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Bioengineering

Fabricación y caracterización de andamios de fibra modificado Griffithsin para la prevención de infecciones de transmisión sexual

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

Este manuscrito describe el procedimiento para fabricar y caracterizar fibras de electrospun modificado Griffithsin poli (ácido láctico-co-glicólico) que muestran potente actividad adhesiva y antiviral contra la infección por virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 en vitro. Métodos utilizados para sintetizar, modificar superficie, caracterizar la morfología resultante, Conjugación, y se describen desorción de Griffithsin de fibras de superficie modificada.

Abstract

Electrospun fibras (EFs) han sido ampliamente utilizadas en una variedad de aplicaciones terapéuticas; sin embargo, sólo recientemente aplicados como una tecnología para prevenir y tratar sexualmente transmitidas (ETS). Además, muchas tecnologías EF se centran en encapsular al agente activo, en relación con la utilización de la superficie para impartir biofunctionality. Aquí se describe un método para fabricar y superficie-modificar poly(lactic-co-glycolic) ácido (PLGA) electrospun fibras, con las lectinas antiviral potente Griffithsin (GRFT). PLGA es un polímero aprobado por la FDA que ha sido ampliamente utilizado en la administración de fármacos debido a sus excelentes propiedades químicas y biocompatibles. GRFT es un natural, potente y seguro lectina que posee actividad amplia contra numerosos virus incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1). Cuando se combinan, las fibras modificadas GRFT han demostrado potente inactivación del VIH-1 en la vitro. Este manuscrito describe los métodos para fabricar y caracterizar EFs GRFT modificado. En primer lugar, PLGA es electrospun crear un andamio de fibra. Las fibras son posteriormente modificado de superficie con GRFT usando 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y la química de N-hydroxysuccinimide (NHS). Microscopía electrónica de barrido (SEM) se utilizó para evaluar el tamaño y la morfología de las formulaciones de superficie modificada. Además, un gp120 o hemaglutinina (HA)-ELISA de base puede utilizarse para cuantificar la cantidad de GRFT conjugada, así como desorción GRFT desde la superficie de la fibra. Este protocolo puede aplicarse más ampliamente para fabricar fibras que son modificados por la superficie con una variedad de proteínas diferentes.

Introduction

El uso de EFs como una plataforma de entrega tópica tiene el potencial para reducir significativamente las ITS. Actualmente, hay más 36 millones personas que viven con el VIH, con sobre 2 millones de nuevos casos reportados en 2015 solo1,2. Además, el virus herpes simple tipo 2 (HSV-2) la infección afecta cientos de millones de personas en todo el mundo y se ha demostrado para mejorar la adquisición del VIH por 2-5 veces3. Debido a esta relación entre infección por VHS-2 y la infección por el VIH, existe gran interés en el desarrollo de nuevos agentes activos que proporcionan la protección simultánea contra las ITS múltiples. Por otra parte, el desarrollo de nuevos vehículos para mejorar la entrega de estos agentes antivirales ofrece el potencial para aumentar la Potencia protectora y terapéutica. Hacia este objetivo EFs han sido investigados como una nueva plataforma para reducir la prevalencia de infecciones por el VIH-1 y HSV-2.

Durante las últimas dos décadas, EFs se han utilizado extensivamente en los campos de la administración de fármacos y tejidos ingeniería4. A menudo, polímeros biocompatibles se seleccionan traducir fácilmente a aplicaciones terapéuticas. Para fabricar el EFs poliméricos, el polímero seleccionado se disuelve en una solución acuosa o disolvente orgánica, dependiendo del grado de hidrofobicidad de polímero5. Agentes activos de interés entonces se agregan a la solución acuosa o disolvente antes del proceso de centrifugado eléctrico. La solución de polímero es entonces aspira en una jeringa y expulsada lentamente mientras sujeta a una corriente eléctrica. Este proceso típicamente resulta en fibras de polímero con hoja o macroestructuras cilíndrico (figura 1) y diámetros de fibra que van desde la micro a nano-escala6. Para aplicaciones más terapéuticas, agentes activos se incorporan dentro de las fibras durante el proceso de centrifugado eléctrico y son liberados de la fibra a través de la difusión y la degradación de fibra posterior. La tasa de degradación o de liberación puede ser alterada usando diferentes tipos de polímeros o mezclas de polímeros para establecer un perfil de liberación deseado, impartiendo propiedades químicas y físicas únicas7y la promoción de la encapsulación de prácticamente cualquier compuesto. Como tal, EFs han demostrado ser beneficiosos para la entrega de fármacos de molécula pequeña y agentes biológicos, como proteínas, péptidos, oligonucleótidos y factores de crecimiento6,8,9.

En el campo de la prevención de ITS, EFs han utilizado recientemente para incorporar y ofrecer o inducible-liberación sostenida de agentes antivirales10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. En uno de los primeros estudios, se desarrollaron fibras sensible al pH para liberar a agentes activos en respuesta a cambios ambientales dentro de la zona reproductiva femenina (FRT), como un método en demanda de protección contra el VIH-111. Desde entonces, otros estudios han investigado mezclas de polímero compuestos de óxido de polietileno (PEO) y el ácido poli-l-láctico (PLLA), para evaluar la liberación ajustable de agentes antivirales y anticonceptivos para VIH-1 prevención y anticoncepción in vitro 12. estudios adicionales han demostrado la viabilidad de EFs para proporcionar lo siguiente: prolongada liberación de pequeñas moléculas antivirales14, fuerte y flexible propiedades mecánicas20, arquitecturas de entrega 3-21 , inhibición de esperma penetración12y la capacidad para combinar con otras tecnologías de entrega13. Finalmente, el trabajo previo ha evaluado fibras poliméricas para la entrega sostenida de los antivirales contra el virus de co-contagioso comunes, HSV-2 y VIH-114. En este estudio, las fibras de polímero proporcionan actividad complementaria a la entrega de antiviral por su estructura de retención hasta por 1 mes y proporcionar una barrera física a la entrada viral. De estos resultados, se observó que la EFs pueden utilizarse tanto física como químicamente impedir la infección del virus.

Mientras que propiedades sintonizables poliméricos EFs una plataforma atractiva para la entrega de microbicidas, EFs se han desarrollado en otras aplicaciones como andamios de superficie modificada7. EFs se han utilizado para imitar la morfología de la matriz extracelular (ECM), actuando a menudo como andamios para mejorar la regeneración celular22y su utilidad en tejidos ingeniería23,24. Las fibras de polímeros como el poli-ε-caprolactone (LCP) y PLLA han sido superficie modificada con factores de crecimiento y proteínas después de electrospinning impartir propiedades de ECM como incluyendo aumento celular adherencia y proliferación25 , 26. Además, EFs modificado superficie antimicrobianas han sido evaluadas para prevenir el crecimiento de bacterias patógenas específicas27,28. Debido a esta versatilidad y la capacidad de inducir efectos biológicos, tecnología EF continúa expandiéndose a través de una variedad de campos para proporcionar funcionalidad de múltiples mecanismos. Sin embargo, a pesar de su utilidad en una diversidad de aplicaciones, fibras de superficie modificada sólo recientemente se han explorado en el campo microbicida del29.

En paralelo con el desarrollo de las nuevas tecnologías de entrega para prevenir y tratar las ITS, se han desarrollado novedosas terapias biológica. Uno de los candidatos más prometedores del microbicida es el adhesivo lectinas antiviral, GRFT30. Derivado originalmente de una especie de algas rojas, GRFT ha demostrado actividad como un potente inhibidor de la HIV, HSV-2, SARS, así como de la Hepatitis C virus31,32,33,34, 35 , 36. de hecho, entre los inhibidores de base biológica, GRFT tiene la más potente actividad anti-VIH, inactivar el VIH-1 casi de inmediato en contacto30, manteniendo la estabilidad y la actividad en presencia de medios de cultivo de vaginal microbios por hasta 10 días37. Más recientemente, gel 0.1% GRFT fue demostrado proteger a ratones contra el desafío de HSV-2 intravaginal, convirtiéndolo en un candidato prometedor para la primera línea de protección contra HSV-2 y VIH-132, 38. para VIH GRFT inhibe específicamente, infección atando físicamente gp120 o terminal de residuos de glicanos N-ligados de manosa en las superficies de la envoltura vírica para prevenir la entrada de38,39,40,41 ,42. Esta inhibición es muy potente, con IC50s a 3 ng/mL43. Además de inhibir la infección por VIH, los estudios también han demostrado que GRFT protege contra la infección por HSV-2 inhibiendo la propagación de célula a célula del virus32. En todos los casos, GRFT ha demostrado ser adhesivo a partículas virales, demostrando alta resistencia a la desnaturalización. Por último, GRFT ha demostrado actividad sinérgica con combinaciones de Tenofovir (TFV) y otros antivirales44, lo que es factible y probable beneficioso administrar conjuntamente con EFs. Las potentes propiedades de GRFT hacen un excelente base biológica antiviral candidato, en el cual entrega puede mejorarse con la tecnología EF.

Utilizando este conocimiento de las propiedades antivirales de GRFT adhesivo e innatas, un andamio de fibra polimérica fue diseñado, que integra estas propiedades para proporcionar la primera capa de virus entrada inhibición29. Encontrando inspiración en el camino que moco cervicovaginal dificulta el transporte de virus principalmente a través de las interacciones de mucina mucoadherentes, presumimos con EFs como andamio y covalente modificando la superficie con GRFT, una alta densidad de conjugados con superficie GRFT debilitar e inactivar virus en su punto de entrada45,46,47. Aquí EFs se desarrollaron como un andamio fijo para proporcionar una viral, basada en la proteína adhesiva inactivar barrera plataforma. Intentamos combinar las potentes propiedades antivirales de GRFT con una plataforma de polímero biocompatible, modificable y durable, para crear un nuevo virus "trampa."

Para alcanzar estos objetivos, las fibras de PLGA eran electrospun y química NHS EDC utilizó posteriormente modificar la superficie EF con GRFT. PLGA sirvió como un polímero del modelo debido a su amplio uso en electrospinning48, combinado con su biocompatibilidad y su rentabilidad. Además, modificación superficial explota la gran superficie de EFs y ofrece una alternativa útil que puede combinarse con la encapsulación para maximizar la utilidad de la fibra49. A diferencia de los métodos de encapsulación tradicionales donde solamente una porción de GRFT está disponible (y sólo transitoriamente presentes en la FRT), modificación superficial puede permitir GRFT mantener bioactividad máxima durante toda la duración del tratamiento. Además, la incorporación de compuestos hidrofílicos como proteínas por métodos tradicionales de electrospinning, puede resultar en rendimientos más bajos de la encapsulación y la pérdida de proteína actividad50. Por lo tanto, las fibras de superficie modificada GRFT pueden ofrecer un método prometedor de entrega alternativos que puede utilizarse solos o en combinación con electrospinning para optimizar la protección contra la infección de ITS.

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Protocol

1. preparación y fabricación de andamio de fibra Electrospun

PRECAUCIÓN: todo el trabajo con solventes o soluciones de polímeros debe realizarse en una campana de humos químicos . Consulte la hoja de datos material de seguridad de cada reactivo antes de iniciar el protocolo de.

  1. Para electrospin una solución de polímero del EGLP 3 mL de 15% w/w, peso 720 mg de 50: 50 poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA; 0.55 a 0.75 dL/g, 31-57 kDa) en un vial de centelleo de 10 mL. El volumen de la solución se basa en el tamaño de lote típico utilizado en los estudios actuales.
    Nota: Debe calcularse la masa de polímero para agregar a un volumen dado de solvente en la primera determinación de la densidad del solvente utilizado para disolver el polímero. La densidad del solvente Hexafluoro-2-propanol (HFIP) es de 1,59 g/mL. Así, el peso del solvente, basado en un volumen de 3.0 mL HFIP necesitada, es 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). Para una fracción 15% w/w de PLGA a HFIP 720 mg EGLP debe agregarse a 3.0 mL HFIP (0.15 x 4.800 mg = 720 mg). La ventaja de usar un % w/w/solución de polímero, en lugar de % w/v, es que proporciona un peso definido de la solución final. Este peso definido permite reemplazo de solvente más precisa, en el caso de evaporación de solvente durante el paso 1.3.
  2. Agregar 3.0 mL HFIP al vial de centelleo de vidrio que contiene PLGA (del paso 1.1) con una pipeta serológica de vidrio. Cubrir el frasco con la película plástica, a continuación, mida y registre el frasco Massachusetts
  3. Incubar la suspensión del polímero durante la noche a 37 ° C para asegurar la completa disolución del polímero. Si ningún tipo de disolvente se evapora, disminuyendo la masa de la cubeta, añadir HFIP hasta que el frasco alcanza su masa original en el paso 1.2.
  4. Después de la incubación, preparar el aparato de electrospinning ( figura 2 A). Aunque puede utilizar un mandril de cualquier tamaño, aquí un mandril giratorio de acero inoxidable de diámetro exterior 25 mm fue utilizado como el colector de.
    Nota: Un diámetro de mandril disminuirá el grosor de la fibra, dado el mismo volumen de solución de electrospinning.
  5. Aspirar la solución de polímero en una jeringa de 3 mL.
  6. Conectar una punta de aguja Roma de calibre 18, 1/2 pulgada a la jeringuilla y dispense el exceso (típicamente de 0.25 mL) de solución para eliminar el espacio vacío en la punta de la aguja.
  7. Coloque la jeringa en una bomba de jeringa y fijar el caudal de instrumento a 2,0 mL/h.
    Nota: Este flujo se optimizó anteriormente basado en la viscosidad del polímero para la formulación de esta.
  8. Conectar la fuente de alimentación a la aguja de la jeringuilla y electrospin la solución de polímero con una tensión de + 27 kV. La distancia entre la aguja y el colector debe ser establecida en aproximadamente 25 cm ( figura 2 B).
    PRECAUCIÓN: El proceso de centrifugado eléctrico crea un vapor de solvente. Utilice una campana de humos o un aparato cerrado ( figura 2) para eliminar el vapor perjudicial .
  9. Una vez que la solución entera electrospun, apague la fuente de energía y permitir que el mandril gire un adicional 30 minutos evaporar totalmente el disolvente.
  10. Vuelta apagado el colector rotativo de mandril y utilice una cuchilla para cortar la fibra del mandril. Utilice la cuchilla para pelar suavemente la fibra de la mandril.
  11. Recoger la fibra PLGA electrospun en una placa Petri marcada y en un desiccatorovernight para quitar el solvente residual.

2. Modificación de la superficie de las fibras con GRFT

  1. Prepare soluciones de tampón fosfato salino (PBS) y 2-(N-morfolino) (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido (tampón de MES). Preparar PBS disolviendo 8 g NaCl 0,2 g KCl, 1,44 g de Na 2 HPO 4 y 0.24 g KH 2 PO 4 en 1 L de agua ultrapura. De manera similar, disolver 19,52 g MES (libre de ácido, 195.2 MW) y 29,22 g NaCl en 1 L de agua ultrapura, para preparar el buffer MES. Asegurar que el pH final de cada solución es entre 7.2-7.5 y 5.0-6.0, respectivamente, usando un medidor de pH.
  2. Preparar soluciones de trabajo individuales de EDC (2 mM) y NHS (5 mM).
    1. Quite la EDC y NHS del congelador y permitirles que alcancen la temperatura ambiente antes de pesar.
    2. Pesar de 4 mg de EDC en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mL.
    3. Pesar de 6 mg de NHS en otro tubo de microcentrífuga.
    4. ML agregue 1 MES buffer a cada tubo. Vórtex los tubos vigorosamente para los reactivos se disuelven completamente.
  3. Preparar una solución de hidroxilamina pesando 70 mg en un tubo de centrífuga cónico de 50 mL.
  4. Añadir a la hidroxilamina y vortex para disolver 20 mL PBS.
  5. Masa hacia fuera una cantidad apropiada de fibra EGLP en un tubo de centrífuga cónico de 15 mL. Normalmente, 75 mg de fibra se utiliza para cada lote de reacción.
  6. Añada 8 mL de tampón MES al tubo de 15 mL.
  7. Agregue 1 mL de cada una de las soluciones EDC y NHS preparado anteriormente para el tubo. El volumen final de la solución debe ser 10 mL. Las concentraciones finales de EDC y NHS deben ser 0,4 mg/mL y 0.6 mg/mL, respectivamente.
  8. Cierre y selle el tubo de 15 mL con película de plástico y colóquelo en un rotor para permitir que la solución de invertirse suavemente durante 15 min a temperatura ambiente ( figura 3 B). Este paso activa los grupos carboxyl en el polímero para permitir la modificación covalente con la proteína GRFT ( figura 3 A).
  9. Después de la activación, cuidadosamente calmar la reacción mediante la adición de 14 μl de β-mercaptoetanol al tubo. Invertir el tubo varias veces para asegurar una mezcla completa.
    PRECAUCIÓN: β-mercaptoetanol es altamente tóxico y debe ser utilizado en una campana de humos químicos.
  10. Eliminar el sobrenadante y lavar dos veces, la fibra PLGA con 10 mL de PBS para quitar cualquier resto de β-mercaptoetanol.
  11. Después de enjuagar, agregar una cantidad apropiada de solución madre GRFT al tubo. Por ejemplo, un 5 nmol fibra GRFT/mg requeriría 6,35 μl de solución stock GRFT (de un stock de 10 mg/mL) por mg de fibra. Así una muestra de fibra 75 mg requeriría 476.25 μl de solución stock de 10 mg/mL GRFT.
    Nota: Se fabrican fibras GRFT con cargas teóricas de 0.05, 0.5 y 5 nmol GRFT por fibra mg.
  12. Añadir suficiente PBS para llevar el volumen final a 8 mL, cerrar e invertir el tubo para asegurar una mezcla completa.
  13. Sellar el tubo con película de plástico y colóquelo en un rotor nuevo, tiempo de 2 h.
  14. Después de las 2 h incubación, calmar la reacción mediante la adición de 2 mL de solución de hidroxilamina en el tubo de centrífuga de 15 mL. Siguiendo las instrucciones del fabricante, la concentración final de hidroxilamina durante la reacción de enfriamiento debe ser 0,7 mg/mL.
  15. La solución se mezcla bien y desechar el sobrenadante. Enjuague la fibra PLGA de superficie modificada dos veces con 10 mL de agua ultrapura para quitar cualquier GRFT.
  16. Transferencia de la fibra a un plato de Petri y lugar dentro de un desecador hasta que la fibra quede completamente seca. Transferencia de la caja Petri a 4 ° C para almacenamiento de información.

3. SEM fibras caracterización de GRFT superficie modificada

montaje del espécimen de
  1. lugar una tira de cinta de carbón de doble cara en un SEM. La parte inferior del montaje del espécimen de la etiqueta con los datos identificativos de la muestra utilizando un marcador permanente.
  2. Cortar tres muestras de una fibra de superficie modificada y en montajes de muestras separadas. El grueso de cada muestra es aproximadamente de 0,5 mm.
  3. Farfulle la capa las muestras mediante la deposición de partículas inducida por electrones de una placa de oro. Sputter coat por 90 s, en 2.4 kV.
    Nota: El tiempo de capa catódica puede variar dependiendo de los parámetros del equipo, incluyendo el voltaje y amperaje.
  4. Las muestras de la imagen a 8 kV con aumentos que van desde 1.000 a 5, 000 x.

4. Extracción de GRFT de fibras de superficie modificada

  1. total a 2 mg de fibra por triplicado en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Agregar dimetilsulfóxido 1 mL (DMSO) en el tubo, entonces vortex e incubar durante 1 min a temperatura ambiente para disolver completamente la fibra.
  3. Después de la incubación, diluir una alícuota de 10 μl de la solución de DMSO-fibra en el paso 4.2, por lo menos 100-fold en tampón Tris-EDTA (TE) (pH = 8.0).
  4. Almacenar las muestras a-20 ° C hasta carga caracterización con ELISA de.

5. Medición GRFT desorción de fibras

  1. para evaluar la cantidad de GRFT lanzado o desorbida de la fibra, peso 5-10 mg de fibra de superficie modificada y colocarla en un tubo de microcentrífuga. Registrar la masa de fibra en cada tubo.
  2. Añada 1 mL de una solución apropiada que imita el entorno fisiológico (e.g., PBS, buffer TE, fluido vaginal simulado (SVF), etc.) para cada muestra.
  3. Incubar las muestras durante 1 hora en un agitador rotatorio a 200 rpm, 37 ° C.
  4. Después de incubación, retirar aproximadamente 1 mL de tampón de TE que contiene el GRFT deabsorbido del frasco y alícuota a cluster tubos. Almacenar a-20 ° C hasta la cuantificación de proteína.
  5. Transferir la muestra a un tubo nuevo de microcentrífuga, añadir 1 mL de solución amortiguadora fresca a la fibra dentro del tubo de microcentrífuga e incubar hasta el siguiente momento.
  6. Puntos de tiempo típico utilizado para medir la versión: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 wk. h y 1 insignificante desorción se observó en estos estudios después de 4 h.

6. Cuantificación de GRFT extracción y desorción mediante ELISA

  1. capa un ELISA de 96 pocillos placa con 0,1 mL de HA (10 μg/mL) por pozo como se describió anteriormente 51. Selle la placa con la película plástica e incubar durante una noche a 4 ° C ( figura 4).
  2. Quitar el tampón con revestimiento y añadir 0,3 mL tampón (2-3% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS con 0.05% polisorbato 20) a cada pozo de bloqueo. Incube la placa durante al menos 2 h a temperatura ambiente.
  3. Después de la incubación, lavar la placa 3 veces con PBS 1 x con 0.1% polisorbato 20 (PBS-P). Después de enjuagar, dispensar 0.1 mL de muestra, estándar o PBS como control negativo en los pocillos respectivos. Incube la placa otra vez por 1 h a temperatura ambiente.
  4. Lavar la placa otra vez 3 veces con PBS-P. Después de enjuagar, agregar 0,1 mL de anticuerpo primario (antisuero de cabra anti-GRFT) en cada pocillo e incubar durante al menos 1 h a temperatura ambiente. Por lo general, se diluye la solución de anticuerpo primario de 1: 10,000 en PBS.
  5. Después de incubar las muestras con enjuague de anticuerpo primario las placas otra vez 3 veces con PBS-P. Añadir 0,1 mL de anticuerpo secundario (peroxidasa de rábano (HRP)-cabra anti conejo Conjugado IgG) a cada uno bien e incubar 1 h a temperatura ambiente. Se diluye la solución de anticuerpo secundario de 1: 10,000 en PBS.
  6. Lavar la placa 3 veces. Agregar sustrato de peroxidasa 2 TMB 0.1 mL en cada pocillo. Supervisar el desarrollo de color (aproximadamente 2 minutos), a continuación, Añadir 0,1 mL de H 2 hasta 4 (1 N) para calmar la reacción. Leer la placa a 450 nm en un lector de placas.
  7. Promedio de los valores de OD de fondo (pozos que sólo reciben la PBS) y restar esto de los grupos experimentales.

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Representative Results

Morfología de la fibra tiene un efecto significativo en la capacidad de la EFs de superficie modificada para proporcionar protección contra virus. Aunque electrospinning es un procedimiento conveniente y sencillo, formulaciones de polímeros no optimizado pueden resultar en la morfología de la fibra irregular (figura 5B-C). Alteraciones en la condiciones de electrospinning que resultan en la formación de morfologías de estera-como cuentas o amorfos, a menudo son causadas por incompatibilidad de disolvente-polímero, viscosidad del polímero bajo, velocidad de flujo u otras condiciones de electrospinning. Las variaciones resultantes en la estructura de la fibra pueden resultar en la liberación diferentes perfiles para drogas incorporan fibras o inconsistencias en la eficacia verbal, alteración de la capacidad de las fibras físicamente o químicamente dificultan la penetración del virus. La EFs de PLGA fabricado usando las condiciones de electrospinning descrito debe resultar en morfologías distintas fibras con diámetros que oscilan entre 1,5 y 2,8 μm (figura 6). Para determinar el diámetro y morfología de la fibra, EFs deben examinarse con SEM antes otras medidas de caracterización o modificación.

Imágenes de SEM de en blanco, 0.05, 0.5 y 5 nmol GRFT fibras no mostraron diferencias significativas en la morfología de la fibra (figura 6A, D), indicando que la modificación GRFT no tiene efecto en la morfología de la fibra. Para determinar el diámetro medio de cada formulación de EF, un mínimo de 50 mediciones al azar se tomaron por campo de visión de las imágenes de SEM. Los diámetros promedio de las formulaciones de EF se midieron y calcularon en ImageJ, como se muestra en la figura 6E. Todas las formulaciones de EF había similares diámetros promedio alrededor de 1,9 μm, demostrando la consistencia del proceso de fabricación de fibra no modificados a través de lotes.

Para determinar que la cantidad de GRFT conjugado con el EFs, GRFT EFs se disolvieron en DMSO, seguido de la 100-fold dilución en buffer TE, extraer GRFT de la fibra. La cantidad de GRFT conjugado por mg de fibra se cuantificó mediante ELISA. Para cada densidad de modificación (0.05, 0.5 y 5 nmol GRFT por fibra mg), se evaluaron diez repeticiones. Para el 5, 0,5 y 0,05 nmol GRFT/mg EF modificaciones, cada EF tenía 373, 165 y 42 ng GRFT por mg de EF, dando por resultado la eficiencia verbal de 0.6 y 4.2 6.9%, respectivamente. Estos resultados demuestran que la EFs GRFT conjugan con mayor densidad teórica de la modificación de superficie, resultado en más GRFT conjugado a la fibra (figura 7A). Sin embargo, hubo una correlación inversa con el de eficiencia verbal resultante29.

Evaluar la cantidad de conjugado covalentemente a la superficie de la fibra en relación con adsorbe GRFT GRFT EFs se incubaron en SVF para determinar la cantidad de GRFT liberado. En las primeras 4 h, 10, 113 y 25 ng de GRFT por mg EF fue detectado en el SVF para el 5, 0,5 y 0,05 nmol las concentraciones teóricas de la modificación, respectivamente. Estos valores corresponden a 30%, 41% y 24% de la cantidad de GRFT conjugado con 5, 0.5 y 0.05 nmol GRFT EFs. Después de 4 h, GRFT insignificante fue detectado en el efluente de lanzamiento para las tres formulaciones. Liberación GRFT después de 1, 2 y 4 h se muestra en la figura 7B. Tomados en conjunto, estos datos indican que la mayoría de GRFT covalente está limitada al EFs, y que el GRFT superficie adsorbido es liberado dentro de las primeras 4 h.

Figure 1
Figura 1: la morfología de la macroescala de electrospun fibras. Las fibras electrospun demostradas fueron fabricadas usando un 4 mm (de cilindro) y el mandril de diámetro 25 mm (hoja), respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: aparato de Electrospinning. Mandril (A) la que recoge donde depositan los chorros de líquido de polímero y (B) la configuración de electrospinning completo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: modificación de la esquemática de EF con GRFT usando química EDC-NHS. Grupos carboxilo (A) en la reacción de PLGA EF con NHS en presencia de la EDC a los ésteres aminas reactivas de forma, que posteriormente formarán enlaces amida estable con las aminas primarias de GRFT. (B) dos miligramos fibra discos o piezas se cortan y se incubaron en 8 mL de tampón MES con 2 mL de reactivo EDC/NHS y giradas para 15 minutos haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: esquemático ilustrando cuantificación GRFT usando ELISA. Un immunoplate de 96 pocillos está cubierta con gp120 HA para capturar e inmovilizar GRFT. Anticuerpos primarios contra GRFT, ligados a peroxidasa de rábano y sustrato de ELISA los anticuerpos secundarios se añaden secuencialmente para cuantificar GRFT. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: efectos de la opción solvente sobre la morfología de PLGA EF. (A) el 15% w/w de PLGA EFs de deseable HFIP aparecido filiforme morfología. (B) el 15% w/w PLGA EFs en cloroformo y dimetilformamida, no forma no óptima opción solvente o concentración de polímero (viscosidad). (C) el 15% w/w y (D) 20% w/w PLGA EFs en TFE demuestran la importancia de la viscosidad del polímero. Granos se forman en la formulación con menor concentración de polímero (C), mientras que el aumento de la concentración de polímero (solvente viscosidad) dio lugar a la morfología de la fibra bien definido (D). Nota, figura 5B fue tomada en una magnificación baja para mostrar la morfología de la estera-como. Barras de la escala = 10 μm.

Figure 6
Figura 6: imágenes de SEM y el diámetro de la fibra de EFs desnudos y modificado GRFT. (A) pelado PLGA EFs y PLGA EFs superficie modificada con (B) 0.05 nmol, (C) 0,5 nmol y (D) 5 nmol de GRFT por mg de fibra. Barras de la escala = 10 μm. (E) diámetros sin modificar y GRFT EFs. Barras de error representan la media ± SEM. Se observó ninguna diferencia estadística entre los diámetros de las fibras sin modificar y GRFT modificado. Figura 6 E ha sido adaptado de novios et al. 29 haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Cantidad de GRFT conjugado y problema desorbida del EF modificado GRFT. (A) la cantidad de GRFT conjugado a cada mg de EF fibra aumenta con la concentración de reactivo GRFT creciente. ()B) se mostrará la cantidad de GRFT liberada cada mg de fibra para el 0.05, 0.5 y 5 nmol formulaciones después de 1, 2 y 4 h de incubación en el SVF. Barras de error representan la media ± SEM. Esta figura ha sido adaptada de novios et al. 29 haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Debido a sus estructuras porosas y superficies grandes, EFs han encontrado una variedad de aplicaciones en la salud, uno de los cuales incluye servir como vectores terapéuticos. Drogas y otros agentes activos pueden ser incorporados dentro de EFs para entrega regulable, mientras que los productos biológicos y químicos ligandos pueden ser conjugados con la superficie de la fibra para celular específica dirigida a52 o biosensores53. Aquí la fabricación de GRFT superficie modificados PLGA EFs, como un andamio de entrega para evitar la infección por VIH, se describe. GRFT EFs se sintetizaron por electrospinning, proporcionando las ventajas de la tasa de producción de bajo costo y alto en relación con otros fibra producción métodos49,53.

Pasos críticos en el protocolo
La formación de EFs es críticamente dependiente de las propiedades de la solución de polímero, en particular la solución o solvente viscosidad54. Los factores que afectan la viscosidad de una solución de polímero incluyen peso molecular de polímero, concentración de polímero y el tipo de solvente utilizado. La solución o solvente viscosidad normalmente se ajusta cambiando la proporción de polímero al solvente, para obtener la concentración deseada del polímero. Cada fabricación, el volumen debe mantenerse durante la incubación durante la noche para mantener la proporción adecuada de polímero-solvente (viscosidad). A concentración suficientemente alta de polímero, las moléculas de polímero enredan en la solución durante el proceso de centrifugado eléctrico para producir fibras. Durante el proceso de centrifugado eléctrico, formará un grano en la punta de la hilera y si hay suficiente enredo de polímero, chorros de líquido se entran en erupción desde este punto en una tensión crítica y acelerar de manera látigo hacia el mandril que recogía55. Evaporación de solvente entonces conducirá a jet adelgazantes, produciendo hilos de fibra como depositan en el mandril que recoge. Una vez sintetizado, EFs deben analizarse por SEM para verificar la correcta morfología y diámetro de fibra consistente. La presencia de cuentas EFs puede ser el resultado de la solución baja viscosidad56, tensión excesivamente alta57, alimentación de polímero tipo58, o una combinación de tres factores. Si esto se observa, debe aumentarse la concentración de polímero y el voltaje aplicado y la velocidad de alimentación deben ajustarse, para lograr la fibra-como morfología.

Para conjugar proteínas a la superficie EF, aquí grupos carboxyl PLGA fueron reaccionados con EDC-NHS carbodiimida reticulación química59. Durante el proceso de modificación, las fibras se someten brevemente con EDC en presencia de NHS que resulta en la conversión de carboxylates en ésteres semi estables, Amina reactiva. Durante el proceso de la conjugación de dos etapas, es fundamental que los buffers utilizados durante cada paso tienen el pH óptimo, en las instrucciones del fabricante, para asegurar eficacia máxima verbal. La vida media de los ésteres de NHS oscila de cuatro a cinco horas a pH neutro y disminuye drásticamente en condiciones más básico60. Así, la primera reacción debe realizarse en tampón MES a pH 5-6 y las fibras activadas deben transferirse a un tampón PBS (pH 7.2-7.5) para la posterior e inmediata reacción con GRFT. También es importante que la EDC es inactivada por la adición de 2-Mercaptoetanol y suficientemente aclarada de las fibras después de la activación de carboxilato. Esto ayudará a evitar la activación de la proteína por EDC y auto-reticulación durante la segunda reacción, que puede reducir la eficiencia verbal.

Modificaciones y la resolución de problemas
Aunque nuestro trabajo anterior demostró la eficacia de una variedad de fibras GRFT modificada contra la infección por VIH-1, ciertas alteraciones de proceso pueden considerarse para personalizar morfología EF o mejorar GRFT (otra proteína) eficiencia verbal o fibra rendimiento de29. En particular, el área superficial de EF puede incrementarse reduciendo el diámetro de la fibra, para permitir una mayor superficie para verbal. Estudios previos han demostrado que la reducción de la viscosidad y la concentración de polímero produce menor fibra diámetro61,62. Sin embargo, este enfoque está limitado por la formación de fibras de cuentas cuando la concentración está por debajo del valor umbral. Para disminuir el diámetro de la fibra sin cambiar la viscosidad de la solución, sistemas dual-solvente pueden ser utilizados para reducir la tensión superficial, o sales se pueden agregar para aumentar la solución conductividad56,57. Ambos métodos le permitirá un mayor estiramiento de los chorros de electrospinning que pueden producir más pequeños diámetros de fibra. Además, los polímeros de peso molecular inferiores pueden utilizarse para fabricar fibras de diámetro más pequeño. Diámetro decreciente de la fibra también proporciona la ventaja añadida de generar poros más pequeños, que potencialmente EFs más eficaces como barrera a la penetración de virus, para aplicaciones basadas en microbicidas63. Por último, se observó que la humedad puede afectar rendimiento EF. En una humedad más alta, el rendimiento tiende a disminuir debido a la formación de fibras con macro-morfología inusual. Instalación de un sistema de control de humedad dentro de la cámara de centrifugado eléctrico podría por lo tanto facilitar producción de EFs con rendimientos constantes, si esto presenta un desafío para la fabricación.

Para mejorar la eficiencia verbal de GRFT, investigando la selección y ubicación de grupos functionalizable también pueden considerarse. Por ejemplo, si las aminas primarias de la proteína de interés se encuentran cerca del interior de la estructura tridimensional de la proteína, impedimento estérico puede impedir que grupos carboxilo activado de EFs interactuando con aminas primarias, lo que disminuye la probabilidad de la reacción. Este reto puede ser superado por substitución del aminoácido de la proteína para generar un grupo de la amina primaria más cercano a la superficie de la proteína. Sin embargo, como GRFT y otras proteínas dependen de la actividad específica de sus sitios de Unión para la funcionalidad, alteraciones en la conformación de proteínas deben ser probadas en ensayos funcionales antes de la conjugación.

Limitaciones
Una limitación importante de modificación superficial GRFT es el potencial de eficacia verbal baja usando carbodiimida reticulación química. Si la proteína antiviral de interés tiene un alta de IC50, una eficacia verbal baja no puede proporcionar protección suficiente (en estas aplicaciones) contra la infección por el virus. Sin embargo, para GRFT (u otro modificado) EFs, proteínas y agentes activos que no están enlazados covalentemente aEFs pueden todavía fijan por adsorción a la superficie. Estos agentes de adsorción ofrecen la posibilidad de complementar la actividad de GRFT conjugado, incrementando transitoriamente la concentración localizada disponible para el atascamiento del virus. En este ejemplo, puede obligar a GRFT desorbida a viriones de VIH-1 que no contacta directamente con EFs y pueden proporcionar un mecanismo alternativo de protección con las primeras 4 h de la administración (pericoital). GRFT conjugado y adsorbidos por la superficie puede contribuir a proporcionar uniforme protección contra las ITS.

A pesar de la protección conferida de la conjugación de proteínas y desorción, podrían aplicarse otras estrategias de modificación de la superficie con potencial mayor eficiencia. Por ejemplo, podría utilizarse PLGA con aminas en lugar de grupos carboxilo conjugar GRFT activado. Por otra parte, una estrategia diferente de la modificación de la superficie puede ser utilizada para mejorar la eficiencia verbal de EF-proteína. Nanofibras de membranas compuestas de EFs han sido funcionalizadas con avidina via carbodiimida reticulación química64. Biotinilación o adición de un Strep-tag (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) a través de la recombinación puede activar la proteína modificada para formar fuerte y extremadamente estable interacción no covalente con avidina EFs. Si bien no covalentes, la vinculación de la avidina-biotina es el más fuerte no-covalente, con afinidad femtomolar, probablemente dando por resultado verbal estable a la superficie de la fibra. Para cualquier estrategia de modificación de la superficie, se debe considerar impedimento estérico para maximizar la eficiencia verbal.

Por último, imaginamos que EFs superficie modificada ofrece una estrategia alternativa para encapsulación de agente activo para proporcionar modos complementarios de protección. Una consideración con la combinación de tecnologías de encapsulación y modificación de superficie en una sola plataforma EF se reduce la liberación prematura de los agentes activos durante el proceso de modificación de la superficie. Para las reacciones de modificación de la superficie que requieren relativamente largo tiempo de incubación en solución acuosa, un porcentaje importante de los agentes activos cargados podría perderse debido a la hidrólisis del polímero.

Importancia del método con respecto a los métodos existentes y alternativos
En trabajos previos, se observó que EFs en blanco fueron capaces de inhibir la infección por VIH por ~ 38% cuando se coloca en un inserto transwell sobre células infectible29. Esta observación, combinada con la biocompatibilidad como microestructura y tortuosidad de la EFs, en paralelo con el observado potentes propiedades antivirales y adhesivo de GRFT, impulsó el desarrollo del EFs de superficie modificada descrita aquí.

Comparado con otras tecnologías de entrega actualmente empleadas en aplicaciones de microbicidas, EFs tienen una amplia gama de aplicaciones potenciales debido a su arquitectura y su capacidad de personalización. En otra obra, la morfología fibrosa de EFs les ha permitido entregar agentes activos y para imitar el ECM, haciéndolos andamios adecuados para la ingeniería de tejidos. EFs también han sido superficie modificada para mejorar la biocompatibilidad y mejorar liberación sostenida65,66.

Para aumentar la biocompatibilidad o entregar a los agentes que funcionan a través de la actividad de unión específica, existen numerosos métodos que permiten el acoplamiento de compuestos a las superficies de EFs como tratamientos de plasma, métodos de química húmedos superficie del injerto polimerizaciones de la50. En el caso de GRFT que específicamente se unen a las glicoproteínas virales de HIV-1, el método químico húmedo de EDC-NHS es el más óptimo debido a la capacidad de penetrar profundamente dentro de la malla de fibras y además conservar GRFT funcionalidad50. GRFT inmovilizado a EFs entonces puede ser entregado en una formulación duradera a la FRT y proporcionan protección inmediata contra la infección por VIH.

En comparación con la estrategia actual de encapsular terapéutica dentro de la EFs para inhibir las ITS, Conjugación covalente ofrece la clara ventaja de aumentar la avidez potenciales entre los viriones GRFT y VIH. Por inmovilización GRFT a EFs a través de la modificación de la superficie, se logra concentración altamente localizada de GRFT, que aumentar las posibilidades de Unión multivalente con VIH. Además, GRFT inmovilizada de EF, en relación con GRFT libre en solución, puede prevenir el agotamiento de la piscina GRFT por dificultar la internalización de la célula. Por otra parte, debido al mecanismo único de acción de GRFT como inhibidor de entrada estable y adhesivo, Conjugación covalente superficial permite EFs superficie modificada proporcionar una barrera física a la penetración de virus, además de potentes propiedades antivirales.

Futuras aplicaciones de este método
La utilización de la modificación de superficie para la entrega presenta la posibilidad de integrar a múltiples agentes activos dentro de una única plataforma EF. En el futuro, buscamos desarrollar una tecnología multipropósito (MPT) donde una variedad de agentes activos puede ser encapsulada dentro de y conjugada con EFs. Estos MPTs pueden estar diseñados para conferir protección contra una gama más amplia de patógenos mediante la incorporación de terapias con diferentes mecanismos de acción. Mediante la utilización de la superficie y el interior de la EFs para entregar a agentes activos con diferentes mecanismos de acción, el potencial de EFs para proteger contra la infección por el virus será maximizado.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al fondo de la judíos patrimonio por excelencia para la financiación de esta investigación. Agradecemos al Dr. Stuart Williams II para ofrecer generosamente el uso del sistema de centrifugado eléctrico. También agradecemos el Dr. Kenneth Palmer nos proporciona Griffithsin. Además agradecemos a Dr. Nobuyuki Matoba y su laboratorio para el entrenamiento en el ELISA GRFT trabajar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

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Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).

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