C 배양 기를 교체 합니다.
- 연구의 끝에, 나머지 생존자 biohazard 가방에 놓고 안락사에-80 ℃에서 동결 합니다.
- 통계적으로 분석 데이터14 l D50 를 결정 하 고 생존을 위한 카 플 란-마이어와 로그-순위 분석. 모든 곤충 실험과 마찬가지로 일부 사망자의 제어 그룹에서 발생할 수 있습니다. 이 죽음은 곤충 15의 자연 사망률 때문 이라고. 컨트롤 그룹에서 죽음에 대 한 계정 하는 방법에 더 자세한 내용은, 참조15참조.
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Representative Results
이 섹션에서는 마다가스카르 쉿 바퀴벌레 했다 또는 감염 된 B. mallei, B. pseudomallei B. thailandensis; 때 가져온 결과 결과이 곤충 독성, 약물 독성, 그리고 세균 감염에 대 한 약물 효능을 공부에서 Burkholderia 의 다른 종족에 대 한 온순한 동물 모델 임을 보여준다. 더 쉿 바퀴벌레 감쇠 돌연변이 (Δhcp1) 보다 그룹 wildtype B. pseudomallei K96243, 부모의 B. mallei 에 감염 된 감염 된 그룹에서 살아남은 SR1, 또는 B. thailandensis DW503 ( 그림 1)입니다. 반대로, 악성 돌연변이 (Δhcp2 또는 Δhcp3) 감염 wildtype B. pseudomallei (그림 1)와 유사 하 게 치찰음 바퀴벌레를 죽 였다. 감염 포유류 avirulent Burkholderia 종, B. thailandensis E264, 및 그것의 aminoglycoside 민감한 파생 DW503, 쉿 하는 바퀴벌레 모델은 특히 에 돌연변이 elucidating 적합 표시 B. thailandensis 는 감쇄 (그림 2) 리드. 따라서, 그것은 더 많은 피팅 동물 모델 B. thailandensis 연구에 대 한 설치류 모델 보다입니다. 증가 농도 또는 CLQ의 여러 주사 치찰음의 바퀴벌레;을 죽이지 않았어요 이것은 약물 독성도 치찰음 바퀴벌레 모델 (그림 3)에서 시험 될 수 있다 보여줍니다. 또한, B. thailandensis 감염에 대 한 CLQ의 효능은 그림 4에 표시 됩니다. 치찰음의 바퀴벌레 케어 및 감염의 중요 한 측면은 그림 5에 나와 있습니다. 표 1 실험 동안 바퀴벌레 치찰음의 병 적 상태를 사용할 수 있습니다.
그림 1: 악성 및 감쇠 주입 후 바퀴벌레 생존 치찰음 Burkholderia . 그룹 당 8 치찰음 바퀴벌레 세균 현 탁 액의 25 µ L로 주입 했다. 치찰음 바퀴벌레 생존 5 일 동안 하루에 한 번 확인 했다. (A) Hissing 바퀴벌레 부모의 B. mallei 와 함께 주입 했다 SR1 (오픈 광장) 또는 100 CFUs에서 (사각 폐쇄) Δhcp1 돌연변이. (B) Hissing 바퀴벌레는 야생 타입 B. pseudomallei K96243와 함께 주입 했다 (오픈 광장), Δhcp1 (사각 폐쇄), Δhcp2 (열려있는 삼각형), 또는 10 CFUs에서 Δhcp3 (오픈 원) 돌연변이. (C) Hissing 바퀴벌레 부모의 B. thailandensis 와 함께 주입 했다 DW503 (오픈 광장) 또는 Δhcp1 돌연변이 (폐쇄 사각형) 100 CFUs에서. 그림 참조 11에 출판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 치찰음의 바퀴벌레 생존의 농도 증가의 주입 후 B. thailandensis LD에 대 한50 결정. 그룹 당 8 치찰음 바퀴벌레 wildtype B. thailandensis E264 주사 했다 (A) 또는 aminoglycoside 민감한 파생 DW503 (B)와 7 일 동안 생존 득점 했다. LD50 은 E264 위한 3 CFUs와 DW503에 대 한 6 CFUs입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 치찰음의 바퀴벌레 생존 클로로퀸으로 주입 후. 그룹 당 5 치찰음 바퀴벌레 한 번 주입 했다 (A) 또는 500 (사각형), 또는 1000 µ g (삼각형) CLQ 또는 PBS (원) 및 생존 7 일 연속, 2 일 (B) 250 (다이아몬드)에 두 번 득점 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 감염 후 바퀴벌레 생존 치찰음 B. thailandensis 와 클로로퀸. 치료 그룹 당 10 ~ 12 치찰음 바퀴벌레 B. thailandensis DW503 감염 했다 고 하지 처리 (광장), B. thailandensis DW503 감염 고 처리 CLQ ( 삼각형), 혼자 (다이아몬드 CLQ), 치료 또는 감염 되지 않은 되었고 치료 (원). 생존은 7 일 동안 기록 되었다. 생존 곡선, 4 별도 실험의 합성 생존자 일에 각 치료에 대 한 치찰음 바퀴벌레의 총 수로 나눈 값의 총 수를 백분율로 표시 표시. CFU inoculum 주어진 20 LD5010에서 ranged. 그림 참조 10출판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 이미지 관련 치찰음 바퀴벌레 모델. (A) A 여성 치찰음의 바퀴벌레 부족 돌출의 머리에. (B) 남성 치찰음 바퀴벌레 뿔의 존재에 의해 확인할 수 있습니다. (C) A 치찰음 바퀴벌레의 외 골격 성장에서 탈피 합니다. 신흥 곤충 색상에 흰색 이지만 새로운 외 골격 견고로 점차적으로 어둡게. (D) 치찰음의 바퀴벌레 수 지 내게 환기 구멍 스냅인 뚜껑 플라스틱 용기에 실험 하는 동안. (E)에서 BSL3 조건, 치찰음의 바퀴벌레는 나사에서 지 내게 모자 플라스틱 용기. (F) A 큰 마우스 케이지 치찰음 바퀴벌레 식민지 집 하는 데 사용 됩니다. 그것은 음식, 물 및 숨기기에 대 한 골 판지 달걀 카 톤을 포함 해야 합니다. (G) Hissing 바퀴벌레 반복적인 피 펫에 연결 된 1 mL 주사기로 주사 된다. (H) A 치찰음 바퀴벌레 복 terga 사이의 피부 막을 통해 주입 주사 이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 1 | 라이브, | -적극적으로 모바일 -파악 하 고 쉿 하는 바퀴벌레 집어 손가락에 개최 수 |
| 2 | 라이브, 기 면 | -크롤링 prodded 때 하지만 움직이지 |
| 3 | 라이브, 죽어가는 | -다리 자리 잡고 움직이지 -prodded 때 이동 하지 않습니다 -안테나 및/또는 다리 prodded 이동 |
| 4 | 죽은 | -다리 자리 잡고 움직이지 -안테나 prodded 때 이동 하지 않습니다 -다리 prodded 때 이동 하지 않습니다 |
표 1: 치찰음의 바퀴벌레 사망률 시스템 득점. 쉿 하는 바퀴벌레의 그룹에 대 한 전체 점수를 매기는 그룹에서 가장 높은 점수와 함께 치찰음 바퀴벌레를 기반으로 합니다.
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Discussion
최적의 실험 조건 일관 된 시간 약속 하지만 최소한의 요구 하는 건강 한 치찰음 바퀴벌레 식민지로 시작 합니다. 치찰음의 바퀴벌레 시간의 비교적 긴 기간에 대 한 갈 수 있지만 (~ 주) 음식과 물 없이 매주 또는 격주 케이지 유지 보수를 제공 해야 합니다. 음식과 물 공급을 확인 하 고 보장 그는 케이지 건조 포함 됩니다. 건조 생활 상태를 유지 하는 특히 중요 한 새 환경 순응 및 높은 온도;에서 부 화 우리는 더 치찰음 바퀴벌레 죽을 찾 및 컨테이너 매일 청소 안 했다 하는 때 더 높은 온도에서 빠른 속도로.
일관 된 주입 또는 쉿 하는 바퀴벌레의 접종에 열쇠 버튼을 누르면 디스펜서 반복적인 피 펫에 확고 하 게 이다. 이 기술을 연습, 반복적인 피 펫에 주사기의 로딩 및 수행 빈 주사는 것이 좋습니다. 기술에 새로운 연산자에 대 한 절차의 가장 시간이 많이 걸리는 단계 보유 또는 주입 동안 쉿 하는 바퀴벌레를 immobilizing. 따라서, 우리 또한 좋습니다 누른 더 야심찬 프로젝트를 폭행 하기 전에 여러 치찰음 바퀴벌레를 주입의 기술을 연습. 이 주입 사례에 대 한 독점적으로 사용 되는 쉿 하는 바퀴벌레의 작은 그룹을 유지 하 여 얻을 수 있습니다. 비록 우리 주입 지주 치찰음 바퀴벌레 (예: 매끄러운 곡선된 표면에 치찰음 바퀴벌레 immobilizing;는 치찰음 perching에 대 한 그것의 측면, 다른 기술에 쉿 하는 바퀴벌레를 잡을 때 신속 하 게 수행할 수 있는 것으로 나타났습니다 가운데 손가락 검지와 엄지 고정 그것 동안에 바퀴벌레) 선호 있을 수 있으며 다른 연산자로 탐색 해야 합니다.
쉿 하는 바퀴벌레 모델의 사용 다른 곤충 모델 (예: 왁 스 벌레 애벌레 갤러리아 mellonella 및 과일 파리 초파리 melanogaster) 이전에 와 함께 동물 모델으로 사용에 몇몇 이점이 월급 Burkholderia 감염 16,,1718. 예를 들어 치찰음의 바퀴벌레에 대 한 실험적 창 범위 달에서 년, 연구원에 게 유연성을 수 있도록 왁 스 벌레 유 충에 대 한 그는 5 일 19,20. 왁 스 벌레 유 충에 대 한 일 기간 또한 일치 누에고치 넣음; 고치의 제거는 애벌레 20물리적 외상을 일으킬 수 있는 노동 집약적인 프로세스입니다. 더 중요 한 것은, 둘 다에서 감쇠 B. thailandensis T6SS-1 돌연변이 시리아 햄스터 치찰음 바퀴벌레 11은 갤러리아, 갤러리아 의 연구에 대 한 좋은 모델 아니다 제안 악성 B. thailandensis (데이터 표시 되지 않음)에 T6SS 같은 일부 돌연변이.
쉿 하는 바퀴벌레를 사용 하 여 과일 파리에 몇 가지 장점을 제공합니다. 쉿 하는 바퀴벌레는 크고 쉽게 주사 하는 동안 처리 될 수 있는 거친 외 골격으로 상당한 몸 질량의. 반면, 과일 파리 작은 고 접종에 대 한 특수 장비를 요구 한다. 또한, 쉿 하는 바퀴벌레는 자연스럽 게 유사한 온도 또는 인체 온도 초과, 과일 파리에 대 한 최적의 온도 22 ~ 28 ° c.에 사이 이것은 공부 하는 (예: Burkholderia 10멀티 nucleated 거 대 한 세포 형성) 인체 온도에 의존 하는 프로세스의 맥락에서 제한 된 사용의 과일 파리.
치찰음의 바퀴벌레의 사용을 몇 가지 단점이 존재 합니다. 쉿 하는 바퀴벌레의 유전학은 초파리 또는 심지어 갤러리아의 또한 공부 하지. 쉿 하는 바퀴벌레는 또한 상당한 "ick" 또는 그로스 팩터 있다. 그러나, 쉿 하는 바퀴벌레 종에 고유한 연구에서 사용 하는 명확한 이점을 제공 하 여 Burkholderia 에 대 한 매력적이 고 실행 가능한 대리 호스트를 남아 있습니다. 볼 수 있듯이 우리는 그는 마다가스카르 치찰음의 바퀴벌레는 Burkholderia에 대 한 세공 대리 호스트, 그것은 매우 가능성이 또한 다른 세균성 병원 체에 대 한 대리 호스트 될 수 있습니다 그리고 우리가 현재 같은 연구에 그것을 이용 하는.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
J. Chua, N.A. 피셔, D. DeShazer 및 오전 프리 원고에 설명 된 절차를 설계 되었습니다. J. Chua, N.A. 피셔, 사 우 스 다코타 Falcinelli와 D. DeShazer는 실험을 수행. J. Chua 원고를 썼다.
저자는 조슈아 J. W. 부드러운 양 가죽, 노라 디도 일, 니콜라스 R. 카터 및 우수한 기술 지원에 대 한 스티븐 A. Tobery와 데이비드 P. Fetterer와 스티븐 제이 컨 통계 분석에 대 한 감사합니다.
작품으로는 방위 위협 감소 기관 제안 #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F 및 #CBS를 지원 했다. D.D. 하 MEDBIO.02.10.RD.034
의견, 해석, 결론, 및 권장 사항 그 저자의 이며 반드시 미국 육군에 의해 승인 되지 않습니다.
이 발행물의 콘텐츠 뷰 또는 국방부의의 정책을 반드시 반영 하지 않습니다도 무역 이름, 상용 제품의 언급지 않습니다 또는 조직 미국 정부에 의해 승인을 의미 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Madagascar hissing cockroach |
Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC | 143668 | |
| Kibbles n Bits, any flavor | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| Snap on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| Screw on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER series repetitive pipette | Dymax Corporation www.dymax.com |
T15469 | |
| Syringe (1 mL) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| Needle (26 or 27G x 1/2) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| Chloroquine diphosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria- Bertani (Lennox) | Becton Dickinson, Sparks, MD | 240230 | |
| Agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
References
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