Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Изготовление и характеристика Griffithsin модифицированные волокна подмости для профилактики передающихся половым

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

Эта рукопись описывает порядок изготовления и характеризуют Griffithsin модифицированные поли (молочно co гликолевая кислота) electrospun волокон, которые демонстрируют мощный клей и противовирусной активностью против инфекции вируса иммунодефицита человека типа 1 в пробирке. Методы, используемые для синтеза, поверхность изменить и характеризуют результате морфологии, сопряжения, и описаны десорбции Griffithsin от поверхности модифицированные волокна.

Abstract

Electrospun волокна (EFs) широко используются в различных лечебных приложений; Однако они только недавно были применены как технология для профилактики и лечения сексуально половым путем (ИППП). Кроме того многие технологии EF сосредоточиться на инкапсулирования активного агента, относительно использования поверхности для придания biofunctionality. Здесь мы опишем способ изготовления и поверхности изменить poly(lactic-co-glycolic) кислоты (PLGA) electrospun волокон, с мощным противовирусным лектина Griffithsin (GRFT). PLGA является FDA утвержденных полимер, который широко используется в доставки лекарств из-за его выдающиеся свойства химические и биосовместимых. GRFT — естественный, мощным и безопасной Лектин, которая обладает широкой деятельности против многочисленных вирусов, включая тип вируса иммунодефицита человека 1 (HIV-1). При сочетании, GRFT-модифицированные волокна продемонстрировали мощным инактивации ВИЧ-1 в пробирке. Эта рукопись описывает методы изготовления и характеризуют изменение GRFT EFs. Во-первых PLGA является electrospun для создания волокна леску. Волокна, впоследствии изменения поверхности с GRFT с помощью 1-этил - 3-(3-dimethylaminopropyl) Карбодиимиды (EDC) и N-оксисукцинимидного (NHS) химии. Растровая электронная микроскопия (SEM) был использован для оценки размера и морфологии поверхности модифицированные составы. Кроме того gp120 или гемагглютинина (HA)-на основе ELISA может использоваться для количественной оценки суммы GRFT, конъюгированных с, а также GRFT десорбции с поверхности волокна. Этот протокол может быть более широко применяется для изготовления волокон, которые изменения поверхности с целым рядом различных белков.

Introduction

Использование EFs в качестве актуальные доставки платформы имеет возможность значительно сократить ИППП. В настоящее время есть более 36 миллионов человек, живущих с ВИЧ, с более чем двух миллионов новых случаев сообщалось в 2015 году только1,2. Кроме того вирус простого герпеса типа 2 (ВПГ-2) инфекции затрагивает сотни миллионов людей во всем мире и показало активизировать приобретения ВИЧ 2-5 раза3. Из-за этого отношения между инфекции HSV-2 и инфицирование ВИЧ существует значительный интерес к разработке новых активных агентов, которые обеспечивают одновременно защиту от нескольких ИППП. Кроме того развитие новых транспортных средств для улучшения доставки этих противовирусных агентов предлагает потенциал для дальнейшего повышения защитных и терапевтические потенции. Достижение этой цели как новая платформа доставки для уменьшения распространенности инфекции ВИЧ-1 и HSV-2 были расследованы EFs.

В течение последних двух десятилетий EFs широко используются в области доставки лекарств и ткани инженерных4. Часто Биосовместимых полимеров выбраны легко перевести для терапевтического применения. Для изготовления полимерных EFs, выбранного полимера растворяется в органических растворителей или водный раствор, в зависимости от степени полимера гидрофобность5. Активные агенты интерес затем добавляются растворителей или водный раствор до процесса electrospinning. Раствор полимера затем наддува в шприц и медленно выбрасывается при условии электрического тока. Этот процесс обычно приводит к полимерных волокон с листа или цилиндрических макростроение (рис. 1) и волокно диаметров от микро нано-6. Для приложений, наиболее терапевтических активные агенты включены в пределах волокна во время процесса electrospinning и выпускаются из волокна через диффузии и последующих волокна деградации. Скорость деградации или освобождения могут быть изменены с использованием различных типов полимеров или полимерные смеси создать профиль нужного выпуска, передаче уникальные химические и физические свойства7, а также содействие инкапсуляции практически любого соединения. Таким образом EFs оказались полезными для доставки лекарств малые молекулы и биологических агентов, включая белков, пептидов, олигонуклеотиды и факторы роста6,8,9.

В области профилактики ИППП EFs недавно использовались для включения и обеспечить устойчивый - или индуцибельной релиз противовирусных агентов10,11,12,13,14 ,,1516,,1718,19. В одном из ранних исследований рН отзывчивым волокна были разработаны для выпуска активных агентов в ответ на экологические изменения в рамках женского репродуктивного тракта (ФРТ), как метод по требованию защиты от ВИЧ-111. Поскольку другие исследования изучили полимерных смесей состоит из полиэтилена оксид (ПЭО) и поли L-молочная кислота (PLLA), оценить перестраиваемый выпуска агентов противовирусное и контрацептивов для контрацепции и профилактики ВИЧ-1 в в пробирке 12. Дополнительные исследования продемонстрировали целесообразность EFs предоставлять следующее: длительное освобождение малых молекул противовирусные препараты14, сильный и гибкие механических свойств20, 3-D доставки архитектуры21 , ингибирование спермы проникновения12и возможность слияния с другими технологии доставки13. Наконец Предыдущая работа оценивала полимерных волокон для устойчивой доставки противовирусных агентов против co-infective вирусам, HSV-2 и14ВИЧ-1. В этом исследовании Полимерные волокна предоставляемых дополняет деятельность к противовирусным доставки, сохраняя их структуру до 1 месяца и предоставляя физический барьер для вирусный вход. Из этих результатов было отмечено, что EFs может использоваться для физически и химически препятствовать вирусной инфекции.

В то время как перестраиваемый релиз свойства делают полимерных EFs платформу привлекательным доставки для доставки микробицидов, EFs были разработаны в других приложениях в качестве поверхности модифицированные подмостей7. Файловая система eFs были использованы для имитации морфология внеклеточного матрикса (ECM), часто действуя в качестве подмости для улучшения клеточной регенерации22и повышения их полезности в ткани, инженерных23,24. Белки состоят из полимеров, таких как поли ε-капролактана (PCL) и PLLA были изменения поверхности с факторами роста и белков после electrospinning для придания ECM-как свойств, включая повышение клеточной адгезии и распространение25 , 26. Кроме того, были оценены антимикробной поверхности модифицированные EFs для предотвращения роста конкретных патогенных бактерий27,28. Благодаря этой гибкости и способности побудить биологические эффекты EF технология продолжает расширяться в различных областях предоставлять несколько механистических функциональность. Тем не менее несмотря на их полезность в разнообразие приложений, поверхность модифицированные волокна только недавно были изучены в поле микробицидов29.

Параллельно с развитием новой технологии доставки для профилактики и лечения ИППП были разработаны новые биологической терапии. Одним из наиболее перспективных кандидатов микробицида является клей противовирусное Лектин, GRFT30. Первоначально производным от видов красных водорослей, GRFT продемонстрировал активность как мощным ингибитором ВИЧ, HSV-2, ОРВИ, а также гепатит C вирус31,,3233,34, 35 , 36. В самом деле, среди биологически на основе ингибиторов, GRFT имеет наиболее мощным анти-ВИЧ активность, инактивации ВИЧ-1 почти сразу же после контакта30, при сохранении стабильности и активности в присутствии СМИ культуры из влагалища микробы на срок до 10 дней-37. Совсем недавно 0,1% гель GRFT было показано для защиты мышей против интравагинального вызов ВПГ-2, что делает его перспективным кандидатом на первой линии защиты от ВПГ-2 и ВИЧ-1-32, 38. для ВИЧ специально, GRFT подавляет инфекцию, физически привязки gp120 или терминал маннозы N-связаны glycan остатков на поверхности вирусный конверт для предотвращения вступления38,,3940,41 ,42. Это торможение является сильнодействующим, с IC50s приближается 3 нг/мл43. В дополнение к ингибирования ВИЧ-инфекции, исследования также показали, что GRFT защищает от инфекции HSV-2 путем ингибирования к ячейке распространения вируса32. Во всех случаях GRFT было показано, чтобы быть клей для вирусных частиц, демонстрируя высокое сопротивление денатурации. Наконец GRFT продемонстрировал синергизма деятельности с комбинациями тенофовир (TFV) и другие противовирусные препараты44, что делает его возможным и, вероятно, целесообразно совместно администрировать с помощью EFs. Мощные свойства GRFT делают его отличным биологически на основе противовирусное кандидата, в котором доставки может быть повышена с EF технологии.

Используя это знание клей и врожденный противовирусными свойствами GRFT, полимерное волокно леску был разработан, что объединяет эти свойства, чтобы предоставить первый слой вирус вход ингибирование29. Найти вдохновение в том, что цервиковагинальных слизь мешает вирус транспорта главным образом через mucoadhesive муцина взаимодействия, мы предположили, что с помощью EFs как леску и ковалентно модификации поверхности с GRFT, высокая плотность поверхность конъюгированных GRFT бы истощают и инактивирует вирус на46,его entrypoint в45,47. Здесь EFs были разработаны в качестве стационарных эшафот чтобы обеспечить на основе белков, вирусной инактивации клей барьер платформу. Мы стремились объединить мощные противовирусные свойства GRFT с биосовместимыми, изменяемые и прочный полимер платформой, чтобы создать роман вирус «ловушку».

Для достижения этих целей, волокон состоит из PLGA были electrospun, и EDC-NHS химии была использована впоследствии изменять поверхность EF с GRFT. PLGA служил в качестве модели полимера из-за его широкого использования в electrospinning48, в сочетании с его биосовместимость и эффективности затрат. Кроме того модификация поверхности использует большой площади поверхности EFs и обеспечивает полезной альтернативой, которые могут быть объединены с инкапсуляцией увеличить волокна Утилита49. В отличие от традиционных инкапсуляции методов, где только часть GRFT доступен (и только временно присутствует в ФРТ) модификация поверхности может позволить GRFT поддерживать максимальную биологическую в течение всего срока лечения. Кроме того включение гидрофильные соединения, такие как белки, методами традиционной electrospinning, может привести к нижней инкапсуляции эффективность и потери белка деятельности50. Таким образом GRFT поверхность модифицированные волокна могут предложить перспективные альтернативные поставки метод, который может использоваться отдельно или в сочетании с electrospinning для усиления защиты от ИППП-инфекции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка и изготовление эшафот волокна Electrospun

ОСТОРОЖНОСТЬЮ: вся работа с растворителями или полимерные растворы должны выполняться в Химический вытяжной шкаф . Обратитесь к безопасности материала таблицы каждого реагента перед началом протокол.

  1. Для electrospin раствор полимера PLGA 3 мл 15% w/w, весят 720 мг 50: 50 поли (молочно co гликолевая кислота) (PLGA; 0,55-0.75 дл/г, 31-57 кДа) в 10 мл флаконе сцинтилляционные. Объем раствора на основе размера типичного пакета, используемые в текущих исследованиях.
    Примечание: Полимерной массы для добавления данного объема растворителя должна рассчитываться сначала продумывается плотность растворителя используется для растворения полимеров. Плотность растворителя Hexafluoro-2-пропанол (HFIP) – 1,59 г/мл. Таким образом, вес растворителя, основываясь на объем 3,0 мл HFIP необходимо, – 4,8 г (3,0 мл x 1,59 г / мл). На долю 15% w/w PLGA к HFIP 720 мг PLGA необходимо добавить 3,0 мл HFIP (0,15 x 4800 = 720 мг). Преимущество использования % w/w/раствор полимера, вместо % w/v, является, что это обеспечивает определенный вес окончательного решения. Этот определенный вес позволяет более точные замена растворителей, в случае испарения растворителя в шаге 1.3.
  2. Добавить 3,0 мл HFIP стекла сцинтилляционные флакон, содержащий PLGA (от шага 1.1) с помощью Пипетки серологические стекла. Покрыть флакон с пластиковой пленкой, а затем измерьте и запишите флакона Массачусетс
  3. Инкубировать полимер подвеска на ночь при 37 ° C для обеспечения полного растворения полимеров. Если любой растворитель испаряется, уменьшение массы во флаконе, добавить HFIP до тех пор, пока флакона достигает своей первоначальной массы на шаге 1.2.
  4. После инкубации, подготовить electrospinning аппарат ( рис A). Хотя оправки любого размера могут быть использованы, здесь вращающейся 25 мм Наружный диаметр нержавеющей стали оправки был использован как коллекционер.
    Примечание: Большего диаметра оправки уменьшается толщина волокна, учитывая же объем раствора electrospinning.
  5. Аспирационная раствор полимера в шприц 3 мл.
  6. Подключить тупым кончик иглы ½ дюйма 18-го калибра, шприц и отказаться от избыточного решения (обычно 0,25 мл) для удаления пустых headspace в кончик иглы.
  7. Место шприц на шприцевый насос и установите скорость потока документа до 2,0 мл/ч.
    Примечание: Этот поток был ранее оптимизирован основанные на вязкость полимера для этой разработки.
  8. Подключите источник питания к иглу шприца и electrospin раствор полимера с использованием напряжения + 27 кв. Расстояние между иглой и коллектор должен быть равен примерно 25 см ( рис. 2 B).
    Предупреждение: Процесс electrospinning создает паров растворителя. Использование вытяжного шкафа или закрытых аппарат ( рис. 2) для удаления вредных паров .
  9. После всего решения electrospun, выключите источник питания и позволяют оправки для спина на дополнительные 30 минут для полного испарения растворителя.
  10. Поворот от вращения оправки коллектор и используйте лезвия для резки волокна из оправки. Используйте нож аккуратно чистить волокна из оправки.
  11. Сбора electrospun PLGA волокна в обозначенные Петри и место в desiccatorovernight для удаления остаточного растворителя.

2. Поверхность модификация волокон с GRFT

  1. подготовить решения фосфат амортизированное saline (PBS) и 2-(N-Морфолино) ethanesulfonic кислота (MES буфера). Подготовьте PBS, растворяя 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na 2 HPO 4 и 0,24 г х 2 PO 4 в 1 Л ультрачистая вода. Аналогичным образом, распустить 19.52 g MES (свободной кислоты, 195.2 МВт) и 29.22 г NaCl в 1 Л ультрачистая вода, подготовить MES буфера. Обеспечивает окончательное pH каждого решения между 7.2-7,5 и 5.0-6.0, соответственно, с помощью рН метр.
  2. Подготовить индивидуальные рабочие решения EDC (2 мм) и стоматология (5 мм).
    1. Удалить EDC и ГСЗ из морозильника и позволяют им сбалансировать до комнатной температуры перед весом.
    2. Весят 4 мг EDC в 1,5 мл трубку microcentrifuge.
    3. Весят 6 мг ГСЗ в другую трубу microcentrifuge.
    4. Добавить 1 мл MES буфер для каждой трубы. Вихревой обеих трубок энергично обеспечивать реагентов полностью растворены.
  3. Приготовления раствора гидроксиламина, весом 70 мг в 50 мл конические пластиковых пробирок.
  4. Добавить 20 мл PBS гидроксиламина и вихревой распустить.
  5. Масса, соответствующее количество PLGA волокна в 15 мл конические пластиковых пробирок. Как правило, 75 мг волокно используется для каждой партии реакции.
  6. Добавить 8 мл буфера МЧС в 15 мл тюбик.
  7. Добавить 1 мл EDC и NHS решений, подготовленных ранее к трубе. Окончательный объем раствора должно быть 10 мл. Окончательный концентрации EDC и NHS должны быть 0,4 мг/мл 0,6 мг/мл, соответственно и.
  8. Закрыть и опечатать 15 мл тюбик с пластиковой пленкой и поместить на вращателе разрешить решение быть аккуратно перевернутой 15 мин при комнатной температуре ( рис. 3 B). Этот шаг активирует карбоксильных групп на полимер для ковалентная модификация с GRFT белками ( рис A).
  9. После активации, тщательно утолить реакции путем добавления 14 мкл β-меркаптоэтанол трубки. Инвертировать трубке несколько раз для обеспечения полного смешивания.
    Предупреждение: β-меркаптоэтанол высоко токсичен и должен использоваться только в химической зонта.
  10. Удалить супернатант и дважды, промыть PLGA волокна 10 мл PBS, чтобы удалить любые оставшиеся β-меркаптоэтанол.
  11. После промывки, добавить соответствующее количество Стоковый раствор GRFT в трубку. К примеру 5 нмоль волокна GRFT/mg потребует 6.35 мкл Стоковый раствор GRFT (от 10 мг/мл бульона) на мг волокна. Таким образом образец волоконно 75 мг потребует 476.25 мкл 10 мг/мл GRFT Стоковый раствор.
    Примечание: GRFT волокон с теоретической нагрузках 0,05, 0.5 и 5 нмоль GRFT за мг волокна были сфабрикованы.
  12. Добавить достаточно PBS довести окончательный объем до 8 мл, закройте и перевернуть трубку для обеспечения тщательного перемешивания.
  13. Прокладка трубки с пластиковой пленкой и место на ротор снова, это время для 2 х.
  14. После 2 ч инкубации, утолить реакции, добавив 2 мл раствора гидроксиламина в пластиковых пробирок 15мл. В соответствии с инструкциями производителя, конечная концентрация гидроксиламина во время тушения реакции должно быть 0,7 мг/мл.
  15. Раствор тщательно перемешать и удалить супернатант. Промойте поверхность модифицированные волокна PLGA дважды с 10 мл сверхчистого водой, чтобы удалить любые неконъюгированной GRFT.
  16. Передачи волокна Петри блюдо и место внутри эксикатора до тех пор, пока волокно абсолютно сухой. Передача на Петри блюдо до 4 ° C для хранения.

3. SEM характеристика GRFT поверхность-модифицированные волокна

  1. место полосы углерода двухсторонние ленты на SEM образца горе. Метка нижней части образца гору с образец идентификационной информации с помощью постоянного маркера.
  2. Сократить три образцов из одной поверхности модифицированные волокна и разместить их на отдельный образец крепления. Толщина каждого образца составляет примерно 0,5 мм.
  3. Распыления покрытия образцы, используя осаждения частиц, электронов индуцированной из золотой пластине. Распыления пальто для 90 s, в 2.4 кв.
    Примечание: Время распыления пальто может варьироваться в зависимости от параметров оборудования, включая напряжение и силу тока.
  4. Изображения образцов в 8 кв с увеличением от 1 000 до 5 000 X.

4. Добыча GRFT от поверхности модифицированные волокна

  1. массы из 2 мг волокна в трех экземплярах в 1,5 мл пробирок microcentrifuge.
  2. Добавить 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) на трубу, затем вихря и инкубировать 1 мин при комнатной температуре до полного растворения волокна и.
  3. После инкубации, развести 10 мкл Алиготе из ДМСО волокна решение от шага 4.2, по крайней мере 100-кратного в буфер Tris-ЭДТА (TE) (рН = 8.0).
  4. Хранить образцы при-20 ° C до загрузки характеристика с ELISA.

5. Измерение GRFT десорбции из волокон

  1. оценить количество GRFT выпущен или десорбированного из волокна, весят 5-10 мг поверхности модифицированные волокна и место в пробки microcentrifuge. Запись массы волокна в каждой тюбике.
  2. Добавляют 1 мл соответствующее решение, которое имитирует физиологических окружающей среды (например, PBS, TE буфера, имитируемых вагинальной жидкости (СФДВ), и т.д.) для каждой выборки.
  3. Проинкубируйте образцы для 1 h на вращающейся шейкер на 200 об/мин, 37 ° C.
  4. После инкубации, удалить примерно 1 мл TE буфер, содержащий десорбировано GRFT из флакона и Алиготе кластер трубки. Хранить при-20 ° C до белка квантификации.
  5. Передавать новые пробки microcentrifuge образца и инкубировать до следующей точки время и добавьте 1 mL свежих буферного раствора с волокном в пробки microcentrifuge.
  6. Стандартное время точек, используемых для измерения выпуска включают в себя: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h и 1 wk., незначительным десорбции было отмечено в этих исследованиях после 4 ч.

6. Количественная оценка добычи GRFT и десорбции через ELISA

  1. пальто ИФА 96-луночных плита с 0,1 мл га (10 мкг/мл) в колодец как описано 51. Уплотнение пластины с пластиковой пленкой и инкубировать на ночь при 4 ° C ( рис. 4).
  2. Удалить буфер покрытия и добавлять 0,3 мл, блокирование буфера (2-3% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS с 0,05% Полисорбат 20) для каждой скважины. Инкубировать пластину для по крайней мере 2 ч при комнатной температуре.
  3. После инкубации, промойте пластины 3 раза с ПБС с 0.1% Полисорбат 20 (PBS-P). После ополаскивания, отказаться от 0,1 мл образцов, стандартом или PBS как отрицательный контроль в соответствующих скважины. Инкубировать пластину за 1 ч при комнатной температуре.
  4. Промойте пластины 3 раза снова с PBS-P. После ополаскивания, добавить 0,1 мл основное антитело (коза анти GRFT антисыворотка) в каждой скважине и проинкубируйте по крайней мере 1 ч при комнатной температуре. Как правило, основное антитело раствор разбавляют путем мэм в PBS.
  5. После инкубации пробы с основное антитело промыть пластины снова 3 раза с PBS-P. Добавить 0,1 мл вторичные антитела (пероксидазы (ПХ)-конъюгированных кролик анти коза IgG) к каждому хорошо и инкубировать 1 час при комнатной температуре. Вторичное антитело раствор разбавляют путем мэм в PBS.
  6. Мыть пластину 3 раза. Добавьте 0,1 мл ТМБ 2-пероксидаза субстрата в каждой скважине. Мониторинг развития цвета (около 2 мин), а затем добавить 0,1 мл Ч 2 так 4 (1 N) чтобы утолить реакции. Читайте пластины на 450 Нм на тарелку reader.
  7. Средние значения ОД фон (скважины, которые получают только PBS) и вычесть это от экспериментальных групп.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Морфология волокно имеет значительное влияние на способность поверхности модифицированные EFs для защиты от вирусов. Хотя electrospinning является удобной и простой процедурой, неоптимизированных полимерные составы может привести к неправильной волокна морфологии (рис. 5B-C). Изменения в условиях electrospinning, которые приводят к образованию бисером или аморфный мат как морфологии, часто бывают вызваны растворителя полимерный несовместимости, низкой полимерной вязкость, скорость потока или других условий electrospinning. Результате вариации в структуре волокон может привести к выпуска различных профилей для наркотиков инкорпорейтид волокон или несоответствия в эффективность спряжение, изменяя волокна способность физически или химически препятствуют проникновения вируса. PLGA EFs, изготовленные с использованием описанных electrospinning условий должно привести к морфологии собственный волокна с диаметром в диапазоне между 1,5 и 2,8 мкм (рис. 6). Чтобы определить морфологию волокна и диаметр, EFs должны рассматриваться с SEM до других характеристик или модификации шаги.

SEM изображения пустое, 0,05, 0.5 и 5 нмоль GRFT волокон показал никаких существенных различий в морфологии волокна (Рисунок 6A-D), указав, что модификация GRFT не влияет на морфологию волокна. Чтобы определить средний диаметр каждого EF формулировки, минимум 50 случайных измерений были взяты в поле зрения с SEM изображений. Средний диаметр составов EF были измерены и рассчитывается в ImageJ, как показано на рисунке 6E. Все составы EF имел аналогичные средние диаметры вокруг 1.9 мкм, демонстрируя согласованности процесса изготовления неизмененном волокна через пакеты.

Чтобы определить, что количество GRFT конъюгированных с EFs, GRFT-EFs были распущены в ДМСО, следуют 100-кратного разбавления TE буфера, чтобы извлечь GRFT из волокна. Количество GRFT, конъюгированных на мг волокна был количественно с помощью ИФА. Для каждого изменения плотности (0,05, 0.5 и 5 нмоль GRFT за мг волокна) десять реплицирует были оценены. Для 5 0.5 изменения и 0,05 нмоль EF GRFT/мг, каждый EF был 373, 165 и 42 нг GRFT на мг EF, что приводит к сопряжение КПД 0,6, 4.2 и 6,9%, соответственно. Эти результаты показывают, что GRFT-EFs сопряженных с более высокой плотностью теоретические поверхности модификация, приводят к более GRFT, конъюгированных с волокном (рисA). Однако существует обратная корреляция с результирующей эффективности спряжение29.

Чтобы оценить количество ковалентно конъюгированных волокна поверхность по отношению к адсорбированные GRFT, GRFT-EFs инкубировали в СФДВ определить количество GRFT освобождены. В первые 4 ч 113, 25 и 10 нг GRFT на мг EF был обнаружен в СФДВ 5, 0,5 и 0,05 нмоль теоретические изменения концентрации, соответственно. Эти значения соответствуют до 30%, 41% и 24% от суммы GRFT, конъюгированных 5, 0,5 и 0,05 нмоль GRFT-EFs. После 4 ч незначительно GRFT был обнаружен в релиз элюата для всех трех формулировок. GRFT выпуска после 1, 2 и 4 h это показано на Рисунок 7B. Взятые вместе, эти данные показывают, что большинство GRFT ковалентно связан с EFs, и что поверхности адсорбированные GRFT выпускается в первые 4 ч.

Figure 1
Рисунок 1: морфология macroscale electrospun волокон. Electrospun волокна показано были изготовлены с использованием 4 мм (цилиндр) и оправки диаметром 25 мм (лист), соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: аппарат Electrospinning. (A) Коллекционирование оправки, где хранение жидкого струи полимера и (B) полное electrospinning установки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: схема EF модификации с GRFT с помощью химии EDC-NHS. (A) карбоксильных групп на PLGA EF реагируют с NHS присутствии EDC формы Амин реактивной эфиров, которые впоследствии образуют стабильные амидных связей с первичных аминов GRFT. (B) два миллиграмма волокна диски или кусков вырезать и инкубировали в 8 мл 2 мл реагента EDC/NHS MES буфера и поворачивается на 15 мин пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: схемы, иллюстрирующие GRFT количественной оценки с помощью ИФА. Immunoplate 96-луночных покрыта gp120 или HA захватить и иммобилизации GRFT. Первичного антитела против GRFT, вторичные антитела связаны с пероксидаза и ELISA субстрата последовательно добавляются для количественного определения GRFT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: эффекты растворителей выбора на словотолковании PLGA EF. (A) 15% w/w PLGA EFs в HFIP отображается желательно нитевидные морфологии. (B) 15% w/w PLGA EFs в хлороформе и диметилформамиде, не форме из-за-неоптимальный выбор растворителей или концентрации полимера (вязкость). (C) 15% w/w и (D) 20% w/w PLGA EFs в TFE продемонстрировать важное значение вязкости полимера. Бусины сформирован в разработке с низкой концентрации полимера (C), в то время как увеличение концентрации полимера (растворителя вязкость) привели к четко определенной волокна морфологии (D). Обратите внимание, что на нижней увеличение было принято Рисунок 5B Показать мат как морфология. Масштаб баров = 10 мкм.Figure 6
Рисунок 6: SEM изображения и волокно диаметров голые и GRFT-модифицированные EFs. (A) голые PLGA EFs и PLGA EFs изменения поверхности с (B) 0,05 нмоль, (C) 0.5 нмоль и (D) 5 нмоль GRFT на мг волокна. Масштаб баров = 10 мкм. (E) диаметров неизмененным и GRFT-EFs. Планки погрешностей представляют собой среднее ± SEM. Не статистическая разница наблюдалась между диаметрами неизмененным и GRFT-модифицированные волокна. Рисунок 6 E был адаптирован от женихов и др. 29 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 : Количество GRFT спрягаются по и десорбированного из GRFT-модифицированные EF. (A) количество GRFT спрягаются по каждой мг EF волокна возрастает с повышенной концентрации реагентов GRFT. ()B) количество GRFT освобожден от каждого мг волокна показывается 0,05, 0.5 и 5 нмоль составы после 1, 2 и 4 ч инкубации в СФДВ. Планки погрешностей представляют собой среднее ± SEM. Эта цифра была адаптирована из женихов и др. 29 пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Благодаря своей пористой структуры и большой площади поверхности EFs нашли целый ряд применений в области здравоохранения, одна из которых включает в себя в качестве терапевтического доставки. Наркотики и другие активные вещества могут быть включены в EFs перестраиваемый доставки, в то время как biologics и химические лигандов может конъюгированных волокна поверхность для клеток конкретного нацеливания52 или biosensing53. Здесь изготовление GRFT поверхность изменение PLGA EFs, как поставка эшафот для предотвращения ВИЧ-инфекции, описано. GRFT-EFs были синтезированы electrospinning, обеспечивая преимущества производства низкой стоимости и высокой скорости по сравнению с другими волокна производства методы49,53.

Важнейшие шаги в протоколе
Формирование EFs является сильнейшей степени зависит от свойства раствора полимера, в частности решение или растворителя вязкость54. Факторы, которые влияют на вязкости раствора полимера включают молекулярная масса полимеров, полимерные концентрации и тип использованного растворителя. Решение или растворителя вязкость обычно корректируется, изменяя соотношение полимер для растворителя, для получения желаемого полимер концентрации. С каждым изготовление объем должен сохраняться в течение ночи инкубации поддерживать надлежащее соотношение полимер растворитель (вязкость). При достаточно высоких полимеров концентрации молекулы полимера втянуть в решении во время процесса electrospinning для производства волокон. Во время процесса electrospinning шарик лягут на кончике прядильная и если есть достаточно полимер запутывания, жидкий струй вспыхнуть от этой точке критического напряжения и ускорить в моды Кнут как к сбору оправки55. Испарения растворителя затем приведет к струи, истончение, производство нити, волокна, как они депозит на сбор оправки. После синтезируется, EFs должны быть проанализированы SEM для проверки правильной морфологии и последовательной волокна диаметром. Присутствие бисером EFs может быть результатом низкой решение вязкость56, чрезвычайно высокое приложенного напряжения57, полимерные кормов скорость58, или сочетание всех трех факторов. Если это наблюдается, следует увеличить концентрацию полимера и приложенного напряжения и скорость подачи должны корректироваться, чтобы достичь волоконно как морфология.

Здесь для конъюгата белков на поверхности EF, PLGA карбоксильных групп были отреагировали с помощью EDC-NHS Карбодиимиды сшивки химия59. Во время процесса модификации волокна кратко инкубируют с EDC присутствии ГСЗ, что приводит к преобразование карбоксилатов в полу стабильные, Амин реактивной эфиры. Во время процесса конъюгации двухступенчатый важно, что буферов, используемых во время каждого шага имеют оптимальный рН, отметил в инструкциях изготовителя, для обеспечения максимальной спряжение эффективности. Half-life NHS эфиры колеблется от четырех до пяти часов в нейтральном pH и в более основных условий60резко уменьшается. Таким образом первая реакция должна быть выполнена в МЧС буфера при рН 5-6 и активированные волокна затем должно передаваться на PBS буфер (pH 7,2-7.5) для последующего и незамедлительной реакции с GRFT. Важно также, что EDC инактивированная добавлением 2-меркаптоэтанол и достаточно промыть из волокон после активации карбоксилат. Это поможет предотвратить активации белка EDC и self сшивки во второй реакции, которые могут снизить эффективность спряжение.

Модификации и устранение неполадок
Хотя наши предыдущие работы продемонстрировали эффективность различных GRFT-модифицированные волокна против инфекции ВИЧ-1, некоторые изменения процесса могут рассматриваться для настройки EF морфологии или улучшить GRFT (или других белков) спряжение эффективности или волокна доходность29. В частности площадь поверхности EF может быть увеличен путем уменьшения диаметр волокна, чтобы включить больше площади поверхности для сопряжения. Предыдущие исследования показали, что уменьшение концентрации полимера и вязкость производит меньше волокна диаметром61,62. Однако этот подход ограничен формирования бисером волокон при концентрации ниже порогового значения. Чтобы уменьшить диаметр волокна без изменения вязкости раствора, двойной растворителя систем могут быть использованы для уменьшения поверхностного натяжения, или соли могут быть добавлены для увеличения раствор проводимости56,57. Оба метода позволит большее растяжение electrospinning струй, которые могут производить меньшего диаметра волокна. Кроме того Нижняя молекулярная масса полимеров могут использоваться для изготовления меньшего диаметра волокна. Уменьшение диаметра волокна также обеспечивает дополнительное преимущество генерации меньше поры, потенциально делает EFs более эффективным барьером для проникновения вируса, для приложений на базе микробицидов63. Наконец было отмечено, что влажность может повлиять на EF урожайности. При более высокой влажности доходность, как правило, уменьшить за счет формирования волокон с необычной макро морфология. Установка системы контроля влажности в пределах electrospinning камеры может таким образом облегчить производство EFs с последовательной урожайности, если это представляет собой проблему для изготовления.

Для повышения эффективности GRFT спряжение, расследование выбор и расположение functionalizable групп могут также рассматриваться. Например, если первичных аминов протеина интереса расположены вблизи внутренних дел структуры трехмерной белков, их пространственной помех может помешать активированные карбоксильных групп на EFs взаимодействующих с первичных аминов, снижая вероятность реакции. Этот вызов может быть преодолен путем замены аминокислот белка, чтобы генерировать Первичные амины группы ближе к поверхности белка. Однако как GRFT и других белков зависят удельная активность своих сайтов связывания для функциональности, изменения в конформации белка должно тщательно протестированы в функциональных анализов до спряжение.

Ограничения
Основным ограничением GRFT модификации поверхности является потенциал для низких спряжение эффективности с использованием Карбодиимиды сшивки химии. Если противовирусное протеина интереса имеет высокий IC50, низкий спряжение эффективности может не обеспечивает достаточной защиты против вирусной инфекции (в этих приложениях). Однако, для GRFT (или другие изменения) EFs, белки и активных агентов, которые не обязаны ковалентноФайловая система eFs может по-прежнему адсорбируются на поверхности. Эти адсорбированных агенты предлагают возможности для дополнения деятельности конъюгированных GRFT, увеличивая временно локализованные концентрации, доступные для связывания вируса. В этом примере десорбировано GRFT могут связывать вирионов ВИЧ-1, которые не связаться непосредственно с EFs и может предоставить альтернативный механизм защиты с первых 4 h администрации (pericoital). Таким образом конъюгированного и поверхности адсорбированные GRFT может способствовать обеспечению единообразного защиты от ИППП.

Несмотря на защиту, предоставленных из белка спряжение и десорбции могут осуществляться другие стратегии поверхности модификация с потенциально более высокой эффективности. Например PLGA, завершенной с аминами вместо карбоксильных групп могут использоваться для конъюгата активированного GRFT. Кроме того различные модификации поверхности стратегии могут быть использованы для повышения эффективности спряжение EF-белка. Nanofibrous мембраны, состоящий из EFs были функционализированных с авидин через Карбодиимиды сшивки химии64. Biotinylation или дополнение Strep-тега (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) через Рекомбинация может включить измененный белок в форме сильного и чрезвычайно стабильной non ковалентные взаимодействие с авидин EFs. Хотя non ковалентные, авидин биотин связь является сильнейшим не ковалентная связь, с femtomolar сходства, вероятно, что приводит к стабильной сопряжения поверхности волокна. Для любой поверхности изменение стратегии их пространственной помех следует рассматривать для максимизации эффективности спряжение.

И наконец мы видим, что изменение поверхности EFs будет предлагать альтернативную стратегию для инкапсуляции активного агента для предоставления дополнительных видов защиты. Один рассмотрения с совмещением технологии инкапсуляции и поверхности модификация на единой платформе EF будет уменьшение досрочного освобождения активных агентов во время процесса модификации поверхности. Для модификации поверхности реакций, которые требуют относительно долгое время инкубации в водном растворе значительный процент активных агентов, загрузки может быть утрачено в результате гидролиза полимера.

Значение метода в отношении существующих и альтернативных методов
В предыдущей работе мы наблюдали, что неизмененном пустой EFs смогли препятствовать ВИЧ-инфекции на ~ 38% при помещении в transwell вставить выше infectible клетки29. Это наблюдение, в сочетании с биосовместимость, веб как микроструктуры и извилистость EFs, параллельно с наблюдаемые мощным противовирусным и адгезивные свойства GRFT, побудило развитие поверхности модифицированные EFs, описанных здесь.

Относительно других поставки технологий в настоящее время работают в приложениях микробицидов, EFs имеют широкий спектр потенциальных приложений из-за их архитектуры и возможностей для настройки. В другой работе волокнистых морфология EFs позволило им доставить активных агентов и имитировать ECM, делая их подходящей подмости для тканевой инженерии. Файловая система eFs также были изменения поверхности для повышения биосовместимость и укрепления устойчивого релиз65,66.

Для повышения биосовместимость, или доставить эту функцию через определенную привязку деятельности агентов, существуют многочисленные методы, позволяют для крепления соединений к поверхности EFs, такие как процедуры плазмы, мокрые химические методы и поверхности трансплантата полимеризация50. В случае GRFT, который специально связать вирусный гликопротеинов ВИЧ-1 влажный химический метод EDC-NHS является наиболее оптимальным из-за способность проникать глубоко внутри сетки волокна сохраняя при этом функциональность GRFT50. GRFT прикол для EFs может затем быть доставлен в прочный формулировке ФРТ и обеспечить немедленную защиту от ВИЧ-инфекции.

По сравнению с существующей стратегии инкапсуляции терапии в рамках EFs для ингибирования ИППП, ковалентных спряжение предлагает преимущество увеличения потенциальных алчность между GRFT и ВИЧ вирионов. По иммобилизации GRFT для системы EFs через поверхность модификация, может быть достигнуто весьма локализованных концентрации GRFT, которые увеличивают возможность для многовалентных привязки с ВИЧ. Кроме того EF-прикол GRFT, относительно свободный GRFT в растворе, может предотвратить истощение GRFT бассейн, препятствуя клеток интернализации. Кроме того из-за уникальный механизм действия GRFT как ингибитор запись стабильной и клей, ковалентных поверхности сопряжения позволяет поверхности модифицированные EFs для обеспечения физического барьера для проникновения вируса, в дополнение к мощной противовирусными свойствами.

Будущего применения этого метода
Использование поверхности модификации для доставки представляет собой возможность для интеграции нескольких активных агентов в рамках единой платформы EF. В будущем мы стремимся к разработке многоцелевой технологии (MPT) где целый ряд активных агентов могут быть инкапсулирован в и конъюгированных для EFs. Эти MPTs могут быть предназначены для обеспечивать защиту против более широкий спектр патогенных микроорганизмов путем включения терапии с разными механизмами действия. Используя как поверхности, так и интерьер EFs для доставки активных веществ с различными механизмами действий, будет развернуто потенциал EFs для защиты от вирусов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы признательны Еврейский фонд наследия для передового опыта для финансирования этого исследования. Мы благодарим д-р Стюарт Уильямс II за щедро предоставленные использования системы electrospinning. Мы также благодарим д-р Кеннет Палмер за предоставление нам с Griffithsin. Мы дополнительно поблагодарить доктора Нобуюки Матоба и его лаборатории для подготовки работы нам в GRFT ELISA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792 (2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108 (2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635 (2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Tags

Биоинженерия выпуск 128 Electrospun волокна болезней передаваемых половым путем инфекций вирус иммунодефицита человека поверхность модификация микробицидов Griffithsin поли (молочно co гликолевая кислота)
Изготовление и характеристика Griffithsin модифицированные волокна подмости для профилактики передающихся половым
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vuong, H. R., Tyo, K. M.,… More

Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter