Summary
Biz Madagaskar kullanmak için bir protokol hamamböceği bakteriyel virülans, Patogenez, ilaç zehirlenmesi, ilaç etkinliğini ve doğuştan gelen bağışıklık yanıtı çalışmalar yapmak için alternatif bir non-memeli hayvan model tıslama mevcut.
Abstract
Doğuştan gelen bağışıklık birçok özelliği memelileri ve böcekler arasında korunmuş. Bir böceği, Hamam böceği Gromphadorhina, cins gelen tıslama Madagaskar virülans, ana bilgisayar-patojen etkileşim, doğuştan gelen bağışıklık yanıtı ve ilaç etkinliğinin incelenmesi için alternatif bir hayvan model olarak yararlı olabilir. Ayrıntılar için yetiştirme, bakım ve Tıslayan hamamböceği üreme sağlanır. Biz de nasıl o intrasellüler patojenlerin Burkholderia mallei, B. pseudomallei ve d. thailandensisgibi bakteri ile enfekte göstermektedir. Tıslayan hamamböceği kullanımı ucuz ve araştırma memelilerde kullanımı ile ilgili düzenleme sorunları üstesinden gelir. Buna ek olarak, sonuç Tıslayan hamamböceği model kullanarak bulundu tekrarlanabilir ve memeli modelleri kullanılarak elde benzer. Böylece, Madagaskar Tıslayan hamamböceği hayvan çalışmaları yürüten zaman keşfedilmeyi bir çekici vekil konak temsil eder.
Introduction
Böcekler bakteriyel Patogenez ve doğuştan gelen ana savunma eğitim için alternatif sigara memeli hayvan modeller olarak kullanımı son yıllarda ivme kazanmaktadır. Lojistik, nispeten ucuz maliyet ve alma, işleme ve memeliler göre böcekler için bakım kolaylığı nedeniyle bu. Böcekler araştırma kullanımı ile ilgili hiçbir yasal ilke olduğunu; Amaç tabi değil veya herhangi bir hayvan tarafından belirtilen koşullar Komitesi veya devlet kurumu kullanın. Böcekler gibi vekil hayvan modelleri özellikle virülans faktörleri, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri ve değerlendirmeler anti-mikrobiyal ilaç etkinliğinin kapsamlı tarama çalışmaları için mükellef bulunmaktadır. Bunların kullanımı araştırma böylece bazı etik ikilemler hayvan deney 1,2yürütülmesi için doğal üstesinden gelmek için kullanılan memeli sayısını azaltabilirsiniz.
Böcekler ve memeliler 1,3doğuştan gelen bağışıklık sistemi arasında ortak olması yüksek derecede olduğundan böcekler vekil ev sahibi olarak hizmet verebilir. Böcek plasmatocytes ve memeli makrofajlar mikroorganizmaların 4phagocytose. Nötrofil böcek Özgününü hemocyte 5,6' dır. Böcek ve memeli hücreleri hücre içi oksidatif patlama yollar benzer; Reaktif oksijen türleri hem de orthologous p47phox ve p67phox proteinleri 5tarafından üretilmektedir. Toll reseptörleri Toll benzeri reseptörler ve böcek ve memelilerde Interleukin-1 sinyal cascades nehrin aşağısında da oldukça benzer; her ikisi de defensins 7gibi antimikrobiyal peptidler üretiminde neden. Böylece, böcekler metazoans tarafından paylaşılan genel doğuştan gelen bağışıklık mekanizmaları incelemek için yararlı olabilir.
Hamamböceği cins Gromphadorhina, gelen tıslama Madagaskar denilen bir böcek var, genellikle 5-8 cm vade sonunda ulaşan en büyük Hamam böceği türlerinden biridir. Bu sadece Madagaskar adasında için yerel ve kolaylaştırır - tıslayan ses Tıslayan hamamböceği solunum açıklıklar vızıltısı 8denilen havada ihraç etti zaman üreten bir ses ile karakterizedir. Kendine özgü tıslamak hamamböceği Kur ve saldırganlık 9 tıslama arasında sosyal iletişim biçimi olarak hizmet verir ve bir erkek tabiatında rahatsız olduğunda duydum. Hamam böceği tıslama Madagaskar yavaş hareket Amerikan hamamböceği ve diğer kentsel zararlı türler için karşılaştırılır. Bu cins ve bakımı kolaydır; hamile Tıslayan hamamböceği teker teker 20-30 yavru üretebilir. Bir perisi olarak adlandırılan Hamam böceği, 5 ayda cinsel olgunluğa ulaşır tıslama bebek 6 molts geçiren ve 5 vahşi ve esaret 8olabilir yıl yaşamak sonra.
İntrasellüler patojenlerin Burkholderia mallei, B. pseudomalleiile enfeksiyon ve B. thailandensis 10,11. için bir vekil ev sahibi olarak hamamböceği tıslama Madagaskar kullanılan Hamamböceği tıslama içinde bu patojenler virülans Burkholderiaiçin Suriye hamster onların virülans kıyaslama hayvan modeli için karşılaştırıldı. B. pseudomallei ve B. mallei % 50 öldürücü doz (LD50) her iki model 11' benzer bulundu. İlginçtir, B. thailandensis, olmayan kemirgen modelindeki Tıslayan hamamböceği 11' öldürücü olmasına rağmen. Bu fark B. thailandensis enfeksiyon ile ilgili yardımcı programı Tıslayan hamamböceği model vurguluyor; Mutantlar inceltiyorum B. thailandensis daha kolay Tıslayan hamamböceği kemirgen modellerinde çözülebilir. Ayrıca, model organizma için inceltiyorum mutasyonların bu tanımlama B. pseudomallei B. mallei 10,12,ve13, B. thailandensis genellikle kullanılır indirilebilir daha öldürücü akrabaları benzer hedefleri yol.
B. thailandensis karşı Suriye hamster Tıslayan hamamböceği virülans farkı, bu tür 6 salgı sistemi-1 (T6SS-1), gibi kritik virülans faktörleri mutasyonların rağmen hangi inceltiyorum B. mallei içinde ve B. pseudomallei, çoğu benzer şekilde B. thailandensis 11için inceltiyorum. Suriye hamster virülans üzerinde hiçbir etkiye sahip, bireysel T6SS mutantlar (T6SS-2 T6SS-6) B. pseudomalleiiçinde Tıslayan hamamböceği 11' öldürücü kalır bu Tıslayan hamamböceği model daha fazla doğrulanır. Böylece, Tıslayan hamamböceği bir uygun Taşıyıcı hayvan üç Burkholderia türler için modeldir. Son zamanlarda Tıslayan hamamböceği Burkholderia enfeksiyon 10 ve onun toksisite karşı anti-sıtma ilaç klorokin (CLQ) etkinliğini incelemek için bir vekil hayvan modeli olarak kullanılmaktadır.
Burada, tarif biz yetiştirme ve bakım Madagaskar hamamböceği tıslama ve bu böcek üç Burkholderia türleri ile enfekte konusunda ayrıntılı bilgi sağlar. Ayrıca, biz virülans ve Burkholderia enfeksiyonlar ilaç etkinliğini ve bu büyük olasılıkla da benzer çalışmalar diğer bakteriyel patojenler için bir vekil olarak hizmet edebilir ki çalışmaya uygun vekil manken Tıslayan hamamböceği olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tıslayan hamamböceği koloni korumak için hazırlıklar
- Tıslayan hamamböceği yaşamak için kümesler hazırlayın. İç duvarları kafes kafes dışına tırmanma ve kaçan Tıslayan hamamböceği önlemek için en yakın çevresi için vazelin, yaklaşık 20 ila 30 mm genişliğinde, ince bir tabaka uygulayın.
Not: hamamböceği tıslama büyük bir yer var, yeterli yüksekliğini ve kapaklarını kapsayıcılar çeşitli barındırılıyor olabilir. Fare kafesleri kullanın (~ 43 cm x 23 cm x 20 cm). 37 ° C için mukadder kafesleri için vazelin geçerli değildir. - Baş aşağı doğal utangaç böcekler için saklanacak bir yer sağlamak için kafesin içine yerleştirilen bir karton yumurta kartonu içerir. Karton yumurta kartonu polistren köpük plastik sindirim önlemek için yapılmış bir ile yerine değil.
- Odada mevcut yataklar kullanılıyorsa daha kolay temizlik için ve yeni taranmış perileri görünürlüğünü artırmak için sağlamaz.
- ~ % 20 ham protein bileşimi içeren kuru köpek maması edinin. Kalitesiz köpek maması blender veya mutfak robotu ile eziyet ve 4 ° C'de depolayın
- Birkaç sığ yemekler ve akvaryum taş veya bir sünger yiyecek ve su elde etmek.
Not: Custome Petri yemekler vardır.
2. Tıslayan hamamböceği bakım ve yetiştirme
- Hamam böcekleri (~ 5 cm)--dan a ticari doğurmak tıslama outbred Madagaskar elde edilir. Bu protokol için kullanılan Gromphadorhina laevigatatürdür. Tıslayan hamamböceği aldıktan hemen sonra içeren nakliye kutusunu açmak.
- Hayvanlar alınmasında kişisel koruyucu ekipman kullanım için uygun kurumsal yönergeleri izleyin.
Not: kalın tek kullanımlık eldiven Tıslayan hamamböceği tarsal pençeleri keskin olduğu gibi Hamam böcekleri işlemek için kullanın. - İlâ 75 büyük Tıslayan hamamböceği transfer (> 3 cm) büyük kafes başına. Yeni taranmış ve daha küçük perileri transfer (< 3 cm) için ayrı bir kafes.
Not: önemli ölçüde daha fazla 75 büyük tutmak tıslama hamamböceği fare kafesi başına sağlık koloninin bozulan için neden olabilir ve ayrıca ölümle sonuçlanabilir. - Kirli beyaz renkli, yavaşça olan yeni molted Hamam böceği, idare ve sıkma kaçının. Alternatif olarak, exoskeleton karartmak ve tutmadan önce sertleşmesine izin verir.
Not: Akarlar, Gromphadorholaelaps schaeferi, sık sık--dan doğurmak aldıktan sonra Tıslayan hamamböceği eşlik kaldırmak için gerekli değildir. Faydalı akarları Tıslayan hamamböceği temiz tutmak ve insanlar için zararsızdır. - Tıslayan hamamböceği ile zemin kuru köpek maması sığ bir tabak içinde bir veya iki kez bir hafta ver. Tıslayan hamamböceği yeterli gıda sonraki besleme kadar olması için köpek besin içerir. Islak ve küflü olmuştur herhangi bir gıda atmak.
- Köpek maması ek olarak kesilmiş meyve ve sebzeler, elma, patates veya marul, sığ bir tabak gibi sağlar. Küflü veya çürümüş gıda atmak.
- İçme suyu sığ bir tabak içinde bir veya iki kez bir hafta sağlar ancak yemek içinde belgili tanımlık kafes dökülmeyi önlemek için fazla değil. Küçük akvaryum taş veya bir sünger bir iniş pisti için küçük perileri sağlamak için çanak yerleştirin. Ters Ozmos su, varsa kullanır.
- Sıcaklık 21 ° C 30 ° C'ye kadar karanlıkta hamamböceği tıslama tutmak Deneme daha düşük sıcaklıkta (~ 21 ° C) ~ 2 ay ıslah ve gebelik azaltmak hedef alan büyük Tıslayan hamamböceği tutun. Buna ek olarak, perileri (28 ° C ile 30 ° C) daha yüksek sıcaklıklarda büyüme hızlandırmak için devam edin.
Not: kafes, karanlık oda sıcaklığında (21 ° C) kabine tutun. - Nem bir kuluçka makinesine hamamböceği tutulur tıslama Eğer ayrı bir tavada su ekleyerek sağlar.
- Kafes düzenli olarak veya aktarma tarafından 2-3 haftada bir temiz kafes Hamamböceklerine tıslama kuru dışkı scooping tarafından temiz. Kafesin dibinde kuru tutun. Aşırı su birikir ve kafesin dibinde dışkı ile karıştırın izni varsa kafes hemen temizle.
3. Hamam böceği hazırlık deneme için
- Bir kafeste Tıslayan hamamböceği uygun sayıda 37 ° C oksijen kuluçka 1 ila 3 hafta önce deney calıştıkları aktarın. Enjeksiyon için denetim grubu içerir. Bu calıştıkları dönem deneme sırasında sıcaklık şok kaçınmak için önemlidir.
- Vazelin jöle daha yüksek sıcaklık erir çünkü 37 ° C için mukadder kafesleri için geçerli değildir.
- Tıslayan hamamböceği her 1-2 gün gıda ve su yerine ve kafes temizlemek için kontrol edin.
- Açık tek kullanımlık plastik saklama kapları Tıslayan hamamböceği deneme sırasında gruplandırma için kapakları ile elde edilir. Havalandırma için kapağı veya kapsayıcı bir çivi ile tarafında delikler ve çekiç.
Not: Kullanım vidalı kapak konteyner üzerinde ek Biyogüvenlik seviye 3 ayarı kaplarda kap. Snap kap kapsayıcılar kasetle, gerekirse takviye. - Enjeksiyon gününde, 6-12 acclimatized Tıslayan hamamböceği konteyner, başına seks tarafından eşit dağıtım sağlanması gruplara dağıtabilir ve kitle vücut.
- Bireysel Tıslayan hamamböceği cinsiyetini belirlemek. Erkek ve kadın bunların eksikliği bulunan boynuzları çıkıntı tarafından seks belirler.
- Bireysel Tıslayan hamamböceği tartın. Tıslayan hamamböceği denge üzerinde ağırlığında kolaylaştırmak için şeytan iki tartmak tekne içinde alın.
Not: deneyler arasında tutarlılık sağlamak için 4-8 g ağırlığıyla Tıslayan hamamböceği kullanın. Ancak, enfeksiyon sonra hayatta kalma hiçbir fark bulundu (1,5-2 g) küçük ve büyük (6-8 g) Tıslayan hamamböceği arasında. İlaç araştırmaları için Tıslayan hamamböceği ~ 5 g bir ağırlık ile vücut başına daha tutarlı bir ilaç konsantrasyonu elde etmek için kullanmak kitle. - Bir su yemek yerine, yüksek su içeriği meyve veya bir dilim elma ya da patates gibi sebzeler içerir. Çürük yiyecek atmak. Konteyner kuru tutmak için ek su sağlar.
- Tıslayan hamamböceği 37 ° C'ye kadar enjeksiyonları dönün.
4. bakteri kültürü ve hazırlıkları
Not: Bu protokol için kullanılan bakteriyel türdür B. mallei, B. pseudomallei ve B. thailandensis. Sınıf III biyolojik Emanet dolapları bir biyogüvenlik düzeyi (BSL) yer alan 3 laboratuvar veya B. mallei ve B. pseudomallei ile tüm manipülasyonlar sınıf II içinde gerçekleştirilmesi gerekir. Uygulamaları gerçekleştirin B. thailandensis benzer biyolojik güvenlik ile dolapları ya BSL2 ya da BSL3 laboratuar bulunmaktadır. BSL3 iş için kurumsal standart işletim prosedürü izleyin. Bakteri işlerken kişisel koruyucu ekipman kullanım için kurumsal yönergeleri izleyin.
- En az 3 gün önce enfeksiyon Burkholderia ana bir tabak hazırla. Luria-Bertani (Lennox) (LB) kullanın agar B. pseudomallei veya B. thailandensis ve kullanım LB agar B. malleiiçin % 4 gliserol ile desteklenmiştir. -80 ° C'de depolanan bir % 25 gliserol hisse senedi bakterilerden çizgi
Not: Her zaman doğrudan donmuş gliserol stoktan ana plaka çizgi; bakteri seri geçişini önlemek dan plaka için plaka bu azaltılmış virülans neden olabilir gibi. - 10-20 mL LB suyu B. thailandensis B. pseudomallei ve sömürgeler ana plaka ile aşılamak. Benzer şekilde B. malleiiçin % 4 gliserol ile desteklenmiş LB suyu aşılamak.
- 175-250 devirde 37 ° c ~ 18 h için suyu kültür sallamak.
- 2-3 mL 5000 x g 10 dk de kültürünün santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant atın ve bakteriyel Pelet steril fosfat tamponlu tuz (PBS, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7,4) resuspend.
- Ölçü vasıl 600 bir Absorbans 0,5, optik bir yoğunluğu (OD) sağlamak için PBS ile bakteri seyreltik bir Spektrofotometre nm.
- Seri olarak bakteri panolarında içinde PBS üzerinden başlangıç OD 0,5 oranında seyreltin. Bu süspansiyonlar enfeksiyon için kullanın.
- Birim inoculum (CFU) tarafından seri seyreltme şekillendirme ve 100 µL aliquots agar medya, kaplama koloni belirlemek. Plakalar için 24-48 h 37 ° C'de kuluçkaya.
5. uyuşturucu hazırlıkları
- Uyuşturucu vücut verilecek uygun miktarını belirlemek kitle. Tıslayan hamamböceği verilen CLQ doz 50 mg/kg olan standart doz memeliler, dayanıyordu/gün.
- Resuspend veya araç ilgi uyuşturucu oranında seyreltin. Örneğin, PBS CLQ 12 mg/mL konsantrasyonu oranında seyreltin. Bu konsantrasyon ilaç cilt 25 µL hamamböceği enjekte tıslama ~ 6 g için 300 µg sağlar.
- Gerekirse, uyuşturucu çözüm 0,22 µm şırınga filtreden geçirilerek sterilize.
- 4 ° C'de uyuşturucu çözüm kullanmak kadar saklamak. Uyuşturucu çözüm en az 21 ° c (oda sıcaklığında) enjeksiyonları önce sıcak.
6. enjektör montajı
- İşaretçiyi istediğiniz birime (25 µL) ayarı vida tekrarlayan bir pipet üzerinde döndürerek ayarlayın.
- Tekrarlayan pipet yayın bar içe doğru itin ve itici dışa doğru çekin. Tekrarlayan pipet şimdi dolu bir şırınga karşılamak hazırdır.
Not: bir denge üzerinde atılır su miktarını ölçerek tekrarlayan pipet tarafından atılır birim kalibre. - 1 mL şırınga ya bakteri ya da uyuşturucu içeren süspansiyon ile doldurun.
- Şırınga steril bir 26 veya 27 G ½ inç x (veya daha kısa) iğne ekleyin.
- Hava kabarcıkları üst şamandıra ve % 10 çamaşır suyu ile dolu bir kap içine baloncuklar ve bazı süspansiyon çıkarmak için şırınga dokunun.
- Yukarı dönük olacak şekilde iğne eğim ile şırınga tekrarlayan pipet şırınga klibin üzerine oturtun.
- Yayın çubuğunu dışa doğru çekin ve sıkıca şırınga pistonu itici karşı gelene kadar % 10 çamaşır suyu ile dolu bir kap içine boş enjeksiyonları gerçekleştirmek için dağıtıcı düğmesine basın.
- Sıvı şırınga dışarı atılır sağlamak için 1 veya 2 ek boş enjeksiyonları gerçekleştirin. Tekrarlayan pipet enjeksiyonlar için hazırdır.
7. Hamam böceği enjeksiyonları
- Sınıf II ve sınıf III biyolojik Emanet bir BSL2 kabin tüm hamamböceği enjeksiyonları gerçekleştirmek veya BSL3 ayarı kurumsal kullanarak kişisel koruyucu ekipman önerilir.
- Tıslayan hamamböceği ile temas gelebilir temiz çalışma yüzeyleri kabin emniyet. % 10 çamaşır suyu % 70 etanol tarafından takip artık çamaşır suyu kaldırmak için kullanın. Hava yüzey kuru izin.
- Bir elinizle Tıslayan hamamböceği onun yanında tut. Öyle ki enjeksiyon sırasında geri tepme değiştiremiyor Tıslayan hamamböceği hareketsiz. Böylece karın terga arasında Kutanöz membranlar maruz Tıslayan hamamböceği biraz kır.
- İğne bir 0 ° 30 ° açı Tıslayan hamamböceği dorso-ventral orta hat öyle ki diğer elini de tekrarlayan pipet tutun. Kutanöz membran 3rd, 4thveya 5inci tergum posterior ucundan yanındaki delik.
Not: Giriş belirtilen açıda Tıslayan hamamböceği içine iğne iğne geçmesi değil ve Tıslayan hamamböceği dışarı çıkmak sağlar. Enjeksiyon yeri çkarlyor malzeme hemolymph ile dolu karın boşluğu içinde bulunur sağlar. Tıslayan hamamböceği holding ve girişim iğneleri canlı bakteri ya da ilaç ile önce su ile enjekte uygulama. - Sıkıca birimi enjekte için besleme butonuna basın. Yavaşça olarak kullanılan aynı açıda iğne giriş için geri alıyorum.
- Değil henüz enjekte etmiş Tıslayan hamamböceği ayırmak için bir yer ayrı bir kapta enjekte Tıslayan hamamböceği. Dışarı enjeksiyon sitesinden oozed herhangi bir hemolymph yok etmek.
- Aynı şırınga ve iğne kullanarak bir grup içindeki diğer Tıslayan hamamböceği enjekte devam edin. Şırınga pistonu eksik son enjeksiyon dozaj önlemek için varil dibinde ulaşmadan önce enjekte durdurmak.
- Bakteri ve uyuşturucu, olanlar gibi tek bir Tıslayan hamamböceği içinde birden çok enjeksiyonlar için farklı bir tergum Tıslayan hamamböceği dorsal tarafta kenarlarında enjekte. Alternatif olarak, birden çok enjeksiyonları farklı terga (3rd 5inciiçin) adlı enjekte edilerek gerçekleştirin.
- Konteyner kapağı güvenli bir şekilde sabitlenmiş emin olun. Teyp, kapaklı gerekirse güçlendirmek.
- Hamamböceği oksijen 37 ° C kuluçka tıslama kuluçkaya.
8. kayıt hamamböceği morbidite ve mortalite tıslama
- Tüm Tıslayan hamamböceği sınavları sınıf II ve sınıf III biyolojik güvenlik ile kurumsal kabin kişisel koruyucu ekipman önerilen gerçekleştirin. Emniyet dolap yüzeyleri % 70 etanol tarafından takip % 10 çamaşır suyu ile temizleyin. Hava için çalışma alanını kuru izin.
- Tıslayan hamamböceği bir veya iki kez 1-2 hafta tablo (Tablo 1) puanlama morbidite kullanarak günlük bir süre içinde puan.
- Ölü Tıslayan hamamböceği kapsayıcıdan kaldır ve ölüm kaydedin.
- Aşırı nem konteyner alt kısmında birikmiş Eğer temiz bir kapsayıcı Hamamböceklerine tıslama canlı kalan aktarın. Alternatif olarak, tek kullanımlık kağıt havlu aşırı nem silmek için kullanın.
- Çürük yiyecek günlük ve dönüş oksijen 37 ° C kuluçka Hamamböceklerine tıslama değiştirin.
- Çalışma sonunda kalan kurtulan bir biohazard torbaya koyun ve ötenazi yapmak-80 ° C'de dondurmak.
- LD50 belirlemek için veri14 istatistiksel analiz ve hayatta kalmak için Kaplan-Meier ve günlük sırası analizi tarafından. Tüm böcek deneme gibi bazı ölümler kontrol grubunda oluşabilir. Bu ölümlerin böcekler 15doğal ölüm atfedilen. Daha ayrıntılı bilgi için nasıl hesabına ölümlerinin kontrol grubunda, başvuru15bakın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölümde Madagaskar Tıslayan hamamböceği B. mallei, B. pseudomallei, veya B. thailandensisile enfekte elde sonuçları göstermektedir; sonuçlar virülans, ilaç toksisitesi ve uyuşturucu etkinliği bakteriyel enfeksiyona karşı okumak bu böcek Burkholderia farklı türler için uysal bir hayvan modeli olduğunu gösterir. Daha fazla Tıslayan hamamböceği hayatta zayıflatılmış mutantlarla (Δhcp1) ile wildtype B. pseudomallei K96243, ebeveyn B. mallei hasta gruplarında daha bulaşmış gruplar halinde SR1 veya B. thailandensis DW503 () Şekil 1). Diğer taraftan, enfeksiyon ölümcül mutantlar (Δhcp2 veya Δhcp3) ile wildtype B. pseudomallei (şekil 1) benzer şekilde Tıslayan hamamböceği öldürdü. Memeli olmayan Burkholderia türler, B. thailandensis E264 ve aminoglikosite hassas türevi DW503, enfeksiyon göstermek Tıslayan hamamböceği model özellikle mutasyonların elucidating için uygundur B. thailandensis bu yol zayıflama (Şekil 2). Bu yüzden, daha fazla uygun hayvan için bir model B. thailandensis çalışmalar kemirgen modelleri daha uygundur. Artan konsantrasyonları veya birden çok CLQ enjeksiyonlari Tıslayan hamamböceği öldürmedi; Bu ilaç toksisitesi de Tıslayan hamamböceği model (şekil 3)test edilecek gösterir. Ayrıca, CLQ etkinliğini B. thailandensis bulaşmasına karşı şekil 4' te gösterilmiştir. Hamam böceği bakım ve enfeksiyon tıslama önemli yönleri şekil 5' te gösterilmektedir. Tablo 1 hamamböceği deneyler sırasında tıslama morbidite puanı için kullanılabilir.
Şekil 1: Hamam böceği sağkalım sonra öldürücü ve zayıflatılmış tıslama Burkholderia . Grup başına sekiz Tıslayan hamamböceği bakteriyel süspansiyon 25 µL ile enjekte edildi. Tıslayan hamamböceği hayatta kalma 5 gün boyunca günde bir kez kontrol edildi. (A)Hissing hamamböceği ile ebeveyn B. mallei enjekte SR1 (açık kare) veya (kare kapalı) Δhcp1 mutant, 100 CFUs. (B) Hissing hamamböceği vahşi türüyle B. pseudomallei K96243 enjekte (açık kare), (kare kapalı) Δhcp1 , Δhcp2 (açık üçgen), veya Δhcp3 (açık Daire) mutant, 10 CFUs. (C) Hissing hamamböceği ebeveyn B. thailandensis ile enjekte DW503 (açık kare) veya (kare kapalı) Δhcp1 mutant, 100 CFUs. Şekil aslen başvuru 11' de yayınlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Hamam böceği yaşam konsantrasyonları artan enjeksiyon sonra tıslama B. thailandensis için LD50 belirlenmesi. Grup başına sekiz Tıslayan hamamböceği wildtype B. thailandensis E264 ile enjekte(a)veya aminoglikosite duyarlı türev DW503 (B) ve hayatta kalma 7 gün boyunca gol attı. LD50 3 CFUs E264 için ve DW503 için 6 CFUs var. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Enjeksiyon klorokin ile sonra Hamam böceği hayatta kalma tıslama. Beş Tıslayan hamamböceği grubu başına bir kez enjekte(a)veya iki kez iki gün üst üste üzerinde (B) ile 250 (elmas), 500 (kare), veya 1000 µg (üçgen) CLQ veya PBS (Daire) ve hayatta kalma 7 gün boyunca gol. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: Hamam böceği hayatta kalma ile enfeksiyon sonra tıslama 10-12 Tıslayan hamamböceği grubu başına B. thailandensis DW503 ile enfekte ve değil (kare) tedavi, B. thailandensis DW503 ile enfekte ve tedavi CLQ () ile B. thailandensis ve tedaviyle klorokin. üçgen), CLQ yalnız (baklava), tedavi veya bulaşmamış ve tedavi edilmezse (Daire). Hayatta kalmak için 7 gün kaydedildi. Sağkalım eğrisi, 4 ayrı deneyler, bir bileşkesi Tıslayan hamamböceği her gün tedavi için toplam sayısı bölü hayatta kalan toplam sayısına eşit bir yüzdesi olarak ifade edilir belirtti. CFU inoculum 10'dan 20 LD50' ye değişmekteydi verilen. Rakam aslında başvuru 10dakika sonra yayınlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Görüntüleri ilgili Tıslayan hamamböceği modeli. (A) A erkek hamamböceği yoksun çıkıntılar onun başında tıslama. (B) A erkek Tıslayan hamamböceği boynuzları varlığı ile tespit edilebilir. (C) A Tıslayan hamamböceği büyümeye, exoskeleton dışarı tüy dökme gerekir. Gelişmekte olan böcek renk beyazdır ama yavaş yavaş yeni exoskeleton sertleşir gibi koyulaştırır. (D) hamamböceği tıslama ev havalandırma delikleri olan bir ek kap plastik kap içinde bir deney sırasında. (E) altında koşullar, hamamböceği tıslama vida yerleştirilmiştir BSL3 kap plastik kaplar. (F) A büyük fare kafesi Tıslayan hamamböceği koloni barındırmak için kullanılır. Yiyecek, su ve bir karton yumurta kartonu saklanma içermelidir. (G) Hissing hamamböceği tekrarlayan bir pipet bağlı 1 mL şırınga ile enjekte. (H) A Tıslayan hamamböceği karın terga arasında Kutanöz membran aracılığıyla enjeksiyonla aşılandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| 1 | Canlı, Normal | -Aktif mobil -güçlü-e doğru kavramak ve Tıslayan hamamböceği yerden alırken parmak tutun |
| 2 | Canlı, uyuşuk | -Ne zaman prodded tarar ama hareketsiz |
| 3 | Canlı, can çekişen | -bacağı sıkışmış olan hareketsiz -Ne zaman prodded hareket etmez -anten ve / veya bacaklar hareket ne zaman sıkıştırılıyor |
| 4 | Ölü | -bacağı sıkışmış olan hareketsiz -Ne zaman prodded anten hareket etmiyor -Ne zaman prodded bacaklar hareket etmiyor |
Tablo 1: puanlama sistemi hamamböceği morbidite tıslama. Tıslayan hamamböceği grupları için genel Puan Tıslayan hamamböceği grubunda en yüksek puanı temel alır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En iyi deneysel koşullar tutarlı süre taahhüdü ama en az gerektiren bir sağlıklı Tıslayan hamamböceği koloni başlayın. Hamamböceği tıslama oldukça uzun bir süre için gidebilirsiniz, ancak (~ hafta) yiyecek ve su, haftalık veya iki haftalık kafes bakım sağlanmalıdır. Bu yiyecek ve su kaynağı kontrol ve kafes kurudur sağlanması içerir. Kuru yaşam koşulları Bakımı calıştıkları ve daha yüksek sıcaklıklarda kuluçka sırasında özellikle önemlidir; Biz daha Tıslayan hamamböceği öleceğini bulmak ve ne zaman konteyner günlük temizlenmiş değil daha yüksek sıcaklıklarda daha hızlı bir oranda.
Tutarlı dozaj veya Tıslayan hamamböceği aşılama sıkıca tekrarlayan pipet dağıtıcı düğmesine basın için anahtarıdır. Biz bu tekniği uygulamak, şırınga tekrarlayan pipet üzerine yükleme ve boş enjeksiyonları gerçekleştirme öneririz. Yeni bir işleç için yordam en zaman alıcı adım tekniği tutarak veya enjeksiyon sırasında Tıslayan hamamböceği immobilizing. Bu nedenle, biz de son derece holding ve daha iddialı bir proje mücadele önce birden çok Tıslayan hamamböceği enjekte tekniği uygulamak öneririz. Bu sadece enjeksiyon uygulamaları için kullanılan küçük bir grup Tıslayan hamamböceği tutarak sağlanabilir. Her ne kadar biz enjeksiyon hızlı bir şekilde ne zaman onun tarafında, diğer teknikleri için holding Tıslayan hamamböceği (düzgün bir eğri yüzey üzerinde Tıslayan hamamböceği immobilizing; tıslama tıraşlamaörneğin Tıslayan hamamböceği tutmak gerçekleştirilebilir bulduk Hamam böceği orta parmak işaret parmağı ve başparmak hareketsiz süre üzerinde) tercih edilebilir ve farklı operatörleri tarafından keşfedilmeyi.
Tıslayan hamamböceği model kullanımı daha önce ile hayvan modelleri olarak kullanılmış olan diğer böcek modelleri (balmumu solucan larva Galleria mellonella ve meyve sineği Drosophila melanogastergibi) çeşitli avantajlar tanıyor Burkholderia enfeksiyon 16,17,18. Örneğin, bunun bir balmumu solucan larva için sadece beş gün 19,20ise araştırmacılar, esneklik sağlayan yıl aydan Tıslayan hamamböceği için deneysel pencere aralıkları. Balmumu solucan larva için beş günlük süre ile koza encasement da denk geliyor; Koza kaldırılması larva 20fiziksel travma neden olabilir emek yoğun bir süreçtir. Daha da önemlisi, ikimiz de zayıflatılmış bir B. thailandensis T6SS-1 mutant Suriye hamster ve Tıslayan hamamböceği 11, Galleria Galleria çalışma için iyi bir model olmadığını düşündüren, öldürücü bazı mutantlar B. thailandensis (veri gösterilmez) içinde T6SS gibi.
Tıslayan hamamböceği kullanımı meyve sineği çeşitli avantajlar sunuyor. Tıslayan hamamböceği büyük ve önemli vücut kitle o iğneleri sırasında kolayca ele alınması bırakmak zor bir exoskeleton ile biridir. Buna ek olarak, meyve sineği küçük ve özel ekipman aşılama için gerektirir. Tıslayan hamamböceği doğal olarak benzer sıcaklık yaşıyor veya insan vücudunun sıcaklığı aşan, Ayrıca, meyve sineği için en uygun sıcaklık 22-28 ° c arasında ise Bu insan vücudunun sıcaklığı (örneğin, çok çekirdekli dev hücre oluşumu Burkholderia 10) bağlı süreçleri eğitimi bağlamında meyve sineği sınırlı kullanım sağlar.
Hamamböceği tıslama kullanımı bazı sakıncaları vardır. Tıslayan hamamböceği genetik de bu Drosophila veya bile Galleriaincelendiği değil. Tıslayan hamamböceği da önemli "Trick" veya brüt faktör vardır. Ancak, Tıslayan hamamböceği Burkholderia için bir çekici ve kalıcı vekil ana bilgisayar kullanımı araştırma türleri için benzersiz olan net avantajları sağlayarak kalır. Biz bu Madagaskar hamamböceği Burkholderiaiçin uysal vekil ev sahipliği yapmaktadır tıslama gösterildiği, bu büyük olasılıkla aynı zamanda diğer bakteriyel patojenler için bir vekil ev sahibi olarak hizmet edebilir ve biz şu anda bu tür çalışmalarda yararlandığımız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
J. Chua, N.A. Fisher, ö. DeShazer ve sabah Friedlander el yazması açıklanan yordamları tasarlanmıştır. J. Chua, N.A. Fisher, S.D. Falcinelli ve D. DeShazer deneyler yapılır. J. Chua el yazması yazdı.
Yazarlar Joshua J. W. Roan, Nora D. Doyle, Nicholas R. Carter ve Steven A. Tobery mükemmel teknik destek için ve David P. Fetterer ve Steven J. Kern istatistiksel analiz için teşekkür ederiz.
İş tarafından savunma tehdit azaltma ajansı önerisi #CBCALL12-THRB1-1-0270 A.M.F ve #CBS destek verdi. MEDBIO.02.10.Rd.034 D.D. için
Görüşleri, Yorumlar, sonuç ve öneriler yazarlar vardır ve mutlaka ABD Ordusu tarafından onaylanan değil.
Bu yayın içeriğini sayısı veya Savunma Bakanlığı politikaları yansıtmayabilir ne ticari adlarını, ticari ürünler, söz etmez veya kuruluşların ABD hükümeti tarafından onaylandığı anlamına.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Madagascar hissing cockroach |
Carolina Biological Supply Co, Burlington, NC | 143668 | |
| Kibbles n Bits, any flavor | Big Heart Pet Brands, San Francisco, CA | UPC #079100519378 | |
| Snap on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7F71RETCHIL | |
| Screw on disposable plastic containers or equivalent | Rubbermaid, Huntersville, NC | UPC #FG7J0000TCHIL | |
| Tridak STEPPER series repetitive pipette | Dymax Corporation www.dymax.com |
T15469 | |
| Syringe (1 mL) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 309659 | |
| Needle (26 or 27G x 1/2) | Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109, 305111 | |
| Chloroquine diphosphate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | C6628 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco/ Thermo Fisher Scientific, Gaithersburg, MD | 10010023 | |
| Difco Luria- Bertani (Lennox) | Becton Dickinson, Sparks, MD | 240230 | |
| Agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G6279 |
References
- Sifri, C. D., Ausubel, F. M. Cellular Microbiology. Boquet, P., Cossart, P., Normark, S., Rappuoli, R. , ASM Press. 543-563 (2004).
- Silcock, S. Is your experiment really necessary? New Sci. 134 (1817), 32-34 (1992).
- Muller, U., Vogel, P., Alber, G., Schaub, G. A. The innate immune system of mammals and insects. Contrib Microbiol. 15, 21-44 (2008).
- Lavine, M. D., Strand, M. R. Insect hemocytes and their role in immunity. Insect Biochem Mol Biol. 32 (10), 1295-1309 (2002).
- Bergin, D., Reeves, E. P., Renwick, J., Wientjes, F. B., Kavanagh, K. Superoxide production in Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils. Infect Immun. 73 (7), 4161-4170 (2005).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Mulder, P. G., Shufran, A. Madagascar hissing cockroaches, information and care. Oklahoma Cooperative Extension Service Leaflet L-278. , Oklahoma State University. 4 (2016).
- Nelson, M. C., Fraser, J. Sound production in the cockroach, Gromphadorhina portentosa: Evidence for communication by hissing. Behav Ecol Sociobiol. 6 (4), 305-314 (1980).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infect Immun. 85 (1), e0058616 (2017).
- Fisher, N. A., Ribot, W. J., Applefeld, W., DeShazer, D. The Madagascar hissing cockroach as a novel surrogate host for Burkholderia pseudomallei, B. mallei and B. thailandensis. BMC Microbiol. 12, 117 (2012).
- Haraga, A., West, T. E., Brittnacher, M. J., Skerrett, S. J., Miller, S. I. Burkholderia thailandensis as a model system for the study of the virulence-associated type III secretion system of Burkholderia pseudomallei. Infect Immun. 76 (11), 5402-5411 (2008).
- West, T. E., Frevert, C. W., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Inhalation of Burkholderia thailandensis results in lethal necrotizing pneumonia in mice: a surrogate model for pneumonic melioidosis. Trans R Soc Trop Med Hyg. 102 Suppl 1, S119-S126 (2008).
- Finney, D. J. Probit Analysis. , University Press. Cambridge. (1971).
- Abbott, W. S. A method of computing the effectiveness of an insecticide. J Am Mosq Control Assoc. 3 (2), 302-303 (1987).
- Schell, M. A., Lipscomb, L., DeShazer, D. Comparative genomics and an insect model rapidly identify novel virulence genes of Burkholderia mallei. J Bacteriol. 190 (7), 2306-2313 (2008).
- Wand, M. E., Muller, C. M., Titball, R. W., Michell, S. L. Macrophage and Galleria mellonella infection models reflect the virulence of naturally occurring isolates of B. pseudomallei, B. thailandensis and B. oklahomensis. BMC Microbiol. 11 (1), 11 (2011).
- Pilatova, M., Dionne, M. S. Burkholderia thailandensis is virulent in Drosophila melanogaster. PLoS One. 7 (11), e49745 (2012).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. J Vis Exp. (70), e4392 (2012).
- Eklund, B. E., et al. The orange spotted cockroach (Blaptica dubia, Serville 1839) is a permissive experimental host for Francisella tularensis. PeerJ Preprints. 4, e1524v1522 (2016).
