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Bioengineering

यौन संचारित संक्रमणों की रोकथाम के लिए Griffithsin-संशोधित फाइबर पाड़ों का निर्माण और लक्षण वर्णन

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

इस पांडुलिपि के निर्माण और Griffithsin संशोधित पाली (लैक्टिक-co-glycolic एसिड) electrospun फाइबर है कि मानव इम्यूनो वायरस प्रकार 1 संक्रमण के खिलाफ शक्तिशाली चिपकने वाला और एंटीवायरल गतिविधि का प्रदर्शन विशेषता की प्रक्रिया का वर्णन इन विट्रो में। संश्लेषित करने के लिए इस्तेमाल किया तरीकों, सतह को संशोधित, और जिसके परिणामस्वरूप आकृति विज्ञान, विकार, और सतह संशोधित तंतुओं से Griffithsin के desorption की विशेषता वर्णित हैं ।

Abstract

Electrospun फाइबर (EFs) व्यापक रूप से चिकित्सीय अनुप्रयोगों की एक किस्म में इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, वे हाल ही में एक तकनीक को रोकने और यौन संचारित संक्रमण (एसटीआई) के इलाज के रूप में लागू किया गया है । इसके अलावा, कई EF प्रौद्योगिकियों को सक्रिय एजेंट encapsulating पर ध्यान केंद्रित, सतह का उपयोग करने के लिए सापेक्ष कार्यक्षमता प्रदान करने के लिए रिश्तेदार । यहां हम एक विधि का वर्णन करने के लिए निर्माण और सतह-संशोधित पाली (लैक्टिक-co-glycolic) एसिड (PLGA) electrospun फाइबर, प्रबल एंटीवायरल लेक्टिन Griffithsin (GRFT) के साथ । PLGA एक एफडीए अनुमोदित बहुलक है कि व्यापक रूप से अपने बकाया रासायनिक और जैव संगत गुणों के कारण दवा वितरण में इस्तेमाल किया गया है । GRFT एक प्राकृतिक, शक्तिशाली, और सुरक्षित लेक्टिन है कि मानव इम्यूनो वायरस प्रकार 1 (एचआईवी-1) सहित कई वायरस के खिलाफ व्यापक गतिविधि के पास है । जब संयुक्त, GRFT-संशोधित फाइबर एचआईवी के प्रबल निष्क्रियता का प्रदर्शन किया है-1 इन विट्रो। इस पांडुलिपि के तरीकों का वर्णन करने के लिए बनाना और GRFT-संशोधित EFs विशेषताएं । सबसे पहले, PLGA फाइबर पाड़ बनाने के लिए electrospun है । फाइबर बाद में सतह-1-एथिल-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) और N-hydroxysuccinimide (एन एच एस) रसायन विज्ञान का उपयोग कर GRFT के साथ संशोधित कर रहे हैं । स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) के आकार और सतह संशोधित योगों के आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । साथ ही, gp120 या hemagglutinin (HA) आधारित एलिसा को GRFT संयुग्मित की मात्रा के साथ-साथ फाइबर की सतह से GRFT desorption के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल और अधिक व्यापक रूप से फाइबर कि सतह-अलग प्रोटीन की एक किस्म के साथ संशोधित कर रहे है बनाना लागू किया जा सकता है ।

Introduction

एक सामयिक प्रसव मंच के रूप में EFs के उपयोग के लिए काफी एसटीआई कम करने की क्षमता है । वर्तमान में, वहां ३६,०००,००० से अधिक एचआईवी के साथ रहने वाले लोग हैं, २,०००,००० से अधिक नए मामलों के साथ २०१५ अकेले1,2में रिपोर्ट की । इसके अतिरिक्त, दाद सिंप्लेक्स वायरस प्रकार 2 (एचएसवी-2) संक्रमण दुनिया भर में लाखों लोगों के सैकड़ों को प्रभावित करता है और 2-5गुना3 द्वारा एचआईवी के अधिग्रहण को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है । एचएसवी-2 संक्रमण और एचआईवी अधिग्रहण के बीच इस संबंध के कारण, वहां कई एसटीआई के खिलाफ एक साथ सुरक्षा प्रदान कि नए सक्रिय एजेंटों के विकास में महत्वपूर्ण रुचि है । इसके अलावा, इन एंटीवायरल एजेंटों के वितरण में सुधार करने के लिए नए वाहनों के विकास के लिए और अधिक सुरक्षा और चिकित्सीय शक्ति को बढ़ाने की क्षमता प्रदान करता है । इस लक्ष्य की ओर, EFs एक नया वितरण मंच के रूप में जांच की गई है एचआईवी के प्रसार-1 और एचएसवी-2 संक्रमण को कम ।

पिछले दो दशकों के दौरान, EFs बड़े पैमाने पर दवा वितरण और ऊतक इंजीनियरिंग के खेतों में इस्तेमाल किया गया है4। अक्सर, आसानी से चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए अनुवाद करने के लिए संगत पॉलिमर का चयन कर रहे हैं । बहुलकत्मक EFs बनाना, चयनित बहुलक एक कार्बनिक विलायक या जलीय समाधान में भंग है, बहुलक hydrophobicity की डिग्री के आधार पर5। ब्याज की सक्रिय एजेंटों तो electrospinning प्रक्रिया से पहले विलायक या जलीय समाधान करने के लिए जोड़ा जाता है । बहुलक समाधान तो एक सिरिंज में aspirated है और धीरे से बाहर निकाले जबकि एक विद्युत प्रवाह के अधीन । इस प्रक्रिया को आम तौर पर शीट या बेलनाकार macrostructures (चित्रा 1), और फाइबर व्यास माइक्रो-नैनो पैमाने6से लेकर के साथ बहुलक फाइबर में परिणाम है । सबसे चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए, सक्रिय एजेंटों electrospinning प्रक्रिया के दौरान फाइबर के भीतर शामिल कर रहे हैं और प्रसार और बाद में फाइबर क्षरण के माध्यम से फाइबर से जारी कर रहे हैं. गिरावट या रिहाई की दर पॉलिमर या बहुलक मिश्रणों के विभिंन प्रकार का उपयोग करने के लिए एक वांछित जारी प्रोफ़ाइल स्थापित करने, अद्वितीय रासायनिक और शारीरिक गुण बीटेक के द्वारा बदला जा सकता है7, और वस्तुतः किसी के encapsulation को बढ़ावा देने कंपाउंड. जैसे, EFs छोटे अणु दवाओं और प्रोटीन, पेप्टाइड्स, oligonucleotides, और विकास कारकों6,8,9सहित जैविक एजेंटों के वितरण के लिए फायदेमंद साबित कर दिया है ।

STI निवारण के क्षेत्र में, EFs हाल ही में शामिल है और एंटीवायरल एजेंटों की निरंतर-या inducible-रिलीज प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. एक से अधिक अध्ययन में, पीएच-उत्तरदायी तंतुओं महिला प्रजनन पथ (FRT) के भीतर पर्यावरण परिवर्तन के जवाब में सक्रिय एजेंटों को रिहा करने के लिए विकसित किया गया था, एचआईवी के खिलाफ संरक्षण की मांग पर एक विधि के रूप में-111. के बाद से, अंय अध्ययनों से सुरक्षात्मक ऑक्साइड (पेो) और पाली-एल लैक्टिक एसिड (PLLA) के शामिल बहुलक मिश्रणों की जांच की है, के लिए एंटीवायरल और गर्भनिरोधक एजेंटों के स्वरित्र रिहाई का मूल्यांकन करने के लिए एचआईवी-1 रोकथाम और इन विट्रो में गर्भनिरोधक 12. अतिरिक्त अध्ययन EFs की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है निंनलिखित प्रदान करने के लिए: छोटे अणु antivirals14, मजबूत और लचीले यांत्रिक गुणों20, 3-डी डिलिवरी आर्किटेक्चर21 के लंबे समय तक जारी , शुक्राणु प्रवेश12के निषेध, और अन्य वितरण प्रौद्योगिकियों के साथ विलय करने की क्षमता13. अंत में, पिछले काम आम सह संक्रामक वायरस, एचएसवी-2 और एचआईवी-114के खिलाफ एंटीवायरल एजेंटों के निरंतर वितरण के लिए पॉलिमर फाइबर का मूल्यांकन किया गया है । इस अध्ययन में, बहुलक फाइबर 1 महीने तक के लिए अपनी संरचना को बनाए रखने और वायरल प्रविष्टि के लिए एक शारीरिक बाधा प्रदान करके एंटीवायरल प्रसव के लिए पूरक गतिविधि प्रदान की है । इन परिणामों से, यह देखा गया कि EFs दोनों शारीरिक और रासायनिक वायरस संक्रमण में बाधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

जबकि स्वरित्र रिलीज गुण बहुलक efs microbicide वितरण के लिए एक आकर्षक वितरण मंच बनाने के लिए, EFs अंय अनुप्रयोगों में विकसित किया गया है सतह संशोधित मचान7के रूप में सेवा । EFs extracellular मैट्रिक्स (ECM) की आकृति विज्ञान की नकल करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, अक्सर पाड़ के रूप में कार्य करने के लिए सेलुलर पुनर्जनन22सुधार, और ऊतक इंजीनियरिंग में उनकी उपयोगिता को बढ़ाने23,24. ऐसे पाली-ε-caprolactone (PCL) और PLLA के रूप में पॉलिमर के शामिल तंतुओं वृद्धि कारकों और प्रोटीन electrospinning के बाद ECM वृद्धि हुई सेलुलर आसंजन और प्रसार सहित गुणों की तरह प्रदान करने के बाद के साथ सतह संशोधित किया गया है25 , 26. इसके अतिरिक्त, रोगाणुरोधी सतह संशोधित EFs विशिष्ट रोगजनक बैक्टीरिया की वृद्धि को रोकने के लिए मूल्यांकन किया गया है27,28. इस बहुमुखी प्रतिभा और जैविक प्रभाव पैदा करने की क्षमता के कारण, EF प्रौद्योगिकी बहु-यंत्रवत कार्यक्षमता प्रदान करने के लिए क्षेत्रों की एक किस्म के पार का विस्तार करने के लिए जारी है । फिर भी, अनुप्रयोगों की विविधता में अपनी उपयोगिता के बावजूद, सतह को संशोधित फाइबर केवल हाल ही में microbicide क्षेत्र में पता लगाया गया है29।

समानांतर में नए वितरण प्रौद्योगिकियों के विकास को रोकने और एसटीआई के इलाज के साथ, उपंयास जैविक चिकित्सकीय विकसित किया गया है । सबसे होनहार microbicide उम्मीदवारों में से एक चिपकने वाला एंटीवायरल लेक्टिन, GRFT30है । मूलतः लाल शैवाल की एक प्रजाति से व्युत्पंन, GRFT एचआईवी के एक शक्तिशाली अवरोध करनेवाला के रूप में गतिविधि का प्रदर्शन किया है, एचएसवी-2, सार्स, साथ ही हेपेटाइटिस सी वायरस 31,३२,३३,३४ ३५ , ३६. वास्तव में, जैविक रूप से आधारित अवरोधकों के बीच, GRFT सबसे शक्तिशाली विरोधी एचआईवी गतिविधि है, एचआईवी को निष्क्रिय-1 लगभग तुरंत संपर्क करने पर30, जबकि स्थिरता और संस्कृति मीडिया की उपस्थिति में योनि से गतिविधि को बनाए रखने 10 दिनों तक के लिए रोगाणुओं३७। हाल ही में, एक ०.१% GRFT जेल intravaginal एचएसवी-2 चुनौती के खिलाफ चूहों की रक्षा के लिए दिखाया गया था, यह दोनों एचएसवी के खिलाफ संरक्षण की पहली पंक्ति के लिए एक होनहार उम्मीदवार बना-2 और एचआईवी-1३२, ३८. एचआईवी के लिए विशेष रूप से, GRFT शारीरिक रूप से बाध्यकारी gp120 या टर्मिनल mannose एन-वायरल लिफाफे पर जुड़े glycan अवशेषों द्वारा संक्रमण को रोकता है प्रवेश को रोकने के लिए३८,३९,४०,४१ ,४२. इस निषेध अत्यधिक प्रबल है, आईसी के साथ५०एस आ 3 एनजी/ एचआईवी संक्रमण को बाधित करने के अलावा, अध्ययनों से यह भी पता चला है कि GRFT वायरस की कोशिका के प्रसार में बाधा द्वारा एचएसवी-2 संक्रमण के खिलाफ की रक्षा करता है३२। सभी मामलों में, GRFT वायरल कणों को चिपकने वाला हो दिखाया गया है, जबकि विकार के लिए उच्च प्रतिरोध का प्रदर्शन । पिछले, GRFT Tenofovir (TFV) और अंय antivirals४४के संयोजन के साथ synergistic गतिविधि का प्रदर्शन किया है, यह संभव है और संभव सह EFs के साथ प्रशासन के लिए लाभप्रद बना । GRFT के प्रबल गुण इसे एक उत्कृष्ट जैव-आधारित एंटीवायरल उंमीदवार बनाते हैं, जिसमें EF टेक्नोलॉजी के साथ डिलीवरी को बढ़ाया जा सकता है ।

GRFT के चिपकने वाला और सहज एंटीवायरल गुणों के इस ज्ञान का उपयोग, एक बहुलक फाइबर पाड़ डिजाइन किया गया था, कि इन गुणों को एकीकृत वायरस प्रविष्टि के पहले परत29प्रदान करते हैं । रास्ते में प्रेरणा ढूंढना है कि cervicovaginal बलगम mucoadhesive mucin बातचीत के माध्यम से मुख्य रूप से वायरस के परिवहन में बाधा, हम परिकल्पना की है कि एक पाड़ और GRFT, एक उच्च घनत्व के साथ सतह को संशोधित covalently के रूप में EFs का उपयोग करके भूतल-संयुग्मित GRFT दुर्बल और अपने entrypoint४५,४६,४७पर वायरस निष्क्रिय होगा । यहाँ EFs एक प्रोटीन आधारित, वायरल चिपकने वाला बैरियर मंच को निष्क्रिय प्रदान करने के लिए एक स्थिर पाड़ के रूप में विकसित किया गया । हम एक के साथ GRFT के शक्तिशाली एंटीवायरल गुण गठबंधन की मांग की, संगत, परिवर्तनीय, और टिकाऊ बहुलक मंच, एक उपंयास वायरस "जाल बनाने के लिए."

इन लक्ष्यों को प्राप्त करने के लिए, PLGA के शामिल तंतुओं electrospun थे, और EDC-एन एच एस रसायन को बाद में GRFT के साथ EF सतह को संशोधित किया गया । PLGA एक मॉडल electrospinning४८में अपने व्यापक उपयोग के कारण बहुलक के रूप में सेवा की, अपनी असंगति और लागत प्रभावशीलता के साथ संयुक्त । इसके अतिरिक्त, सतह संशोधन EFs के बड़े सतह क्षेत्र कारनामे, और एक उपयोगी विकल्प है कि encapsulation के साथ जोड़ा जा सकता है फाइबर उपयोगिता४९अधिकतम प्रदान करता है । पारंपरिक encapsulation तरीकों के विपरीत जहां GRFT का केवल एक हिस्सा उपलब्ध है (और केवल क्षणिक FRT में मौजूद), सतह संशोधन GRFT के उपचार की पूरी अवधि के दौरान अधिकतम करने के लिए अधिक से अधिक गतिविधि बनाए रखने के लिए सक्षम हो सकता है । इसके अलावा, प्रोटीन के रूप में हाइड्रोफिलिक यौगिकों के शामिल करने, पारंपरिक electrospinning तरीकों से, कम encapsulation क्षमता और प्रोटीन गतिविधि की हानि में परिणाम हो सकता है५०। इसलिए, GRFT सतह संशोधित फाइबर एक आशाजनक वैकल्पिक वितरण विधि है कि अकेले या संयोजन में electrospinning के साथ STI संक्रमण के खिलाफ सुरक्षा बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की पेशकश कर सकते हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. Electrospun फाइबर पाड़ की तैयारी और निर्माण

< p class = "jove_content" > सावधानी: सभी सॉल्वैंट्स या बहुलक समाधान के साथ काम एक रासायनिक धुएं डाकू में प्रदर्शन किया जाना चाहिए । प्रोटोकॉल प्रारंभ करने से पहले प्रत्येक एजेंट की सामग्री सुरक्षा डेटापत्रक का संदर्भ लें ।

  1. करने के लिए electrospin एक 3 मिलीलीटर 15% w/w PLGA बहुलक समाधान, वजन ७२० मिलीग्राम की 50:50 पाली (लैक्टिक-सह-glycolic एसिड) (PLGA; ०.५५ करने के लिए ०.७५ डीएल/जी, 31-57 केडीए) एक 10 मिलीलीटर जुटान शीशी में । समाधान की मात्रा वर्तमान अध्ययनों में प्रयुक्त विशिष्ट बैच आकार पर आधारित है ।
    नोट: बहुलक जन विलायक के एक दिया मात्रा में जोड़ने के लिए पहली बहुलक भंग करने के लिए इस्तेमाल किया विलायक के घनत्व का निर्धारण द्वारा गणना की जानी चाहिए । विलायक Hexafluoro-2-propanol (HFIP) का घनत्व १.५९ ग्राम/ इस प्रकार, विलायक के वजन, ३.० मिलीलीटर HFIP की जरूरत की मात्रा पर आधारित है, ४.८ ग्राम (३.० एमएल एक्स १.५९ ग्राम/ एक 15% डब्ल्यू के लिए PLGA के अंश/HFIP, ७२० मिलीग्राम PLGA के लिए जोड़ा जाना चाहिए ३.० एमएल HFIP (०.१५ x ४,८०० मिलीग्राम = ७२० मिलीग्राम) । % w/w बहुलक/समाधान का उपयोग करने का लाभ, बजाय यह है कि यह अंतिम समाधान का निर्धारित भार प्रदान करता है । यह निर्धारित वजन १.३ कदम के दौरान विलायक वाष्पीकरण के मामले में और अधिक सटीक विलायक प्रतिस्थापन, सक्षम बनाता है ।
  2. (१.१ से) एक सीरम ग्लास पिपेट का उपयोग कर PLGA युक्त ग्लास जुटाना शीशी में ३.० मिलीलीटर HFIP जोड़ें । प्लास्टिक की फिल्म के साथ शीशी कवर, तो उपाय और शीशी मास रिकॉर्ड.
  3. बहुलक सस्पेंशन पर रात भर ३७ & #176; ग बहुलक का पूरा विघटन सुनिश्चित करने के लिए । यदि कोई विलायक वाष्प, शीशी द्रव्यमान को कम करने, HFIP जोड़ें जब तक शीशी १.२ कदम में अपने मूल द्रव्यमान तक पहुंचता है ।
  4. के बाद, electrospinning तंत्र तैयार करें (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा २ अ ). हालांकि किसी भी आकार का एक खराद इस्तेमाल किया जा सकता है, यहां एक घूर्णन 25 मिमी बाहरी व्यास स्टेनलेस स्टील खराद कलेक्टर के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।
    नोट: एक बड़ा खराद व्यास फाइबर मोटाई में कमी, electrospinning समाधान की एक ही मात्रा दी जाएगी ।
  5. एक 3 मिलीलीटर सिरिंज में बहुलक समाधान महाप्राण.
  6. कनेक्ट एक कुंद 18 गेज, & #189; इंच सुई टिप सिरिंज के लिए और अतिरिक्त समाधान (आमतौर पर ०.२५ एमएल) वितरण सुई टिप में खाली headspace को दूर करने के लिए.
  7. एक सिरिंज पंप पर सिरिंज जगह और साधन प्रवाह दर २.० मिलीलीटर के लिए सेट/
    नोट: यह प्रवाह दर पहले इस निर्माण के लिए बहुलक चिपचिपापन के आधार पर अनुकूलित किया गया था ।
  8. सिरिंज सुई करने के लिए बिजली के स्रोत से कनेक्ट करें और + 27 केवी का एक वोल्टेज का उपयोग बहुलक समाधान electrospin. सुई और कलेक्टर के बीच की दूरी लगभग 25 सेमी (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 बी ) निर्धारित की जानी चाहिए.
    चेतावनी: electrospinning प्रक्रिया एक विलायक वाष्प बनाता है । एक धुएं डाकू या एक संलग्न तंत्र का प्रयोग करें (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा २ ) हानिकारक वाष्प को दूर करने के लिए.
  9. एक बार संपूर्ण समाधान electrospun है, बिजली के स्रोत को बंद करें और खराद को पूरी तरह से विलायक वाष्पित करने के लिए एक अतिरिक्त 30 मिनट के लिए स्पिन करने की अनुमति दें ।
  10. घूर्णन खराद कलेक्टर बारी है, और एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने के लिए खराद से फाइबर कटौती । धीरे खराद.
    11. से फाइबर छील करने के लिए ब्लेड का प्रयोग करें
  11. एक लेबल पेट्री डिश में electrospun PLGA फाइबर इकट्ठा, और एक desiccatorovernight में जगह अवशिष्ट विलायक हटाने के लिए ।
< p class = "jove_title" > 2. सतह-GRFT के साथ तंतुओं के संशोधन

  1. फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) और 2-(एन morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस बफर) के समाधान तैयार करते हैं । पंजाबियों को भंग करके तैयार करें 8 g NaCl, ०.२ g KCl, १.४४ g न 2 HPO 4 , और ०.२४ g KH 2 पो 4 1 L म ultrapure जल । इसी तरह, एमईएस बफर तैयार करने के लिए १९.५२ जी एमईएस (फ्री एसिड, मेगावाट १९५.२) और २९.२२ ग्राम ultrapure पानी की 1 एल में NaCl, भंग । प्रत्येक समाधान के अंतिम पीएच सुनिश्चित करें ७.२-७.५ और ५.०-६.० के बीच है, क्रमशः, एक पीएच मीटर का उपयोग कर ।
  2. EDC (2 मिमी) और एन एच एस (5 मिमी) के व्यक्तिगत काम समाधान तैयार करते हैं ।
    1. EDC और एन एच एस फ्रीजर से हटा दें और उंहें वजन से पहले कमरे के तापमान के लिए equilibrate करने के लिए अनुमति देते हैं ।
    2. एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में EDC के 4 मिलीग्राम वजन ।
    3. वजन 6 एक और microcentrifuge ट्यूब में एन एच एस के मिलीग्राम.
    4. प्रत्येक ट्यूब के लिए 1 मिलीलीटर एमईएस बफर जोड़ें । भंवर दोनों ट्यूबों सख्ती से सुनिश्चित करने के लिए एजेंट पूरी तरह से भंग कर रहे हैं ।
  3. एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में ७० मिलीग्राम वजनी द्वारा hydroxylamine का एक समाधान तैयार करते हैं ।
  4. hydroxylamine और भंवर को भंग करने के लिए 20 एमएल पंजाबियों जोड़ें ।
  5. मास एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब में PLGA फाइबर की एक उपयुक्त मात्रा बाहर । आमतौर पर, फाइबर की ७५ मिलीग्राम प्रत्येक प्रतिक्रिया बैच के लिए प्रयोग किया जाता है ।
  6. 15 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए एमईएस बफर के 8 मिलीलीटर जोड़ें.
  7. 1 मिलीलीटर के प्रत्येक EDC और एन एच एस ट्यूब करने के लिए पहले तैयार समाधान जोड़ें । समाधान का अंतिम खंड 10 मिलीलीटर होना चाहिए । EDC और एन एच एस के अंतिम सांद्रता ०.४ मिलीग्राम/एमएल और ०.६ मिलीग्राम/एमएल, क्रमशः होना चाहिए
  8. बंद करें और एक रोटेटर पर प्लास्टिक की फिल्म और जगह के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूब सील करने के लिए समाधान धीरे कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए औंधा हो (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 बी ). यह चरण GRFT प्रोटीन के साथ आबंध संशोधन के लिए अनुमति देने के लिए बहुलक पर carboxyl समूहों को सक्रिय करता है (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्र 3 A ).
  9. के बाद, ध्यान से प्रतिक्रिया बुझाने के लिए 14 & #181 जोड़कर; L के & #946;-mercaptoethanol करने के लिए ट्यूब. ट्यूब पलटना कई बार पूरा मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए.
    सावधानी: & #946;-mercaptoethanol अत्यधिक विषाक्त है और केवल एक रासायनिक धुएं हुड में इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
  10. supernatant और कुल्ला PLGA फाइबर दो बार, पंजाब के 10 मिलीलीटर के साथ, किसी भी शेष को दूर करने के लिए & #946;-mercaptoethanol.
  11. धोने के बाद, GRFT शेयर समाधान की एक उपयुक्त मात्रा ट्यूब करने के लिए जोड़ें । उदाहरण के लिए, एक 5 nmol GRFT/मिलीग्राम फाइबर की आवश्यकता होती है ६.३५ & #160; & #181; L के GRFT स्टॉक समाधान (एक 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक से) फाइबर की मिलीग्राम प्रति । इस प्रकार एक ७५ मिलीग्राम फाइबर नमूना ४७६.२५ & #160 की आवश्यकता होगी; & #181; L के 10 मिलीग्राम/एमएल GRFT स्टॉक समाधान.
    नोट: ०.०५, ०.५, और 5 nmol GRFT प्रति मिलीग्राम फाइबर के सैद्धांतिक लदान के साथ GRFT फाइबर गढ़े थे ।
  12. 8 मिलीलीटर करने के लिए अंतिम मात्रा लाने के लिए पर्याप्त पंजाबियों को जोड़ने, बंद करें और पूरी तरह से मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए ट्यूब पलटना.
  13. प्लास्टिक की फिल्म और एक रोटर पर फिर से जगह के साथ ट्यूब सील, 2 एच
    14. के लिए इस बार
  14. 2 एच मशीन के बाद, 15 एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में hydroxylamine समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़कर प्रतिक्रिया बुझाने । प्रति निर्माता निर्देश, शमन प्रतिक्रिया के दौरान hydroxylamine के अंतिम एकाग्रता होना चाहिए ०.७ मिलीग्राम/एमएल.
  15. घोल को अच्छी तरह मिला लें और supernatant को त्याग दें । किसी भी unconjugated GRFT को दूर करने के लिए सतह-संशोधित PLGA फाइबर को दो बार 10 मिलीलीटर ultrapure पानी के साथ कुल्ला करें ।
  16. एक पेट्री डिश के लिए फाइबर हस्तांतरण और एक desiccator के अंदर जगह जब तक फाइबर पूरी तरह से शुष्क है । पेट्री डिश को 4 & #176; C हण के लिए अंतरण.
< p class = "jove_title" > 3. GRFT सतह के SEM लक्षण-संशोधित फाइबर

  1. एक SEM नमूना माउंट पर डबल पक्षीय कार्बन टेप की एक पट्टी जगह है । नमूना माउंट के नमूने एक स्थाई मार्कर का उपयोग कर जानकारी की पहचान के साथ नीचे लेबल ।
  2. एक सतह संशोधित फाइबर से तीन नमूनों में कटौती और उन्हें अलग नमूना माउंट पर जगह है. प्रत्येक नमूने की मोटाई लगभग ०.५ mm.
  3. धूम कोट एक सोने की थाली से इलेक्ट्रॉन प्रेरित कण जमाव का उपयोग कर नमूने । ९० एस के लिए धूम कोट, २.४ केवी पर ।
    नोट: धूम कोट समय उपकरण पैरामीटर, वोल्टेज और amperage सहित के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।
  4. छवि १,००० से 5, 000X.
    5. से लेकर आवर्धन के साथ 8 केवी पर नमूने
< p class = "jove_title" > 4. सतह संशोधित तंतुओं से GRFT का निष्कर्षण

  1. मास बाहर १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में तपसिल में फाइबर की मिलीग्राम 2 ।
  2. 1 मिलीलीटर dimethyl sulfoxide (DMSO) ट्यूब, तो भंवर और गर्मी के लिए कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए पूरी तरह से फाइबर भंग जोड़ें ।
  3. के बाद, पतला एक 10 & #181; L aliquot चरण ४.२ से DMSO-फाइबर समाधान, Tris-EDTA (ते) बफ़र (pH = ८.०) में कम से १००-गुना.
  4. स्टोर नमूनों पर-20 & #176; C जब तक एलिसा के साथ लोड हो रहा है लक्षण वर्णन ।
< p class = "jove_title" > 5. फाइबर से GRFT Desorption को मापने

  1. की मात्रा का आकलन करने के लिए GRFT जारी की है या तंतु से desorbed, वजन 5-10 मिलीग्राम सतह के संशोधित फाइबर और एक microcentrifuge ट्यूब में जगह. प्रत्येक ट्यूब में फाइबर मास रिकॉर्ड.
  2. एक उपयुक्त समाधान है कि शारीरिक वातावरण ( जैसे , पंजाबियों, ते बफर, नकली योनि द्रव (SVF), आदि ) प्रत्येक नमूने के लिए नकल की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. एक घूर्णन शेखर पर 1 ज के लिए नमूने २०० आरपीएम पर, ३७ & #176; C.
  4. के बाद, ते बफर के लगभग 1 मिलीलीटर निकालने के लिए शीशी से desorbed GRFT युक्त, और क्लस्टर ट्यूबों के लिए aliquot । दुकान पर-20 & #176; ग तक प्रोटीन ठहराव.
  5. एक नया microcentrifuge ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण, microcentrifuge ट्यूब के भीतर फाइबर के लिए ताजा बफर समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ने, और अगली बार बिंदु तक मशीन ।
    6. 1, 2, 4, 6, 8, 24, ४८, ७२ एच, और 1 wk:
  6. ठेठ समय रिलीज को मापने के लिए इस्तेमाल किया अंक शामिल हैं । 4 ज.
    7. के बाद इन अध्ययनों में नगण्य desorption मनाया गया
< p class = "jove_title" > 6. ठहराव GRFT निष्कर्षण और Desorption के माध्यम एलिसा

  1. कोट एक ९६-अच्छी एलिसा थाली के साथ ०.१ मिलीलीटर की हा (10 & #181; g/एमएल) के अनुसार पहले से वर्णित < सुप वर्ग = "xref" > ५१ . प्लास्टिक की फिल्म के साथ प्लेट सील और रात भर में 4 & #176; ग (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा ४ ).
  2. कोटिंग बफर निकालें, और एक अच्छी तरह से करने के लिए ०.३ मिलीलीटर अवरुद्ध बफर (2-3% polysorbate 20) के साथ पंजाब में (BSA% गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन) जोड़ें । कमरे के तापमान पर कम से 2 ज के लिए थाली मशीन ।
  3. के बाद, प्लेट कुल्ला ०.१% polysorbate 20 (पंजाब-पी) के साथ 1x & #160;P बी एस के साथ 3 बार । धोने के बाद, संबंधित कुओं में नकारात्मक नियंत्रण के रूप में नमूना, मानक, या पंजाब के ०.१ मिलीलीटर वितरण । थाली गर्मी कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए फिर से ।
  4. धो प्लेट 3 बार फिर से पंजाबियों के साथ पी । धोने के बाद, एक अच्छी तरह से प्राथमिक एंटीबॉडी (बकरी विरोधी GRFT आनटिसम) के ०.१ मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर कम से 1 ज के लिए गर्मी । सामांयतया, प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान 1:10000 से लेकर पंजाब में पतला है ।
  5. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूने मशीन के बाद प्लेटें कुल्ला फिर से 3 बार पंजाबियों के साथ पी । माध्यमिक एंटीबॉडी के ०.१ मिलीलीटर जोड़ें (सहिजन peroxidase (एचआरपी)-संयुग्मित खरगोश विरोधी बकरी आईजीजी) के लिए एक अच्छी तरह से और गर्मी कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए । माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान से पतला है 1:10000 में पंजाब.
  6. 3 बार प्लेट धो लें । जोड़ें ०.१ मिलीलीटर TMB 2-peroxidase सब्सट्रेट करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से । मॉनिटर रंग विकास (लगभग 2 मिनट), तो जोड़ें ०.१ एमएल एच 2 तो 4 (1 N) प्रतिक्रिया बुझाने के लिए । एक प्लेट रीडर पर ४५० एनएम में थाली पढ़ें.
  7. औसत पृष्ठभूमि आयुध डिपो मूल्यों (वेल्स जो केवल पंजाब प्राप्त), और प्रयोगात्मक समूहों से इस घटाना ।

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Representative Results

फाइबर आकृति विज्ञान वायरस के खिलाफ सुरक्षा प्रदान करने के लिए सतह संशोधित EFs की क्षमता पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है. हालांकि electrospinning एक सुविधाजनक और सरल प्रक्रिया है, गैर-अनुकूलित बहुलक योगों अनियमित फाइबर आकृति विज्ञान (चित्रा 5बी सी) में परिणाम हो सकता है । electrospinning स्थितियों में परिवर्तन कि मनके या अमली चटाई की तरह morphologies के गठन में परिणाम है, अक्सर विलायक-बहुलक असंगति, कम बहुलक चिपचिपापन, प्रवाह दर, या अंय electrospinning शर्तों के कारण होते हैं । फाइबर संरचना में आने वाली विविधताओं दवा शामिल फाइबर या विकार प्रभावकारिता में विसंगतियों के लिए अलग रिलीज प्रोफाइल में परिणाम कर सकते हैं, शारीरिक रूप से या रासायनिक वायरस पैठ बाधा करने के लिए फाइबर की क्षमता में फेरबदल. वर्णित electrospinning शर्तों का उपयोग कर निर्मित PLGA EFs १.५ और २.८ µm (चित्रा 6) के बीच लेकर व्यास के साथ अलग फाइबर morphologies में परिणाम होना चाहिए. फाइबर आकृति विज्ञान और व्यास का निर्धारण करने के लिए, EFs अन्य लक्षण वर्णन या संशोधन कदम से पहले SEM के साथ जांच की जानी चाहिए.

रिक्त, ०.०५, ०.५, और 5 nmol GRFT फाइबर की SEM छवियों फाइबर आकृति विज्ञान में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाया (चित्रा 6ए-डी), यह दर्शाता है कि GRFT संशोधन फाइबर आकृति विज्ञान पर कोई प्रभाव नहीं है. प्रत्येक EF निर्माण के औसत व्यास का निर्धारण करने के लिए, ५० यादृच्छिक माप की एक ंयूनतम दृश्य के प्रति क्षेत्र SEM छवियों से लिया गया । EF योगों के औसत व्यास को ImageJ में मापा और परिकलित किया गया था, जैसा चित्रा 6Eमें दिखाया गया है । सभी EF योगों १.९ µm के आसपास समान औसत व्यास था, बैचों में unसंशोधित फाइबर निर्माण प्रक्रिया की निरंतरता का प्रदर्शन ।

efs करने के लिए GRFT संयुग्मित की मात्रा निर्धारित करने के लिए, GRFT-efs DMSO में भंग किया गया था, ते में एक १००-गुना कमजोर पड़ने के बाद बफर, फाइबर से GRFT निकालने के लिए. फाइबर की प्रति मिलीग्राम GRFT संयुग्मित की मात्रा एलिसा का उपयोग मात्रा था । प्रत्येक संशोधन घनत्व के लिए (०.०५, ०.५, और 5 मिलीग्राम फाइबर प्रति nmol GRFT), दस दोहराने मूल्यांकन किया गया । के लिए 5, ०.५, और ०.०५ nmol GRFT/mg ef संशोधनों, प्रत्येक ef था ३७३, १६५, और के प्रति मिलीग्राम ४२ एनजी GRFT, क्रमशः ०.६, ४.२, और ६.९% की विकार क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप । ये परिणाम प्रदर्शित करता है कि GRFT-EFs संयुग्मित उच्च सैद्धांतिक सतह के साथ-संशोधन घनत्व, परिणाम में अधिक GRFT संयुग्मित फाइबर (चित्रा 7ए). हालांकि, परिणामी विकार दक्षता29के साथ प्रतिलोम सहसंबंध था ।

कि adsorbed के सापेक्ष फाइबर सतह के लिए GRFT covalently संयुग्मित की मात्रा का आकलन करने के लिए, GRFT-EFs जारी SVF की मात्रा निर्धारित करने के लिए GRFT में मशीन थे. पहले 4 एच के भीतर, ११३, 25, और 10 मिलीग्राम EF प्रति GRFT के एनजी 5, ०.५, और ०.०५ nmol सैद्धांतिक संशोधन सांद्रता, क्रमशः के लिए SVF में पाया गया । ये मान 30%, ४१%, और GRFT संयुग्मित की राशि का 24% 5, ०.५, और ०.०५ nmol GRFT-EFs के लिए अनुरूप है । 4 ज के बाद, सभी तीन योगों के लिए जारी eluate में नगण्य GRFT का पता लगाया गया । 1, 2, और 4 ज के बाद GRFT रिलीज चित्रा 7बीमें दिखाया गया है । एक साथ लिया, इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि GRFT के बहुमत EFs के लिए बाध्य covalently है, और है कि सतह-adsorbed GRFT पहले 4 घंटे के भीतर जारी की है ।

Figure 1
चित्रा 1: electrospun फाइबर की macroscale आकृति विज्ञान. electrospun फाइबर दिखाया एक 4 मिमी (सिलेंडर) और 25 मिमी (शीट) व्यास खराद, क्रमशः का उपयोग कर गढ़े थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Electrospinning तंत्र । (क) इकट्ठा खराद जहां बहुलक जमा के तरल जेट विमानों, और (ख) पूर्ण electrospinning सेटअप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: EDC-एन एच एस रसायन विज्ञान का उपयोग कर GRFT के साथ EF संशोधन की योजनाबद्ध । (क) PLGA EF पर Carboxyl समूह EDC की उपस्थिति में एन एच एस के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए अमीन-प्रतिक्रियाशील एस्टर, जो बाद में GRFT के प्राथमिक अमीन के साथ बांड के बीच स्थिर फार्म होगा फार्म । (ख) दो मिलीग्राम फाइबर डिस्क या टुकड़े काट रहे है और EDC के 2 मिलीलीटर/एन एच एस एजेंट के साथ एमईएस बफर के 8 मिलीलीटर में मशीन और 15 मिनट के लिए घुमाया गया । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: योजनाबद्ध चित्रण GRFT ठहराव एलिसा प्रयोग । एक ९६-अच्छी तरह से immunoplate gp120 या हा कब्जा करने के लिए और स्थिर GRFT के साथ लेपित है । GRFT के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी, माध्यमिक सहिजन peroxidase से जुड़े एंटीबॉडी, और एलिसा सब्सट्रेट क्रमिक रूप से GRFT मात्रा में जोड़ा जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: PLGA EF आकृति पर विलायक विकल्प के प्रभाव । (A) 15% w/w PLGA EFs in HFIP प्रदर्शित वांछनीय धागा की तरह आकृति विज्ञान । (B) 15% w/w PLGA EFs क्लोरोफॉर्म और dimethylformamide में, गैर-इष्टतम विलायक विकल्प या बहुलक एकाग्रता (चिपचिपापन) के कारण फार्म करने में विफल रहा है । (C) 15% w/w और (D) 20% w/w PLGA EFs in TFE बहुलक चिपचिपापन के महत्व को प्रदर्शित करता है । कम बहुलक एकाग्रता (ग) के साथ निर्माण में गठन मोती, बहुलक एकाग्रता में वृद्धि करते हुए (विलायक चिपचिपापन) अच्छी तरह से परिभाषित फाइबर आकृति विज्ञान (डी) में हुई । नोट, चित्रा 5B को चटाई की तरह आकृति विज्ञान दिखाने के लिए कम आवर्धन पर लिया गया था । स्केल पट्टियां = 10 µm । इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: SEM छवियों और नंगे और GRFT के फाइबर व्यास-संशोधित EFs । (A) नंगे PLGA efs और PLGA efs सतह के साथ संशोधित (B) ०.०५ nmol, (C) ०.५ nmol, और (D) 5 nmol के GRFT प्रति मिलीग्राम फाइबर की. स्केल पट्टियां = 10 µm. (E) संशोधित और GRFT-EFs का व्यास । त्रुटि पट्टियों मतलब ± SEM प्रतिनिधित्व करते हैं । कोई सांख्यिकीय अंतर unसंशोधित और GRFT संशोधित फाइबर के व्यास के बीच मनाया गया । चित्र 6 ई दूल्हे एट अल से अनुकूलित किया गया है । 29 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्र 7 : GRFT संयुग्मित की मात्रा और desorbed से GRFT-संशोधित EF । (क) EF फाइबर की प्रत्येक मिलीग्राम के लिए GRFT संयुग्मित की मात्रा बढ़ GRFT प्रतिक्रियात्मक एकाग्रता के साथ बढ़ जाती है । (ख) फाइबर के प्रत्येक मिलीग्राम से जारी GRFT की मात्रा ०.०५, ०.५ के लिए दिखाया गया है, और 5 nmol योगों के बाद 1, 2, और 4 एच SVF में गर्मी. त्रुटि पट्टियों मतलब ± SEM प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा दूल्हे एट अल से अनुकूलित किया गया है । 29 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

उनके असुरक्षित संरचनाओं और बड़े सतह क्षेत्रों के कारण, EFs स्वास्थ्य में आवेदनों की एक किस्म है, जिनमें से एक चिकित्सकीय प्रसव के वाहनों के रूप में सेवारत शामिल पाया है । दवाओं और अन्य सक्रिय एजेंटों स्वरित्र वितरण के लिए EFs के भीतर शामिल किया जा सकता है, जबकि जैव तर्क और रासायनिक लाइगैंडों सेल विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए फाइबर सतह के लिए संयुग्मित जा सकता है५२ या संवेदन५३. यहां GRFT सतह के निर्माण-संशोधित PLGA EFs, एक प्रसव पाड़ के रूप में एचआईवी संक्रमण को रोकने के लिए, वर्णित है । GRFT-EFs electrospinning द्वारा संश्लेषित किया गया, कम लागत और अंय फाइबर उत्पादन विधियों के सापेक्ष उच्च उत्पादन दर के लाभ प्रदान४९,५३।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण
EFs के गठन विशेष रूप से समाधान या विलायक चिपचिपापन५४में, बहुलक समाधान के गुणों पर गंभीर रूप से निर्भर है । कारकों है कि एक बहुलक समाधान की चिपचिपाहट को प्रभावित बहुलक आणविक वजन, बहुलक एकाग्रता, और उपयोग विलायक के प्रकार शामिल हैं । समाधान या विलायक चिपचिपापन आम तौर पर बहुलक के अनुपात में विलायक को बदलने के द्वारा समायोजित है, इच्छित बहुलक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए । प्रत्येक निर्माण के साथ, मात्रा उचित बहुलक करने के लिए विलायक अनुपात (चिपचिपापन) को बनाए रखने के लिए रातोंरात गर्मी के दौरान बनाए रखा जाना चाहिए । पर्याप्त उच्च बहुलक एकाग्रता पर, बहुलक अणुओं electrospinning प्रक्रिया के दौरान समाधान में फंसाए फाइबर का उत्पादन करने के लिए । electrospinning प्रक्रिया के दौरान, एक मनका spinneret टिप पर फार्म और अगर वहां पर्याप्त बहुलक उलझाव है, तरल जेट विमानों में एक महत्वपूर्ण वोल्टेज पर इस बिंदु से उभर जाएगा और कोड़ा में तेजी लाने की तरह फैशन की ओर इकट्ठा खराद५५। विलायक वाष्पीकरण फिर thinning जेट करने के लिए नेतृत्व करेंगे, फाइबर के धागे का उत्पादन के रूप में वे इकट्ठा खराद पर जमा । एक बार संश्लेषित, EFs के लिए उचित आकृति विज्ञान और लगातार फाइबर व्यास की पुष्टि SEM द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए । मनके EFs की उपस्थिति कम समाधान चिपचिपापन५६, अत्यधिक उच्च लागू वोल्टेज५७, बहुलक फ़ीड दर५८, या सभी तीन कारकों का एक संयोजन का परिणाम हो सकता है । यदि यह मनाया जाता है, बहुलक एकाग्रता बढ़ाया जाना चाहिए और लागू वोल्टेज और फ़ीड दर समायोजित किया जाना चाहिए, फाइबर की तरह आकृति विज्ञान प्राप्त करने के लिए.

EF surface में प्रोटीन संयुग्म करने के लिए, यहां PLGA carboxyl के लिए EDC-एन एच एस carbodiimide crosslinking केमिस्ट्री५९का उपयोग करके प्रतिक्रिया व्यक्त की गई । संशोधन प्रक्रिया के दौरान, फाइबर संक्षिप्त में carboxylates के अर्द्ध स्थिर, अमीन-प्रतिक्रियाशील एस्टर में रूपांतरण में जो परिणाम एन एच एस की उपस्थिति में EDC के साथ मशीन हैं । दो कदम विकार प्रक्रिया के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक चरण के दौरान इस्तेमाल किया बफ़र्स इष्टतम पीएच, निर्माता के निर्देशों में नोट किया है, अधिकतम विकार दक्षता सुनिश्चित करने के लिए । एन एच एस एस्टर के आधे जीवन तटस्थ पीएच में चार से पांच घंटे से पर्वतमाला और नाटकीय रूप से अधिक बुनियादी स्थितियों६०में कम हो जाती है । इस प्रकार, पहली प्रतिक्रिया 5-6 पीएच पर एमईएस बफर में प्रदर्शन किया जाना चाहिए और सक्रिय फाइबर तो GRFT के साथ बाद और तत्काल प्रतिक्रिया के लिए एक पंजाबियों बफर (पीएच ७.२-७.५) के लिए हस्तांतरित किया जाना चाहिए । यह भी महत्वपूर्ण है कि EDC 2-mercaptoethanol के अलावा निष्क्रिय है और पर्याप्त carboxylate सक्रियण के बाद तंतुओं से कुल्ला किया है । यह दूसरी प्रतिक्रिया के दौरान EDC और स्वयं-crosslinking द्वारा प्रोटीन सक्रियण को रोकने में मदद करेगा, जो विकार क्षमता को कम कर सकता है ।

संशोधन और समस्या निवारण
हालांकि हमारे पिछले काम एचआईवी-1 संक्रमण के खिलाफ GRFT-संशोधित फाइबर की एक किस्म की प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया, कुछ प्रक्रिया परिवर्तन EF आकृति को अनुकूलित करने के लिए या GRFT (या अन्य प्रोटीन) विकार दक्षता या फाइबर में सुधार करने के लिए माना जा सकता है २९घनमीटर. विशेष रूप से, EF सतह क्षेत्र विकार के लिए एक बड़ा सतह क्षेत्र को सक्षम करने के लिए, फाइबर व्यास को कम करके बढ़ाया जा सकता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि बहुलक एकाग्रता को कम करने और चिपचिपापन छोटे फाइबर व्यास६१,६२पैदा करता है । हालांकि, इस दृष्टिकोण जब एकाग्रता सीमा मूल्य से नीचे है मनके फाइबर के गठन तक सीमित है । समाधान चिपचिपापन बदलने के बिना फाइबर व्यास कम करने के लिए, दोहरे विलायक प्रणालियों सतह तनाव को कम करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, या लवण समाधान चालकता को बढ़ाने के लिए जोड़ा जा सकता है५६,५७। दोनों तरीकों electrospinning जेट विमानों जो छोटे फाइबर व्यास का उत्पादन हो सकता है की अधिक से अधिक खींच सक्षम हो जाएगा । इसके अलावा, कम आणविक वजन पॉलिमर छोटे व्यास फाइबर बनाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । फाइबर व्यास घटते भी छोटे pores पैदा करने का जोड़ा लाभ प्रदान करता है, संभावित EFs वायरस प्रवेश के लिए एक बाधा के रूप में अधिक प्रभावी बनाने, microbicide-आधारित अनुप्रयोगों६३के लिए । अंत में, यह देखा गया कि नमी EF उपज को प्रभावित कर सकते हैं । उच्च आर्द्रता में, उपज असामान्य स्थूल-आकृति विज्ञान के साथ तंतुओं के गठन के कारण कम करने के लिए जाता है । electrospinning चैंबर के भीतर एक आर्द्रता नियंत्रण प्रणाली स्थापित इसलिए लगातार पैदावार के साथ EFs उत्पादन की सुविधा सकता है, अगर यह निर्माण के लिए एक चुनौती प्रस्तुत करता है ।

GRFT विकार कुशलता में सुधार करने के लिए functionalizable समूहों के चयन और स्थान की जाँच-पड़ताल पर भी विचार किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, यदि ब्याज की प्रोटीन के प्राथमिक अमीन तीन आयामी प्रोटीन संरचना के इंटीरियर के पास स्थित हैं, steric बाधा EFs पर प्राथमिक अमीन के साथ बातचीत से सक्रिय carboxyl समूहों को रोकने, जिससे कम हो सकता है प्रतिक्रिया की संभावना । प्रोटीन की सतह के करीब एक प्राथमिक अमीन समूह उत्पन्ना करने के लिए इस चुनौती को प्रोटीन के एमिनो एसिड प्रतिस्थापन से दूर किया जा सकता है । हालांकि, के रूप में GRFT और अंय प्रोटीन कार्यशीलता के लिए अपनी बाध्यकारी साइटों की विशिष्ट गतिविधि पर निर्भर, प्रोटीन के अनुरूप में परिवर्तन अच्छी तरह कार्यात्मक परख में विकार से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए ।

सीमाओं
GRFT सतह संशोधन की एक प्रमुख सीमा कम विकार carbodiimide crosslinking रसायन विज्ञान का उपयोग क्षमता के लिए क्षमता है । यदि ब्याज की एंटीवायरल प्रोटीन एक उच्च आईसी५०, एक कम विकार दक्षता (इन अनुप्रयोगों में) वायरस के संक्रमण के खिलाफ पर्याप्त सुरक्षा प्रदान नहीं कर सकते हैं । हालांकि, के लिए GRFT (या अंय संशोधित) EFs, प्रोटीन और सक्रिय एजेंट्स को बाउंड covalently नहीं हैEFs अभी भी सतह के लिए adsorb हो सकता है । ये adsorbed एजेंट क्षणिक रूप से वायरस बाइंडिंग के लिए उपलब्ध स्थानीयकृत एकाग्रता में वृद्धि करके, संयुग्मित GRFT की गतिविधि को पूरक करने की क्षमता प्रदान करते हैं । इस उदाहरण में, desorbed GRFT एचआईवी-1 virions करने के लिए सीधे EFs से संपर्क नहीं कर बाइंड कर सकते हैं, और (pericoital) व्यवस्थापन के पहले 4 h के साथ सुरक्षा का एक वैकल्पिक प्रणाली प्रदान कर सकते हैं । इस प्रकार, दोनों संयुग्मित और सतह adsorbed GRFT एसटीआई के खिलाफ वर्दी संरक्षण प्रदान करने के लिए योगदान कर सकते हैं ।

दोनों प्रोटीन विकार और desorption से संमानित संरक्षण के बावजूद, संभवतः उच्च दक्षता के साथ अंय सतह संशोधन रणनीतियों का पीछा किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, PLGA carboxyl समूहों के बजाय अमीन के साथ समाप्त संयुग्म सक्रिय GRFT के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, EF-प्रोटीन विकार दक्षता में सुधार करने के लिए एक अलग सतह-संशोधन कार्यनीति का उपयोग किया जा सकता है । EFs से बना Nanofibrous झिल्ली carbodiimide crosslinking रसायन६४के माध्यम से avidin के साथ कार्यात्मक किया गया है । Biotinylation या एक Strep-टैग के अलावा (टीआरपी-Ser-अपने-प्रो-Gln-Phe-Glu-Lys) reयुग्म के माध्यम से संशोधित प्रोटीन आबंध EFs के साथ मजबूत और अत्यंत स्थिर गैर avidin बातचीत के रूप में सक्षम हो सकता है । जबकि गैर आबंध, avidin-बायोटिन लिंकेज मजबूत गैर आबंध बंधन है, femtomolar संबध के साथ, संभावना फाइबर सतह के लिए स्थिर विकार में जिसके परिणामस्वरूप । किसी भी सतह-संशोधन रणनीतियों के लिए, steric बाधा विकार दक्षता को अधिकतम करने के लिए विचार किया जाना चाहिए ।

अंत में, हम कि सतह को संशोधित EFs सुरक्षा के पूरक मोड प्रदान करने के लिए सक्रिय एजेंट encapsulation के लिए एक वैकल्पिक रणनीति की पेशकश करेगा कल्पना । एक EF मंच पर encapsulation और सतह संशोधन प्रौद्योगिकियों के संयोजन के साथ एक विचार सतह संशोधन प्रक्रिया के दौरान सक्रिय एजेंटों के समयपूर्व रिहाई को कम किया जाएगा । सतह-संशोधन प्रतिक्रियाओं कि जलीय समाधान में अपेक्षाकृत लंबी मशीन समय की आवश्यकता के लिए, सक्रिय एजेंटों की एक महत्वपूर्ण प्रतिशत बहुलक hydrolysis के कारण खो दिया जा सकता है लोड ।

मौजूदा और वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व
पिछले काम में, हमने देखा है कि अनसंशोधित रिक्त EFs के लिए ~ ३८% द्वारा एचआईवी संक्रमण को बाधित कर रहे थे जब एक transwell में रखा infectible कोशिकाओं के ऊपर डालने के29। इस अवलोकन के साथ संयुक्त, microstructure की तरह, वेब, और efs के tortuosity मनाया शक्तिशाली एंटीवायरल और चिपकने वाला गुण GRFT के साथ समानांतर में, सतह संशोधित EFs के विकास के लिए प्रेरित किया यहां वर्णित है ।

वर्तमान में microbicide अनुप्रयोगों में कार्यरत अन्य वितरण प्रौद्योगिकियों के सापेक्ष, EFs उनके वास्तुकला और अनुकूलन के लिए क्षमता के कारण संभावित अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है । अन्य काम में, EFs के रेशेदार आकृति विज्ञान उन्हें सक्रिय एजेंटों देने के लिए सक्षम है, और ECM की नकल करने के लिए, उन्हें ऊतक इंजीनियरिंग के लिए उपयुक्त पाड़ बनाने. EFs भी किया गया है सतह संशोधित करने के लिए और अधिक बढ़ाने के निरंतर-रिलीज६५,६६।

के लिए जैव संगतता बढ़ाने या एजेंटों कि विशिष्ट बाध्यकारी गतिविधि के माध्यम से कार्य उद्धार, कई तरीकों मौजूद है कि प्लाज्मा उपचार, गीले रासायनिक तरीकों, और सतह भ्रष्टाचार के रूप में EFs की सतहों के लिए यौगिकों के लगाव के लिए अनुमति polymerizations५०. GRFT के मामले में जो विशेष रूप से एचआईवी के वायरल नच के लिए बाइंड-1, EDC के गीले रासायनिक विधि-एन एच एस सबसे इष्टतम के लिए जाल के भीतर फाइबर गहरी घुसना जबकि भी GRFT कार्यशीलता५०संरक्षण की क्षमता के कारण है । EFs के लिए GRFT मैटीरियल तो FRT को एक टिकाऊ निर्माण में दिया जा सकता है और एचआईवी संक्रमण के खिलाफ तत्काल संरक्षण प्रदान करते हैं ।

एसटीआई को बाधित करने के लिए EFs के भीतर चिकित्सीय encapsulating की मौजूदा रणनीति की तुलना में, आबंध विकार GRFT और एचआईवी virions के बीच संभावित शौकीनता को बढ़ाने का विशिष्ट लाभ प्रदान करता है । सतह के माध्यम से EFs के लिए GRFT को स्थिर करने से संशोधन, GRFT के उच्च स्थानीयकृत सांद्रता प्राप्त किया जा सकता है, जो एचआईवी के साथ multivalent बंधन के लिए अवसर में वृद्धि । इसके अलावा, EF-मैटीरियल GRFT, सॉल्यूशन में फ्री GRFT के सापेक्ष, कोशिका internalization को बाधा पहुंचाकर GRFT पूल के घट को रोक सकता है । इसके अलावा, एक स्थिर और चिपकने वाला प्रवेश अवरोधक के रूप में GRFT की कार्रवाई की अनूठी तंत्र के कारण, आबंध सतह विकार वायरस पैठ के लिए एक शारीरिक बाधा प्रदान करने के लिए सतह संशोधित EFs सक्षम बनाता है, शक्तिशाली एंटीवायरल गुणों के अलावा ।

इस विधि के भविष्य अनुप्रयोगों
प्रसव के लिए सतह-संशोधन का उपयोग एक EF मंच के भीतर एक से अधिक सक्रिय एजेंटों को एकीकृत करने का अवसर प्रस्तुत करता है । भविष्य में, हम एक बहुउद्देशीय प्रौद्योगिकी (एमपीटी) का विकास करना चाहते हैं जहां विभिन्न प्रकार के सक्रिय एजेंटों के भीतर और संयुग्मित को EFs में समझाया जा सकता है । इन MPTs को कार्रवाई के विभिंन तंत्र के साथ चिकित्सीय चिकित्सा शामिल करके रोगजनकों की एक व्यापक श्रेणी के खिलाफ संरक्षण प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है । कार्रवाई के विभिन्न तंत्र के साथ सक्रिय एजेंटों देने के लिए efs के दोनों सतह और इंटीरियर का उपयोग करके, efs वायरस संक्रमण के खिलाफ की रक्षा के लिए अधिकतम किया जाएगा की क्षमता ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस अनुसंधान के वित्तपोषण के लिए उत्कृष्टता के लिए यहूदी विरासत कोष के लिए आभारी हैं । हम उदारता से electrospinning प्रणाली के उपयोग प्रदान करने के लिए डॉ स्टुअर्ट विलियंस द्वितीय धंयवाद । हम भी Griffithsin के साथ हमें प्रदान करने के लिए डॉ केनेथ पामर धंयवाद । हम इसके अलावा GRFT एलिसा काम में हमें प्रशिक्षण के लिए डॉ Nobuyuki Matoba और उनकी प्रयोगशाला का धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
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इंजीनियरिंग अंक १२८ Electrospun फाइबर यौन संचारित संक्रमण मानव इम्यूनो वायरस सतह-संशोधन microbicide Griffithsin पाली (लैक्टिक-co-glycolic एसिड)
यौन संचारित संक्रमणों की रोकथाम के लिए Griffithsin-संशोधित फाइबर पाड़ों का निर्माण और लक्षण वर्णन
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Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).

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