Summary
이 원고 조작 하 고 인간 면역 결핍 바이러스 1 형 감염에 대 한 강력한 접착제 및 항 바이러스 활동을 보여 주는 Griffithsin 수정 폴 리 유산 공동 glycolic acid () electrospun 섬유를 특성화 하는 절차를 설명 합니다. 생체 외에서. 합성 하는 데 사용 하는 방법 표면 수정, 결과 형태, 활용, 특성 및 표면 수정 섬유에서 Griffithsin의 탈 착에 설명 되어 있습니다.
Abstract
Electrospun 섬유 (EFs) 널리 다양 한 치료 애플 리 케이 션;에 사용 되었습니다. 그러나, 그들은 단지 최근에 적용 되었을으로 방지 하 고 치료 성적으로 기술 전송 감염 (STIs). 또한, 많은 EF 기술 biofunctionality를 얻으며 표면을 활용 하 여 상대적인 활성 에이전트를 캡슐화에 초점. 여기 조작 및 poly(lactic-co-glycolic) 산 (PLGA) electrospun 섬유, 강력한 항 바이러스 lectin Griffithsin (GRFT)와 표면 수정 하는 방법을 설명 합니다. PLGA는 약물 전달의 뛰어난 화학 및 생체 특성 때문에 널리 사용 된는 FDA 승인 중합체 이다. GRFT 자연, 강력한, 및 안전 lectin 인간 면역 결핍 바이러스 1 (hiv-1) 형을 포함 하는 수많은 바이러스에 대 한 광범위 한 활동을 소유 하는. 결합 될 때, GRFT 수정 섬유 체 외에에이즈-1의 강력한 비활성화를 증명 하고있다. 이 원고에서는 조작 하 고 GRFT 수정 EFs를 특성화 하는 방법을 설명 합니다. 첫째, PLGA 섬유 비 계를 만들 electrospun입니다. 섬유는 이후에 표면 수정 1을 사용 하 여 GRFT-에틸-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) 및 N-hydroxysuccinimide (NHS) 화학. 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 크기와 표면 수정 공식의 형태를 평가 하기 위해 사용 되었다. 또한, gp120 또는 조류 (하)-기반된 ELISA, 활용 된 GRFT GRFT 섬유 표면에서 탈 착의 양을 계량 하 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 섬유를 서로 다른 단백질의 다양 한 표면 수정 조작 하 더 광범위 하 게 적용할 수 있습니다.
Introduction
국 소 전달 플랫폼으로 EFs 사용 하 여 성병을 줄일 가능성이 있다. 현재, 36 백만 이상의 사람들이 HIV에 보고 2015 혼자1,2의 이상 2 백만 새로운 케이스와 함께 살고 있다. 또한, 포진 심 플렉스 바이러스 2 (HSV-2) 감염의 영향을 수백 전세계 사람들의 수백만 입력 하 고 2-5 배3HIV의 수집을 향상을 보여줘 왔다. 이 관계 HSV-2 감염 및 HIV 취득으로 인해 여러 성병에 대 한 동시 보호를 제공 하는 새로운 활성 에이전트 개발에 상당한 관심이입니다. 또한, 이러한 항 바이러스 대리인의 납품을 개선 하기 위해 새로운 차량의 개발 추가 보호 및 치료 효능을 향상 시키기 위해 잠재력을 제공 합니다. 이 목표를 향해 EFs V-1와 h s V-2 감염의 보급을 줄이기 위해 새로운 배달 플랫폼으로 조사 되어 있다.
지난 2 년 동안 EFs는 약물 전달 및 조직 공학4의 분야에서 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다. 종종, 생체 고분자는 쉽게 치료 응용 프로그램을 변환할 선택 됩니다. 고분자 EFs를 조작 하 선택 된 폴리머는 유기 용 제 또는 수성 솔루션에 폴리머 hydrophobicity5의 정도 따라 녹입니다. 관심의 활성 에이전트 다음 전기 과정 이전 또는 수성 솔루션에 추가 됩니다. 폴리머 솔루션 다음 주사기로 발음 이며 천천히 전류 따라 나옵니다. 이 프로세스는 일반적으로 폴리머 섬유 시트 또는 원통형 macrostructures (그림 1)와 마이크로-나노 규모6에서 배열 하는 섬유 직경에에서 발생 합니다. 가장 치료 응용 프로그램에 대 한 활성 에이전트 전기 과정에서 섬유 안에 통합 되 고 확산 및 후속 섬유 저하를 통해 섬유에서 해제 됩니다. 속도 저하 또는 자료의 다른 유형의 폴리머를 사용 하 여 변경 될 수 있습니다 또는 폴리머 혼합7을 독특한 화학 및 물리적 특성 부여 하 고 거의 모든의 캡슐화를 추진 하 고 원하는 릴리스 프로필을 설정 하 복합. 따라서, EFs는 작은 분자 약물 및 단백질, 펩 티 드, oligonucleotides, 및 성장 요인6,,89를 포함 하 여 생물 학적 에이전트의 배달에 도움이 입증 했습니다.
STI 예방 분야에서 EFs 최근 사용 된 통합 하 고 지속 또는 유도할 수 있는-릴리스 항 바이러스 대리인10,,1112,13,14의 제공 ,15,,1617,,1819. 초기 연구 중 하나에서 전화 응답 섬유 에이즈-111에 대 한 보호의 온-디맨드 방법으로 활성 에이전트 (FRT) 여성 재생산 지역 내 환경 변화에 대응을 출시 개발 되었다. 이후, 다른 연구 조사 폴리머 혼합 폴 리 에틸렌 산화물 (PEO)와 폴 리-L-젖 산 (PLLA), 에이즈-1 예방 및 피임 생체 외 에 대 한 항 바이러스 및 피임 제의 가변 평가의 구성 12. 추가 연구는 다음을 제공 하는 EFs의 타당성 증명: 작은 분자 antivirals14, 강한 릴리스 및 유연한 기계적 특성20, 3 차원 배달 아키텍처21 연장 , 정자 침투12, 그리고 다른 배달 기술13와 병합 하는 능력의 저해. 마지막으로, 이전 작업 일반적인 co-infective 바이러스, HSV-2와 에이즈-114에 대 한 항 바이러스 제의 지속적인 배달에 대 한 고분자 섬유를 평가 했다. 이 연구에서는 폴리머 섬유 1 달까지 동안 그들의 구조를 유지 하 고 바이러스 항목에 대 한 물리적 방 벽을 제공 하 여 항 바이러스 배달 보완 활동을 제공. 이러한 결과에서 둘 다 물리적 및 화학적 방해 바이러스 감염에 EFs를 사용할 수 있습니다 관찰 되었다.
가변 자료 속성을 고분자 EFs microbicide 배달에 대 한 매력적인 전달 플랫폼, EFs 표면 수정 건설 기계7을 다른 응용 프로그램에서 개발 되었습니다. 종종 역할 건설 기계 세포 재생22, 개선 하 고 조직 공학23,24에 그들의 유틸리티를 강화 하는 세포 외 기질 (ECM)의 형태를 모방 하기 위해 eFs 사용 되었습니다. 섬유 고분자 폴 리-ε-caprolactone (PCL) 등으로 구성 되었으며 PLLA 성장 인자와 단백질 표면 수정 후 전기를 얻으며 ECM 같은 속성 증가 세포 접착 및 확산25 를 포함 하 여 , 26. 항균 성 표면 수정 EFs 특정 병원 성 박테리아27,28의 성장을 방지 하기 위해 평가 또한. 이 다양성 및 생물 학적 효과 유도 하는 능력, EF 기술 다양 한 기계 멀티 기능을 제공 하는 분야에서 확장 하 고 있습니다. 그러나, 그들의 유틸리티 애플 리 케이 션의 다양성에도 불구 하 고 표면 수정 섬유 최근에 microbicide 필드29탐험 되었습니다 있다.
방지 하 고 성병 치료 배달 신기술 개발 병행, 새로운 생물학적 치료제 개발 되었습니다. 가장 유망한 microbicide 후보자 중 하나 접착제 항 바이러스 lectin, GRFT30입니다. 원래 빨강 조류의 종에서 파생 된, GRFT는 설명 했다 HIV, HSV-2, SARS의 강력한 억제제로 활동 뿐만 아니라 C 형 간염 바이러스31,32,,3334, 35 , 36. 사실, 생물학 기반의 억제제 중 GRFT는 가장 강력한 반대로 HIV 활동 하면서 안정성과 질에서 문화 미디어 존재 활동 연락처30, 시 거의 즉시 V-1를 비활성화 최대 10 일37미생물. 더 최근에, 0.1 %GRFT 젤 자 HSV-2 도전, 그것은 HSV-2와 에이즈-132 에 대 한 보호의 첫 번째 줄에 대 한 유망한 후보 만들기에 대 한 마우스를 보호 하기 위해 표시 했다, 38. 에이즈에 대 한 GRFT 물리적 항목38,,3940,41 방지 하기 위해 바이러스 성 봉투 표면에 gp120 또는 터미널만 노 오 스 N 연결 glycan 잔류물을 바인딩 하 여 감염을 억제 하는 특히, ,42. 이 억제는 매우 강력한 IC50s 3 ng/mL43접근. HIV 감염을 억제 하는 것 이외에 연구는 또한 보여주었다 GRFT 바이러스32의 세포-세포 확산을 억제 하 여 감염 HSV-2에 대 한 보호. 모든 경우에, GRFT 변성에 높은 저항을 시연, 바이러스 성 입자에 접착제를 되도록 표시 되었습니다. 마지막으로, GRFT 만들고 그것은 실현 가능성이 EFs와 함께 공동 관리에 도움이 테 (TFV) 및44의 다른 antivirals 조합으로 시너지 활동을 시연 하고있다. GRFT의 강력한 속성은 우수한 생물학 기반의 항 바이러스 후보자, 있는 배달 EF 기술로 향상 될 수 있도록 합니다.
GRFT의 접착제 및 타고 난 항 바이러스 속성의이 지식을 활용 하 여, 고분자 섬유 비 계 설계 되었습니다, 이러한 속성을 제공 하는 바이러스 항목 저해29의 첫 번째 계층을 통합 하. Cervicovaginal 점액 mucoadhesive mucin 상호 작용을 통해 주로 바이러스 전송 방해 하는 방법에 영감을 찾기, 우리 가정 했다 그를 발판으로 EFs를 사용 하 여 covalently GRFT의 높은 밀도와 표면 수정 GRFT 표면에 활용 된 것 수 고 entrypoint45,,4647에서 바이러스를 비활성화. 여기 EFs는 플랫폼을 제공 하는 단백질 기반, 바이러스 성 접착제 비활성화 장벽 고정 발판으로 개발 되었다. 우리를 만드는 새로운 바이러스 "함정." 생체, 대, 고 내구성 폴리머 플랫폼 GRFT의 적 정량 항 바이러스 특성을 결합 하고자
이러한 목표를 달성 하기 위해 PLGA의 구성 하는 섬유 electrospun, 그리고 EDC-보 건국 화학 GRFT와 EF 표면 그 후 수정 하는 데 사용 되었다. PLGA 전기48, 생체 적합성 및 비용 효율성에에서 그것의 광범위 한 사용 모델 폴리머 역임 했습니다. 또한, 표면 개 질 EFs의 큰 표면 영역을 이용 하 고 캡슐화 섬유 유틸리티49를 극대화 하기 위해 결합 될 수 있는 유용한 대안을 제공 합니다. 전통적인 캡슐화 방법 어디 GRFT의 일부만 사용할 수 (그리고는 FRT만 뚜렷이 제시), 달리 표면 수정 수 있습니다 가능 치료의 전체 기간 동안 최대 bioactivity를 유지 하는 GRFT 또한, 전통적인 전기 방법으로 단백질 같은 친수성 화합물의 낮은 캡슐화 효율성 및 단백질 활동50의 손실 될 수 있습니다. 따라서, GRFT 표면 수정 섬유 STI 감염에 대 한 보호 기능을 향상 하거나 전기와 함께 사용할 수 있는 유망한 대체 배달 방법을 제공할 수 있습니다.
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Protocol
1. 준비 및 제조 Electrospun 섬유 발판의
주의: 화학 증기 두건 .에 용 매 또는 폴리머 솔루션으로 모든 작업을 수행 해야 프로토콜을 시작 하기 전에 각 시 약의 물질 안전 데이터 시트를 참조.
- Electrospin 3 mL 15 %w / w PLGA 폴리머 솔루션에 무게의 50: 50 폴 리 (유산 공동 glycolic 산) 720 mg (PLGA; 0.55 0.75 dL/g, 31-57 kDa) 10 mL 섬광 유리병에. 솔루션의 볼륨은 현재 연구에 사용 되는 일반적인 일괄 처리 크기에 따라.
참고: 폴리머 질량 주어진된 양의 용 매를 추가 하는 폴리머를 분해 하는 데 사용 하는 용 매에의 밀도 확인 하 여 계산 되어야 합니다. 용 매 Hexafluoro-2-프로 판 올 (HFIP)의 조밀도 1.59 g/mL 이다. 따라서, 용 매, 무게 4.8 g (3.0 x 1.59 g/mL)는 3.0 mL HFIP 필요의 볼륨에 따라. 15 %w / w HFIP PLGA의 일부분, 720 mg PLGA 3.0 mL HFIP (0.15 x 4800 mg = 720 mg)에 추가 되어야 합니다. %W / v, 보다는 오히려 %w / w 폴리머/솔루션을 사용 하 여의 장점은이 마지막 해결책의 정의 무게를 제공 합니다. 이 정의 된 무게 1.3 단계 용 매 증발의 경우 더 정확한 용 매 대체 가능.
참고: 큰 맨 드릴 직경 전기 솔루션의 동일한 볼륨을 주어 섬유 두께 줄일 것 이다.
참고:이 유량은 이전 기반 최적화이 대 한 폴리머 점도.
주의: 전기 프로세스 용 매 증기를 만듭니다. 증기 두건 또는 밀폐 장치 ( 그림 2)를 사용 하 여 유해한 증기 .을 제거
2. GRFT 섬유의 표면 수정
- 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 2-(N-morpholino)의 준비 솔루션 ethanesulfonic 산 (MES 버퍼). 8 g NaCl, KCl 0.2 g, 1.44 g Na 2 HPO 4 및 0.24 g KH 2 포 4 초순 물 1 L에 용 해 하 여 PBS를 준비 합니다. 마찬가지로, 19.52 g MES (무료 산, MW 195.2) 분해 및 29.22 g MES 버퍼 준비 초순 물 1 L에 NaCl. 각 솔루션의 최종 pH는 7.2-7.5 5.0-6.0, 각각, pH 미터를 사용 하 여 확인 하십시오.
- EDC (2 mM) 및 보 건국 (5mm)의 개별 작업 솔루션 준비.
- EDC와 보 건국 냉장고에서 제거 하 고 무게 전에 실내 온도에 equilibrate 수.
- 1.5 mL microcentrifuge 관으로 EDC의 4 밀리 그램 무게.
- 다른 microcentrifuge 관으로 NHS의 6 밀리 그램 무게.
- 추가 1 mL MES 버퍼 각 튜브입니다. 소용돌이 시 약을 보장 하기 위해 적극적으로 모두 튜브 완전히 해산.
- Hydroxylamine 솔루션 50 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 70 밀리 그램 무게에 의해 준비.
- 20 mL PBS hydroxylamine와 추가 해산 소용돌이.
- 15 mL 원뿔 원심 분리기 관으로 PLGA 섬유의 적절 한 금액을 질량. 일반적으로, 섬유의 75 mg는 각 반응 일괄 처리에 사용 됩니다.
- 15 mL 튜브에 MES 버퍼의 8 mL을 추가.
- 추가 1 mL 각 관에 앞서 준비 EDC와 보 건국 솔루션의. 솔루션의 최종 볼륨 10 mL 이어야 한다. EDC와 보 건국의 최종 농도 0.4 mg/mL 및 0.6 mg/mL, 각각 이어야 한다.
- 가까이 플라스틱 필름 및 실내 온도 ( 그림 3 B)에서 15 분 동안 부드럽게 반전에 솔루션을 수 있도록 회전에 15 mL 튜브를 봉인. 이 단계는 GRFT 단백질 ( 그림 3 A)와 공유 수정 있도록 폴리머에 carboxyl 그룹 활성화.
- 활성화, 후 신중 하 게 튜브에 β-mercaptoethanol의 14 µ L을 추가 하 여 반응을 끄다. 완전 한 혼합 되도록 여러 번 튜브를 반전.
주의: β-mercaptoethanol은 매우 독성 및 화학 증기 두건에서 사용 해야 합니다. - 는 상쾌한 삭제 하 고 10 mL PBS, 모든 나머지 β-mercaptoethanol을 제거 하려면 두 번, PLGA 섬유 린스.
- Rinsing 후, 튜브를 GRFT 재고 솔루션의 적절 한 금액을 추가. 예를 들어 5 nmol GRFT/mg 섬유는 섬유의 밀리 그램 당 (10 mg/mL 재고)에서 GRFT 재고 솔루션의 6.35 µ L를 요구할 것입니다. 따라서 75 mg 섬유 샘플 476.25 µ L 10 mg/mL GRFT 재고 솔루션의 필요.
참고: GRFT 섬유 0.05, 0.5, 및 mg 섬유 당 5 nmol GRFT의 이론적인 선적으로 조작 했다. - 닫고 철저 하 게 혼합 되도록 튜브 반전 추가 8 mL를 최종 볼륨을가지고 충분 한 PBS.
- 튜브 플라스틱 필름으로 밀봉 하 고 장소는 터에 다시,이 시간 2 h.
- 부 화 후 2 h, 15ml 원심 관으로 hydroxylamine 솔루션의 2 개 mL를 추가 하 여 반응을 끄다. 제조업체 지침 당 냉각 반응 동안 hydroxylamine의 최종 농도 0.7 mg/mL 이어야 한다.
- 는 솔루션을 잘 혼합 하 고는 상쾌한 삭제. 어떤 결합형된 GRFT를 제거 하려면 10 mL 초순 물으로 두 번 표면 수정 PLGA 섬유 린스.
- 전송 섬유 페 트리 접시 및 장소는 desiccator 내부 섬유 완전히 건조 될 때까지. 저장을 위한 4 ° C를 페 트리 접시를 전송.
3. SEM GRFT 표면 특성 수정 섬유
- 장소는 SEM에 탄소 이중 면 테이프의 스트립 견본 마운트. 영구 마커를 사용 하 여 샘플 식별 정보 견본 마운트 하단의 레이블.
- 한 표면 수정 섬유에서 3 샘플 고 별도 표본 마운트에 그들을 배치. 각 샘플의 두께 약 0.5 m m.
- 스퍼터 코트 골드 플레이트에서 전자 유도 입자 증 착을 사용 하 여 샘플. 스퍼터 90 코트 s, 2.4 k v.
참고: 스퍼터 코트 시간 전압 및 암페어 수를 포함 하 여 장비 매개 변수에 따라 다를 수 있습니다. - 8 샘플 이미지 5, 1, 000에서까지 확대와 함께 kV X. 000
4. GRFT 표면 수정 섬유에서 추출
- 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 3 중에서 섬유의 2 밀리 그램을 대량.
- 튜브, 다음 소용돌이를 1 mL 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)를 추가 하 고 완전히 섬유 분해를 실 온에서 1 분 동안 품 어.
- 인큐베이션, 후 희석의 10 µ L 약 수 트리 스-EDTA (테) 버퍼에 4.2, 적어도 100 단계에서 DMSO 섬유 솔루션 (pH = 8.0).
- ELISA와 특성화 로드까지-20 ° C에서 샘플을 저장할.
5. 섬유에서 탈 착 GRFT 측정
- GRFT 발표의 양을 평가 또는 섬유 표면 수정 및 microcentrifuge 관에서 5-10 밀리 그램의 무게는 섬유에서 desorbed. 각 관에서 섬유 대량 기록.
- 생리 적인 환경을 모방 하는 적절 한 솔루션의 1 mL을 추가 (예, PBS, 테 버퍼, 시뮬레이션된 질 액체 (SVF), 등) 각 샘플.
- 200 rpm, 37 회전 통에 1 시간에 대 한 샘플을 품 어 ° c.
- 후 부 화, 제거 약 1 mL 유리병, 약 수에서 desorbed GRFT 클러스터에 포함 된 테 버퍼 튜브. 단백질 정량화까지-20 ° C에서 저장소.
- 새로운 microcentrifuge 튜브 샘플 전송, microcentrifuge 관 내의 섬유에 신선한 버퍼 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 다음 시간 포인트까지 품 어.
- 릴리스를 측정 하는 데 사용 하는 전형적인 시간 포인트 포함: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h, 및 1 wk. 무시할 수 탈 착 4 헤 후 이러한 연구에서 관찰 되었다
6. GRFT 추출 및 ELISA 통해 탈 착의 정량화
HA의 0.1 mL- 코트 96-잘 ELISA 플레이트 (10 µ g/mL) 잘 당 앞에서 설명한 51. 플라스틱 필름 격판덮개 및 4 ° C ( 그림 4)에서 밤새 품 어.
- 코팅 버퍼를 제거 하 고 각 우물에 버퍼 (2-3% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) PBS에 0.05% 폴 20와 함께)를 차단 하는 0.3 mL를 추가 합니다. 실내 온도에 적어도 2 시간에 대 한 접시를 품 어.
- , 부 화 후 3 번 0.1% 폴 20 (PBS-P)와 1 x PBS 가진 접시를 씻어. Rinsing 후, 각 우물에 부정적인 컨트롤 샘플, 표준, 또는 PBS의 0.1 mL를 분배. 다시 실 온에서 1 h에 대 한 접시를 품 어.
- 린스는 접시 3 번 다시 PBS. Rinsing 후, 각 음에 1 차적인 항 체 (염소 안티 GRFT 원으로)의 0.1 mL를 추가 하 고 실내 온도에 적어도 1 시간에 품 어. 일반적으로 1 차적인 항 체 솔루션 1:10,000 PBS에 의해 희석 이다.
- 잠복기 1 차적인 항 체 린스 샘플 판 다시 3 회 PBS.와 후 이차 항 체의 0.1 mL를 추가 (양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)-활용 된 토끼 반대로 염소 IgG) 각을 잘 하 고 실 온에서 1 h에 품 어. 이차 항 체 솔루션 1:10,000 PBS에 의해 희석 이다.
- 세척 접시 3 번. 각 우물에 0.1 mL TMB 2 과산화 효소 기질을 추가 합니다. 모니터 색상 개발 (약 2 분), 다음 추가 0.1 mL H 2 이렇게 4 (1 N) 반응 해소. 450에 접시를 읽고 플레이트 리더에 nm.
- 배경 OD 값 (웰 스 PBS를 수신만 하는), 평균 및 실험적인 그룹에서 이것을 빼기.
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Representative Results
섬유 형태 바이러스에 대 한 보호를 제공 하는 표면 수정 EFs의 기능에 상당한 효과가 있다. 전기는 편리 하 고 간단한 절차, 최적화 되지 않은 폴리머 제형 불규칙 한 섬유 형태 (그림 5B-C) 발생할 수 있습니다. 파란색 또는 비정 질 매트 같은 형태학의 대형 귀착되는 전기 조건에서 변경 종종 용 폴리머 호환성, 낮은 폴리머 점도, 흐름 속도, 또는 다른 전기 조건에 의해 발생 합니다. 섬유 구조에 결과 유사 약물 통합 섬유 또는 불일치 활용 효능, 물리적 또는 화학적으로 바이러스 침투를 방해 하는 섬유 수 변경에 대 한 다른 릴리스 프로필에 발생할 수 있습니다. 설명된 전기 조건을 사용 하 여 날조 PLGA EFs 1.5와 2.8 µ m (그림 6) 사이 배열 하는 직경 고유 섬유 형태학 발생 한다. 섬유 형태 및 직경을 확인 하려면 다른 특성 또는 수정 단계 이전 EFs SEM으로 시험 한다.
빈의 SEM 이미지, 0.05, 0.5, 및 5 nmol GRFT 섬유 상당한 차이가 섬유 형태 (그림 6A D)에 GRFT 수정 섬유 형태에 영향을 주지 않습니다에 나타내는 보였다. 확인 하려면 각 EF 배합의 평균 직경, 최소 50 임의의 측정의 SEM 이미지에서 시야 당 찍은. EF 공식의 평균 직경 측정 하 고 그림 6EImageJ, 계산 했다. 모든 EF 공식 비슷한 평균 직경 1.9 µ m, 일괄 처리를 통해 수정 되지 않은 섬유 제조 프로세스의 일관성을 보여주는 주위 했다.
EFs에 활용 된 GRFT의 크기를 확인 하려면 GRFT EFs DMSO, 뒤에 테 버퍼에서 100 희석 GRFT 섬유에서 추출에 해산 했다. GRFT 섬유의 밀리 그램 당 활용의 수량 ELISA를 사용 하 여 정량 했다. 각 수정 밀도 (0.05, 0.5, 및 5 nmol GRFT mg 섬유 당), 10 복제 평가 했다. 5, 0.5, 및 0.05 nmol GRFT/mg EF 수정, 각 EF 했다 373, 165, 42 각각 0.6, 4.2, 6.9%의 활용 효율성의 결과로 EF의 밀리 그램 당 GRFT ng. 이 결과 GRFT EFs 높은 이론적인 표면 수정 밀도, 섬유 (그림 7A)를 활용 하는 더 많은 GRFT에 결과 함께 활용 하는 방법을 보여 줍니다. 그러나, 결과 활용 효율29와 반비례 상관이 없었다.
Covalently 흡착을 기준으로 섬유 표면에 활용 된 GRFT의 양을 평가 하 GRFT EFs SVF GRFT 발표의 결정에서 incubated 했다. 첫 번째 4 h 내 113, 25, 그리고 10 mg EF 당 GRFT의 ng는 5, 0.5, 및 0.05 nmol 이론적 수정 농도, 각각 SVF에서 검색 되었습니다. 이 값은 30%, 41%, 및 GRFT 5, 0.5, 및 0.05 nmol GRFT EFs에 활용 된 금액의 24%에 해당 합니다. 4 h 후 무시할 수 GRFT 모든 3 정립 위한 릴리스 eluate에서 발견 되었다. 1, 2, 및 4 h 후 GRFT 릴리스는 그림 7B에 표시 됩니다. 함께 찍은, 이러한 데이터 나타냅니다 GRFT의 대다수는 EFs에 바인딩되어 covalently 표면 흡착 GRFT 첫 번째 4 h 이내 릴리스입니다.
그림 1: electrospun 섬유의 macroscale 형태. 표시 된 electrospun 섬유 각각 4 mm (실린더) 및 25 mm (시트) 직경 굴대를 사용 하 여 조작 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 전기 기구. (A) 수집 굴대 어디 고분자의 액체 제트기 예금, 그리고 (B) 전체 전기 설치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: EDC-보 건국 화학을 사용 하 여 GRFT와 회로도의 EF 수정. (A) Carboxyl 그룹 PLGA EF 반응에 양식 아민 반응 에스테 르에 EDC의 보 건국는 이후에 GRFT의 1 차 아민으로 안정 된 아 미드 유대 형성 합니다. (B) 두 밀리 그램 섬유 디스크 또는 조각 잘라 고 MES 버퍼의 EDC/NHS 시 약의 2 mL와 8 ml에서 incubated 하 고 15 분에 대 한 회전 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: GRFT 정량화 ELISA를 사용 하 여 보여주는 도식. 96-잘 immunoplate gp120 또는 GRFT 고정을 하 코팅입니다. GRFT, 양 고추냉이 과산화 효소, 및 ELISA 기판에 연결 하는 2 차 항 체에 대하여 1 차 항 체는 GRFT 척도를 순차적으로 추가 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: PLGA EF 형태학에 용 매 선택의 효과. (A)는 15 %w / w PLGA EFs HFIP 표시 바람직한 스레드 같은 형태로 (B) 15 %w / w PLGA EFs 클로 프롬 및 dimethylformamide, 폴리머 농도 (점도) 또는 비-최적의 용 매 선택 양식을 하지 못했습니다. (C) 15 %w / w 및 (D) 20 %w / w TFE에서 PLGA EFs 폴리머 점도의 중요성을 입증. 구슬 잘 정의 된 섬유 형태 (D) 결과 폴리머 농도 (용 매 점도)를 증가 하는 동안 낮은 폴리머 농도 (C)와 배합에 형성. Note, 그림 5B 매트와 같은 형태를 보여 낮은 확대율에서 찍은. 스케일 바 = 10 µ m.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: SEM 이미지와 베어와 GRFT 수정 EFs의 섬유 지름. (A) 벌 거 벗은 PLGA EFs 및 EFs PLGA (B) 0.05 표면 수정 nmol, (C) 0.5 nmol, 및 (D) 5 섬유의 밀리 그램 당 GRFT의 nmol. 스케일 바 = 10 µ m. (E) 직경의 수정 되지 않은 및 GRFT EFs. 오차 막대 대표 평균 ± SEM. 통계적 차이가 수정 되지 않은 및 GRFT 수정 섬유의 직경 사이 관찰 되었다. 그림 6 전자 는 신랑 외. 에서 적응 되었습니다. 29 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7 : GRFT의 수량을 활용 및 GRFT 수정 EF에서 desorbed. (A) GRFT의 양 GRFT 반응 물 농도 증가와 EF 섬유 증가의 각 mg을 활용. (B) 섬유의 각 mg에서 발표 하는 GRFT의 수량 SVF에서 1, 2, 및 4 h 부 화 후는 0.05, 0.5, 및 5 nmol 공식에 대 한 표시 됩니다. 오차 막대 대표 평균 ± SEM. 이 수치는 신랑 외. 에서 적응 되었습니다. 29 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
그들의 다공성 구조와 큰 표면 영역, EFs 헬스케어, 치료 배달 차량으로 봉사를 포함 하는 중 하나는 다양 한 응용 프로그램을 발견 했다. 약물 및 다른 활성 에이전트 통합할 수 있습니다 EFs에서 가변 배달 동안 생물 의약품 및 화학 ligands 셀-특정 대상52 또는 바이오 센 싱53섬유 표면에 활용 될 수 있습니다. 여기 GRFT의 제조 표면-수정 PLGA EFs, HIV 감염을 방지 하기 위해 배달 비 계 설명. GRFT-EFs 다른 섬유 생산 방법49,53상대적인 낮은 비용과 높은 생산 비율의 혜택을 제공, 전기에 의해 합성 되었다.
프로토콜의 중요 한 단계
EFs의 형성은 비판적으로 특히 솔루션 또는 용 매 점도54폴리머 솔루션의 속성에 따라 달라 집니다. 폴리머 솔루션의 점도 영향을 주는 요인에는 분자량 폴리머, 폴리머 농도, 용 매 사용의 유형과 포함 됩니다. 솔루션 또는 용 매 점도 일반적으로 원하는 고분자 농도를 용 매에 고분자의 비율을 변경 하 여 조정 됩니다. 각 제조와 볼륨 적절 한 고분자를 용 매 비율 (점도)을 유지 하기 위해 하룻밤 인큐베이션 기간 동안 유지 되어야 합니다. 충분히 높은 폴리머 농도에서 고분자 분자는 섬유를 생산 하는 전기 과정 솔루션에 빠뜨려. 전기 과정 구슬 spinneret 끝에 형성 하 고 충분 한 폴리머 녹 채 있는 경우에, 액체 제트기 것 이다 중요 한 전압에서이 지점에서 폭발 패션 수집 굴대55쪽으로 채찍 처럼 가속. 용 매 증발 후 숱이, 그들은 수집 굴대에 예금으로 섬유의 생산 제트 이어질 것입니다. 일단 합성, EFs sem의 적절 한 형태와 일관 된 섬유 직경을 확인 하 여 분석 합니다. 파란색된 EFs의 존재 낮은 솔루션 점도56, 상당히 높은 적용된 전압57의 결과, 폴리머 피드 속도58또는 모든 세 가지 요소의 조합. 이 관찰 되는 경우 폴리머 농도 증가 한다 고 적용된 전압 및 피드 속도 조정 되어야 한다, 섬유와 같은 형태를 달성 하기 위해.
EF 표면에 단백질을 단백 결합, 여기 PLGA carboxyl 그룹은 반작용 했다 EDC NHS carbodiimide 가교 화학59를 사용 하 여. 수정 하는 동안 섬유는 준 안정, 아민 반응 에스테 르로 carboxylates의 변환 귀착되는 NHS의 EDC와 인 큐베이 팅 짧게. 2 단계 활용 과정 각 단계 중에 사용 하는 버퍼 최대 활용 효율성을 보장 하기 위해 제조업체의 지침에 명시 된 최적의 pH가 중요 하다. NHS 에스테 르의 반감기 중립 산도에서 5 시간을 4 범위 그리고 더 기본적인 조건60에 극적으로 감소. 따라서, 첫 번째 반응은 pH 5-6에서 MES 버퍼에서 수행 되어야 합니다 고 활성화 된 섬유 해야 다음 전송 PBS 버퍼 (pH 7.2-7.5) GRFT와 후속이 고 즉각적인 반응에 대 한. 그것은 또한 EDC 2-mercaptoethanol의 추가 의해 inactivated 카복실산 활성화 후 섬유에서 충분히 씻어 서 중요. 이 활용의 효율성을 줄일 수 있습니다 두 번째 반응 동안 EDC와 자기 가교에 의해 단백질 활성화를 방지 도움이 됩니다.
수정 및 문제 해결
EF 형태에 맞게 또는 GRFT (또는 다른 단백질)을 개선 하기 위해 특정 프로세스 변경 고려 될 수 있습니다 있지만 우리의 이전 작품 시연 에이즈-1 감염에 대 한 GRFT 수정 섬유의 다양 한 효능, 활용 효율성 또는 섬유 29항복. 특히, EF 표면적 증가 감소 하는 섬유 직경의 활용에 대 한 더 큰 표면 영역을 사용 하 여. 이전 연구는 작은 섬유 직경61,62생성 폴리머 농도 점도 감소 나타났습니다. 그러나,이 방법은 농도 임계값 미만이 면 파란색된 섬유의 형성에 의해 제한 됩니다. 솔루션 점도 변경 하지 않고 섬유 직경을 감소, 듀얼 용 매 시스템은 표면 긴장을 줄이기 위해 이용 될 수 있다 또는 소금 솔루션 전도도56,57증가에 추가할 수 있습니다. 두 방법 모두 작은 섬유 직경을 생산할 수 있는 전기 제트기의 더 큰 스트레칭 수 있게 된다. 또한, 낮은 분자량 고분자 작은 직경의 섬유를 조작에 사용할 수 있습니다. 섬유 직경 감소는 또한 잠재적으로 EFs를63microbicide 기반 응용 프로그램 대 한 바이러스 침투에 방 벽으로 더 효과적인 만드는 더 작은 숨 구멍을 생성의 이점이 제공 합니다. 마지막으로, 습도 EF 수율에 영향을 미칠 수는 관찰 되었다. 높은 습도에서 수익률 특이 한 매크로-형태와 섬유의 형성으로 인해 감소 경향이 있다. 챔버 내에 전기 습도 제어 시스템을 설치 수 따라서 촉진 EFs를 생산 하는 일관 된 수익률이 제작에 도전을 선물 하는 경우.
GRFT 활용 효율성 개선, 선택과 functionalizable 그룹의 위치를 조사 하 고 또한 고려할 수 있습니다. 예를 들어 경우에 관심사의 단백질의 1 차 아민의 3 차원 단백질 구조 내부 부근으로, 입체 방해 되지 않을 수 있습니다 EFs에 활성화 carboxyl 그룹 주 아민, 감소와 상호 작용 합니다 반응의 유사도입니다. 이 도전은 단백질 표면에 가까이 1 차 아민 그룹을 생성 하는 단백질의 아미노산 대체에 의해 극복할 수 있습니다. 그러나, GRFT 및 다른 단백질 기능에 대 한 바인딩 사이트의 구체적인 활동에 따라, 단백질 구조에 변경 철저 하 게 테스트 해야 활용 사전 기능 분석에서.
제한 사항
GRFT 표면 처리의 주요 한계 carbodiimide 가교 화학을 사용 하 여 낮은 활용 효율성에 대 한 가능성은. 관심사의 항 바이러스 단백질은 높은 IC50, 낮은 활용 효율을 바이러스 감염에 대 한 (응용이 프로그램)에서 충분 한 보호를 제공 하지 않을 수 있습니다. 그러나, GRFT (또는 다른 수정)에 대 한 EFs, 단백질 및 covalently에 바인딩되지 않은 활성 에이전트EFs는 표면에 흡착 여전히 수 있습니다. 이러한 흡착된 에이전트 뚜렷이 바이러스 바인딩에 사용할 수 있는 지역화 된 농도 증가 의해 활용된 GRFT의 활동을 보완 하기 위해 잠재력을 제공 합니다. 이 예제에서 desorbed GRFT V-1 virions를 EFs를 직접 연결 하지 않는 (pericoital) 관리의 첫 번째 4 h와 보호의 다른 메커니즘을 제공할 수 있습니다에 바인딩할 수 있습니다. 따라서, 활용 및 표면 흡착 GRFT STIs에 대하여 일정 한 보호를 제공 하기 위해 기여할 수 있습니다.
단백질 활용 및 탈 착에서 수 여 하는 보호에도 불구 하 고 잠재적으로 더 높은 효율성과 다른 표면 수정 전략을 추구 수도 있습니다. 예를 들어 PLGA에 아민 carboxyl 그룹 대신 종료 활성화 GRFT 켤레 사용 될 수 있습니다. 또는, 다른 표면 수정 전략 EF-단백질 활용 효율을 개선 하기 위해 활용 될 수 있습니다. EFs의 구성 하는 Nanofibrous 세포 막 있다 되어 기능성 carbodiimide 가교 화학64통해 avidin와. Biotinylation 또는 재결합을 통해 Strep-태그 (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)의 추가 강한 형태로 수정 된 단백질을 활성화 하 고 매우 안정적인 avidin EFs와 비 공유 상호 작용 수 있습니다. 화학식, avidin 비타민 b 복합체 연계는 강한 비-공유 결합, femtomolar 선호도, 섬유 표면에 안정적인 활용 가능성이 결과입니다. 어떤 표면 수정 전략에 대 한 입체 방해 활용 효율을 극대화 하기 위해 고려 되어야 한다.
마지막으로, 우리는 구상 표면 수정 EFs 보호의 보완 모드를 제공 하는 활성 에이전트 캡슐화 하는 대체 전략을 제공할 것입니다. 단일 EF 플랫폼에서 캡슐화 및 표면 수정 기술 결합으로 하나의 고려 표면 수정 과정에서 활성 에이전트의 조기 출시를 줄일 것입니다. 수성 해결책에서 상대적으로 긴 부 화 시간을 필요로 하는 표면 수정 반응 활성 에이전트 로드의 상당한 비율 폴리머 가수분해 손실 될 수 있습니다.
기존 및 대체 방법에 관하여 방법의 중요성
이전 작품에서는, 우리는 수정 되지 않은 빈 EFs ~ 38 %infectible 셀29위에 transwell 삽입에 배치 하 여 HIV 감염을 억제 하기 위해 수 있었다 관찰. 생체 적합성, 웹 같이 미시와 GRFT의 관찰 된 강력한 항 바이러스 및 접착 속성 병행에서 EFs의 tortuosity 결합이 관측 여기에 설명 된 표면 수정 EFs의 개발을 자극.
현재 다른 배달 기술 상대 microbicide 애플리케이션에서 EFs 있다 잠재적인 응용 프로그램의 아키텍처 및 사용자 지정에 대 한 능력의 광범위. 다른 작업에서 EFs의 섬유 형태 그들 활성 에이전트, ECM, 그들을 만드는 조직 공학에 대 한 적합 한 건설 기계를 모방 하 고 있었습니다. EFs에서는 생체 적합성을 향상 및 강화 지속 출시65,66표면 수정도 있다.
생체 적합성을 향상 또는 에이전트 특정 바인딩 활동을 통해 그 기능을 제공, 수많은 방법이 존재는 플라즈마 처리, 습식된 화학 방법 등 표면 이식 EFs의 표면에 화합물의 첨부 파일에 대 한 허용 polymerizations50. GRFT는 V-1의 바이러스 glycoproteins에 특히 묶는 경우 EDC NHS의 습식된 화학 방법 또한 GRFT 기능50을 유지 하면서 섬유 메시 안에서 깊은 침투 능력으로 인해 가장 최적입니다. GRFT EFs에 움직일 다음는 FRT 내구성 배합에 전달할 수 있습니다 고 HIV 감염에 대 한 즉각적인 보호를 제공 합니다.
STIs를 억제 하기 위해 EFs 내 치료제를 캡슐화의 기존 전략에 비해 공유 활용 GRFT 및 HIV virions 사이 잠재적인 갈망을 증가의 고유한 이점을 제공 합니다. 여 표면 수정 통해 EFs에 GRFT을 immobilizing, GRFT의 매우 지역화 된 농도 얻을 수 있습니다는 hiv multivalent 바인딩을 위해 기회를 증가. 또한, EF 움직일 GRFT 솔루션, 무료 GRFT 기준으로 셀 국제화를 방해 하 여 GRFT 풀의 소모를 방지할 수 있습니다. 또한, 안정적이 고 접착제 항목 억제제로 GRFT의 행동의 독특한 메커니즘으로 인해 화학식 표면 활용 적 정량 항 바이러스 특성 이외에 바이러스 침투에 대 한 물리적 방 벽을 제공 하기 위해 EFs를 표면 수정 있습니다.
이 방법의 미래 응용 프로그램
배달에 대 한 표면 수정 활용 단일 EF 플랫폼 내에서 여러 명의 활성 에이전트를 통합 하는 기회를 제공 합니다. 미래에, 우리는 다목적 기술 (MPT) 어디 다양 한 활성 에이전트 내에서 캡슐화 수 있습니다 하 고 EFs에 활용 된 개발을 추구 합니다. 이러한 MPTs 행동의 다른 메커니즘으로 치료를 통합 하 여 병원 균의 더 넓은 범위에 대 한 보호를 부여 하는 설계 된 수 있습니다. 표면 및 행동의 다른 메커니즘으로 활성 에이전트를 제공 하는 EFs의 내부를 이용 하 여 바이러스 감염 으로부터 보호 하기 위해 EFs의 잠재력을 최대화 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는이 연구 자금에 대 한 우수성에 대 한 유태인 유산 기금에 감사입니다. 우리 닥터 스튜어트 윌리엄스 II 전기 시스템의 사용을 아낌없이 제공 감사. 우리는 또한 Griffithsin를 제공에 대 한 박사 케네스 팔 머 감사 합니다. 우리는 또한 박사 노부유키 마토 바와 그의 연구소 GRFT ELISA에서 작동 하는 훈련에 대 한 감사 합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 | Lactel | B6013-2P | |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Thermo Scientific | 147541000 | |
| Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 | Brico Medical Supplies | BN1815 | |
| BD 3mL Syringe Luer-lok tip | VWR | 309657 | |
| Parafilm (plastic film) | Sigma Aldrich | P7793 | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) | Sigma Aldrich | M3671 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S7653 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S7907 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P0662 | |
| Hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo Scientific | 24500 | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) | Thermo Scientific | 22980 | |
| 2-Mercaptoethanol | Fisher | BP176 | |
| Griffithsin (GRFT) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
| Dimethyl Sulfoxide | Milipore | 317275 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tris EDTA Buffer | Sigma Aldrich | 93283 | |
| Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3355 | |
| Influenza Hemagglutinin (HA) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
| Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) | Kentucky Bioprocessing | NA | custom made, no product number |
| Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) | Santa Cruz | 2056 | |
| Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate | KPL | 52-00-00 |
References
- Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
- Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
- Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
- Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
- Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
- Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
- Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
- Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
- Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
- Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
- Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792 (2012).
- Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
- Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
- Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
- Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
- Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
- Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
- Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
- Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
- Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
- Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
- Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108 (2010).
- Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
- Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
- Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
- Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
- Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
- Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
- Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
- Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
- Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
- O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
- Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
- Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
- Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
- Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635 (2011).
- Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
- Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
- Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
- Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
- Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
- O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
- Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
- Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
- Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
- Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
- Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
- Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
- Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
- Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
- Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
- Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
- Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
- Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
- Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
- Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
- Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
- Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
- Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
- Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
- Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
- Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
- Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
- Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).
