Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור ואפיון של סיבים Griffithsin-השתנה פיגומים לצורך מניעת מחלות המועברות

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

כתב יד זה מתאר את ההליך כדי להמציא לאפיין את סיבי electrospun פולי Griffithsin-לאחרונה (חומצה לקטית-co-גליקולית) הממחישים דבק חזק ופעילות אנטי נגד זיהום מסוג 1 וירוס הכשל החיסוני האנושי במבחנה. שיטות השתמשו כדי לסנתז, שינוי פני השטח, לאפיין את המורפולוגיה וכתוצאה מכך, נטיה, ואת desorption של Griffithsin מסיבי השטח-השתנה מתוארים.

Abstract

Electrospun סיבים (EFs) היה בשימוש נרחב במגוון יישומים טיפוליים; עם זאת, הם רק לאחרונה הוחלו כמו טכנולוגיה כדי למנוע ולטפל מינית המועברות במגע מיני (STIs). יתר על כן, טכנולוגיות רבות EF מתמקדים לבצע את הסוכן הפעיל, יחסי ניצול השטח כדי להקנות את biofunctionality. כאן נתאר שיטת לפברק ושינוי פני השטח-poly(lactic-co-glycolic) חומצה (PLGA) electrospun סיבים, עם לקטין אנטי-ויראלי חזק Griffithsin (GRFT). PLGA הוא פולימריים שאושרו על-ידי ה-FDA כי כבר בשימוש נרחב במשלוח סמים בשל תכונותיו כימית, ביולוגית יוצאת מן הכלל. GRFT הוא טבעי, חזק, בטוח לקטין שמחזיק פעילות רחבה נגד וירוסים רבים כולל סוג וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1) 1. בשילוב, סיבי GRFT-לאחרונה הראו איון חזק של HIV-1 במבחנה. כתב יד זה מתאר את השיטות כדי להמציא לאפיין GRFT-השתנה EFs. ראשית, PLGA הוא electrospun ליצירת לפיגום סיבים. סיבי הם משטח שונה לאחר מכן עם GRFT באמצעות 1-אתיל - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) וכימיה N-hydroxysuccinimide (NHS). סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) נעשה שימוש כדי להעריך את גודל ואת המורפולוגיה של השטח-השתנה ניסוחים. בנוסף, gp120, או hemagglutinin (HA)-אליסה מבוסס עשוי לשמש כדי לכמת את כמות GRFT מצומדת כדי, וכן GRFT desorption מפני השטח סיבים. פרוטוקול זה ניתן להחיל באופן נרחב יותר כדי לבדות בסיבים השטח-השתנה עם מגוון רחב של חלבונים שונים.

Introduction

השימוש ב- EFs כפלטפורמה משלוח אקטואלי יש הפוטנציאל לצמצום משמעותי STIs. כיום ישנם מעל ל-36 מיליון אנשים החיים עם HIV, עם יותר מ-2 מיליון מקרים חדשים של שדווחו ב 2015 לבד1,2. בנוסף, נגיף הרפס סימפלקס סוג 2 משפיע זיהום (HSV-2) מאות מיליוני אנשים ברחבי העולם, הוכח כדי לשפר את רכישת HIV על ידי 2-5 קיפול3. עקב היחס בין זיהום HSV-2 ורכישה HIV, יש עניין משמעותי בפיתוח סוכנים פעילים חדשים המספקים הגנה בו זמנית נגד STIs מרובים. יתר על כן, הפיתוח של כלי רכב חדשים כדי לשפר את המסירה של סוכנים אנטי ויראליים מציע את היכולת לשפר עוד יותר את עצמת המגן וטיפוליים. לקראת מטרה זו, נחקרו EFs כפלטפורמה משלוח חדש כדי להפחית את שכיחות דלקות HIV-1 ו- HSV-2.

במהלך שני העשורים האחרונים, EFs היו בשימוש נרחב בתחומים של הנדסת רקמות4והספקת סמים. לעתים קרובות, פולימרים מסתיימים נבחרים לתרגם בקלות ליישומים טיפוליים. כדי לבדות EFs פולימריים, הפולימר שנבחר הוא מומס אורגני ממס או מימית פתרון, ובהתאם למידת פולימר hydrophobicity5. סוכנים פעילים עניין ואז יתווספו הפתרון ממס או מימית לפני תהליך electrospinning. הפתרון פולימר aspirated ואז לתוך מזרק, נפלט לאט בזמן נתון זרם חשמלי. תהליך זה גורמת סיבי פולימר בגיליון ' או ' גלילי macrostructures (איור 1), קטרים סיבים הנעים בין מיקרו - כדי בקנה מידה ננו6. ליישומים טיפוליים ביותר, סוכנים פעילים משולבים בתוך הסיבים במהלך תהליך electrospinning, משתחררים מן הסיבים באמצעות דיפוזיה והשפלה סיבים עוקבות. הקצב של השפלה או שחרור עשויה להשתנות באמצעות סוגים שונים של פולימרים או פולימר תערובות להקים פרופיל לשחרר הרצוי, להקניית מאפיינים כימיים ייחודיים7, וקידום של העטיפה של כמעט כל מתחם. ככזה, EFs הוכיחו מועיל לפתחו של מולקולה קטנה וסמים ביולוגיים כולל חלבונים, פפטידים, oligonucleotides של גורמי גדילה6,8,9.

בתחום של מניעת STI, EFs לאחרונה השתמשו כדי לשלב ולספק מתמשכת או inducible-שחרור של סוכנים אנטי ויראליים10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. באחד המחקרים המוקדמים, pH מגיבים סיבי פותחו כדי לשחרר סוכנים פעילים בתגובה לשינויים סביבתיים בתוך באיברי הרבייה הנקביים (והשפלתם), כמו שיטת לפי דרישה של הגנה נגד HIV-111. מאז, מחקרים אחרים יש חקר תערובות פולימר המורכב תחמוצת פוליאתילן (פאו) ו חומצה פולי-L-חומצת חלב (PLLA), כדי להעריך את המהדורה tunable של סוכנים אנטי-ויראלי ואנטי למניעת הריון עבור HIV-1 ומניעת אמצעי מניעה חוץ גופית בתוך 12. מחקרים נוספים הראו את הכדאיות של EFs כדי לספק את הנתונים הבאים: ממושך שחרורו של מולקולה קטנה antivirals14, חזקה וארכיטקטורות תכונות מכניות גמיש20, משלוח תלת-ממדי21 , עיכוב של זרע חדירה12, ואת היכולת למזג עם טכנולוגיות אחרות משלוח13. לבסוף, העבודות הקודמות יש הערכה סיבים פולימריים למסירה מתמשכת-של סוכנים אנטי נגד וירוסים co-infective נפוצים, HSV-2 ו- HIV-114. במחקר זה, סיבי פולימר מסופקים פעילות משלימה משלוח אנטי ויראליים על ידי שמירה על המבנה שלהם עד כחודש, מתן מכשול פיסי לערך ויראלי. מתוצאות אלה, זה היה ציין כי EFs עשוי לשמש הן מבחינה פיזית והן מבחינה כימית לעכב בנגיף.

בזמן שחרור tunable מאפיינים להפוך EFs פולימריים פלטפורמה מושכת משלוח למשלוח microbicide, EFs פותחו ביישומים אחרים כדי לשמש פיגומים השטח-לאחרונה7. EFs שימשו כדי לחקות את המורפולוגיה של מטריצות (ECM), לעיתים קרובות כסוכנות פיגומים כדי לשפר את התחדשות תאית22, ולשפר את השירות שלהם ב23,הנדסת רקמות,24. סיבים של פולימרים כגון פולי-חדוה-caprolactone (PCL) PLLA היה השטח-השתנה עם גורמי גדילה וחלבונים לאחר electrospinning להקנות תכונות כמו ECM כולל מוגברת הסלולר אדהזיה והתפשטות25 , 26. בנוסף, הוערכו מיקרוביאלית השטח-השתנה ב- EFs כדי למנוע את התפתחותם של חיידקים פתוגניים מסוימים27,28. בשל רבגוניות זו ואת היכולת לגרום השפעות ביולוגיות, EF הטכנולוגיה ממשיכה להרחיב על פני מגוון רחב של שדות כדי לספק פונקציונליות מרובת מכניסטית. ובכל זאת, למרות השירות שלהם בתוך מגוון של יישומים, סיבי השטח-השתנה רק לאחרונה נחקרו על שדה microbicide29

במקביל עם התפתחות טכנולוגיות חדשות מסירה כדי למנוע ולטפל STIs, פותחו הריפוי ביולוגי. אחד מהמועמדים microbicide המבטיחים ביותר הוא דבק לקטין אנטי ויראליים, GRFT30. במקור נגזר מין אדומיות, GRFT הוכיח פעילות כמו מעכב חזק של HIV, HSV-2, הסארס, כמו גם הפטיטיס C וירוס31,32,33,34, 35 , 36. למעשה, בין מעכבי מבוסס מבחינה ביולוגית, GRFT יש את הפעילות נגד HIV הקטלניים ביותר, inactivating HIV-1 כמעט מיד על קשר30, תוך שמירה על יציבות ופעילות בנוכחות תרבות המדיה מן הנרתיק מיקרובים עבור עד 10 ימים37. לאחרונה, GRFT 0.1% ג'ל הוצגה להגן על עכברים נגד אתגר HSV-2 intravaginal, שהופך אותו מועמד מבטיח השורה הראשונה של הגנה מפני HSV-2 ו- HIV-132, 38. עבור HIV באופן ספציפי, GRFT מעכב זיהום על ידי איגוד פיזית gp120 או מסוף מנוז מקושרים-N glycan משקעים על מעטפת נגיפית משטחים למניעת כניסה38,39,40,41 ,42. עיכוב זה הוא חזק מאוד, עם s50IC מתקרב ng/mL 343. בנוסף מעכב הידבקות ב- HIV, מחקרים הראו גם כי GRFT מגן מפני זיהום HSV-2 על ידי עיכוב ההתפשטות לתא וירוס32. בכל המקרים, GRFT הוכח להיות דבק חלקיקים נגיפיים, תוך הפגנת עמידות גבוהה בפני דנטורציה. האחרון GRFT הוכיחה פעילות סינרגטיים עם שילובים של Tenofovir (TFV), אחרת עלולות44, שהופך אותו אפשרי וסביר מועיל לנהל יחד עם EFs. מאפייני GRFT חזק לעשות את זה מבוסס מבחינה ביולוגית נגיפים מועמד מצוין, שבו משלוח שעשויים להיות מוגברת עם טכנולוגיית EF.

ניצול הידע הזה של המאפיינים אנטי דבק ו מולדת של GRFT, לפיגום סיבים פולימריים תוכנן, המשלב מאפיינים אלה לספק את השכבה הראשונה של וירוס ערך עיכוב29. מוצאים השראה בדרך cervicovaginal ריר מעכבת וירוס תחבורה בעיקר באמצעות אינטראקציות mucin mucoadhesive, שיערנו כי באמצעות EFs בדומה לפיגום ו covalently שינוי פני השטח עם GRFT, צפיפות גבוהה של GRFT מצומדת השטח להחליש, בטל וירוס-46,45,שלה entrypoint47. כאן EFs פותחו בדומה לפיגום נייח לספק מבוססות חלבון נגיפי inactivating דבק מכשול פלטפורמה. חיפשנו לשלב את המאפיינים אנטי-ויראלי חזק של GRFT עם פלטפורמה פולימר מסתיימים, לשינוי ועמיד, כדי ליצור וירוס הרומן "מלכודת".

כדי להשיג מטרות אלה, סיבי המורכב PLGA היו electrospun, כימיה EDC-NHS שימש לאחר מכן לשנות את פני השטח EF עם GRFT. PLGA שימש פולימר דגם בשל השימוש הנרחב שלה electrospinning48, בשילוב עם הביו וחסכון שלה. בנוסף, שינוי פני השטח מנצל את פני השטח גדולים של EFs, ומספק חלופה זה יכול להיות משולב עם עיטוף כדי למקסם את השירות הסיבים49. שלא כמו שיטות כימוס המסורתי שבו רק חלק GRFT זמין (ולהציג רק transiently והשפלתם), שינוי פני השטח עשוי לאפשר GRFT לשמור על אתריים המרבי במהלך משך הטיפול כולו. יתר על כן, שילוב של תרכובות הידרופילית כגון חלבונים, באמצעות שיטות מסורתיות electrospinning, עלול לגרום היעילות כימוס התחתון ואת אובדן חלבון פעילות50. לכן, GRFT שעבר שינוי משטח סיבי עשוי להציע שיטה למשלוח חלופית מבטיח כי ניתן להשתמש לבד או בשילוב עם electrospinning כדי לשפר את ההגנה מפני זיהום STI.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה ועל פבריקציה נוספת של לגרדום סיבים Electrospun

שים לב: כל העבודה עם ממיסים או תמיסות פולימר צריכה להתבצע בשכונה fume כימיים . עיין גליון בטיחות חומרים של כל ריאגנט לפני שמתחילים את הפרוטוקול.

  1. על electrospin 3 מ ל 15% w/w PLGA פולימר פתרון, שוקל 720 מ ג של 50: 50 פוליפוני (חומצה לקטית-co-גליקולית) (PLGA; dL 0.55 כדי 0.75/g, 31-57 kDa) לתוך בקבוקון נצנוץ 10 מ"ל. הנפח של הפתרון מבוסס על גודל המנה אופייני בשימוש במחקרים עדכניים.
    הערה: המסה פולימר להוספת נפח נתון של הממס חייב יחושב על ידי הראשון לקביעת הצפיפות של הממס להשתמש כדי להמיס את הפולימר. צפיפות הממס Hexafluoro-2-פרופנול (HFIP) הוא 1.59 g/mL. לפיכך, המשקל של הממס, בהתבסס על נפח של mL 3.0 HFIP הצורך, הוא 4.8 גרם (3.0 מ ל x 1.59 g / mL). לחלקיק w/w 15% של PLGA כדי HFIP, 720 מ ג PLGA להתווסף מ 3.0 ל HFIP (0.15 x 4,800 מ ג = 720 מ ג). היתרון של שימוש של % w/w פולימר/פתרון, יותר מאשר % w/v, הוא זה מספקת משקל מוגדר של הפתרון הסופי. המשקל מוגדר הזה מאפשר החלפת הממס מדויקת יותר, במקרה של הממס התאיידות במהלך שלב 1.3.
  2. מ ל 3.0 HFIP להוסיף המבחנה נצנוץ זכוכית המכילים PLGA (מתוך שלב 1.1) באמצעות פיפטה של זכוכית סרולוגית. לכסות את המבחנה עם הסרט פלסטיק, ואז למדוד ולהקליט את המבחנה מסצ'וסטס
  3. דגירה ההשעיה פולימר בן לילה ב 37 ° C כדי להבטיח התפרקות מוחלטת של הפולימר. אם כל הממס מתאדה, הפחתת מסה המבחנה, להוסיף HFIP עד המבחנה מגיע המסה המקורית בשלב 1.2.
  4. לאחר דגירה, להכין את המנגנון electrospinning ( איור 2 א). אמנם ניתן להשתמש עם מוט בכל גודל, כאן מוט פלדת אל-חלד חיצוני בקוטר 25 מ מ מסתובב שימש האספן.
    הערה: קוטר מוט גדול יותר יקטן העובי סיבים, בהתחשב באותו אמצעי אחסון של פתרון electrospinning.
  5. וארוקן את הפתרון פולימרי לתוך מזרק 3 מ ל.
  6. להתחבר אל תדאגי, בוטה ½ אינץ ' מחט המזרק, לוותר על הפתרון עודף (בדרך כלל 0.25 mL) כדי להסיר קראוון ריק בקצה המחט.
  7. למקם את המזרק מזרק משאבה והגדר קצב הזרימה לכלי 2.0 mL/ה
    הערה: זה קצב הזרימה היה בעבר מותאם בהתבסס על צמיגות פולימר של ניסוח זה.
  8. להתחבר מקור הכוח מחט מזרק ואת electrospin הפתרון פולימר באמצעות מתח של +27 kV. יש להגדיר את המרחק בין המחט אספן ( איור 2 B) כ- 25 ס מ.
    התראה: תהליך electrospinning יוצר את האדים הממס. להשתמש ברדס fume או מכשירים סגורים ( איור 2) כדי להסיר את אדי מזיקים .
  9. לאחר הפתרון כולו electrospun, לבטל את מקור הכוח ולאפשר את מוט לסובב למשך 30 דקות נוספות מתמוססות מלא ממס.
  10. התור מחוץ האספן מוט סיבוב, והשתמש סכין גילוח לחתוך הסיבים מ מוט. השתמש הלהב לקלף בעדינות הסיבים של מוט.
  11. לאסוף סיבים PLGA electrospun לתוך צלחת פטרי עם תוויות, ולמקם desiccatorovernight כדי להסיר שאריות ממס.

2. השטח-שינוי של סיבים עם GRFT

  1. פתרונות הכן של באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ו- 2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES מאגר). להכין PBS על ידי המסת 8 g NaCl, 0.2 גרם אשלגן כלורי, 1.44 g נה 2 HPO 4 ו- 0.24 g ח' 2 PO 4 ב- 1 ליטר של מים הנדסה גנטית. באופן דומה, להמיס 19.52 g MES (חומצה חינם, MW 195.2) ו- g 29.22 NaCl ב- 1 ליטר של מים הנדסה גנטית, כדי להכין מאגר MES. להבטיח רמת ה-pH הסופי של כל פתרון בין 7.2-7.5 ל- 5.0-6.0, בהתאמה, באמצעות מד pH.
  2. להכין פתרונות עבודה בודדים של EDC (2 מ מ), NHS (5 מ מ)-
    1. להסיר את EDC NHS מהמקפיא ולאפשר להם equilibrate לטמפרטורת החדר לפני שקילה.
    2. שוקלת 4 מ"ג EDC לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL-
    3. שוקל 6 מ"ג NHS לתוך צינור microcentrifuge אחר.
      4. מאגר
    4. להוסיף 1 mL MES אל כל שפופרת. מערבולת שני צינורות נמרצות על מנת להבטיח את ריאגנטים להתמוססות מלאה.
  3. להכין פתרון של hydroxylamine על ידי במשקל של 70 מ"ג לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 50 מ ל.
  4. להוסיף 20 מ"ל PBS hydroxylamine ו מערבולת להתמוסס.
  5. המוני החוצה כמות מספקת של סיבים PLGA לתוך שפופרת צנטרפוגה חרוט 15 מ"ל. בדרך כלל, 75 מ ג של סיבים משמש עבור כל אצווה התגובה.
  6. להוסיף 8 מ של מאגר MES הצינור 15 mL-
  7. להוסיף 1 מ ל כל אחד הפתרונות EDC, NHS מוכנים מוקדם יותר הצינור. הנפח הסופי של הפתרון צריך להיות 10 מ"ל. האחרון ריכוזי EDC NHS צריך להיות 0.4 מ"ג/מ"ל ו- 0.6 מ"ג/מ"ל, בהתאמה.
  8. קרוב לאטום את הצינור 15 מ"ל עם הסרט פלסטיק והמקום -מסובב כדי לאפשר את הפתרון להיות הפוכה בעדינות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר ( איור 3 ב). שלב זה מפעיל את קבוצות carboxyl על הפולימר כדי לאפשר שינוי קוולנטיות עם החלבון GRFT ( איור 3 א).
  9. לאחר ההפעלה, בזהירות להרוות את התגובה על-ידי הוספת µL 14 של β-mercaptoethanol ברכבת התחתית. הפוך את הצינור מספר פעמים כדי לוודא ערבוב מוחלט.
    התראה: β-mercaptoethanol הוא רעיל מאוד, יש להשתמש רק בשכונה fume כימי.
  10. למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף סיבים PLGA פעמיים, עם 10 מ"ל ל- PBS, כדי להסיר כל הנותרים של β-mercaptoethanol.
  11. לאחר שטיפה, להוסיף כמות מספקת של פתרון מניות GRFT ברכבת התחתית. לדוגמה, nmol 5 סיבים GRFT/מ ג ידרוש 6.35 µL של GRFT פתרון מניות (מתוך מלאי 10 מ"ג/מ"ל) לכל מ"ג של סיבים. לפיכך מדגם סיבים 75 מ ג ידרוש µL 476.25 של 10 מ"ג/מ"ל GRFT מניות פתרון.
    הערה: סיבי GRFT עם loadings התיאורטית של 0.05, 0.5 ו- 5 nmol GRFT לכל סיב מ ג זוייפו.
  12. להוסיף PBS מספיק כדי להביא את עוצמת הקול הסופי 8 מל ', סגור, להפוך את הצינור כדי להבטיח ערבוב יסודי.
  13. לאטום את הצינור עם הסרט פלסטיק ומניחים על הרוטור שוב, זה הזמן ח' 2
  14. לאחר 2 h דגירה, להרוות את התגובה על-ידי הוספת 2 מ"ל של פתרון hydroxylamine לתוך הצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. לפי הוראות יצרן, הריכוז הסופי של hydroxylamine במהלך התגובה quenching צריך להיות 0.7 מ"ג/מ"ל.
  15. מערבבים היטב את הפתרון ולמחוק את תגובת שיקוע. לשטוף את סיב PLGA השטח-השתנה פעמיים עם 10 מ"ל מים הנדסה גנטית כדי להסיר את כל GRFT unconjugated.
  16. להעביר הסיבים פטרי ומקום בתוך desiccator עד הסיבים הוא יבש לחלוטין. העברת הפטרי עד 4 ° C עבור אחסון.

3. SEM אפיון של השטח GRFT-השתנה סיבי

  1. המקום רצועה של פחמן דו-צידית דבק SEM הדגימה הר. תווית בתחתית ההר הדגימה עם פרטים מזהים הדגימה באמצעות סמן קבוע.
  2. לחתוך שלוש דגימות סיב אחד שעבר שינוי פני השטח והציבו אותם על טעינות הדגימה נפרדים. עובי כל דגימה היא כ- 0.5 מ מ.
  3. לרעוד. להוציא מעיל הדגימות באמצעות חלקיקים אלקטרון-induced התצהיר מצלחת זהב. להתיז את המעיל 90 s, ב 2.4 kV-
    הערה: הזמן לרעוד. להוציא את המעיל עשוי להשתנות בהתאם פרמטרים ציוד, כולל מתח ואת עוצמת הזרם-
  4. תמונה הדגימות בשמונה kV עם הגדלה ועד 1,000 5, 000 X.

4. מן השטח-השתנה סיבי החילוץ של GRFT

  1. המונית החוצה 2 מ ג של סיבים שהפקידים לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ ל.
  2. להוסיף 1 מ"ל דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) הצינור, ואז מערבולת, תקופת דגירה של 1 דקות בטמפרטורת החדר לחלוטין להתמוסס הסיבים.
  3. לאחר דגירה, לדלל את aliquot 10 µL של הפתרון דימתיל סולפוקסיד-סיב מ שלב 4.2, לפחות 100-fold במאגר טריס-EDTA (TE) (ה-pH = 8.0).
  4. לאחסן דגימות ב-20 ° C עד טעינת אפיון עם אליסה.

5. מדידת GRFT Desorption מסיבי

  1. כדי להעריך את כמות GRFT שוחרר או desorbed של הסיבים, שוקל 5-10 מ"ג של השטח-השתנה סיבים ומקום צינור microcentrifuge. להקליט את המסה סיבים כל שפופרת.
  2. להוסיף 1 מ"ל של פיתרון הולם המחקה את הסביבה פיזיולוגית (למשל, PBS, טה מאגר, נוזל הנרתיק סימולציה (SVF), וכדומה) כדי שכל דוגמית.
  3. דגירה בדגימות עבור h 1 ב מטרף מסתובב במהירות של 200 סל ד, 37 מעלות צלזיוס.
  4. לאחר דגירה, הסר כ 1 mL טה מאגר המכיל את GRFT desorbed מתוך בקבוקון ולאחר aliquot לאשכול צינורות. חנות ב-20 ° C עד חלבון כמת.
  5. להעביר את הדגימה אל צינור microcentrifuge, להוסיף 1 מ"ל של בופר טריים הסיבים בתוך הצינור microcentrifuge, וכן דגירה עד הנקודה בפעם הבאה.
  6. נקודות זמן אופייני המשמש למדידת שחרור לכלול: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h, ו- 1 wk. desorption זניח נצפתה במחקרים אלה לאחר 4 h.

6. כימות של חילוץ GRFT ו- Desorption ויה אליסה

  1. מעיל אליסה 96-ובכן צלחת עם 0.1 מ"ל של HA (10 µg/mL) לכל טוב כאמור תיאר 51. לאטום את הצלחת עם הסרט פלסטיק, דגירה בין לילה ב 4 ° C ( איור 4).
  2. להסיר את המאגר ציפוי, והוסף mL 0.3 חסימת מאגר (2-3% שור אלבומין (BSA) ב- PBS עם 0.05% polysorbate 20) כדי מכל קידוח. דגירה את הצלחת כבר לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר דגירה, לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם PBS 1 x עם 0.1% polysorbate 20 (PBS-P). לאחר השטיפה, לוותר על 0.1 מ של דגימה, תקן או PBS כפקד שליליים לתוך הבארות בהתאמה. דגירה את הצלחת שוב לשעה בטמפרטורת החדר.
  4. לשטוף את הצלחת שוב 3 פעמים עם PBS-פ לאחר השטיפה, הוסף 0.1 מ"ל של נוגדן ראשוני (תרופת אנטי-GRFT עז) לבאר כל ' תקופת דגירה של פחות שעה בטמפרטורת החדר. בדרך כלל, הפתרון נוגדן ראשוני הוא מדולל על ידי 1:10,000 ב- PBS.
  5. לאחר המקננת הדגימות עם נוגדן ראשוני יש לשטוף את הלוחיות שוב 3 פעמים עם PBS-פ להוסיף 0.1 מ"ל של נוגדנים משניים (peroxidase חזרת (HRP)-ארנב מצומדת עז אנטי איג) לכל אחד טוב ואני תקופת דגירה של h 1 בטמפרטורת החדר. הפתרון נוגדנים משניים הוא מדולל על ידי 1:10,000 ב- PBS.
  6. לשטוף את הצלחת 3 פעמים. להוסיף 0.1 מ"ל שוייץ 2-peroxidase המצע מכל קידוח. לפקח על פיתוח צבע (כ- 2 דקות), ולאחר מכן להוסיף 0.1 מ"ל H 2 אז 4 (1 N) כדי להרוות את התגובה. לקרוא את הצלחת 450 ננומטר על קורא צלחת.
  7. ממוצע של הערכים OD של הרקע (בארות אשר רק לקבל PBS), לחסר זה מקבוצות ניסיוני.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מורפולוגיה סיבים יש השפעה משמעותית על היכולת של השטח-השתנה ב- EFs כדי לספק הגנה מפני וירוסים. למרות electrospinning הוא הליך נוח וברור, ניסוחים פולימר הלא אופטימיזציה עלול לגרום סיבים לא סדיר מורפולוגיה (איור 5בג). שינויים בתנאי electrospinning לגרום להיווצרות של חרוזים או אמורפי דמוי שטיח מורפולוגיות, נגרמות לעיתים קרובות אי התאמה הממס-פולימר, צמיגות נמוכה פולימר, קצב הזרימה או תנאים אחרים electrospinning. הווריאציות הנוצרת במבנה הסיבים עלולים לגרום שחרור שונים פרופילים עבור סיבי שולבו סמים או בחוסר יעילות ההטיה, שינוי היכולת סיבי פיזית או כימית לעכב וירוס חדירה עקביות. EFs PLGA מפוברק באמצעות התנאים המתוארים electrospinning צריך לגרום מורפולוגיות סיבים ברורים עם קטרים הנע בין 1.5 ו 2.8 µm (איור 6). כדי לקבוע קוטר ומורפולוגיה של סיבים, יש לבחון EFs עם SEM לפני צעדים אחרים אפיון או שינוי.

תמונות SEM של ריק, 0.05, 0.5 ו- 5 סיבי GRFT nmol הראה אין הבדלים משמעותיים סיבים מורפולוגיה (איור 6י-ם), המציין כי השינוי GRFT יש אין השפעה על מורפולוגיה סיבים. כדי לקבוע את קוטר ממוצע של כל ניסוח EF, מינימום של 50 מדידות אקראי נלקחו לכל שדה ראייה מן התמונות SEM. הקוטר הממוצע של ניסוחים EF היו מדודים ומחושבים ב ImageJ, כפי שמוצג באיור 6E. ניסוחים EF כל היה דומה קטרים הממוצע סביב 1.9 מיקרומטר, מפגין מרקם של תהליך ייצור סיבים שלא שונתה על פני קבוצות.

כדי לקבוע שכמות GRFT מצומדת EFs, GRFT-EFs היו מומס דימתיל סולפוקסיד, ואחריו לדילול 100-fold במאגר טה, לחלץ GRFT הסיבים. כמות GRFT מצומדת לכל מ"ג של סיבים הייתה לכמת באמצעות אליסה. כל שינוי צפיפות (0.05, 0.5 ו- 5 nmol GRFT לכל סיב מ ג), משכפל עשר הוערכו. במשך ה-5, 0.5 ובשינויי 0.05 nmol EF GRFT/mg, בכל EF היה 373, 165 ו- 42 ng GRFT לכל מ"ג של EF, והתוצאה היא יעילות ההטיה של 0.6, 4.2 ו- 6.9%, בהתאמה. תוצאות אלו מדגימים כי GRFT-EFs מצומדת עם צפיפות המשטח-השינוי התיאורטי גבוהה יותר, תוצאה יותר GRFT מצומדת כדי הסיבים (איור 7א). עם זאת, היה מתאם הפוך עם יעילות ההטיה הנוצרת29.

כדי להעריך את כמות GRFT covalently מצומדת השטח סיבים יחסית זה הספוחה, GRFT-EFs היו מודגרות ב SVF כדי לקבוע את כמות GRFT שוחרר. בתוך הראשון 4h, 113, 25, ו-10 ננוגרם של GRFT לכל mg EF זוהה SVF 5, 0.5 של ריכוזים 0.05 nmol השינוי התיאורטי, בהתאמה. ערכים אלה תואמות 30%, 41% ו- 24% מהסכום של GRFT מצומדת 5, 0.5 של 0.05 nmol GRFT-EFs. לאחר 4 שעות, GRFT זניח זוהה eluate שחרור עבור כל שלוש ניסוחים. GRFT שחרור לאחר 1, 2 ו- 4 שעות מוצג איור 7ב'. נתונים אלה יחדיו, מציינים כי הרוב המכריע של GRFT קשורה covalently EFs, ומשוחרר כי GRFT פני השטח-הספוחה בתוך ה 4 הראשון.

Figure 1
איור 1: המורפולוגיה macroscale של סיבי electrospun. הסיבים electrospun המוצגים היו מפוברק באמצעות 4 מ מ (גליל) מוט בקוטר 25 מ מ (גיליון), בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: מכשירים Electrospinning. (א) איסוף מוט היכן להפקיד מטוסי סילון נוזלי של פולימר, (B) ההתקנה המלאה electrospinning. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: סכמטי של EF שינוי עם GRFT באמצעות הכימיה EDC-NHS. Carboxyl (א) קבוצות-התגובות PLGA EF עם NHS בנוכחות EDC ל אסטרים אמין-תגובתי טופס, אשר יהוו לאחר מכן אמיד יציב הנרקמים אמינים הראשי של GRFT. (B) שני מיליגרם סיבים דיסקים או חתיכות לחתוך, מודגרות ב mL 8 MES מאגר עם 2 מ של ריאגנט EDC/NHS הינם מסובב במשך 15 דקות אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: סכמטי הממחישות כמת GRFT באמצעות אליסה. Immunoplate 96-ובכן מצופה gp120 או HA כדי ללכוד לשתק GRFT. ראשי נוגדנים נגד GRFT, נוגדנים משניים מקושר peroxidase חזרת, אליסה המצע ברצף יתווספו לכמת GRFT. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: השפעות הבחירה ממס על מורפולוגיה PLGA EF. (א) 15% w/w PLGA EFs ב- HFIP מוצג רצוי חוט כמו מורפולוגיה. (B) 15% w/w PLGA EFs כלורופורם, dimethylformamide, נכשל טופס בחירה ממס בלתי אופטימאליים או פולימר ריכוז (צמיגות). (C) 15% w/w ו- (ד) 20% w/w PLGA EFs ב מוסיקה להדגים את חשיבותה של פולימר צמיגות. חרוזים נוצרו בניסוח לריכוז פולימר התחתון (C), בעוד הגדלת ריכוז פולימר (הממס צמיגות), גרמו סיבים מוגדר היטב מורפולוגיה (D). שימו לב, דמות 5B נלקח בהגדלה נמוכה יותר גדולה כדי להראות כמו שטיח המורפולוגיה. גודל ברים = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: תמונות SEM ו סיבים קטרים של EFs חשופות ושינית GRFT. EFs PLGA חשופות (A) ו- PLGA EFs השטח-השתנה עם (B) 0.05 nmol, (ג) 0.5 nmol, ו- (ד) 5 nmol של GRFT לכל מ"ג של סיבים. גודל ברים = 10 מיקרומטר. (E) קטרים של יאומתו ו- GRFT-EFs. קווי שגיאה לייצג את זאת אומרת ± ב- SEM. אין הבדל סטטיסטי נצפתה בין הקוטר של סיבי יאומתו ושינית על-ידי GRFT. איור 6 E היה ממאמרו של החתנים. et al. 29 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : כמות GRFT מצומדת ל ו desorbed מ- GRFT-השתנה EF- (א) כמות GRFT מצומדת כל מ ג של EF גדל סיבים עם ריכוז מוגבר של מגיבים GRFT. (B) כמות GRFT שוחררו כל מ"ג של סיבים מוצג עבור 0.05, 0.5, ניסוחים nmol 5 לאחר דגירה 1, 2 ו- 4 שעות ב- SVF. קווי שגיאה לייצג את זאת אומרת ± ב- SEM. איור זה כבר ממאמרו של החתנים. et al. 29 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשל מבנה נקבובי שלהם ואת פני שטחים גדולים, מצאו EFs במגוון יישומים במערכת הבריאות, אחד מהם כולל הגשה כמו רכבי ההעברה טיפולית. סמים, סוכנים פעילים אחרים ניתן לשלב בתוך EFs למסירה tunable, ואילו תרופות/מוצרים ביולוגיים, כימיים ליגנדים יכול להיות מצומדת השטח סיבים עבור תאים ספציפיים מיקוד52 או biosensing53. כאן הזיוף של GRFT השטח-שונה PLGA EFs, כפי שמתואר לפיגום משלוח למניעת הידבקות ב- HIV. GRFT-EFs היו מסונתז על ידי electrospinning, מספק את היתרונות של קצב ייצור גבוהה, בעלות נמוכה יחסית אחרים סיבים ייצור שיטות49,53.

שלבים קריטיים בפרוטוקול
היווצרות של EFs תלויה באופן ביקורתי המאפיינים של פתרון פולימר, בפרט פתרון או הממס צמיגות54. הגורמים המשפיעים על צמיגות של פתרון פולימר כוללות משקל מולקולרי פולימר, לריכוז פולימר בסוג הממס בשימוש. הפתרון או את צמיגות הממס מכוון בדרך כלל על-ידי שינוי היחס של פולימר הממס, כדי להשיג את הריכוז פולימר הרצוי. עם כל פבריקציה נוספת, אמצעי האחסון חייבות להישמר במהלך הדגירה לילה כדי לשמור על יחס נאות פולימר-כדי-הממס (צמיגות). -ריכוז גבוה מספיק פולימר, מולקולות הפולימר לסבך בפתרון במהלך תהליך electrospinning לייצר סיבים. במהלך תהליך electrospinning, חרוז יהוו בקצה spinneret, אם יש מספיק פולימר שזירה, מטוסי סילון נוזלי להתפרץ מנקודה זו-מתח קריטי, להאיץ ב אופנה השוט לעבר מוט איסוף55. אידוי הממס יוביל ואז סילון דליל, ייצור החוטים של סיבים כפי שהם להפקיד על מוט איסוף. ברגע מסונתז, EFs צריך להיות מנותח על ידי SEM כדי לוודא מורפולוגיה תקין קוטר סיבים עקביים. הנוכחות של EFs חרוזים עשויים להיות התוצאה של צמיגות נמוכה פתרון56, גבוה מאוד מתח המופעל57, פולימר להאכיל קצב58, או שילוב של כל שלושת הגורמים. אם זה הוא ציין, פולימר הריכוז צריך להיות מוגברת, מתח המופעל וקצב ההזנה צריך להיות מותאם, להשיג, כמו סיבים מורפולוגיה.

כדי נזווג חלבונים על פני השטח EF, כאן PLGA carboxyl קבוצות היו הגיבו באמצעות EDC-NHS carbodiimide crosslinking כימיה59. במהלך תהליך השינוי, סיבי מודגרת בקצרה עם EDC בנוכחות NHS שתוצאתה ההמרה של carboxylates לתוך אסטרים למחצה יציב, אמין-ריאקטיבי. במהלך תהליך ההטיה בשני שלבים, חיוני שיש המאגרים במהלך כל שלב ה-pH האופטימלי, ציין בהוראות היצרן, על מנת להבטיח יעילות מרבית ההטיה. זמן מחצית החיים של אסטרים NHS נע בין ארבע עד חמש שעות ב- pH נייטרלי ומקטינות באופן דרמטי ב תנאים בסיסיים יותר60. לפיכך, התגובה הראשונה צריכה להתבצע במאגר MES ב- pH 5-6, הסיבים שהופעל אז יועבר למאגר PBS (pH 7.2-7.5) עבור התגובה עוקבות ומיידי עם GRFT. זה גם חשוב כי EDC מומת על ידי התוספת של מרקפטואתנול, מספיק לשטוף מן הסיבים לאחר הפעלת carboxylate. זה יעזור למנוע הפעלת חלבון על ידי EDC העצמי-crosslinking במהלך התגובה השנייה, אשר עשוי להפחית את יעילות ההטיה.

שינויים ופתרון בעיות
למרות העבודות הקודמות שלנו הוכיח את היעילות של מגוון רחב של סיבי GRFT-לאחרונה מפני הידבקות ב- HIV-1, ניתן לשקול שינויים תהליך מסוים כדי להתאים אישית EF מורפולוגיה או לשפר את GRFT (או חלבונים אחרים) יעילות ההטיה או סיבים תשואות29. בפרט, ניתן להגדיל את EF פני השטח על ידי הפחתת הקוטר סיבים, כדי לאפשר פני שטח גדול יותר עבור ההטיה. מחקרים קודמים הראו כי הפחתת ריכוז פולימר צמיגות מייצרת קטנים יותר סיבים בקוטר61,62. עם זאת, גישה זו הוא מוגבל על ידי היווצרות של סיבי חרוזים כאשר הריכוז מתחת לערך הסף. כדי להפחית סיבים בקוטר מבלי לשנות את הפתרון צמיגות, מערכות ממיס כפול יכול להיות מנוצל כדי להפחית את המתח, או מלחי עשויים להתווסף כדי להגדיל את הפתרון מוליכות56,57. שתי השיטות יאפשר מתיחה גדולה יותר של הג'טס electrospinning אשר עשויה לייצר קטרים סיבים קטנים יותר. בנוסף, פולימרים משקל מולקולרי נמוך עשוי לשמש כדי לבדות סיבים בקוטר קטן יותר. הפחתת סיבים בקוטר מספק גם יתרון נוסף של יצירת נקבוביות קטנות יותר, ובכך הוא עשוי להפוך EFs יעיל יותר כמחסום לחדירה וירוס, עבור יישומים מבוססי microbicide63. בסופו של דבר, זה היה ציין כי לחות יכול להשפיע על התשואה EF. -לחות גבוהה יותר, התשואה נוטה להפחית בשל היווצרות של סיבים עם מאקרו יוצא דופן-מורפולוגיה. התקנת מערכת בקרת לחות בתוך תא electrospinning יכול ולכן להקל על הפקת EFs עם תשואות עקבי, אם זה מציגה את אתגר פבריקציה נוספת.

כדי לשפר את יעילות ההטיה GRFT, חוקרת את הבחירה ואת המיקום של קבוצות functionalizable יכול גם להיחשב. לדוגמה, אם אמינים העיקרי של החלבון עניין ממוקמים ליד הפנים של מבנה החלבון תלת מימדי, הפרעה סטרית עלול למנוע carboxyl מופעל קבוצות ב- EFs אינטראקציה עם ראשי אמינים, ובכך להקטין הסבירות התגובה. האתגר הזה עלול להתגבר על ידי החלפת חומצת אמינו של החלבון כדי ליצור קבוצת אמין הראשי קרוב יותר אל פני השטח חלבון. עם זאת, כפי GRFT וחלבונים אחרים תלויים פעילות ספציפיים של אתרי קישור שלה עבור פונקציונליות, שינוי קונפורמציה חלבון ביסודיות לבדוק מבחני פונקציונלי לפני ההטיה.

מגבלות
מגבלה עיקרית של שינוי פני השטח GRFT הוא הפוטנציאל ליעילות נמוכה ההטיה באמצעות carbodiimide crosslinking כימיה. אם החלבון נגיפים עניין של IC גבוה50, יעילות ההטיה נמוכה לא מספקות הגנה מספקת (ביישומים אלה) מפני הידבקות בווירוסים. עם זאת, עבור GRFT (או השני שונה) EFs, חלבונים, סוכנים פעילים, אשר לא covalently חייביםEFs עשוי לספוח עדיין אל פני השטח. סוכנים הספוחה אלה מציעות פוטנציאל כדי להשלים את הפעילות של GRFT מצומדת, על-ידי transiently הגדלת ריכוז המותאמות לשפות אחרות זמינות עבור איגוד וירוס. בדוגמה זו, desorbed GRFT ייתכן לאגד virions HIV-1 לא קשר ישירות עם EFs, והוא עשוי לספק מנגנון חלופי של הגנה עם ה 4 הראשון של הממשל (pericoital). לפיכך, GRFT מצומדת והן הספוחה-משטח עשוי לתרום מתן הגנה אחידה נגד STIs.

למרות ההגנה שהוענקו חלבון ההטיה והן desorption, עשוי להיות נרדף אחרים אסטרטגיות שינוי פני השטח עם פוטנציאל גבוה יותר יעילות. לדוגמה, ניתן להשתמש PLGA הסתיים עם אמינים במקום carboxyl קבוצות כדי נזווג GRFT מופעל. לחלופין, אסטרטגיה השטח-השינוי שונה עשוי להיות מנוצל כדי לשפר את יעילות ההטיה EF-חלבון. יש כבר functionalized ממברנות Nanofibrous המורכב EFs עם אבידין ויה carbodiimide crosslinking כימיה64. Biotinylation או תוספת של דלקת תג (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) דרך רקומבינציה עשוי לאפשר החלבון ששונה כדי ליצור חזקה ויציבה מאוד שאינם קוולנטיות אינטראקציה עם אבידין EFs. בעוד שאינם קוולנטיות, ניגודים אבידין-ביוטין הוא החזקה אי - קשר קוולנטי, עם זיקה femtomolar, סביר להניח וכתוצאה מכך ההטיה יציבה על פני השטח סיבים. על כל משטח-שינוי אסטרטגיות, הפרעה סטרית להתייחס כדי למקסם את יעילות ההטיה.

לבסוף, אנו לדמיין כי השטח-השתנה EFs יציע אסטרטגיית חלופיים כדי הסוכן הפעיל כימוס לספק מצבי משלימים של הגנה. שיקול אחד עם שילוב של טכנולוגיות כימוס והסבת השטח על פלטפורמה אחת EF להיות הפחתת שחרור מוקדם של סוכנים פעילים במהלך תהליך שינוי פני השטח. עבור משטח-שינוי תגובות הדורשים זמן רב יחסית זמן הדגירה ב תמיסה מימית, אחוז ניכר של הסוכנים פעיל טעון עשוי להיות איבדו בשל פולימר הידרוליזה.

משמעות השיטה ביחס קיימים ושיטות אלטרנטיביות
בעבודה הקודמת, הבחנו כי EFs ריק שלא הצליחו לעכב את הידבקות ב- HIV על ידי ~ 38% כאשר הוספה transwell מעל התאים infectible29. התבוננות זו בשילוב עם הביו, כמו אינטרנט מיקרו, tortuosity של EFs, במקביל נצפתה חזק אנטי ויראליים, דביק המאפיינים של GRFT, עודדה ההתפתחות של EFs שעבר שינוי פני השטח המתואר כאן.

יחסית לטכנולוגיות אחרים משלוח מועסקים כיום ביישומים microbicide, EFs יש מגוון רחב של יישומים אפשריים עקב שלהם ארכיטקטורה ויכולת התאמה אישית. בעבודה אחרת, המורפולוגיה סיביים של EFs אפשרה להם כדי לספק סוכנים פעילים, וכדי לחקות את ECM, הפיכתם פיגומים מתאימים עבור הנדסת רקמות. EFs היו גם משטח שונה כדי לשפר את התאימות ולשפר את שחרור-מתמשכת65,66.

כדי לשפר את התאימות או לספק סוכנים שהפונקציה באמצעות פעילות איגוד ספציפיים, קיימות שיטות רבות לאפשר הקובץ המצורף של תרכובות משטחי EFs כגון טיפולי פלסמה, שיטות כימיות רטובות שתל משטח polymerizations50. במקרה של GRFT אשר במיוחד לאגד glycoproteins ויראלי של HIV-1, לשיטת כימי רטוב EDC-NHS הוא האופטימלי ביותר בשל היכולת לחדור עמוק בתוך רשת סיבים תוך גם שמירה על פונקציונליות GRFT50. GRFT מרותק למיטה כדי EFs ואז ניתן לקבל בניסוח עמיד והשפלתם ומספקים הגנה מיידית מפני הידבקות ב- HIV.

לעומת האסטרטגיה הקיימת של לבצע הרפוי בתוך EFs כדי לעכב STIs, ההטיה קוולנטיות מציע יתרון מובהק של הגדלת את ובצמא פוטנציאלי בין virions GRFT ו- HIV. מאת שיתק GRFT כדי EFs דרך השטח-שינוי, ריכוזים מאוד המותאמות לשפות אחרות של GRFT יכולה להיות מושגת, אשר במאמציו עבור איגוד multivalent עם HIV. בנוסף, GRFT EF. מרותק למיטה, יחסית GRFT חינם בפתרון, עלול למנוע דלדול של הבריכה GRFT על ידי הפרעה תא הפנמה. יתר על כן, בשל מנגנון ייחודי של פעולה של GRFT כמו מעכב כניסה יציב, דביק, ההטיה משטח קוולנטיות מאפשר השטח-השתנה ב- EFs לספק מכשול פיסי לחדירה וירוס, בנוסף מאפיינים ויראליים חזק.

יישומים עתידיים של שיטה זו
הניצול של השטח-שינוי למסירה מציג את ההזדמנות לשלב מספר סוכנים פעילים בתוך פלטפורמה אחת EF. בעתיד, אנו שואפים לפתח טכנולוגיה הרב-תכליתי (MPT) מגוון רחב של סוכנים פעילים עשויים להיות אנקפסולציה בתוך ואיפה מצומדת כדי EFs. Mpts ב אלה עשויות להיות בנויות להתייעץ הגנה מפני מגוון רחב יותר של פתוגנים על-ידי שילוב הרפוי עם מנגנונים שונים של פעולה. על ידי ניצול השטח והן הפנימי של EFs כדי לספק סוכנים פעילים עם מנגנונים שונים של פעולה, מוגדל את הפוטנציאל של EFs כדי להגן מפני הידבקות בווירוסים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים על הקרן למורשת למצוינות למימון מחקר זה. אנו מודים ד ר סטיוארט וויליאמס II למתן בנדיבות את השימוש של מערכת electrospinning. אנו מודים גם ד ר קנת פאלמר סיפק לנו Griffithsin. אנו מודים בנוסף ד ר נוביוקי Matoba ו במעבדתו לאימונים שאותנו אליסה GRFT לעבוד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792 (2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108 (2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635 (2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Tags

Bioengineering גיליון 128 Electrospun סיבים במגע מיני זיהומים וירוס הכשל החיסוני האנושי שינוי פני השטח microbicide Griffithsin פוליפוני (חומצה לקטית-co-גליקולית)
ייצור ואפיון של סיבים Griffithsin-השתנה פיגומים לצורך מניעת מחלות המועברות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vuong, H. R., Tyo, K. M.,… More

Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter