Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تصنيع وتوصيف السقالات جريفيثسين تعديل الألياف للوقاية من الأمراض المنقولة

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

هذه المخطوطة يصف الإجراءات لاختلاق وتميز ألياف اليكتروسبون تعديل جريفيثسين بولي (حمض اللبن-co-الجليكوليك) التي تبين نشاط لاصقة والأدوية المضادة للفيروسات القوية ضد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 في المختبر. الأساليب المستخدمة لتجميع، تعديل السطح، وتميز مورفولوجية الناتجة، الاقتران، ووصف الامتزاز جريفيثسين من تعديل سطح الألياف.

Abstract

ألياف اليكتروسبون (EFs) وقد استخدمت على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من التطبيقات العلاجية؛ ومع ذلك، أنها إلا في الآونة الأخيرة طبقت كما هي تقنية لمنع وعلاج الأمراض التي تنتقل (المنقولة). وعلاوة على ذلك، العديد من التكنولوجيات EF تركز على تغليف عامل نشط، بالنسبة للاستفادة من السطح لنقل بيوفونكتيوناليتي. هنا يصف لنا طريقة لاختلاق والسطح-تعديل poly(lactic-co-glycolic) الحمضية (بلجا) ألياف اليكتروسبون مع يكتين المضادة للفيروسات القوية جريفيثسين (جرفت). بلجا هو بوليمر وافقت إدارة الأغذية والعقاقير التي استخدمت على نطاق واسع في إيصال الأدوية بسبب خصائصه الكيميائية ومتوافق حيويا المعلقة. وهو جرفت الطبيعية، قوية، ويكتين الآمنة التي تمتلك نشاط واسع النطاق ضد فيروسات عديدة بما في ذلك فيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1 (فيروس نقص المناعة البشرية-1). عندما يتم دمجها، أثبتت ألياف معدلة جرفت المنظمة القوية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 في المختبر. هذه المخطوطة يصف الأساليب اختﻻق وتميز تعديل جرفت EFs. أولاً، هو بلجا اليكتروسبون لإنشاء سقالة ألياف. الألياف تعديل للسطح في وقت لاحق مع جرفت استخدام 1-إيثيل-3-(3-ديميثيلامينوبروبيل) كاربودييميدي (EDC) والكيمياء N-هيدروكسيسوكسينيميدي (NHS). واستخدمت المسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM) لتقييم حجم ومورفولوجيا سطح تعديل الصيغ. بالإضافة إلى ذلك، gp120 أو هيماغلوتينين (ها)-أليسا أساس يمكن أن تستخدم لتحديد مقدار جرفت مترافق ل، فضلا عن الامتزاز جرفت من سطح الألياف. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على نطاق واسع اختﻻق الألياف التي يتم تعديل سطح مع مجموعة متنوعة من البروتينات المختلفة.

Introduction

وقد استخدام EFs كمنصة تسليم الموضعية يمكن أن تقلل إلى حد كبير من العداوي المنقولة جنسياً. حاليا، هناك ما يزيد على 36 مليون شخص يعيشون مع فيروس نقص المناعة البشرية، مع ما يزيد على 2 مليون من الحالات الجديدة المبلغ عنها في عام 2015 وحدها1،2. بالإضافة إلى ذلك، اكتب 2 (HSV-2) العدوى يؤثر على مئات الملايين من الناس في جميع أنحاء العالم فيروس الحلأ البسيط وقد ثبت أن تعزيز الحصول على فيروس نقص المناعة البشرية من 2-5 إضعاف3. بسبب هذه العلاقة بين عدوى HSV-2 واكتساب فيروس نقص المناعة البشرية، هناك اهتمام كبير بتطوير عناصر فاعلة جديدة توفر الحماية الفورية ضد العداوي المنقولة جنسياً متعددة. وعلاوة على ذلك، يوفر تطوير مركبات جديدة تحسين أداء هذه العوامل المضادة للفيروسات يمكن أن تزيد من تعزيز القدرة الوقائية والعلاجية. نحو تحقيق هذا الهدف، تم تحري EFs كمنصة تسليم جديدة للحد من انتشار الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 و 2-هامبورغ.

وخلال العقدين الماضيين، استخدمت EFs على نطاق واسع في الحقول لإيصال الأدوية، و هندسة الأنسجة4. وغالباً ما يتم اختيار البوليمرات متوافق حيويا أن يترجم بسهولة إلى التطبيقات العلاجية. لاختلاق EFs البوليمرية، هو حل البوليمر المحدد في حلاً مائي أو المذيبات عضوية، تبعاً لدرجة البوليمر هيدروفوبيسيتي5. ثم تضاف عناصر فاعلة لمصلحة حل المذيبات أو مائي قبل عملية اليكتروسبينينج. ثم يستنشق في محقن الحل البوليمر وإخراجه ببطء بينما تخضع لتيار كهربائي. وينتج هذه العملية عادة الألياف البوليمرية مع ورقة أو أسطواني ماكروستروكتوريس (الشكل 1)، والألياف بأقطار تتراوح بين الصغير إلى نانو الحجم6. للتطبيقات العلاجية الأكثر، مدرجة ضمن الألياف أثناء عملية اليكتروسبينينج عناصر فاعلة وتم إصدارها من الألياف عن طريق نشر وتدهور الألياف اللاحقة. يمكن تغيير معدل التدهور أو الإصدار باستخدام أنواع مختلفة من البوليمرات أو البوليمر يمزج بإنشاء ملف تعريف إصدار المطلوب، إضفاء خصائص كيميائية وفيزيائية فريدة من نوعها7، وتشجيع تغليف تقريبا أي مجمع. على هذا النحو، وقد أثبتت EFs مفيداً لإيصال الأدوية جزيء صغير والعوامل البيولوجية، بما في ذلك البروتينات، الببتيدات، النوكليوتيد، وعوامل النمو6،،من89.

في مجال الوقاية من الأمراض المنقولة جنسياً، EFs مؤخرا استخدمت لدمج وتوفير استدامة-أو إيندوسيبلي-الإفراج عن العوامل المضادة للفيروسات10،11،،من1213،14 ،،من1516،17،،من1819. في واحدة من الدراسات أقرب، وضعت ألياف المراعية للأس الهيدروجيني بالإفراج عن عناصر فاعلة في الاستجابة للتغيرات البيئية داخل المسالك التناسلية الأنثى (معاهدة سجل الأفلام)، كأسلوب الطلب على الحماية ضد فيروس نقص المناعة البشرية-111. منذ ذلك الحين، حققت دراسات أخرى يمزج بوليمر يتألف من البولي إيثيلين أكسيد (بيو) وحامض بولي-L-اللبن (ذات)، لتقييم الإصدار الانضباطي للعوامل المضادة للفيروسات واستخدام وسائل منع الحمل لفيروس نقص المناعة البشرية-1 الوقاية ومنع الحمل في المختبر 12-دراسات إضافية قد أثبتت جدوى EFs تقديم ما يلي: الإفراج عن جزيء صغير مضادات الفيروسات14، قوية ومرنة الخصائص الميكانيكية20، تسليم ثلاثي الأبعاد أبنية21 لفترات طويلة ، تثبيط من الحيوانات المنوية اختراق12، والقدرة على دمج مع سائر التكنولوجيات تسليم13. وأخيراً، تقييم الأعمال السابقة الألياف البوليمرية لإيصال المستدام للعوامل المضادة للفيروسات مكافحة الفيروسات كوينفيكتيفي المشتركة، هامبورغ-2 وفيروس نقص المناعة البشرية-114. في هذه الدراسة، تقدم الألياف البوليمرية نشاط مكمل لتقديم الأدوية المضادة للفيروسات بالإبقاء على الهيكل لمدة تصل إلى شهر واحد، وتوفير حاجز مادي لدخول الفيروسية. من هذه النتائج، فقد لوحظ أنه يمكن استخدام EFs جسديا وكيميائيا يحول دون الإصابة بعدوى الفيروس.

بينما جعل خصائص الإصدار الانضباطي EFs البوليمرية منصة تسليم جذابة للتسليم للجراثيم، وضعت EFs في تطبيقات أخرى لتكون بمثابة تعديل للسطح السقالات7. وقد استخدمت eFs لمحاكاة مورفولوجية المصفوفة خارج الخلية (ECM)، غالباً بوصفها السقالات تحسين التجدد الخلوية22، وزيادة فائدتها في الأنسجة الهندسة23،24. الألياف تتكون من البوليمرات مثل بولي-اليورو--كابرولاكتوني (PCL) وذات تم تعديل السطح مع عوامل النمو والبروتينات بعد اليكتروسبينينج نقل خصائص مثل إدارة المحتوى في المؤسسة بما في ذلك زيادة التصاق وانتشار الهاتف الخلوي25 , 26-وبالإضافة إلى ذلك، تم تقييمها EFs الميكروبات المعدلة السطح لمنع نمو البكتيريا المسببة للأمراض المحددة27،28. نظراً لهذا التنوع والقدرة على حمل الآثار البيولوجية، EF والتكنولوجيا لا يزال لتوسيع عبر مجموعة متنوعة من المجالات لتوفير وظائف ميكانيكية متعددة. حتى الآن، على الرغم من فائدتها في مجموعة متنوعة تطبيقات، إلا في الآونة الأخيرة تم استكشاف تعديل سطح الألياف في حقل الجراثيم29.

وقد وضعت بالتوازي مع تطوير تكنولوجيات تسليم جديدة لمنع وعلاج الأمراض المنقولة جنسياً، رواية العلاجات البيولوجية. أحد المرشحين للجراثيم الأكثر تبشيرا بالنجاح هو يكتين المضادة للفيروسات لاصقة، جرفت30. مستمد أصلاً من نوع من أنواع الطحالب الحمراء، جرفت أثبت النشاط كمثبط قوي لفيروس نقص المناعة البشرية، هامبورغ-2، والسارس، والتهاب الكبد الوبائي فيروس31،32،،من3334، 35 , 36-وفي الواقع، بين مثبطات المستندة إلى بيولوجيا، جرفت قد أقوى النشاط المضادة فيروس نقص المناعة البشرية، ويخمد فيروس نقص المناعة البشرية-1 على الفور تقريبا على اتصال30، مع الحفاظ على الاستقرار والنشاط حضور وسائل الإعلام ثقافة من المهبل الجراثيم لمدة تصل إلى 10 أيام37. في الآونة الأخيرة، أبدى جل جرفت 0.1% لحماية الفئران ضد مهبلي HSV-2 التحدي، مما يجعل من مرشح واعدة للسطر الأول من الحماية ضد كل من هامبورغ-2 وفيروس نقص المناعة البشرية-132, 38-"لفيروس نقص المناعة البشرية" على وجه التحديد، جرفت يمنع الإصابة جسديا ملزمة gp120 أو المحطة الطرفية من بقايا جليكان ن ربط يطلق على الأسطح الفيروسية المغلف لمنع دخول38،،من3940،41 ،42. هذا التثبيط قوية للغاية، مع s50IC تقترب من 3 نانوغرام/مليلتر43. بالإضافة إلى منع الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية، بينت الدراسات أيضا أن يحمي جرفت HSV-2 العدوى عن طريق منع انتشار الفيروسات32خلية بخلية. وفي جميع الحالات، أظهرت جرفت لتكون مادة لاصقة للجسيمات الفيروسية، مع إظهار مقاومة عالية تمسخ. آخر، قد أثبتت جرفت نشاط تعاوني مع مزيج من التنفوفير (تفف) و مضادات الفيروسات الأخرى44، مما يجعل من الممكن والمحتمل مفيدة لإدارة التعاون مع EFs. خصائص قوية جرفت جعله بيولوجيا على الأدوية المضادة للفيروسات مرشح ممتاز، الذي قد تحسين الأداء مع التكنولوجيا EF.

الاستفادة من هذه المعرفة بخصائص مضادة للفيروسات لاصقة والفطرية جرفت، سقالة ألياف البوليمرية صمم، يجمع بين هذه الخصائص توفر الطبقة الأولى من دخول الفيروس تثبيط29. العثور على الإلهام في الطريق أن المخاط سيرفيكوفاجينال يعوق نقل الفيروس أساسا عن طريق التفاعلات الميوسين موكواديسيفي، افترضنا أن عن طريق استخدام EFs سقالة وتساهمي تعديل السطح مع جرفت، بكثافة عالية أن إضعاف جرفت سطح مترافق وإلغاء تنشيط الفيروس في46،،من45نقطة الإدخال في47. هنا وضعت سقالة ثابتة لتوفير أساس البروتين، والفيروسية، يخمد لاصقة حاجز منصة EFs. وسعينا إلى الجمع بين خصائص مضادة للفيروسات قوية جرفت مع منصة بوليمر متوافق حيويا وقابلة للتعديل، ودائم، لخلق فيروس رواية "فخ".

لتحقيق هذه الأهداف، كانت تتألف من بلجا ألياف اليكتروسبون، واستخدمت الكيمياء تنمية الصادرات--دائرة الصحة الوطنية في وقت لاحق تعديل السطح EF مع جرفت. بمثابة بلجا بوليمر نموذجي سبب استعماله واسعة النطاق في اليكتروسبينينج48، جنبا إلى جنب مع توافق مع الحياة والفعالية من حيث التكلفة. بالإضافة إلى ذلك، تعديل السطح يستغل مساحة كبيرة من EFs، وتوفر بديلاً مفيداً يمكن دمجها مع تغليف لتعظيم فائدة الألياف49. خلافا لأساليب التغليف التقليدية حيث جزء فقط من جرفت متوفر (ويقدم فقط عابر في معاهدة سجل الأفلام)، يمكن تعديل السطح جرفت الإبقاء على الحد الأقصى بيواكتيفيتي طوال مدة العلاج. وعلاوة على ذلك، قد يؤدي إدراج مركبات ماء مثل البروتينات، بالطرق التقليدية اليكتروسبينينج، أقل تغليف الكفاءة وفقدان البروتين نشاط50. ولذلك، جرفت تعديل سطح الألياف قد توفر أسلوب تسليم بديلة واعدة التي يمكن استخدامها منفردة أو مجتمعة مع اليكتروسبينينج لتعزيز الحماية ضد الإصابة بالأمراض المنقولة جنسياً.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد وتصنيع "السقالة الألياف اليكتروسبون"

تنبيه: ينبغي إجراء جميع الأعمال بالمذيبات أو حلول البوليمر في غطاء الأبخرة كيميائية . الرجوع إلى ورقة بيانات السلامة المادية لكل كاشف قبل بدء تشغيل البروتوكول.

  1. إلى اليكتروسبين حل بوليمر 3 مل 15% w/w بلجا، تزن 720 ملغ من 50: 50 بولي (حمض اللبن-co-الجليكوليك) (بلجا؛ 0.55 إلى 0.75 dL/g, كاتشين 31-57) إلى 10 مل التﻷلؤ قنينة. حجم الحل يستند إلى حجم المجموعة النموذجية المستخدمة في الدراسات الحالية-
    ملاحظة: يجب احتساب كتلة البوليمر لإضافة إلى حجم معين من المذيب بأول تحديد كثافة المذيبات المستخدمة لإذابة البوليمر. كثافة المذيبات هيكسافلورو-2-بروبانول (هفيب) 1.59 غ/مل. وهكذا، وزن المذيب، استناداً إلى حجم 3.0 مل هفيب اللازمة، 4.8 ز (3.0 مل × 1.59 g/mL). لجزء 15% w/w من بلجا هفيب، يجب إضافة 720 ملغ بلجا إلى 3.0 مل هفيب (0.15 × 4,800 = 720 مجم بت). وميزة استخدام % w/w البوليمر/الحل، بدلاً من % w/v، أن يوفر هذا وزن محدد للحل النهائي. هذا الوزن محددة يمكن استبدال المذيبات أكثر دقة، في حالة تبخر المذيبات أثناء الخطوة 1.3.
    2. إضافة
  2. 3.0 مل هفيب إلى القنينة التﻷلؤ الزجاج الذي يتضمن بلجا (من الخطوة 1، 1) استخدام ماصة زجاجية مصلية. تغطي القنينة بغشاء بلاستيكي، ثم قياس وتسجيل القنينة ماساشوستس
  3. احتضان تعليق البوليمر بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية لضمان اكتمال انحلال البوليمر. إذا يتبخر أي مذيب، تتناقص كتلة قنينة، إضافة هفيب إلى القنينة يبلغ وزنها الأصلي في الخطوة 1.2.
  4. بعد الحضانة، إعداد الجهاز اليكتروسبينينج ( الشكل 2 أ). على الرغم من أن يمكن استخدام مغزل من أي حجم، مغزل فولاذ المقاوم للصدأ القطر الخارجي 25 مم الدورية استخدمت هنا كجامع.
    ملاحظة: إنقاص قطرها مغزل أكبر سمك الألياف، نظراً لحجم نفس الحل اليكتروسبينينج.
  5. نضح الحل البوليمر في محقن 3 مللي.
  6. توصيل طرف إبرة نصف بوصة 18-قياس، كليلة المحاقن والاستغناء عن الحل الزائدة (عادة 0.25 مل) لإزالة headspace فارغة في تلميح إبرة.
  7. مكان المحاقن على مضخة الحقن وضبط معدل تدفق صك لمل 2.0/ح.
    ملاحظة: هذا معدل التدفق كان سابقا الأمثل استناداً إلى اللزوجة البوليمر لصياغة هذا.
  8. الاتصال بمصدر الطاقة بإبرة المحقن واليكتروسبين الحل البوليمر باستخدام جهد من + 27 كيلو فولت. يجب تعيين المسافة بين الإبر وجامع لحوالي 25 سم ( الشكل 2 ب)-
    تنبيه: يقوم بعملية اليكتروسبينينج بخار المذيبات. استخدام غطاء دخان أو جهاز مغلقة ( الشكل 2) لإزالة البخار الضارة .
  9. مرة واحدة هو الحل الكامل اليكتروسبون، إيقاف تشغيل مصدر الطاقة وتسمح مغزل تدور 30 دقيقة إضافية الكامل تتبخر المذيبات.
  10. بدوره قبالة جامع مغزل الدورية، واستخدم شفرة حلاقة لقطع الألياف من مغزل. استخدام الشفرة لقشر الألياف من مغزل لطف.
  11. جمع الألياف بلجا اليكتروسبون إلى طبق بتري مسمى، ووضع في ديسيككاتوروفيرنيت لإزالة المذيبات المتبقية.

2. تعديل سطح الألياف مع جرفت

  1. تحضير حلول مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) 2-(ن-morpholino) وحمض اثانيسولفونيك (مس المخزن المؤقت). إعداد برنامج تلفزيوني بتذويب ز 8 كلوريد الصوديوم 0.2 ز بوكل، ز 1.44 غ 2 هبو 4 و 0.24 ز خ 2 ص 4 في 1 لتر الماء عالي النقاوة. وبالمثل، حل 19.52 ز مس (حمض الحرة، 195.2 ميغاواط) وز 29.22 كلوريد الصوديوم في 1 لتر الماء عالي النقاوة، إعداد مس المخزن المؤقت. ضمان درجة الحموضة النهائي من كل حل بين 7.2-7.5 و 5.0-6.0، على التوالي، باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
  2. إعداد الحلول العمل الفردية لتنمية الصادرات (2 مم) والمستشفيات (5 مم)-
    1. إزالة تنمية الصادرات والمستشفيات العامة من الثلاجة والسماح لهم بحجته إلى درجة حرارة الغرفة قبل وزنها.
    2. تزن 4 ملغ لتنمية الصادرات في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
    3. تزن 6 مغ من دائرة الصحة الوطنية في أنبوب ميكروسينتريفوجي أخرى.
      4. أضف 1 مل مس
    4. المخزن المؤقت لكل أنبوبة. دوامة أنابيب معا بنشاط لضمان الكواشف هي حلت تماما.
  3. تعد حلاً هيدروكسيلاميني التي تزن 70 ملغ في أنبوب الطرد مركزي مخروطية 50 مل.
  4. إضافة 20 مل برنامج تلفزيوني هيدروكسيلاميني ودوامه حل.
  5. الجماهيري بمبلغ مناسب من الألياف بلجا إلى أنبوب الطرد مركزي مخروطية 15 مل. نموذجياً، يتم استخدام 75 ملغ ألياف لكل دفعة رد فعل-
  6. إضافة 8 مل مس المخزن المؤقت إلى أنبوب 15 مل.
  7. إضافة 1 مل كل الحلول تنمية الصادرات والمستشفيات العامة أعدت في وقت سابق إلى الأنبوب. ينبغي أن يكون حجم الحل النهائي 10 مل. تركيزات نهائية لتنمية الصادرات ودائرة الصحة الوطنية ينبغي أن يكون 0.4 ملغ/مل و 0.6 ملغ/مل، على التوالي.
  8. إغلاق وختم أنبوب 15 مل مع الأفلام البلاستيكية والمكان المعني دوار للسماح بحل يكون مقلوب برفق لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ( الشكل 3 ب). هذه الخطوة تنشيط مجموعات الكربوكسيل في البوليمر تسمح بتعديل التساهمية مع البروتين جرفت ( الشكل 3 أ)-
  9. بعد عملية التنشيط، بعناية إخماد رد فعل عن طريق إضافة 14 ميليلتر من β-mercaptoethanol إلى الأنبوب. قلب الأنبوبة عدة مرات لضمان خلط كاملة-
    تنبيه: β-mercaptoethanol عالية السمية ويجب استخدامه فقط في غطاء الأبخرة كيميائية.
  10. تجاهل المادة طافية وشطف الألياف بلجا مرتين، مع 10 مل من برنامج تلفزيوني، لإزالة أي المتبقية β-ميركابتوثانول-
  11. بعد الشطف، إضافة مبلغ مناسب لحل الأسهم جرفت إلى الأنبوب. على سبيل المثال، يتطلب نمول 5 ملغ/جرفت الألياف ميليلتر 6.35 جرفت حل الأسهم (من أصل 10 ملغ/مل) كل ملغ ألياف. وبالتالي سيتطلب عينة ألياف 75 ملغ ميليلتر 476.25 10 ملغ/مل جرفت حل الأسهم.
    ملاحظة: الألياف جرفت مع أحمال النظرية من 0.05 و 0.5 و 5 نمول جرفت كل مغ الألياف كانت ملفقة.
  12. إضافة برنامج تلفزيوني ما يكفي لجعل وحدة التخزين النهائي لمل 8، إغلاق وعكس أنبوب لضمان خلط دقيق.
  13. ختم الأنبوب بغشاء بلاستيكي ووضع على دوار مرة أخرى، هذا الوقت حاء 2
    14. آرو
  14. بعد 2 ح الحاضنات، رد فعل بإضافة 2 مل من محلول هيدروكسيلاميني في أنبوب الطرد المركزي 15 مل. كل إرشادات الشركة المصنعة، ينبغي أن يكون تركيز هيدروكسيلاميني النهائي أثناء عملية التفاعل التبريد 0.7 ملغ/مل.
  15. مزيج الحل جيد وتجاهل المادة طافية. شطف الألياف بلجا تعديل السطح مرتين مع 10 مل ماء عالي النقاوة لإزالة أي جرفت أونكونجوجاتيد.
  16. نقل الألياف إلى طبق بتري ومكان داخل مجفف حتى الألياف جافة تماما. نقل طبق بيتري إلى 4 درجة مئوية للتخزين.

3. SEM تعديل "توصيف سطح جرفت" ألياف

جبل
  1. مكان قطاع من الشريط الكربون على الوجهين في وزارة شؤون المرأة عينة. التسمية أسفل جبل العينة مع معلومات تعريف العينة باستخدام علامة دائمة-
  2. قص ثلاث عينات من الألياف تعديل سطح واحد ووضعها على عينة منفصلة يتصاعد. سمك كل عينة حوالي 0.5 ملم.
    3. معطف
  3. الرش العينات باستخدام ترسب الجسيمات الناجمة عن إلكترون من صفيحة الذهب. تفل معطف من 90 ثانية، في 2.4 كيلو فولت-
    ملاحظة: قد تختلف الوقت معطف الرش تبعاً لمعايير المعدات، بما في ذلك الجهد والتيار.
  4. صورة العينات في 8 كيلو فولت مع تكبير تتراوح من 000 1 إلى 5، 000 عاشرا-

4. استخراج جرفت من تعديل سطح ألياف

  1. الشامل من 2 مغ ألياف في ثلاث نسخ إلى أنابيب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
  2. إضافة 1 مل ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) إلى الأنبوبة، ثم دوامة واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإذابة الألياف تماما.
  3. بعد الحضانة، يضعف من قاسمة 10 ميليلتر من الحل [دمس]-الألياف من الخطوة 4-2، 100-fold على الأقل في تريس يدتا (TE) المخزن المؤقت (الرقم الهيدروجيني = 8.0).
  4. تخزين العينات في-20 درجة مئوية حتى تحميل توصيف مع أليسا-

5. قياس "الامتزاز جرفت" من ألياف

  1. لتقييم مقدار جرفت صدر أو ديسوربيد من الألياف، تزن 5-10 مغ بتعديل سطح الألياف ومكان في أنبوب ميكروسينتريفوجي. تسجيل كتلة الألياف في كل أنبوبة.
  2. إضافة 1 مل حل مناسب يحاكي البيئة الفسيولوجية (مثلاً، برنامج تلفزيوني، الشركة المصرية للاتصالات المخزن المؤقت، لمحاكاة السوائل المهبلية (التبرعات)، إلخ) لكل عينة.
  3. احتضان العينات ح 1 على شاكر الدورية 200 لفة في الدقيقة، 37 درجة مئوية.
  4. بعد أنابيب الحضانة، إزالة ما يقرب من 1 مل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات التي تتضمن جرفت ديسوربيد من قنينة، وقاسمه للكتلة. مخزن في-20 درجة مئوية حتى الكمي البروتين.
  5. نقل العينة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة، وإضافة 1 مل من محلول العازلة الطازجة على الألياف داخل الأنبوب ميكروسينتريفوجي، واحتضان حتى النقطة المرة القادمة.
  6. تشمل النقاط الزمنية المعتادة المستخدمة لقياس الإصدار: 1، 2، 4، 6، 8، 24، 48، 72 wk. ح، و 1 الامتزاز ضئيلة وقد لوحظ في هذه الدراسات بعد حاء – 4

6. التحديد الكمي لاستخراج جرفت والامتزاز عبر أليسا

  1. معطف أليسا 96-جيدا لوحة مع 0.1 مل ها (10 ميكروغرام/مل) كل جيدا كما سبق وصف 51. ختم اللوحة مع الأفلام البلاستيكية واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ( الشكل 4).
  2. إزالة المخزن المؤقت طلاء، وأضف 0.3 مل حجب المخزن المؤقت (2-3% البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني مع 0.05% بوليسوربيت 20) لكل بئر. احتضان لوحة لمالا يقل عن 2 ح في درجة حرارة الغرفة-
  3. بعد الحضانة، شطف لوحة 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x مع 0.1% بوليسوربيت 20 (برنامج تلفزيوني-P). بعد الشطف، الاستغناء عن 0.1 مل من عينة أو قياسي أو برنامج تلفزيوني كالمراقبة السلبية إلى الآبار الخاصة بكل منها. احتضان لوحة مرة أخرى ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
  4. شطف لوحة 3 مرات مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني-ص وبعد الشطف، إضافة 0.1 مل جسم الأولية (الماعز جرفت مكافحة antiserum) في كل بئر واحتضانها لعلى الأقل 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. نموذجياً، هو تمييع الحل الأساسي جسم المضيفين في برنامج تلفزيوني.
  5. بعد حضانة العينات مع الشطف الابتدائي جسم اللوحات مرة أخرى 3 مرات مع برنامج تلفزيوني-ص إضافة 0.1 مل جسم الثانوي (الفجل البيروكسيديز (HRP)-الأرنب مترافق الماعز المضادة IgG) إلى كل خير واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة. الحل جسم الثانوي هو المخفف من المضيفين في برنامج تلفزيوني.
    6. أغسل
  6. اللوحة 3 مرات. إضافة 0.1 مل TMB 2-البيروكسيديز الركيزة لكل بئر. رصد التنمية اللون (حوالي 2 دقيقة)، ثم إضافة 0.1 مل ح 2 حتى 4 (1 ن) إخماد رد فعل. قراءة اللوحة في 450 نانومتر على قارئ لوحة.
  7. متوسط القيم OD الخلفية (الآبار التي لا يحصلون إلا على برنامج تلفزيوني)، وطرح هذا من المجموعات التجريبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مورفولوجيا الألياف له تأثير كبير على قدرة تعديل سطح EFs على توفير الحماية ضد الفيروسات. على الرغم من أن اليكتروسبينينج إجراء مناسب وواضحة، قد يؤدي تركيبات البوليمرات غير محسنة مورفولوجيا الألياف غير النظامية (الشكل 5ب-ج). غالباً ما تسبب تغييرات في الظروف اليكتروسبينينج التي تسفر عن تشكيل الخرز أو غير متبلور مورفولوجيس الشبيهة بالشروط المتفق عليها تبادلياً، بالتعارض البوليمر المذيبات، البوليمر منخفض اللزوجة، معدل التدفق، أو غيرها من الشروط اليكتروسبينينج. يمكن أن تؤدي التغيرات الناتجة عن ذلك في هيكل الألياف الإفراج عن مختلف التشكيلات الجانبية لإدراج المخدرات ألياف أو التضارب في فعالية التصريف، تغيير قدرة الألياف على جسديا أو كيميائيا تعوق انتشار الفيروس. ينبغي أن يؤدي EFs بلجا ملفقة باستخدام شروط اليكتروسبينينج وصف مورفولوجيس الألياف متميزة بأقطار تتراوح ما بين 1.5 و 2.8 ميكرون (الشكل 6). لتحديد مورفولوجيا الألياف والقطر، ينبغي أن تدرس EFs مع وزارة شؤون المرأة قبل خطوات أخرى توصيف أو التعديل.

وأظهرت SEM صور فارغة، 0.05 و 0.5 و 5 ألياف جرفت نمول لا اختلافات كبيرة في مورفولوجيا الألياف (الشكل 6أ-د)، التي تشير إلى أن التعديل جرفت له أي تأثير على مورفولوجيا الألياف. لتحديد متوسط قطر كل صياغة EF، اتخذت الحد أدنى من 50 القياسات عشوائية كل مجال الرؤية من الصور ووزارة شؤون المرأة. أقطار متوسط تركيبات EF المقاسة والمحسوبة في إيماجيج، كما هو موضح في الشكل 6ه. كان جميع EF تركيبات مماثلة أقطار متوسط حوالي 1.9 ميكرومتر، مما يدل على اتساق عملية تصنيع الألياف غير معدلة عبر دفعات.

لتحديد مقدار جرفت مترافق EFs، حلت جرفت EFs في [دمس]، متبوعاً بإضعاف 100-fold في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات، لاستخراج جرفت من الألياف. كان كمياً كمية جرفت مترافق كل ملغ ألياف باستخدام ELISA. لكل تعديل كثافة (0.05 و 0.5 و 5 نمول جرفت كل الألياف ملغ)، قيمت replicates عشرة. وكان كل EF 5، 0.5، ونمول 0.05 مغ/جرفت EF التعديلات، 373، و 165، و 42 ng جرفت كل مغ من الإنكليزية والفرنسية، أسفر عن كفاءات تصريف 0.6 و 4.2 6.9 في المائة، على التوالي. وتبين هذه النتائج أن EFs جرفت مترافق مع أعلى كثافة السطح-تعديل النظرية، النتيجة في أكثر جرفت مترافق للألياف (الشكل 7أ). ومع ذلك، كان هناك علاقة عكسية مع كفاءة التصريف الناتج29.

لتقييم مقدار جرفت مترافق تساهمي على سطح الألياف بالنسبة إلى تمتز، كانت المحتضنة جرفت EFs في صندوق التبرعات الخاص لتحديد مقدار جرفت إصدارها. ضمن ح 4 الأول، 113 و 25، و 10 اكتشفت نانوغرام جرفت كل مغ EF في صندوق التبرعات الخاص 5 و 0.5 و 0.05 نمول تركيزات تعديل النظرية، على التوالي. تتوافق هذه القيم إلى 30% و 41% 24% من كمية جرفت مترافق إلى 5 و 0.5 و 0.05 نمول جرفت EFs. بعد ح 4، تم اكتشاف جرفت ضئيلة في النذرة الإفراج عن جميع الصيغ الثلاث. ويبين الشكل 7بجرفت الإفراج بعد 1 و 2 و 4 ح. أخذت معا، تشير هذه البيانات إلى أن أغلبية جرفت تساهمي ملزم EFs، وأن جرفت تمتز على السطح يتم تحريرها داخل ح 4 الأولى.

Figure 1
الشكل 1: مورفولوجية ماكروسكالي ألياف اليكتروسبون. كانت ملفقة ألياف اليكتروسبون هو موضح باستخدام 4 مم (اسطوانة) ومغزل قطرها 25 مم (ورقة)، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: جهاز اليكتروسبينينج- مغزل (A) جمع فيها إيداع الطائرات السائل من البوليمر، و (ب) الإعداد اليكتروسبينينج كامل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: EF التخطيطي للتعديل مع جرفت استخدام الكيمياء تنمية الصادرات--دائرة الصحة الوطنية- مجموعات الكربوكسيل (A) على الرد بلجا EF مع دائرة الصحة الوطنية حضور تنمية الصادرات بشكل أمين المتفاعلة استرات، التي ستشكل بعد ذلك سندات أميد مستقرة مع الأمينات الأولية من جرفت. (ب) هما مليغرام ألياف الأقراص أو القطع هي قطع والمحتضنة في 8 مل مس المخزن المؤقت مع 2 مل كاشف تنمية الصادرات/دائرة الصحة الوطنية وتناوب عن 15 دقيقة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: التخطيطي يوضح جرفت القياس الكمي باستخدام ELISA. إيمونوبلاتي 96-جيدا فهي مغلفة ب gp120 أو هكتار التقاط وشل جرفت. تتم إضافة الابتدائي أضداد جرفت، الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالفجل البيروكسيديز، والركيزة أليسا تسلسلياً كمياً جرفت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5: آثار اختيار المذيبات على مورفولوجيا EF بلجا. (أ) 15% w/w بلجا EFs في هفيب عرض مرغوب فيه مثل مؤشر ترابط مورفولوجيا. (ب) 15% w/w EFs بلجا في كلوروفورم و dimethylformamide، فشل النموذج بسبب اختيار المذيبات غير الأمثل أو تركيز البوليمر (اللزوجة). (ج) 15% w/w و (د) 20% w/w بلجا EFs في TFE تبرهن على أهمية اللزوجة البوليمر. وشكلت الخرز في الصياغة مع انخفاض تركيز البوليمر (ج)، بينما زيادة تركيز البوليمر (المذيب اللزوجة) أسفرت عن مورفولوجيا الألياف واضحة المعالم (د). ملاحظة، تتخذ الشكل 5B في تكبير أقل لإظهار مورفولوجية الشبيهة بالشروط المتفق عليها تبادلياً. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: الصور ووزارة شؤون المرأة وأقطار الألياف من EFs العارية وتعديل جرفت. (أ) العارية بلجا EFs و EFs بلجا تعديل سطح (بب) 0.05 نمول، (ج) 0.5 نمول، و (د) 5 نمول جرفت كل ملغ ألياف. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. (ﻫ) أقطار من غير معدلة وجرفت EFs. تمثل أشرطة الخطأ ± يعني sem. ولوحظ لا الفرق الإحصائي بين أقطار ألياف غير معدلة وجرفت معدلة. الرقم 6 ه قد تم تكييفه من العرسان et al. 29 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
الشكل 7 : يضاف إلى كمية جرفت وديسوربيد من تعديل جرفت EF. (أ) كمية جرفت مترافق بملغ كل EF الألياف يزيد مع زيادة تركيز مادة التفاعل جرفت. (ب) يبين كمية جرفت صدر من كل ملغ من الألياف 0.05 و 0.5 5 نمول تركيبات بعد حضانة 1 و 2 و 4 ح في صندوق التبرعات الخاص. تمثل أشرطة الخطأ ± يعني sem. وهذا الرقم قد تم تكييفه من العرسان et al. 29 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بسبب هياكلها المليئة بالثغرات والمساحات الكبيرة، وجدت EFs مجموعة متنوعة من التطبيقات في مجال الرعاية الصحية، ويتضمن أحد التي تخدم كوسائل إيصال العلاجية. المخدرات وعناصر فاعلة أخرى يمكن إدراجها ضمن EFs لإيصال الانضباطي، في حين يمكن أن يكون مترافق البيولوجي والكيميائي يغاندس على سطح الألياف لخلية محددة تستهدف52 أو بيوسينسينج53. هنا تلفيق جرفت سطح معدلة بلجا EFs، كما هو موضح سقالة تسليم لمنع الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية،. تم توليفها EFs جرفت من قبل اليكتروسبينينج، توفير المزايا لمعدل إنتاج منخفضة التكلفة وعالية بالنسبة إلى غيرها الألياف إنتاج أساليب49،53.

خطوات حاسمة في البروتوكول
تشكيل EFs اعتماداً كبيرا على خصائص الحل البوليمر، وبخاصة حل أو المذيب اللزوجة54. وتشمل العوامل التي تؤثر على اللزوجة من الحل البوليمر بوليمر الوزن الجزيئي وتركيز البوليمر، والنوع من المذيبات المستخدمة. عادة ما يتم ضبط الحل أو المذيب اللزوجة عن طريق تغيير نسبة البوليمر للمذيبات، للحصول على تركيز البوليمر المطلوب. مع كل افتراء، يجب الحفاظ على وحدة التخزين أثناء الحضانة بين عشية وضحاها الحفاظ على نسبة البوليمر للمذيبات المناسبة (اللزوجة). في تركيز عالية بما فيه الكفاية البوليمر، ممجوج جزيئات البوليمر في الحل أثناء عملية اليكتروسبينينج لإنتاج الألياف. أثناء عملية اليكتروسبينينج، وستشكل حبة على طرف مغزال وإذا كان هناك تشابك البوليمر كافية، طائرات السائل سوف تندلع من هذه النقطة في جهد الحرج والتعجيل في أزياء شبيهة بالسوط تجاه مغزل جمع55. ثم سوف يؤدي تبخر المذيبات إلى جت رقيق، إنتاج خيوط ألياف كما أنها إيداع على مغزل جمع. بمجرد تجميع، يجب أن يتم تحليل EFs بوزارة شؤون المرأة للتحقق من مورفولوجيا السليم وقطر الألياف متسقة. قد يكون وجود EFs مطرز نتيجة لحل منخفض اللزوجة56،57من الغاية عالية الجهد المطبقة، والبوليمر تغذية معدل58، أو مزيج من كل ثلاثة عوامل. إذا كان هذا هو لاحظ، ينبغي زيادة تركيز البوليمر وينبغي تعديل الجهد التطبيقي ومعدل تغذية، لبلوغ مورفولوجيا شبيهة بالألياف.

إلى متزاوجة البروتينات على سطح EF، هنا مجموعات الكربوكسيل بلجا كانت رد فعل استخدام الصادرات--دائرة الصحة الوطنية كاربودييميدي كروسلينكينج الكيمياء59. أثناء عملية التعديل، بإيجاز، هي المحتضنة ألياف مع تنمية الصادرات حضور دائرة الصحة الوطنية مما يؤدي إلى تحويل كاربوكسيلاتيس إلى اﻻسترات شبه مستقرة، ورد الفعل أمين. خلال عملية الاقتران من خطوتين، من الأهمية بمكان أن المخازن المؤقتة المستخدمة أثناء كل خطوة يكون الرقم الهيدروجيني الأمثل، لاحظت في إرشادات الشركة المصنعة، ضمان تصريف الحد الأقصى من الكفاءة. أن نصف العمر لدائرة الصحة الوطنية استرات تتراوح من أربع إلى خمس ساعات في الأس الهيدروجيني المحايدة ويقلل جذريا في الظروف الأساسية أكثر60. وهكذا، ينبغي أن يقوم أول رد فعل في مس المخزن المؤقت على درجة الحموضة 5-6 والألياف المنشط ينبغي ثم نقل إلى المخزن مؤقت لبرنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.2-7.5) لرد فعل لاحقة وفورية مع جرفت. من المهم أيضا أن تنمية الصادرات هو إلغاء تنشيطه بإضافة 2-mercaptoethanol وتشطف بما فيه الكفاية من الألياف بعد التنشيط كاربوكسيلات. وهذا سيساعد على منع تفعيل البروتين بتنمية الصادرات والمتمتعة بالحكم الذاتي-crosslinking أثناء رد فعل الثاني، الذي قد يقلل من كفاءة التصريف.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
على الرغم من أن عملنا السابق أثبت فعالية مجموعة متنوعة من ألياف معدلة جرفت ضد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1، بعض التعديلات العملية قد تعتبر لتخصيص مورفولوجيا EF أو لتحسين جرفت (أو أخرى البروتين) كفاءة التصريف أو الألياف العائد29. على وجه الخصوص، يمكن زيادة المساحة السطحية EF بتناقص قطر الألياف، لتمكين مساحة أكبر للاقتران. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن خفض تركيز البوليمر واللزوجة تنتج أصغر الألياف قطر61،62. ومع ذلك، يقتصر هذا النهج تشكيل ألياف مطرز عند التركيز أقل من قيمة العتبة. لإنقاص قطر الألياف دون تغيير اللزوجة الحلول، يمكن أن تستخدم الأنظمة المزدوجة-المذيبات لخفض التوتر السطحي، أو يمكن إضافة أملاح زيادة حل الموصلية56،57. وسيمكن كلا الأسلوبين تمتد أكبر من الطائرات اليكتروسبينينج التي قد تنتج أصغر الألياف أقطار. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام انخفاض الوزن الجزيئي البوليمرات اختﻻق أصغر قطر الألياف. انخفاض الألياف قطر كما يوفر ميزة إضافية تتمثل في توليد المسام أصغر، ويحتمل أن يجعل EFs أكثر فعالية كحاجز لانتشار الفيروس، للتطبيقات المستندة إلى الجراثيم63. وأخيراً، فقد لوحظ أن الرطوبة يمكن أن تؤثر على العائد EF. في أعلى من الرطوبة، العائد يميل إلى الانخفاض بسبب تشكيل الألياف مع الماكرو-مورفولوجيا غير عادية. تركيب نظام مراقبة رطوبة داخل الغرفة اليكتروسبينينج ولذلك يسهل إنتاج EFs مع غلة متسقة، إذا كان هذا يمثل تحديا لتلفيق.

لتحسين كفاءة التصريف جرفت، التحقيق بالتحديد وموقع الجماعات فونكتيوناليزابل قد يعتبر أيضا. على سبيل المثال، إذا كانت الأمينات الأولية من بروتين الفائدة تقع قرب داخلية بنية البروتين ثلاثية الأبعاد، عائق الفراغية قد تمنع مجموعات الكربوكسيل المنشط في EFs تتفاعل مع الأمينات الأولية، مما يقلل احتمال رد فعل. قد يمكن التغلب على هذا التحدي باستبدال الأحماض الأمينية من البروتين لتوليد مجموعة أمين الابتدائي أقرب إلى سطح البروتين. ومع ذلك، كما جرفت والبروتينات الأخرى تعتمد على نشاط محدد مواقع الربط للحصول على وظائف، التعديلات في تشكيل البروتين ينبغي دقة اختبار في الاختبارات الفنية قبل الاقتران.

القيود
قيداً رئيسيا لتعديل السطح جرفت هو القدرة على التصريف تدني كفاءة استخدام الكيمياء كروسلينكينج كاربودييميدي. كفاءة تصريف منخفضة إذا كان البروتين المضاد للفيروسات لمصلحة IC ارتفاع50، قد لا توفر حماية كافية (في هذه التطبيقات) ضد الإصابة بعدوى الفيروس. ولكن جرفت (أو آخر تعديل) EFs والبروتينات وعناصر فاعلة غير مرتبطة تساهميا إلىقد لا تزال الجسميات eFs على السطح. هذه العوامل في الممتزة تنطوي على إمكانيات لاستكمال نشاط جرفت مترافق، عن طريق زيادة تركيز المترجمة المتوفرة لربط فيروس عابر. في هذا المثال، يمكن ربط جرفت ديسوربيد فيريونس فيروس نقص المناعة البشرية-1 أن عدم الاتصال مباشرة ب EFs، وقد توفر إليه بديلة للحماية مع ح 4 الأولى للإدارة (بيريكويتال). وهكذا، جرفت مترافق وتمتز على السطح قد تساهم في توفير حماية موحدة ضد العداوي المنقولة جنسياً.

على الرغم من الحماية الممنوحة من تصريف البروتين والامتزاز، يمكن أن تتبع استراتيجيات تعديل سطح أخرى مع احتمال زيادة الكفاءة. على سبيل المثال، يمكن استخدام بلجا إنهاء مع الأمينات بدلاً من مجموعات الكربوكسيل متزاوجة جرفت المنشط. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام السطح-تعديل استراتيجية مختلفة لتحسين كفاءة التصريف EF-البروتين. وقد تم فونكتيوناليزيد الأغشية نانوفيبروس تتألف من EFs مع عبدين عبر كاربودييميدي كروسلينكينج الكيمياء64. بيوتينيليشن أو إضافة بكتيريا-علامة (تربسيرهيسبروجلنفيجلوليس) عن طريق جزئ قد تمكين البروتين معدلة بشكل قوي والغاية مستقرة غير التساهمية التفاعل مع عبدين EFs. بينما غير التساهمية، الربط avidin-البيوتين هو أقوى غير-تساهمية الرابطة، مع تقارب فيمتومولار، يرجح أن أسفر عن تصريف مستقرة على سطح الألياف. لأي استراتيجيات تعديل السطح، ينبغي النظر عائق الفراغية لتعظيم كفاءة التصريف.

وأخيراً، نحن نتصور أن EFs تعديل سطح سوف تقدم استراتيجية بديلة لتغليف عامل نشط لتوفير وسائل مكملة للحماية. سوف يخفض النظر واحد مع الجمع بين تقنيات التغليف وتعديل السطح على منصة EF واحدة سابق لأوانه إطلاق سراح عناصر فاعلة أثناء عملية تعديل السطح. لتعديل سطح ردود الفعل التي تتطلب الحضانة في وقت طويلة نسبيا في المحلول، يمكن أن تكون نسبة كبيرة من عناصر نشطة محملة فقدت بسبب التحلل البوليمر.

أهمية الأسلوب فيما يتعلق بالأساليب الحالية والبديلة
في العمل السابق، لاحظنا أن EFs فارغة غير معدلة استطاعت أن تحول دون الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية ~ 38% عند وضعها في إدراج ترانسويل فوق الخلايا إينفيكتيبلي29. هذه الملاحظة جنبا إلى جنب مع توافق مع الحياة والمجهرية مثل شبكة الإنترنت، وتورتوسيتي من EFs، بالتوازي مع الخصائص المضادة للفيروسات ولاصقة قوية الملاحظة من جرفت، دفع تنمية تعديل سطح EFs الموصوفة هنا.

النسبي لتقنيات إيصال الأخرى المستخدمة حاليا في تطبيقات مبيدات الميكروبات، EFs لها طائفة واسعة من التطبيقات المحتملة نظراً للهندسة المعمارية والقدرة على التخصيص. في أعمال أخرى، مكن الليفي مورفولوجية EFs لهم على تقديم عناصر فاعلة، وتحاكي إدارة المحتوى في المؤسسة، مما يجعلهم السقالات مناسبة لهندسة الأنسجة. وكانت eFs أيضا تعديل السطح لتعزيز توافق مع الحياة وتعزيز استدامة-الإصدار65،66.

إلى تعزيز توافق مع الحياة أو تسليم وكلاء تلك الوظيفة من خلال النشاط ملزمة محددة، توجد العديد من الأساليب التي تسمح للمرفق للمركبات على أسطح EFs مثل العلاجات البلازما والأساليب الكيميائية الرطب والاختلاس السطحية بوليميريزيشنز50. في حالة جرفت الذي ربط glycoproteins الفيروسية لفيروس نقص المناعة البشرية-1 على وجه التحديد، هو الأسلوب الكيميائي الرطب لتنمية الصادرات--دائرة الصحة الوطنية المثلى بسبب القدرة على اختراق عميق داخل الشبكة الألياف مع أيضا الحفاظ على وظيفة جرفت50. ثم يتم تسليم في صيغة دائمة لمعاهدة سجل الأفلام جرفت معطلة ل EFs وتوفير حماية فورية ضد الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية.

مقارنة بالاستراتيجية الحالية لتغليف المداواة داخل EFs لمنع الأمراض المنقولة جنسياً، تصريف التساهمية يوفر ميزة واضحة لزيادة اللذة المحتملة بين فيريونس جرفت وفيروس نقص المناعة البشرية. بشل حركة جرفت إلى EFs من خلال تعديل السطح، يمكن تحقيق تركيزات عالية مترجمة من جرفت، التي تزيد من الفرصة لربط متعددي مع فيروس نقص المناعة البشرية. وباﻹضافة إلى ذلك، جرفت EF معطلة، بالنسبة إلى جرفت مجاناً في الحل، قد منع استنفاد تجمع جرفت بإعاقة استيعاب الخلية. وعلاوة على ذلك، نظراً لآلية عمل جرفت كمثبط دخول مستقرة ولاصقة فريدة من نوعها، تمكن التصريف السطحي التساهمية EFs تعديل السطح لتوفير حاجز مادي لاختراق الفيروس، بالإضافة إلى خصائص مضادة للفيروسات قوية.

التطبيقات المستقبلية لهذا الأسلوب
الاستفادة من السطح-تعديل لتسليم تمثل فرصة لإدماج عناصر فاعلة متعددة داخل منصة EF واحدة. وفي المستقبل، نسعى إلى تطوير تكنولوجيا متعددة الأغراض (MPT) حيث يمكن تغليف ضمن مجموعة متنوعة من العوامل النشطة ومترافق ب EFs. وقد يستهدف هذه MPTs تمنح حماية ضد طائفة أوسع من مسببات الأمراض من خلال دمج المداواة مع آليات مختلفة للعمل. باستخدام كل المياه السطحية والداخلية من EFs لتسليم عناصر فاعلة مع آليات مختلفة للعمل، إلى أقصى حد إمكانات EFs للحماية من الإصابة بالفيروس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن ممتنون "صندوق التراث اليهودي" للتميز لتمويل هذه البحوث. ونحن نشكر الدكتور ستوارت وليامز الثاني لتوفير استعمال النظام اليكتروسبينينج بسخاء. كما نشكر الدكتور كينيث بالمر لتزويدنا جريفيثسين. بالإضافة إلى ذلك نحن نشكر الدكتور نوبويوكي ماتوبا ومختبرة لتدريب لنا في أليسا جرفت العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792 (2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108 (2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635 (2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Tags

الهندسة الحيوية، المسألة 128، ألياف اليكتروسبون، المنقولة، وفيروس نقص المناعة البشرية، وتعديل سطح، الجراثيم، جريفيثسين، بولي (حمض اللبن الجليكوليك co)
تصنيع وتوصيف السقالات جريفيثسين تعديل الألياف للوقاية من الأمراض المنقولة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vuong, H. R., Tyo, K. M.,… More

Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter