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Bioengineering

Fabricação e caracterização de andaimes de fibra Griffithsin-modificado para a prevenção de doenças sexualmente transmissíveis

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

Este manuscrito descreve o procedimento para fabricar e caracterizar as fibras de electrospun de Griffithsin-modificado poli (ácido lático-co-glicólico) que demonstram potente atividade antiviral e adesiva contra infecção por vírus da imunodeficiência humana tipo 1 em vitro. Métodos utilizados para sintetizar, modificar a superfície e caracterizar a morfologia resultante, conjugação, e dessorção de Griffithsin superfície-modificado com fibras são descritos.

Abstract

Fibras de Electrospun (EFs) têm sido amplamente utilizadas em uma variedade de aplicações terapêuticas; no entanto, eles só recentemente foram aplicados como uma tecnologia para prevenir e tratar sexualmente transmissíveis (DSTs). Além disso, muitas tecnologias EF focar encapsulando o agente ativo, em relação ao utilizando a superfície para dar biofunctionality. Aqui nós descrevemos um método para fabricar e superfície-modificar poly(lactic-co-glycolic) ácido (PLGA) electrospun fibras, com a lectina antiviral potente Griffithsin (GRFT). PLGA é um polímero aprovado pela FDA que tem sido amplamente utilizado na administração de medicamentos, devido às suas excelentes propriedades químicas e biocompatíveis. GRFT é um natural, potente e segura lectina que possui ampla atividade contra numerosos vírus incluindo o vírus da imunodeficiência humana tipo 1 (HIV-1). Quando combinados, fibras GRFT-modificado demonstraram potente inativação do HIV-1 em vitro. Este manuscrito descreve os métodos para fabricar e caracterizar EFs GRFT-modificado. Primeiro, PLGA é electrospun para criar um andaime de fibra. As fibras são posteriormente modificado de superfície com GRFT usando 1-etil - 3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) e N-Hidroxisuccinimida (NHS) química. Microscopia eletrônica (SEM) foi usado para avaliar o tamanho e morfologia da superfície-modificado formulações. Além disso, um gp120 ou hemaglutinina (HA)-ELISA com base pode ser usado para quantificar a quantidade de GRFT conjugada com, bem como dessorção GRFT da superfície da fibra. Este protocolo pode ser aplicado mais amplamente para fabricar fibras que são modificados de superfície com uma variedade de proteínas diferentes.

Introduction

O uso do EFs como uma plataforma de entrega tópica tem o potencial para reduzir significativamente as DSTs. Atualmente, existem mais 36 milhões as pessoas que vivem com HIV, com mais 2 milhões de novos casos de relatado em 2015 sozinho1,2. Além disso, o vírus herpes simplex tipo 2 (HSV-2) infecção afeta centenas de milhões de pessoas em todo o mundo e foi mostrado para melhorar a aquisição do HIV por 2-5 vezes3. Devido a esta relação entre infecção por HSV-2 e aquisição do HIV, há um interesse significativo no desenvolvimento de novos agentes ativos que fornecem a proteção simultânea contra várias DSTs. Além disso, o desenvolvimento de novos veículos para melhorar a entrega destes agentes antivirais oferece o potencial para aumentar ainda mais a potência protetora e terapêutica. Para atingir esta meta, EFs têm sido investigados como uma nova plataforma de entrega para reduzir a prevalência de infecções de HIV-1 e HSV-2.

Durante as últimas duas décadas, EFs têm sido extensivamente usados nas áreas de administração de medicamentos e de engenharia de tecidos4. Muitas vezes, polímeros biocompatíveis são selecionados para traduzir facilmente para aplicações terapêuticas. Para fabricar EFs poliméricos, o polímero selecionado é dissolvido em uma solução aquosa ou solvente orgânica, dependendo do grau de polímero hidrofobicidade5. Agentes ativos de interesse são adicionados à solução aquosa ou solvente antes do processo de eletrofiação. A solução de polímero é então aspirada para a seringa e ejectada lentamente enquanto sujeito a uma corrente elétrica. Este processo normalmente resulta em fibras de polímero com folha ou macrostructures cilíndrico (Figura 1) e diâmetros de fibras que variam do micro para nano-escala6. Para aplicações mais terapêuticas, agentes ativos são incorporados dentro das fibras durante o processo de eletrofiação e são liberados da fibra via difusão e a degradação da fibra subsequentes. A taxa de degradação ou de lançamento pode ser alterada usando diferentes tipos de polímeros ou misturas de polímero para estabelecer um perfil do lançamento desejado transmitir propriedades químicas e físicas únicas7e promover o encapsulamento de praticamente qualquer composto. Como tal, EFs provaram ser benéficas para a entrega de drogas de pequenas moléculas e agentes biológicos, incluindo proteínas, peptídeos, oligonucleotides e fatores de crescimento6,8,9.

No campo da prevenção de DST, EFs têm sido recentemente utilizados para incorporar e fornecer sustentada ou inducible-liberação de agentes antivirais10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. Em um dos primeiros estudos, pH-responsivo fibras foram desenvolvidas para liberar agentes ativos em resposta às mudanças ambientais dentro do trato reprodutivo feminino (FRT), como um método de demanda de proteção contra o HIV-111. Desde então, outros estudos têm investigado a misturas de polímero compostas de óxido de polietileno (PEO) e ácido poli-L-láctico (pilão), para avaliar a liberação sintonizável de agentes antivirais e anticoncepcionais para HIV-1 prevenção e contracepção em vitro 12. estudos adicionais demonstraram a viabilidade de EFs para fornecer o seguinte: prolongada liberação de pequenas moléculas antivirais14, forte e flexível propriedades mecânicas20, arquiteturas de entrega 3-d21 , inibição da penetração de esperma12e a capacidade de mesclar com outras tecnologias de entrega13. Finalmente, o trabalho anterior avaliou fibras poliméricas para a entrega sustentada dos agentes antivirais contra vírus co-infective comuns, o HSV-2 e o HIV-114. Neste estudo, fibras de polímero fornecido atividade complementar para entrega antiviral, mantendo a sua estrutura para até 1 mês e fornecendo uma barreira física a entrada viral. Nesses resultados, foi observado que o EFs podem ser usados para fisicamente e quimicamente impedem a infecção pelo vírus.

Enquanto propriedades de liberação sintonizável EFs poliméricos uma plataforma de entrega atraente para entrega de microbicida, EFs têm sido desenvolvidas em outras aplicações para servir como superfície-modificado andaimes7. EFs têm sido utilizados para imitar a morfologia da matriz extracelular (ECM), muitas vezes agindo como andaimes para melhorar a regeneração celular22e aumentar a sua utilidade em tecido engenharia23,24. Fibras de composto de polímeros tais como poli-ε-Caprolactona (PCL) e pilão ter sido modificado de superfície com proteínas e fatores de crescimento após eletrofiação conferir propriedades como ECM incluindo aumento celular adesão e proliferação de25 , 26. Além disso, foram avaliadas antimicrobianas EFs superfície modificada para impedir o crescimento de bactérias patogénicas específicas27,28. Devido a essa versatilidade e a capacidade de induzir efeitos biológicos, tecnologia EF continua a expandir-se através de uma variedade de campos para fornecer funcionalidade multi mecanicista. Ainda, apesar de sua utilidade em uma diversidade de aplicações, fibras de superfície modificada só recentemente foi exploradas no campo microbicida29.

Em paralelo com o desenvolvimento de novas tecnologias de entrega para prevenir e tratar as DSTs, desenvolveram-se novos terapêutica biológica. Um dos mais promissores candidatos microbicida é o adesiva lectina antiviral, GRFT30. Originalmente derivado de uma espécie de algas vermelhas, GRFT demonstrou atividade como um potente inibidor de HIV, HSV-2, SARS, assim como a hepatite C vírus31,32,33,34, 35 , 36. na verdade, entre inibidores biologicamente baseados, GRFT tem a mais potente atividade anti-HIV, inativando HIV-1 quase imediatamente em cima do contato30, mantendo estabilidade e atividade na presença de meios de cultura de vaginal micróbios para até 10 dias37. Mais recentemente, um gel GRFT 0,1% foi mostrado para proteger camundongos contra o desafio de HSV-2 intravaginal, tornando-se um candidato promissor para a primeira linha de proteção contra o HSV-2 e HIV-132, 38. para HIV especificamente, GRFT inibe infecção por fisicamente ligação gp120 ou terminal de resíduos de N-ligadas glicano manose em superfícies de envelope viral para impedir entrada38,39,40,41 ,,42. Esta inibição é altamente potente, com IC50s se aproximando a 3 ng/mL.43. Além de inibir a infecção pelo HIV, estudos também têm demonstrado que GRFT protege contra infecção por HSV-2, inibindo a propagação de célula para célula dos vírus32. Em todos os casos, GRFT tem demonstrado ser adesivo de partículas virais, enquanto demonstrando alta resistência à desnaturação. Por último, GRFT demonstrou atividade sinérgica com combinações de Tenofovir (TFV) e outros medicamentos antivirais44, tornando-o viável e provavelmente benéfico para administrar conjuntamente com o EFs. As potentes propriedades de GRFT torná-lo um excelente biologicamente baseados antiviral candidato, em que a entrega pode ser melhorada com tecnologia EF.

Utilizando esse conhecimento das propriedades antivirais adesivos e inatas de GRFT, um andaime de fibras poliméricas foi projetado, que integra essas propriedades para fornecer a primeira camada de entrada de vírus inibição29. Encontrando inspiração da forma que o muco cervicovaginal dificulta o transporte de vírus, principalmente através de interações de mucina mucoadhesive, formulamos a hipótese que usando EFs como um andaime e covalentemente, modificando a superfície com GRFT, uma elevada densidade de conjugados a superfície GRFT seria debilitar e inativar o vírus em seu entrypoint45,46,47. Aqui o EFs foram desenvolvidos como um andaime estacionário para fornecer uma base de proteína, viral adesivo-Inactive barreira plataforma. Nós procuramos combinar as propriedades antivirais potentes de GRFT com uma plataforma de polímero biocompatível, modificável e durável, para criar um novo vírus "armadilha".

Para atingir essas metas, fibras compostas de PLGA eram electrospun, e química de EDC-NHS foi usada para modificar posteriormente a superfície EF com GRFT. PLGA serviu como um polímero modelo devido ao uso extensivo em eletrofiação48, combinado com sua biocompatibilidade e custo-efetividade. Além disso, a modificação da superfície explora a grande área de superfície de EFs e fornece uma alternativa útil que pode ser combinada com encapsulamento para maximizar a utilidade de fibra49. Ao contrário dos métodos de encapsulamento tradicional onde somente uma parcela de GRFT está disponível (e apenas transitoriamente, presente no FRT), modificação da superfície pode permitir GRFT manter Bioatividade máxima durante toda a duração do tratamento. Além disso, a incorporação de compostos hidrofílicos como proteínas, pelos métodos tradicionais eletrofiação, pode resultar em menor eficiência de encapsulação e perda de proteína atividade50. Portanto, fibras de superfície-modificado GRFT podem oferecer um método promissor de entrega alternativo que pode ser usado sozinho ou em combinação com eletrofiação para aumentar a proteção contra a infecção de STI.

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Protocol

1. preparação e fabricação de andaime fibra Electrospun

atenção: todo trabalho com solventes ou soluções de polímero deve ser executado em uma coifa química . Consulte a folha de dados material da segurança de cada reagente antes de iniciar o protocolo.

  1. Para electrospin uma solução de polímero 3 mL 15% w/w PLGA, pesa 720 mg de 50: 50 poli (ácido lático-co-glicólico) (PLGA; 0,55 a 0,75 dL/g, 31-57 kDa) em um frasco de 10ml cintilação. O volume da solução baseia-se o tamanho do lote típico usado em estudos atuais.
    Nota: A massa de polímero para adicionar a um determinado volume de solvente deve ser calculada pelo primeiro determinar a densidade do solvente utilizado para dissolver o polímero. A densidade do solvente Hexafluoro-2-propanol (HFIP) é 1,59 g/mL. Assim, o peso do solvente, baseado em um volume de 3,0 mL HFIP precisava, é de 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). Por uma fração de 15% w/w de PLGA para HFIP, 720 mg PLGA deve ser adicionado à 3,0 mL HFIP (0,15 x 4.800 mg = 720 mg). A vantagem de usar um % w/w polímero/solução, em vez de % p/v, é que isso dá um peso definido da solução final. Este peso definido permite substituição de solvente mais exata, no caso de evaporação de solvente durante a etapa 1.3.
  2. , Adicionar 3,0 mL HFIP o frasco de cintilação de vidro contendo PLGA (da etapa 1.1) utilizando uma pipeta de vidro serológicos. Cubra o frasco com filme plástico, em seguida, medir e gravar o frasco Mass.
  3. Incube a suspensão de polímero durante a noite a 37 ° C, para garantir a completa dissolução do polímero. Se qualquer solvente evapora, diminuindo a massa do frasco, adicione HFIP até o frasco atinge sua massa original na etapa 1.2.
  4. Após a incubação, preparar o aparelho eletrofiação ( Figura 2). Embora um mandril de qualquer tamanho pode ser usado, aqui, um mandril de aço inoxidável de diâmetro externo de 25 mm rotativa foi usado como o coletor de.
    Nota: Um maior diâmetro do mandril irá diminuir a espessura da fibra, dada o mesmo volume de solução de eletrofiação.
  5. Aspirar a solução de polímero em uma seringa de 3 mL.
  6. Conecte uma ponta de agulha romba 18-gauge, ½ polegada na seringa e dispense o excesso de solução (normalmente de 0,25 mL) para remover o headspace vazio na ponta da agulha.
  7. Coloque a seringa numa bomba e definir a taxa de fluxo do instrumento a 2,0 mL/h.
    Nota: Esta taxa de fluxo foi baseado na viscosidade do polímero para esta formulação previamente otimizada.
  8. Ligar a fonte de alimentação para a agulha da seringa e electrospin a solução de polímero usando uma tensão de + 27 kV. A distância entre a agulha e o coletor deve ser definida como aproximadamente 25 cm ( Figura 2 B).
    Atenção: O processo de eletrofiação cria um vapor de solvente. Usar uma coifa ou um aparelho fechado ( Figura 2) para remover os vapores nocivos .
  9. Uma vez que toda a solução é electrospun, desligue a fonte de energia e permitir que o mandril de girar por um adicional 30 min totalmente evaporar o solvente.
  10. Vez fora o coletor de mandril rotativo e use uma lâmina de barbear para cortar a fibra do mandril. Use a lâmina para descascar suavemente a fibra de mandril.
  11. Coletar a fibra PLGA electrospun em um prato de Petri etiquetados e coloque em um desiccatorovernight para remover o solvente residual.

2. Modificação de superfície das fibras com GRFT

  1. preparar soluções de tampão fosfato salino (PBS) e 2-(N-Morpholinos) etanesulfónico ácido (tampão de MES). Prepare o PBS dissolvendo-se 8 g NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 e 0,24 g KH 2 PO 4 em 1 L de água ultrapura. Da mesma forma, dissolver 19,52 g MES (ácido livre, 195.2 MW) e 29,22 g de NaCl em 1 L de água ultrapura, para preparar o tampão MES. Garantir que o pH final de cada solução é entre 7,2-7,5 e 5.0-6.0, respectivamente, usando um medidor de pH.
  2. Preparar soluções de trabalho individuais de EDC (2 mM) e NHS (5 mM).
    1. Remover a EDC e NHS do congelador e permitir-lhes equilibrar a temperatura ambiente antes da pesagem.
    2. Pesar 4 mg de EDC em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
    3. Pesa 6 mg de NHS em outro tubo de microcentrifugadora.
    4. Adicionar 1 mL MES buffer para cada tubo. Vórtice de ambos os tubos vigorosamente para garantir os reagentes são totalmente dissolvidos.
  3. Preparar uma solução de hidroxilamina pesando 70 mg em um tubo de centrifuga conico de 50 mL.
  4. Adicionar 20 mL de PBS para a hidroxilamina e vortex a dissolver-se.
  5. Massa para fora uma quantidade adequada de fibra PLGA em um tubo de centrifuga conico de 15 mL. Normalmente, 75 mg de fibra é utilizado para cada lote de reação.
  6. Adicionar 8 mL de tampão MES para o tubo de 15 mL.
    7. Adicionar 1 mL cada uma das soluções de EDC e NHS preparado anteriormente para o tubo de
  7. . O volume final da solução deve ser de 10 mL. As concentrações finais de EDC e NHS devem ser 0,4 mg/mL e 0,6 mg/mL, respectivamente.
  8. Fechar e selar o tubo de 15ml com filme plástico e coloque em um rotador para permitir que a solução para inverter suavemente durante 15 minutos à temperatura ambiente ( Figura 3 B). Esta etapa ativa os grupos carboxila em polímero para permitir a modificação de ligações covalente com a proteína GRFT ( Figura 3).
  9. Após a ativação, cuidadosamente saciar a reação adicionando 14 µ l de β-Mercaptoetanol ao tubo. Inverter o tubo várias vezes para assegurar uma mistura completa.
    Cuidado: β-Mercaptoetanol é altamente tóxico e só deve ser usado em uma coifa química.
  10. Desprezar o sobrenadante e lavar a fibra PLGA duas vezes, com 10 mL de PBS, para remover qualquer restante β-Mercaptoetanol.
  11. Após o enxágue, adicionar uma quantidade adequada de solução-mãe GRFT no tubo. Por exemplo, um 5 nmol fibra GRFT/mg exigiria 6,35 µ l de solução-mãe GRFT (a partir de um estoque de 10 mg/mL) por mg de fibra. Assim, uma amostra de fibra 75mg exigiria 476.25 µ l de 10 mg/mL de solução GRFT.
    Nota: As fibras GRFT com cargas teóricas de 0,05 e 0,5 nmol 5 GRFT por fibra mg foram fabricadas.
  12. Adicionar suficiente PBS para trazer o volume final de 8ml, fechar e inverter o tubo para assegurar uma mistura completa.
  13. Fechar o tubo com filme plástico e coloque sobre um rotor novo, este tempo de 2 h.
  14. Após o 2 h incubação, saciar a reação adicionando 2 mL de solução de hidroxilamina no tubo de centrífuga de 15 mL. As instruções do fabricante, a concentração final de hidroxilamina durante a reação de têmpera deve ser 0,7 mg/mL.
  15. Misturar a solução bem e descartar o sobrenadante. Enxaguar a superfície modificada fibra PLGA duas vezes com 10 mL de água ultrapura para remover qualquer unconjugated GRFT.
  16. Transferir a fibra para um prato de Petri e lugar dentro num exsicador até a fibra está completamente seca. Transferir a placa de Petri a 4 ° C, para armazenamento.

3. SEM fibras de caracterização da superfície GRFT-modificado

  1. lugar uma tira de fita dupla-face de carbono em um SEM montagem de amostra. Rotular o fundo da montagem da amostra com as informações de identificação de amostra usando um marcador permanente.
  2. Cortar três amostras de uma fibra de superfície modificada e colocá-los em montagens de amostra separada. A espessura de cada amostra é de aproximadamente 0,5 mm.
  3. Sputter revestir as amostras usando a deposição de partículas induzida por elétrons de uma placa de ouro. Salpicar o casaco para 90 s, a 2.4 kV.
    Nota: O tempo de revestimento por pulverização catódica pode variar dependendo dos parâmetros do equipamento, incluindo a voltagem e amperagem.
  4. As amostras de imagem em 8 kV com uma ampliação variando de 1.000 a 5, 000 x.

4. Extração de GRFT de superfície modificada de fibras

  1. em massa para fora de 2 mg de fibra em triplicado para tubos de 1,5 mL microcentrifuge.
  2. Adicionar Dimetilsulfóxido 1ml (DMSO) para o tubo, então o vórtex e incubar durante 1 minuto na temperatura para dissolver completamente a fibra.
  3. Após a incubação, diluir uma alíquota de 10 µ l de a solução de DMSO-fibra da etapa 4.2, pelo menos 100 vezes em tampão Tris-EDTA (TE) (pH = 8,0).
  4. Armazenar amostras a-20 º C até carregar caracterização com ELISA.

5. Medição GRFT dessorção de fibras

  1. para avaliar a quantidade de GRFT lançado ou em estudo dessorvida da fibra, pesa 5-10 mg de fibra de superfície modificada e coloque em um tubo de microcentrifugadora. Gravar a massa de fibra em cada tubo.
  2. Adicionar 1 mL de uma solução adequada que imita o ambiente fisiológico (por exemplo, PBS, tampão de TE, fluido vaginal simulado (SVF), etc.) para cada amostra.
  3. Incubar as amostras por 1h num agitador rotativo a 200 rpm, 37 ° C.
  4. Após a incubação, remove aproximadamente 1 mL de tampão TE contendo o GRFT dessorvida do frasco e a alíquota para cluster de tubos. Loja a-20 ° C até quantificação da proteína.
  5. Transferir a amostra para um tubo de microcentrifugadora novo, adicionar 1 mL de solução tampão fresco para a fibra no interior do tubo de microcentrifugadora e incubar até o próximo ponto de tempo.
  6. Pontos de tempo típico utilizados para medir a liberação incluem: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h e 1 semana insignificante dessorção foi observada nestes estudos após 4 h.

6. Quantificação de extração GRFT e dessorção através de ELISA

placa
  1. casaco um ELISA 96 poços com 0,1 mL de HA (10 µ g/mL) por bem como descrito anteriormente 51. A placa com a película plástica do selo e incubar durante uma noite a 4 ° C ( Figura 4).
  2. Remover o buffer de revestimento e adicionar 0,3 mL bloqueio de buffer (2-3% albumina de soro bovino (BSA) em PBS com 0,05% polissorbato 20) para cada poço. Incubar a placa pelo menos 2 h à temperatura ambiente.
  3. Após a incubação, lavar a placa 3 vezes com PBS 1x com 0,1% polissorbato 20 (PBS-P). Após o enxágue, dispense 0,1 mL de amostra, padrão ou PBS como controlo negativo nos respectivos poços. Incubar a placa novamente por 1h à temperatura ambiente.
  4. Lavar a placa 3 vezes com PBS-P. Após o enxágue, adicionar 0,1 mL de anticorpo primário (soro de cabra anti-GRFT) em cada poço e incubar durante pelo menos 1 h à temperatura ambiente. Normalmente, a solução de anticorpo primário é diluída pela 1:10,000 em PBS.
  5. Após a incubação das amostras com enxágue do anticorpo primário as placas novamente 3 vezes com PBS-P. Adicionar 0,1 mL de anticorpo secundário (peroxidase de rábano (HRP)-anti-cabra de coelho Conjugado IgG) para cada um bem e incubar por 1h à temperatura ambiente. A solução de anticorpo secundário é diluída pela 1:10,000 em PBS.
  6. Lavar a placa 3 vezes. Adicione o substrato de peroxidase-2 0,1 mL TMB a cada poço. Monitorar o desenvolvimento de cor (aproximadamente 2 min) e, em seguida, adicionar 0,1 mL H 2 então 4 (1 N) para saciar a reação. Leia a placa a 450 nm em um leitor de placa.
  7. Média os valores de OD de fundo (poços que receberiam apenas PBS) e isto subtrair os grupos experimentais.

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Representative Results

Morfologia das fibras tem um efeito significativo sobre a capacidade da superfície-modificado EFs para fornecer proteção contra vírus. Embora eletrofiação é um procedimento simples e conveniente, formulações de polímero não-otimizados podem resultar na morfologia da fibra irregular (Figura 5B-C). Alterações em eletrofiação condições que resultam na formação de frisado ou amorfas morfologias semelhantes a esteira, muitas vezes são causados por incompatibilidade de solvente-polímero, viscosidade do polímero baixa, taxa de fluxo ou outras condições eletrofiação. As variações resultantes na estrutura da fibra podem resultar em lançamento de diferentes perfis para drogas-incorporadas fibras ou inconsistências na eficácia de conjugação, alterando a capacidade de fibras fisicamente ou quimicamente impedir a penetração do vírus. O EFs de PLGA fabricado usando as condições descritas eletrofiação deve resultar em morfologias distintas da fibra, com diâmetros variando entre 1,5 e 2,8 µm (Figura 6). Para determinar o diâmetro e a morfologia das fibras, EFs devem ser examinados com SEM antes outras etapas de caracterização ou modificação.

SEM imagens de em branco, 0.05, 0.5 e 5 fibras GRFT nmol não mostraram nenhuma diferença significativa na morfologia da fibra (Figura 6A-D), indicando que a modificação GRFT não tem efeito na morfologia das fibras. Para determinar o diâmetro médio de cada formulação de EF, um mínimo de 50 medições aleatórias foram tiradas por campo de visão a partir das imagens de SEM. Os diâmetros médios das formulações EF foram medidos e calculados em ImageJ, como mostrado na Figura 6E. Todas as formulações de EF tinham semelhantes diâmetros médios em torno de 1,9 µm, demonstrar a consistência do processo de fabricação de fibra não modificado através de lotes.

Para determinar que a quantidade de GRFT conjugada com o EFs, GRFT-EFs foram dissolvidos em DMSO, seguido por uma diluição 100 vezes em tampão TE, extrair GRFT da fibra. A quantidade de GRFT conjugado por mg de fibra foi quantificada utilizando ELISA. Para cada densidade de modificação (0.05, 0.5 e 5 nmol GRFT por fibra mg), foram avaliadas dez repetições. Para o 5, 0,5 e 0,05 nmol GRFT/mg EF modificações, cada EF tinha 373, 165 e 42 ng GRFT por mg de EF, resultando em eficiência de conjugação de 0,6, 4.2 e 6,9%, respectivamente. Estes resultados demonstram que a GRFT-EFs conjugados com maior densidade de modificação de superfície teórica, resultado em mais GRFT conjugada com a fibra (Figura 7A). No entanto, houve uma correlação inversa com a resultante de eficiência de conjugação29.

Para avaliar a quantidade de GRFT conjugado covalentemente à superfície da fibra em relação ao que adsorvido, GRFT-EFs foram incubadas em SVF para determinar a quantidade de GRFT lançado. Dentro das primeira 4h, 113, 25 e 10 ng de GRFT por mg EF foi detectado em SVF para o 5, 0,5 e 0,05 nmol concentrações de modificação teórica, respectivamente. Esses valores correspondem a 30%, 41% e 24% do montante da GRFT conjugada com 5, 0,5 e 0,05 nmol GRFT-EFs. Após 4 h, GRFT insignificante foi detectado no eluato de lançamento para todas as três formulações. Lançamento GRFT após 1, 2 e 4 h é mostrado na Figura 7B. Tomados em conjunto, estes dados indicam que a maioria dos GRFT é covalently ao EFs, e que a superfície-adsorvido GRFT é liberado dentro as primeiras 4 horas.

Figure 1
Figura 1: A morfologia de macroescala de fibras electrospun. As fibras de electrospun mostradas foram fabricadas usando um 4 mm (cilindro) e mandril de diâmetro de 25 mm (folha), respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: aparelho eletrofiação. (A) a coleta de um mandril onde depositam os jatos de líquido do polímero e (B), a configuração completa eletrofiação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: modificação esquemática da EF com GRFT usando química EDC-NHS. (A) Carboxyl grupos na reagir de PLGA EF com NHS na presença de EDC para ésteres amina reativos de formulário, que posteriormente formarão ligações Amida estável com as aminas primárias de GRFT. (B) miligrama de dois discos de fibra ou peças são cortadas e incubadas em 8 mL de tampão MES com 2 mL de reagente EDC/NHS e giradas durante 15 min. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: esquemático ilustrando a quantificação GRFT usando ELISA. Um immunoplate de 96 poços é revestido com gp120 ou HA para capturar e imobilizar GRFT. Anticorpos primários contra GRFT, anticorpos secundários ligados a peroxidase de rábano e substrato de ELISA são adicionados sequencialmente para quantificar GRFT. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: efeitos da escolha do solvente na morfologia de PLGA EF. (A) a 15% w/w PLGA EFs em desejável HFIP exibido como fio morfologia. (B) o 15% w/w PLGA EFs em clorofórmio e dimetilformamida, falha ao formulário devido à escolha de solvente não ideal ou concentração de polímero (viscosidade). (C) o 15% w/w e (D) 20% w/w PLGA EFs em TFE demonstram a importância da viscosidade do polímero. Grânulos formaram na formulação com menor concentração de polímero (C), enquanto aumentando a concentração de polímero (viscosidade do solvente) resultou na morfologia de fibra bem definidos (D). Observe, Figura 5B foi levado em uma baixa ampliação para visualizar a morfologia da esteira, como. Barras de escala = 10 µm.

Figure 6
Figura 6: SEM imagens e diâmetros de fibra de EFs desencapados e modificado GRFT. (A) Bare PLGA EFs e EFs PLGA nmol superfície modificada com (B), 0.05, (C) 0,5 nmol e (D) 5 nmol de GRFT por mg de fibra. Barras de escala = 10 µm. (E) diâmetros de não modificado e GRFT-EFs. Barras de erro representam a média ± SEM. Nenhuma diferença estatística foi observada entre os diâmetros de fibras não modificados e GRFT-modificado. Figura 6 E tem sido adaptado de noivos et al 29 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7 : Quantidade de GRFT conjugada com e em estudo dessorvida do GRFT-modificado EF. (A) a quantidade de GRFT conjugados para cada mg de EF fibra aumenta com maior concentração de reagente GRFT. (B) a quantidade de GRFT liberado de cada mg de fibra é mostrada para a 0.05, 0.5 e 5 nmol formulações após incubação de 1, 2 e 4 h em SVF. Barras de erro representam a média ± SEM. Esta figura foi adaptada da et al . os noivos 29 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Devido a suas estruturas porosas e grandes áreas de superfície, EFs têm encontrado uma variedade de aplicações na área da saúde, um dos quais inclui servir como veículos de entrega terapêutica. Drogas e outros agentes ativos podem ser incorporados dentro de EFs para entrega sintonizável, enquanto produtos biológicos e químicos ligantes podem ser conjugadas com a superfície da fibra para célula específica alvo52 ou biosensing53. Aqui a fabricação de GRFT superfície modificado PLGA EFs, como um andaime de entrega para prevenir a infecção de HIV, é descrito. GRFT-EFs foram sintetizados por eletrofiação, proporcionando as vantagens da taxa de produção de baixo custo e alta em relação a outros de49,de métodos de produção da fibra53.

Passos críticos no protocolo
A formação das EFs é criticamente dependente as propriedades da solução de polímero, em particular a solução ou solvente viscosidade54. Os fatores que afetam a viscosidade de uma solução de polímero incluem o peso molecular de polímero, concentração do polímero e o tipo de solvente usado. A viscosidade do solvente ou solução normalmente é ajustada, alterando a relação de polímero para solvente, para obter a concentração desejada de polímero. Com cada fabricação, o volume deve ser mantido durante a incubação durante a noite para manter a relação apropriada do polímero-para-solvente (viscosidade). Concentração de polímero suficientemente alta, as moléculas de polímero emaranhar na solução durante o processo de eletrofiação para produzir fibras. Durante o processo de eletrofiação, um grânulo irá formar a ponta da fieira e se houver suficiente emaranhamento de polímero, jatos de líquido irão entrar em erupção deste ponto a uma tensão crítica e acelerar em forma de chicote, como para a coleta de mandril55. Evaporação de solvente então levará para desbaste, produzindo fios de fibra como eles depositam sobre o mandril de coletando do jato. Uma vez sintetizado, EFs devem ser analisadas por SEM verificar a morfologia adequada e diâmetro da fibra consistente. A presença de frisado EFs pode ser o resultado da solução de baixa viscosidade56, excessivamente alta tensão aplicada57, polímero alimenta taxa58, ou uma combinação de todos os três fatores. Se isto for observado, concentração de polímero deve ser aumentada e a tensão aplicada e a taxa de alimentação devem ser ajustados, para atingir a morfologia de fibra-like.

Para conjugar as proteínas à superfície EF, aqui grupos carboxila PLGA foram reagiu usando EDC-NHS carbodiimida reticulação química59. Durante o processo de modificação, fibras brevemente são incubadas com EDC na presença do NHS, que resulta na conversão de carboxilatos em ésteres semi-estável, Amina reage. Durante o processo de conjugação de duas etapas, é fundamental que os buffers usados durante cada etapa tem o pH ideal, observou-se nas instruções do fabricante, para assegurar a eficiência máxima de conjugação. A meia-vida de ésteres de NHS varia de quatro a cinco horas a pH neutro e diminui drasticamente em mais básicas condições de60. Assim, a primeira reação deve ser realizada no buffer MES em pH 5-6 e as fibras ativadas em seguida devem ser transferidas para um tampão PBS (pH 7,2-7,5) para subsequente e imediata reação com GRFT. Também é importante que o EDC é inativado pela adição de 2-Mercaptoetanol e suficientemente enxaguado das fibras após ativação carboxilato. Isto ajudará a impedir a ativação da proteína por EDC e autoreticulação durante a segunda reação, que pode reduzir a eficiência de conjugação.

Modificações e solução de problemas
Embora nosso trabalho anterior demonstrou a eficácia de uma variedade de fibras GRFT-modificado contra a infecção por HIV-1, certas alterações do processo podem ser consideradas para personalizar a morfologia do EF ou para melhorar GRFT (ou outras proteínas) eficiência de conjugação ou fibra rendimento de29. Em particular, a área de superfície de EF pode ser aumentada, diminuindo o diâmetro da fibra, para permitir uma maior área de superfície para conjugação. Estudos anteriores têm mostrado que a redução da viscosidade e concentração de polímero produz fibra menor diâmetro61,62. No entanto, essa abordagem é limitada pela formação de fibras frisadas quando a concentração é inferior ao valor de limiar. Para diminuir o diâmetro da fibra sem alterar a viscosidade da solução, sistemas dual-solvente podem ser utilizados para reduzir a tensão de superfície, ou sais podem ser adicionados para aumentar a condutividade de solução56,57. Ambos os métodos permitirá maior alongamento dos jatos eletrofiação que podem produzir diâmetros menores de fibra. Além disso, polímeros de peso molecular inferiores podem ser usados para fabricar fibras de diâmetro menores. Decrescente de diâmetro da fibra também oferece a vantagem adicional de gerar pequenos poros, tornando potencialmente EFs mais eficaz como uma barreira à penetração do vírus, para aplicativos baseados em microbicida63. Finalmente, observou-se que a umidade pode afetar rendimento EF. A umidade mais elevada, o rendimento tende a diminuir devido a formação de fibras com morfologia macro incomum. Instalando um sistema de controle de umidade dentro da câmara de eletrofiação poderia, portanto, facilitar a produzir EFs com rendimentos consistentes, se isto representa um desafio para a fabricação.

Para melhorar a eficiência de conjugação GRFT, investigando a seleção e localização dos grupos functionalizable pode também ser considerado. Por exemplo, se as aminas primárias da proteína de interesse estão localizadas perto do interior da estrutura tridimensional da proteína, estérico pode impedir que grupos carboxila registrados na EFs interagindo com aminas primárias, diminuindo assim o probabilidade da reação. Este desafio pode ser superado pela substituição de aminoácidos da proteína para gerar um grupo amina primária mais próximos à superfície da proteína. No entanto, como GRFT e outras proteínas dependem da atividade específica de seus sítios de ligação para a funcionalidade, alterações na conformação da proteína devem ser exaustivamente testadas em ensaios funcionais antes da conjugação.

Limitações
Uma grande limitação de modificação da superfície GRFT é o potencial de eficiência baixa conjugação usando carbodiimida reticulação química. Se a proteína antiviral de interesse tem uma alta IC50, uma eficiência baixa conjugação não pode fornecer protecção suficiente (esses aplicativos) contra a infecção pelo vírus. No entanto, para GRFT (ou outro modificado) EFs, proteínas e agentes ativos que não estão covalentemente ligados aEFs ainda podem adsorver na superfície. Esses agentes adsorvidos oferecem o potencial para complementar a atividade de GRFT conjugado, aumentando transitoriamente a concentração localizada disponível para vinculação de vírus. Neste exemplo, GRFT dessorvida pode vincular a virions HIV-1 que não contate diretamente o EFs e podem fornecer um mecanismo alternativo de proteção com as primeiras 4 horas de administração (pericoital). Assim, GRFT conjugado e superfície-adsorvido pode contribuir para fornecer uniforme proteção contra DSTs.

Apesar da proteção conferida da conjugação de proteínas e dessorção, outras estratégias de modificação de superfície com eficiência potencialmente mais elevada podem ser perseguidas. Por exemplo, PLGA finalizado com aminas em vez de grupos carboxila poderia ser usado para conjugar GRFT ativado. Alternativamente, uma estratégia diferente de modificação de superfície pode ser utilizada para melhorar a eficiência de conjugação de EF-proteína. Nanofibrous membranas compostas de EFs têm sido acrescidas com avidin através de carbodiimida reticulação química64. Biotinylation ou adição de um Strep-tag (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys), através de recombinação pode ativar a proteína modificada de forma forte e extremamente estável não-covalente interação com avidin EFs. Enquanto não-covalente, o enlace de avidina-biotina é o mais forte não-covalente com afinidade de femtomolar, provavelmente resultando em conjugação estável na superfície da fibra. Para as estratégias de modificação de superfície, estérico deve ser considerado para maximizar a eficiência de conjugação.

Por último, vislumbramos que a superfície modificada EFs irão oferecer uma estratégia alternativa para encapsulamento de agente ativo para fornecer modos complementares de proteção. Uma consideração com combinando tecnologias de encapsulamento e modificação de superfície em uma única plataforma EF irá reduzir o lançamento prematuro de agentes ativos durante o processo de modificação de superfície. Para reações de modificação de superfície que exigem relativamente longo tempo de incubação em solução aquosa, uma percentagem significativa dos agentes ativos carregado pode ser perdida devido à hidrólise do polímero.

Importância do método em relação a métodos existentes e alternativos
Em trabalho anterior, observamos que o EFs em branco sem modificações foram capazes de inibir a infecção pelo HIV por ~ 38%, quando colocado em uma inserção transwell acima de células infectible29. Esta observação, combinada com a biocompatibilidade, web-como microestrutura e tortuosidade do EFs, em paralelo com os observado potentes propriedades antivirais e adesivos de GRFT, será solicitado o desenvolvimento do EFs superfície-modificado descrito aqui.

Relativo a outras tecnologias de entrega atualmente empregadas em aplicações de microbicida, EFs têm uma ampla gama de aplicações potenciais, devido à sua arquitetura e a capacidade de personalização. Em outros trabalhos, a morfologia fibrosa do EFs lhes permitiu entregar agentes ativos e para imitar o ECM, tornando-os andaimes adequados para a engenharia de tecidos. EFs também tem sido modificado de superfície para melhorar a biocompatibilidade e aumentar a liberação sustentada65,,66.

Para realçar a biocompatibilidade ou entregar agentes que funcionam através da atividade de ligação específica, que existem numerosos métodos permitem a fixação de compostos para as superfícies de EFs como tratamentos de plasma, métodos químicos molhados e enxerto de superfície polimerizações50. No caso de GRFT que se ligam especificamente para a glicoproteína viral do HIV-1, o método químico molhado de EDC-NHS é o mais ideal devido a capacidade de penetrar profundamente dentro da malha de fibras preservando também GRFT funcionalidade50. GRFT imobilizada para EFs podem ser entregues em uma formulação durável para o FRT e fornecer proteção imediata contra infecção por HIV.

Em comparação com a estratégia existente de encapsular terapêutica dentro EFs para inibir a DSTs, conjugação covalente oferece a vantagem de aumentar o potencial avidez entre virions GRFT e HIV. Por imobilizando GRFT para EFs através da modificação de superfície, concentrações altamente localizadas de GRFT podem ser alcançadas, o que aumenta a oportunidade para multivalentes vinculação com HIV. Além disso, GRFT EF-imobilizado, em relação a GRFT livre em solução, pode evitar o esgotamento da piscina GRFT por dificultar a internalização de célula. Além disso, devido ao exclusivo mecanismo de ação de GRFT como um inibidor de entrada estável e adesivo, conjugação covalente de superfície permite que a EFs superfície modificada fornecer uma barreira física à penetração de vírus, além de propriedades antivirais potentes.

Futuras aplicações deste método
A utilização de modificação de superfície para entrega apresenta a oportunidade de integrar múltiplos agentes ativos dentro de uma única plataforma EF. No futuro, buscamos desenvolver uma tecnologia multiuso (MPT) onde uma variedade de agentes ativos pode ser encapsulada em e conjugada com EFs. Estes MPTs podem ser criados para conferir proteção contra uma ampla gama de patógenos, incorporando a terapêutica com diferentes mecanismos de ação. Utilizando a superfície e o interior do EFs para entregar agentes ativos com diferentes mecanismos de ação, o potencial de EFs para proteger contra a infecção pelo vírus será ser maximizado.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Estamos gratos ao fundo de herança judaica por excelência para o financiamento desta pesquisa. Agradecemos o Dr. Stuart Williams II para generosamente proporcionando o uso do sistema eletrofiação. Agradecemos também o Dr. Kenneth Palmer para nos fornecer com Griffithsin. Além disso, nós agradecemos Dr. Nobuyuki Matoba e seu laboratório para treinamento que na GRFT ELISA trabalhar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

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