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Bioengineering

Fabbricazione e caratterizzazione di fibra Griffithsin-modificato ponteggi per la prevenzione delle infezioni sessualmente trasmesse

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

Questo manoscritto descrive la procedura per fabbricare e caratterizzare fibre elettrofilate per volta Griffithsin poli (acido lattico-co-glicolico) che illustrano le attività di adesivo ed antivirale potente contro l'infezione di tipo 1 del virus dell'immunodeficienza umana in vitro. Metodi utilizzati per sintetizzare, superficie-modificare e caratterizzare la morfologia risultante, coniugazione, e desorbimento di Griffithsin dalle fibre modificate in superficie sono descritti.

Abstract

Fibre elettrofilate (EFs) sono stati ampiamente utilizzati in una varietà di applicazioni terapeutiche; Tuttavia, solo recentemente sono stati applicati come una tecnologia per prevenire e curare sessualmente trasmissibili (malattie sessualmente trasmissibili). Inoltre, molte tecnologie di EF concentrano sull'incapsulamento l'agente attivo, rispetto che utilizzano la superficie per impartire biofunzionalità. Qui descriviamo un metodo per fabbricare e superficie-modificare le fibre elettrofilate (PLGA) acidi poly(lactic-co-glycolic), con il potente antivirale lectin Griffithsin (GRFT). PLGA è un polimero approvato dalla FDA che è stato ampiamente utilizzato nella somministrazione di farmaci a causa di sue eccezionali proprietà chimiche e biocompatibile. GRFT è un naturale, potente, sicuro lectin che possiede vasta attività contro numerosi virus compreso il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1 (HIV-1). Quando combinati, GRFT-modificato fibre hanno dimostrato potente inattivazione di HIV-1 in vitro. Questo manoscritto descrive i metodi per fabbricare e caratterizzare GRFT-modificato EFs. In primo luogo, PLGA è elettrofilate per creare un'impalcatura di fibra. Le fibre sono successivamente modificate in superficie con GRFT utilizzando 1-etil - 3-(3-dimetetilpropile) carbodiimide (EDC) e N-Idrossisuccinimide (NHS) chimica. Microscopia elettronica (SEM) è stato utilizzato per valutare la dimensione e la morfologia delle formulazioni modificate in superficie. Inoltre, un gp120 o emoagglutinina (HA)-ELISA base può essere usato per quantificare la quantità di GRFT coniugato a, come pure il desorbimento GRFT dalla superficie della fibra. Questo protocollo può essere applicato più ampiamente per fabbricare fibre che vengono modificate in superficie con una varietà di differenti proteine.

Introduction

L'utilizzo di EFs come una piattaforma di consegna attuale ha il potenziale per ridurre in modo significativo le malattie sessualmente trasmissibili. Attualmente, ci sono oltre 36 milioni persone affette da HIV, con oltre 2 milioni di nuovi casi segnalati nel 2015 solo1,2. Inoltre, virus herpes simplex tipo 2 (HSV-2) infezione colpisce centinaia di milioni di persone in tutto il mondo e ha dimostrato di migliorare l'acquisizione dell'HIV da 2-5 volte3. A causa di questa relazione tra infezione HSV-2 e acquisizione di HIV, c'è notevole interesse nello sviluppo di nuovi agenti attivi che forniscono protezione simultanea contro più di malattie sessualmente trasmissibili. Inoltre, lo sviluppo di nuovi veicoli per migliorare l'erogazione di questi agenti antivirali offre il potenziale per migliorare ulteriormente la potenza protettiva e terapeutica. Verso questo obiettivo, EFs sono stati studiati come una nuova piattaforma di consegna per ridurre la prevalenza di infezioni da HIV-1 e HSV-2.

Durante le due decadi scorse, EFs sono stati ampiamente utilizzati nei campi della somministrazione di farmaci e di ingegneria del tessuto4. Spesso, polimeri biocompatibili sono selezionati per tradurre facilmente per applicazioni terapeutiche. Per fabbricare polimerici EFs, il polimero selezionato è disciolto in una soluzione acquosa o solvente organica, a seconda del grado di idrofobicità di litio5. Agenti attivi di interesse vengono quindi aggiunti alla soluzione acquosa o solvente prima del processo di elettrofilatura. La soluzione di polimero viene poi aspirata in una siringa e lentamente espulso mentre è soggetto ad una corrente elettrica. Questo processo normalmente produce fibre di polimeri con foglio o macrostrutture cilindrico (Figura 1) e diametri di fibra che vanno dai6ai micro-nano-scala. Per le applicazioni più terapeutiche, agenti attivi sono incorporati nelle fibre durante il processo di elettrofilatura e vengono rilasciati dalla fibra tramite diffusione e degradazione della fibra successive. Il tasso di degradazione o di rilascio può essere modificato utilizzando diversi tipi di polimeri o miscele di polimeri per stabilire un profilo di rilascio desiderata, impartendo le proprietà chimiche e fisiche uniche7e promuovere l'incapsulamento di praticamente qualsiasi composti. Come tale, EFs hanno dimostrato benefici alla consegna dei farmaci piccola molecola e agenti biologici tra cui proteine, peptidi, oligonucleotidi e fattori di crescita6,8,9.

Nel campo della prevenzione di STI, EFs sono stati recentemente utilizzati per incorporare e fornire o inducibile-rilascio prolungato di agenti antivirali10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. In uno degli studi più in anticipo, fibre pH-sensible a reagire sono stati sviluppati per rilasciare agenti attivi in risposta ai cambiamenti ambientali all'interno del tratto riproduttivo femmina (FRT), come un metodo su richiesta di protezione contro l'HIV-111. Da allora, altri studi hanno studiato i miscugli di polimeri composto di ossido di polietilene (PEO) e acido poli-L-lattico (PLLA), per valutare il rilascio sintonizzabile di agenti antivirali e contraccettivi per HIV-1 prevenzione e contraccezione in vitro 12. studi supplementari hanno dimostrato la fattibilità di EFs per fornire la seguente documentazione: prolungato rilascio di piccole molecole antivirali14, forte e flessibile proprietà meccaniche20, architetture 3D consegna21 , inibizione di sperma penetrazione12e la capacità di fondersi con altre tecnologie di consegna13. Infine, il lavoro precedente ha valutato fibre polimeriche per la consegna di sostenuta degli agenti antivirali contro il virus co-infective comuni, HSV-2 e di HIV-114. In questo studio, fibre polimeriche fornito attività complementare alla consegna antivirale mantenendo la loro struttura per fino a 1 mese e fornendo una barriera fisica per entrata virale. Da questi risultati, è stato osservato che EFs può essere utilizzato sia fisicamente e chimicamente ostacolare l'infezione del virus.

Mentre rilascio sintonizzabile proprietà rendono polimerici EFs una piattaforma attraente recapito per la consegna di microbicida, EFs sono state sviluppate in altre applicazioni per servire come scaffold modificate in superficie7. EFs sono stati utilizzati per simulare la morfologia della matrice extracellulare (ECM), spesso agendo come scaffold per la rigenerazione cellulare22di migliorare e potenziare la loro utilità in tessuto ingegneria23,24. Fibre di polimeri come poli-ε-caprolattone (PCL) e PLLA sono state modificate in superficie con fattori di crescita e proteine dopo elettrofilatura per conferire proprietà simil-ECM cui adesione e la proliferazione cellulare aumentata25 , 26. Inoltre, EFs modificate in superficie antimicrobica sono state valutate per impedire la crescita di batteri patogeni specifici27,28. A causa di questa versatilità e la capacità di indurre effetti biologici, tecnologia EF continua ad espandersi attraverso una varietà di campi per fornire funzionalità di multi-meccanicistico. Eppure, nonostante la loro utilità in una varietà di applicazioni, fibre modificate in superficie solo di recente sono stati esplorati nel campo microbicida29.

In parallelo con lo sviluppo di nuove tecnologie per la distribuzione per prevenire e curare le malattie sessualmente trasmissibili, approcci terapeutici biologici sono stati sviluppati. Uno dei più promettenti candidati microbicida è l'adesivo lectina antivirale, GRFT30. Originariamente derivato da una specie di alghe rosse, GRFT ha dimostrato l'attività come un potente inibitore dell'HIV, HSV-2, SARS, così come l'epatite C virus31,32,33,34, 35 , 36. infatti, tra inibitori biologicamente-based, GRFT ha la più potente attività anti-HIV, inattivando HIV-1 quasi immediatamente al contatto30, mantenendo stabilità e attività in presenza di terreni di coltura da vaginale microbi per fino a 10 giorni37. Più recentemente, un gel GRFT 0,1% è stato indicato per proteggere i topi contro intravaginale sfida di HSV-2, che lo rende un candidato di promessa per la prima linea di protezione contro HSV-2 sia HIV-132, 38. per HIV in particolare, GRFT inibisce l'infezione legandosi fisicamente i residui di glycan N-collegati di mannosio gp120 o terminal su superfici di envelope virale per prevenire la voce38,39,40,41 ,42. Questa inibizione è altamente potente, con IC50s avvicina 3 ng/mL43. Oltre ad inibire l'infezione da HIV, studi hanno anche dimostrato che GRFT protegge contro l'infezione HSV-2 inibendo la diffusione della cellula--cellula del virus32. In tutti i casi, il GRFT ha dimostrato di essere adesivo di particelle virali, pur dimostrando elevata resistenza alla denaturazione. Ultima, GRFT ha dimostrato l'attività sinergica con combinazioni di Tenofovir (TFV) e altri farmaci antivirali44, rendendo fattibile e probabilmente utile per somministrare con EFs. Le potenti proprietà di GRFT rendono un eccellente candidato antivirale biologicamente-based, in cui la consegna può essere migliorata con tecnologia EF.

Utilizzando questa conoscenza delle proprietà adesive e innata antivirale di GRFT, un'impalcatura di fibra polimerica è stata progettata, che integra queste proprietà per fornire il primo strato di virus voce inibizione29. Trovare ispirazione nel modo che cervicovaginali muco ostacola il trasporto virus principalmente attraverso interazioni di mucina mucoadesive, abbiamo supposto che utilizzando EFs come un'impalcatura e covalenza modificando la superficie con GRFT, un'alta densità di superficie-coniugati GRFT sarebbe debilitano e inattivare il virus al suo entrypoint45,46,47. Qui EFs sono stati sviluppati come un ponteggio fisso per fornire una piattaforma virale, basato su proteine inattivanti adesivo barriera. Abbiamo cercato di combinare le potenti proprietà antivirali di GRFT con una piattaforma di polimero biocompatibile, modificabile e durevole, per creare un virus novello "trappola".

Per raggiungere questi obiettivi, fibre composto da PLGA erano elettrofilate e chimica di EDC-NHS è stato utilizzato per modificare in seguito la superficie EF con GRFT. PLGA servito come un polimero modello dovuto il relativo uso esteso in elettrofilatura48, combinato con la sua biocompatibilità e rapporto costo-efficacia. Inoltre, modificazione superficiale sfrutta l'ampia superficie di EFs e fornisce un'alternativa utile che può essere combinata con incapsulamento per massimizzare la fibra utilità49. A differenza dei metodi tradizionali di incapsulamento dove solo una parte del GRFT è disponibile (e solo transitoriamente presenti nella FRT), modificazione superficiale può abilitare GRFT mantenere la massima bioattività durante tutta la durata del trattamento. Inoltre, l'incorporazione dei composti idrofili quali proteine, dai metodi tradizionali di elettrofilatura, potrebbero inferiore incapsulamento efficienze e perdita di proteina attività50. Di conseguenza, fibre di modificazione superficiale GRFT possono offrire un promettente metodo di consegna alternativo che può essere utilizzato da solo o in combinazione con elettrofilatura per migliorare la protezione contro l'infezione di STI.

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Protocol

1. preparazione e montaggio dell'impalcatura di fibre elettrofilate

Attenzione: tutti i lavori con solventi o soluzioni di polimero devono essere eseguiti in una cappa chimica . Vedere la scheda tecnica di sicurezza materiale di ciascun reagente prima di iniziare il protocollo.

  1. a electrospin una soluzione di polimero di 3 mL 15% w/w PLGA, pesare 720 mg di 50: 50 poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA; 0,55-0,75 dL/g, 31-57 kDa) in un flacone da 10 mL di scintillazione. Il volume della soluzione si basa sui vostri lotti tipici utilizzati negli studi attuali.
    Nota: La massa di polimero per aggiungere a un determinato volume di solvente deve essere calcolata dal primo determinazione della densità del solvente utilizzato per sciogliere il polimero. La densità del solvente Hexafluoro-2-propanolo (HFIP) è 1,59 g/mL. Così, il peso di solvente, basato su un volume di 3,0 mL HFIP necessari, è 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). Per una frazione di 15% w/w di PLGA per HFIP 720 mg PLGA deve essere aggiunto a 3,0 mL HFIP (0,15 x 4.800 mg = 720 mg). Il vantaggio dell'utilizzo di un polimero/soluzione % w/w, anziché % w/v, è che questo fornisce un peso definito della soluzione finale. Questo peso definito consente una più accurata sostituzione solvente, nel caso di evaporazione del solvente durante passaggio 1.3.
  2. Aggiungere 3,0 mL HFIP nel flaconcino di scintillazione di vetro contenente PLGA (dal punto 1.1) usando una pipetta di vetro sierologica. Coprire il flaconcino con pellicola di plastica, poi misurare e registrare il flaconcino mass.
  3. Incubare la sospensione di polimero durante la notte a 37 ° C per garantire la completa dissoluzione del polimero. Se qualsiasi solvente evapora, diminuendo la massa di fiala, aggiungere HFIP fino a quando il flaconcino raggiunge sua massa originale nel passaggio 1.2.
  4. Dopo l'incubazione, preparare l'apparato di elettrofilatura ( Figura 2 A). Anche può essere usato un mandrino di qualsiasi dimensione, qui un rotazione mandrino in acciaio inox di diametro esterno 25 mm è stato usato come il collettore.
    Nota: Un più grande diametro del mandrino consentirà di ridurre lo spessore della fibra, dato lo stesso volume di soluzione di elettrofilatura.
  5. Aspirare la soluzione di polimero in una siringa da 3 mL.
  6. Collegare una punta smussata del ago calibro 18, ½ pollice alla siringa ed erogare la soluzione in eccesso (in genere 0,25 mL) per rimuovere il vuoto dello spazio di testa nella punta dell'ago.
  7. Posizionare la siringa su una pompa a siringa e impostare la velocità di flusso di strumento a 2,0 mL/h.
    Nota: La portata precedentemente è stata ottimizzata basata sulla viscosità del polimero per questa formulazione.
  8. Collegare la fonte di energia per l'ago della siringa ed electrospin la soluzione di polimero utilizzando una tensione di + 27 kV. La distanza tra l'ago e il collettore deve essere impostata su circa 25 cm ( Figura 2 B).
    Attenzione: Il processo di elettrofilatura crea un vapore solvibile. Utilizzare una cappa aspirante o un apparecchio chiuso ( Figura 2) per rimuovere il vapore nocivo .
  9. Una volta che l'intera soluzione è elettrofilate, spegnere la fonte di alimentazione e consentire il mandrino a girare per altri 30 min far evaporare completamente il solvente.
  10. Turn off il collettore mandrino rotante e usare una lama di rasoio per tagliare la fibra dal mandrino. Utilizzare la lama per Sbucci delicatamente la fibra da mandrino.
  11. Raccogliere la fibra PLGA elettrofilate in una capsula di Petri con etichetta e inserire in un desiccatorovernight per rimuovere il solvente residuo.

2. Superficie-modifica delle fibre con GRFT

  1. preparare soluzioni di tampone fosfato salino (PBS) e 2-(N-morfolino) ethanesulfonic acido (buffer di MES). Preparate PBS sciogliendo 8 g NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 e 0,24 g KH 2 PO 4 in 1 L di acqua ultrapura. Allo stesso modo, sciogliere g 19,52 MES (acido libero, 195,2 MW) e 29,22 g NaCl in 1 L di acqua ultrapura, per preparare il tampone di MES. Garantire il pH finale di ogni soluzione è compreso tra 7.2-7.5 e 5.0-6.0, rispettivamente, utilizzando un misuratore di pH.
  2. Preparare soluzioni individuali di lavoro di EDC (2 mM) e NHS (5 mM).
    1. Rimuovere l'EDC e NHS dal freezer e consentire loro di stabilizzare a temperatura ambiente prima della pesatura.
    2. Pesare 4 mg di EDC in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
    3. Pesare 6 mg di NHS in un altro tubo del microcentrifuge.
    4. Aggiungere 1 mL MES buffer per ogni tubo. Vortice di entrambi i tubi energicamente affinché i reagenti sono completamente dissolte.
  3. Preparare una soluzione di idrossilammina pesando 70 mg in una provetta conica per centrifuga da 50 mL.
  4. Aggiungere 20 mL di PBS per l'idrossilammina e vortex per sciogliere.
  5. Massa fuori una quantità appropriata di fibra di PLGA in una provetta da centrifuga a fondo conico da 15 mL. In genere, 75 mg di fibra viene utilizzato per ogni batch di reazione:.
  6. Aggiungere 8 mL di tampone MES per il tubo da 15 mL.
  7. Aggiungere 1 mL delle soluzioni EDC e NHS preparato in precedenza sul tubo. Il volume finale della soluzione dovrebbe essere 10 mL. Le concentrazioni finali di EDC e NHS dovrebbero essere 0,4 mg/mL e 0,6 mg/mL, rispettivamente.
  8. Nelle vicinanze e sigillare il tubo da 15 mL con film plastico e mettere su un rotatore per consentire la soluzione deve essere invertito delicatamente per 15 min a temperatura ambiente ( Figura 3 B). Questo passaggio consente di attivare i gruppi carbossilici il polimero per consentire modifica covalente con la proteina GRFT ( Figura 3 A).
  9. Dopo l'attivazione, attentamente placare la reazione aggiungendo 14 µ l di β-mercaptoetanolo al tubo. Capovolgere la provetta diverse volte a garantire la completa miscelazione.
    Attenzione: β-mercaptoetanolo è altamente tossico e deve essere utilizzato solo in una cappa chimica.
  10. Scartare il surnatante e lavare due volte, la fibra PLGA con 10 mL di PBS, per rimuovere qualsiasi residuo β-mercaptoetanolo.
  11. Dopo il risciacquo, è necessario aggiungere una quantità appropriata di soluzione stock GRFT al tubo. Ad esempio, un 5 nmol fibra GRFT/mg richiederebbe 6,35 µ l di soluzione madre GRFT (da uno stock di 10 mg/mL) per mg di fibra. Quindi un campione di fibra 75mg richiederebbe 476.25 µ l di soluzione madre di 10 mg/mL GRFT.
    Nota: Fibre GRFT con carichi teorici di 0,05 e 0,5 nmol 5 GRFT per fibra di mg sono stati fabbricati.
  12. Aggiungere abbastanza PBS per portare il volume finale a 8 mL, chiudere e capovolgere la provetta per garantire la completa miscelazione.
  13. Guarnizione tubo con film plastico e posto su un rotore di nuovo, questa volta per 2 h.
  14. Dopo il 2 h incubazione, placare la reazione aggiungendo 2 mL di soluzione di idrossilammina nella provetta da centrifuga da 15 mL. Secondo le istruzioni del produttore, la concentrazione finale di idrossilammina durante la reazione di tempra dovrebbe essere di 0,7 mg/mL.
  15. Mescolare bene la soluzione e scartare il surnatante. Sciacquare la fibra PLGA modificate in superficie due volte con 10 mL di acqua ultrapura per rimuovere qualsiasi non coniugata GRFT.
  16. Trasferire la fibra ad una capsula di Petri e posto all'interno di un essiccatore fino a quando la fibra è completamente asciutta. Trasferimento di Petri a 4 ° C per deposito.

3. SEM caratterizzazione di GRFT superficie-modificata fibre

Monte campione
  1. luogo una striscia di nastro biadesivo carbonio su un SEM. Etichettare il fondo del supporto del campione con le informazioni di identificazione del campione usando un pennarello indelebile.
  2. Tagliare tre campioni da una fibra ottica modificate in superficie e metterli su supporti separati esemplare. Lo spessore di ogni campione è di circa 0,5 mm.
  3. Polverizzi ricoprire i campioni utilizzando deposizione delle particelle di elettrone-indotta da un piatto di oro. Sputter cappotto per 90 s, a 2,4 kV.
    Nota: Il tempo di cappotto Polverizzi variano a seconda dei parametri di attrezzature, tra cui tensione e amperaggio.
  4. i campioni di immagine a 8 kV con un ingrandimento che vanno da 1.000 a 5, 000 x.

4. Estrazione di GRFT da fibre modificate in superficie

  1. massa fuori 2 mg di fibra in triplice copia in provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
  2. Aggiungere solfossido dimetilico 1ml (DMSO) nella provetta, quindi vortex e incubare per 1 min a temperatura ambiente per sciogliere completamente la fibra.
  3. Dopo l'incubazione, diluire un'aliquota di 10 µ l di la soluzione di DMSO-fibra dalla fase 4.2, almeno 100 volte in tampone Tris-EDTA (TE) (pH = 8,0).
  4. Conservare i campioni a-20 ° C fino al caricamento di caratterizzazione con ELISA.

5. Misura GRFT desorbimento dalle fibre

  1. per valutare la quantità di GRFT rilasciato o sotto esame desorbita dalla fibra, pesare 5-10 mg di modificazione superficiale della fibra e posto in un tubo del microcentrifuge. Registrare la massa di fibra in ciascun tubo.
  2. Aggiungere 1 mL di una soluzione adeguata che riproduce l'ambiente fisiologico (per esempio, PBS, buffer di TE, fluido vaginale simulato (SVF), ecc.) per ogni campione.
  3. Incubare i campioni per 1 ora su un agitatore rotante a 200 giri/min, 37 ° C.
  4. Dopo incubazione, rimuovere circa 1 mL di buffer di TE contenente il GRFT desorbito dal flaconcino e aliquota al cluster tubi. Conservare a-20 ° C fino alla quantificazione della proteina.
  5. Trasferire il campione ad un nuovo tubo del microcentrifuge, aggiungere 1 mL di soluzione tampone fresco alla fibra all'interno del tubo del microcentrifuge e incubare fino al prossimo punto di tempo.
  6. Punti di tempo tipico usati per misurare il rilascio includono: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 ore e 1 settimana desorbimento trascurabile è stata osservata in questi studi dopo 4 h.

6. Quantificazione di estrazione GRFT e desorbimento via ELISA

  1. cappotto a 96 pozzetti ELISA piastra con 0,1 mL di HA (10 µ g/mL) per pozzetto come precedentemente descritto 51. Sigillare la piastra con la pellicola di plastica e incubare per una notte a 4 ° C ( Figura 4).
  2. Rimuovere il tampone di rivestimento e aggiungere 0,3 mL bloccante tampone (2-3% albumina di siero bovino (BSA) in PBS con 0.05% polisorbato 20) ad ogni pozzetto. Incubare la piastra per almeno 2 ore a temperatura ambiente.
  3. Dopo l'incubazione, risciacquare la piastra 3 volte con PBS 1x con 0,1% polisorbato 20 (PBS-P). Dopo il risciacquo, pipettare 0,1 mL di campione, standard o PBS come controllo negativo nei relativi pozzetti. Incubare la piastra ancora per 1 ora a temperatura ambiente.
  4. Risciacquare la piastra 3 volte con PBS-P. Dopo il risciacquo, aggiungere 0,1 mL di anticorpo primario (antisiero anti-GRFT di capra) in ogni pozzetto e incubare per almeno 1 h a temperatura ambiente. In genere, la soluzione di anticorpo primario è diluita 1: 10.000 in PBS.
  5. Dopo incubazione dei campioni con risciacquo di anticorpo primario le piastre ancora 3 volte con PBS-P. Aggiungere 0,1 mL di anticorpo secondario (perossidasi di rafano (HRP)-anti-capra coniglio coniugato IgG) ad ogni pozzetto ed incubare per 1 h a temperatura ambiente. La soluzione di anticorpo secondario è diluita 1: 10.000 in PBS.
  6. Lavare la piastra 3 volte. Aggiungere 0,1 mL TMB 2-perossidasi substrato in ciascun pozzetto. Monitorare lo sviluppo del colore (circa 2 min), quindi aggiungere 0,1 mL H 2 così 4 (1 N) per placare la reazione. Leggere la piastra a 450 nm in un lettore di piastra.
  7. Media dei valori OD di sfondo (pozzi che ricevono solo PBS) e questo deve essere sottratto i gruppi sperimentali.

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Representative Results

Morfologia delle fibre ha un effetto significativo sulla capacità di modificazione superficiale EFs per fornire protezione contro i virus. Anche se elettrofilatura è una procedura semplice e conveniente, formulazioni polimeriche non ottimizzato possono provocare la morfologia delle fibre irregolari (Figura 5B-C). Alterazioni in condizioni di elettrofilatura che risultano nella formazione di morfologie di mat-come perline o amorfe, sono spesso causati da incompatibilità di polimero-solvente, viscosità del polimero basso, portata o altre condizioni di elettrofilatura. Profili di rilascio diverse fibre di droga-incorporato o incoerenze nell'efficacia di coniugazione, alterando la capacità di fibre fisicamente o chimicamente ostacolare la penetrazione del virus possono causare le variazioni risultanti nella struttura della fibra. L'EFs di PLGA fabbricato utilizzando le condizioni di elettrofilatura descritto dovrebbe provocare morfologie distinte fibra con diametri compresi tra 1,5 e 2,8 µm (Figura 6). Per determinare il diametro e la morfologia delle fibre, EFs devono essere valutati con SEM prima altri passaggi di caratterizzazione o la modifica.

Immagini di SEM di vuoto, 0.05, 0,5 e 5 nmol GRFT fibre ha mostrato nessuna differenza significativa nella morfologia delle fibre (Figura 6A-D), che indica che modifica GRFT non ha alcun effetto sulla morfologia delle fibre. Per determinare il diametro medio di ogni formulazione di EF, un minimo di 50 misurazioni casuali sono state scattate al campo di vista dalle immagini SEM. Il diametro medio delle formulazioni EF stato misurato e calcolato in ImageJ, come illustrato nella Figura 6E. Tutte le formulazioni di EF ha avuto simili diametri medio intorno a 1,9 µm, dimostrando la coerenza del processo di fabbricazione della fibra non modificato in batch.

Per determinare che la quantità di GRFT coniugato di EFs, GRFT-EFs è stato dissolto in DMSO, seguita da una diluizione 100 volte nel buffer di TE, per estrarre GRFT dalla fibra. La quantità di GRFT coniugato per mg di fibra è stata quantificata mediante ELISA. Per ogni densità di modificazione (0,05, 0,5 e 5 nmol GRFT per fibra di mg), sono stati valutati dieci repliche. Per il 5, 0,5 e 0,05 nmol EF GRFT/mg modifiche, ogni EF aveva 373, 165 e 42 ng GRFT per mg di EF, conseguente efficienze di coniugazione di 0,6, 4.2 e 6,9%, rispettivamente. Questi risultati dimostrano che GRFT-EFs coniugato con alta densità di modificazione della superficie teorica, risultato in più GRFT coniugato alla fibra (Figura 7A). Tuttavia, c'era una correlazione inversa con il risultante di efficienza di coniugazione29.

Per valutare la quantità di GRFT coniugati covalentemente alla superficie della fibra rispetto a quello adsorbito, GRFT-EFs sono stati incubati in SVF per determinare la quantità di GRFT rilasciato. Entro le prime 4 ore, 113, 25 e 10 ng di GRFT a mg EF è stato rilevato in SVF per il 5, 0,5 e 0,05 nmol teorica modifica concentrazioni, rispettivamente. Questi valori corrispondono al 30%, 41% e 24% della quantità di GRFT coniugato a 5, 0,5 e 0,05 nmol GRFT-EFs. Dopo 4 h, trascurabile GRFT è stato rilevato l'eluato di rilascio per tutte e tre le formulazioni. Rilascio GRFT dopo 1, 2 e 4 h è illustrato nella Figura 7B. Presi insieme, questi dati indicano che la maggior parte dei GRFT è legame covalente con EFs, e che la superficie adsorbito GRFT viene rilasciato entro le prime 4 ore.

Figure 1
Figura 1: morfologia delle fibre elettrofilate macroscala. Le fibre elettrofilate mostrate furono fabbricate usando un 4mm (cilindro) e mandrino di diametro di 25 mm (foglio), rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: apparato di elettrofilatura. Mandrino (A) la raccolta dove depositare i getti di liquidi del polimero e (B), il programma di installazione completo di elettrofilatura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: modifica schematica di EF con GRFT utilizzando chimica EDC-NHS. Gruppi carbossilici di (A) sul reagire PLGA EF con NHS in presenza di EDC agli esteri ammina-reattivo di forma, che formerà successivamente legami ammidici stabile con le ammine primarie di GRFT. (B) due milligrammi fibra dischi o pezzi sono tagliati e incubati in 8 mL di buffer di MES con 2 mL di reagente EDC/NHS e ruotati per 15 min. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: schematico che illustra la quantificazione GRFT usando ELISA. Un immunoplate 96 pozzetti è ricoperto di gp120 o HA per catturare e immobilizzare GRFT. Gli anticorpi primari contro GRFT, anticorpi secondari collegati a perossidasi di rafano e substrato ELISA vengono aggiunti in sequenza per quantificare GRFT. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: effetti del solvente scelta sulla morfologia di PLGA EF. (A), il 15% w/w PLGA EFs in auspicabile HFIP visualizzate thread-come la morfologia. (B) 15% w/w PLGA EFs in cloroformio e dimetilformammide, è Impossibile di forma a causa della scelta di solvente non ottimale o concentrazione di polimero (viscosità). (C) il 15% w/w e (D) 20% w/w PLGA EFs in TFE dimostrano l'importanza della viscosità dei polimeri. Perline formano nella formulazione con concentrazione più bassa di polimero (C), mentre l'aumento della concentrazione di polimero (solvente viscosità) ha provocato la morfologia delle fibre ben definito (D). Si noti che nella figura 5B è stata presa a un ingrandimento minore per mostrare la stuoia-come la morfologia. Barre di scala = 10 µm.

Figure 6
Figura 6: Immagini al SEM e diametri di fibra di EFs nudo e GRFT-modified. (A) nudo PLGA EFs e PLGA EFs modificate in superficie con (B) 0,05 nmol, (C) 0,5 nmol e (D) 5 nmol di GRFT per mg di fibra. Barre di scala = 10 µm. (E) diametri non modificato e GRFT-EFs. Barre di errore rappresentano la media ± SEM Nessuna differenza statistica è stata osservata fra i diametri delle fibre non modificate e GRFT-modificato. Figura 6 E è stato adattato da Grooms et al. 29 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 : Quantità di GRFT coniugato a e sotto esame desorbita dal GRFT-modificato EF. (A) la quantità di GRFT coniugato ad ogni mg di EF fibra aumenta con una maggiore concentrazione di reagente GRFT. (B) la quantità di GRFT rilasciato da ogni mg di fibra è riportata per il 0,05, 0,5 e 5 nmol formulazioni dopo 1, 2 e 4 h di incubazione in SVF. Barre di errore rappresentano la media ± SEM Questa figura è stata adattata da Grooms et al. 29 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Grazie alle strutture porose e grandi superfici, EFs hanno trovato una varietà di applicazioni nel settore sanitario, uno dei quali comprende che serve come veicoli di consegna terapeutico. Farmaci e altri agenti attivi possono essere incorporati all'interno di EFs per consegna sintonizzabile, mentre biologics e leganti chimici possono essere coniugati alla superficie della fibra per cellula-specifico targeting52 o biosensoristica53. Qui la fabbricazione di GRFT modificate in superficie PLGA EFs, come un'impalcatura di consegna per prevenire l'infezione da HIV, è descritto. GRFT-EFs sono stati sintetizzati da elettrofilatura, fornendo i vantaggi del tasso di basso costo ed alta produzione rispetto altri fibra produzione metodi49,53.

Fasi critiche nel protocollo
La formazione di EFs dipende criticamente le proprietà della soluzione polimerica, in particolare il solvente o soluzione viscosità54. I fattori che influenzano la viscosità di una soluzione polimerica includono peso molecolare del polimero, la concentrazione di polimero e il tipo di solvente utilizzato. La soluzione o la viscosità del solvente viene in genere regolata modificando il rapporto del polimero in solvente, per ottenere la concentrazione desiderata di polimero. Con ogni fabbricazione, il volume deve essere mantenuto durante l'incubazione durante la notte per mantenere il corretto rapporto di polimero-solvente (viscosità). Concentrazione del polimero sufficientemente elevata, le molecole di polimero impigliare nella soluzione durante il processo di elettrofilatura per produrre fibre. Durante il processo di elettrofilatura, una perlina formerà sulla punta di filiera e se c'è sufficiente dell'intrico di polimero, getti di liquidi saranno eruttare da questo punto ad una tensione critica e accelerare nella moda di frusta verso il mandrino raccolta55. Evaporazione del solvente porterà quindi a getto diradamento, producendo filati di fibra come depositano sul mandrino raccolta. Una volta sintetizzato, EFs dovrebbero essere analizzate da SEM per verificare la corretta morfologia e diametro della fibra coerente. La presenza di EFs in rilievo può essere il risultato della soluzione bassa viscosità56, eccessivamente alta tensione applicata57, polimero mangimi tasso58, o una combinazione di tutti e tre i fattori. Se questo è osservato, concentrazione di polimero dovrebbe essere aumentato e la tensione applicata e la velocità di avanzamento deve essere registrati, per raggiungere la fibra-come la morfologia.

Per coniugare proteine sulla superficie di EF, qui i gruppi carbossilici PLGA erano reagiti utilizzando EDC-NHS carbodiimide reticolazione chimica59. Durante il processo di modificazione, fibre brevemente vengono incubati con EDC in presenza di NHS che si traduce nella conversione dei carboxylates in esteri di semi-stabile, ammina-reattivo. Durante il processo di coniugazione in due fasi, è fondamentale che i buffer utilizzati durante ogni passaggio hanno il pH ottimale, indicato nelle istruzioni del produttore, per garantire un'efficienza massima di coniugazione. L'emivita di esteri NHS varia da quattro a cinque ore a pH neutro e diminuisce drasticamente in più di base condizioni60. Così, la prima reazione dovrebbe essere eseguita in MES buffer a pH 5-6 e le fibre attivate quindi dovrebbero essere trasferite a un tampone PBS (pH 7.2-7.5) per la successiva e immediata reazione con GRFT. È anche importante che EDC è inattivato tramite l'aggiunta di 2-mercaptoetanolo e sufficientemente sciacquato dalle fibre dopo l'attivazione del carbossilato. Questo aiuterà a prevenire l'attivazione della proteina di EDC e autoreticolante durante la seconda reazione, che può ridurre l'efficienza di coniugazione.

Le modifiche e la risoluzione dei problemi
Anche se il nostro lavoro precedente ha dimostrato l'efficacia di una varietà di fibre per volta GRFT contro l'infezione HIV-1, certe alterazioni del processo possono essere considerati per morfologia EF di personalizzare o migliorare GRFT (o altre proteine) efficienza di coniugazione o fibra resa di29. In particolare, l'area della superficie EF può essere aumentato diminuendo il diametro della fibra, per consentire una maggiore area superficiale per coniugazione. Gli studi precedenti hanno dimostrato che riducendo la viscosità e la concentrazione del polimero produce più piccola fibra diametro61,62. Tuttavia, questo approccio è limitato dalla formazione di fibre in rilievo quando la concentrazione è inferiore al valore di soglia. Per ridurre il diametro della fibra senza modificare la viscosità della soluzione, sistemi dual-solvente possono essere utilizzate per ridurre la tensione superficiale, o sali possono essere aggiunti per aumentare la soluzione conducibilità56,57. Entrambi i metodi consentirà maggiore allungamento dei getti elettrofilatura che possono produrre più piccoli diametri di fibra. Inoltre, polimeri di peso molecolare inferiore possono essere utilizzati per fabbricare fibre di diametro più piccoli. Diametro della fibra decrescente fornisce anche il vantaggio di generare più piccoli pori, potenzialmente rendere EFs più efficace come una barriera alla penetrazione del virus, per applicazioni basate su microbicida63. Infine, è stato osservato che umidità può influenzare la resa EF. A umidità elevata, il rendimento tende a diminuire a causa della formazione di fibre con macro-morfologia insolita. L'installazione di un sistema di controllo dell'umidità all'interno della camera di elettrofilatura potrebbe pertanto facilitare producendo EFs con rendimenti coerenti, se ciò rappresenta una sfida per la fabbricazione.

Per migliorare l'efficienza di coniugazione GRFT, indagando la selezione e la posizione dei gruppi di functionalizable può anche essere considerata. Ad esempio, se le ammine primarie della proteina di interesse si trovano vicino all'interno della struttura tridimensionale della proteina, sterico impediscono che i gruppi carbossilici attivati su EFs di interagire con ammine primarie, diminuendo in tal modo la probabilità della reazione. Questa sfida può essere superata con la sostituzione dell'amminoacido della proteina per generare un gruppo di ammina primaria più vicino alla superficie della proteina. Tuttavia, come GRFT e altre proteine dipendono l'attività specifica dei suoi siti di legame per funzionalità, alterazioni nella conformazione della proteina devono essere accuratamente testate in saggi funzionali prima coniugazione.

Limitazioni
Una limitazione importante di modificazione superficiale GRFT è il potenziale di efficienza bassa coniugazione utilizzando carbodiimide reticolazione chimica. Se la proteina antivirale di interesse ha un alta IC50, un'efficienza bassa coniugazione non può fornire una protezione sufficiente contro l'infezione del virus (in queste applicazioni). Tuttavia, per GRFT (o altro per volta) EFs, proteine ed agenti attivi che non legame covalente conEFs può adsorbire ancora alla superficie. Questi agenti adsorbiti offrono il potenziale per completare l'attività di coniugati GRFT, aumentando transitoriamente la concentrazione localizzata disponibile per l'associazione del virus. In questo esempio, desorbito GRFT possono vincolare virioni di HIV-1 che non contatto diretto con EFs e possono fornire un meccanismo alternativo di protezione con il primo 4 h di amministrazione (pericoital). Quindi, coniugato e superficie-adsorbito GRFT può contribuire a fornire una protezione uniforme contro le malattie sessualmente trasmissibili.

Nonostante la protezione conferita dalla coniugazione di proteina e desorbimento, altre strategie di modificazione della superficie con potenzialmente maggiore efficienza potrebbero essere perseguite. Ad esempio, PLGA terminato con ammine invece di gruppi carbossilici potrebbe essere utilizzato per coniugare GRFT attivato. In alternativa, una diversa strategia di modificazione della superficie può essere utilizzata per migliorare l'efficienza di coniugazione EF-proteina. Nanofibrous membrane composte da EFs sono state funzionalizzate con avidina via carbodiimide reticolazione chimica64. Biotinylation o l'aggiunta di un tag di Strep (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) attraverso ricombinazione può attivare la proteina modificata a forma forte ed estremamente stabile interazione non-covalente con avidina EFs. Mentre non-covalente, il legame di avidina-biotina è il più forte non-legame covalente, con affinità di femtomolar, probabilmente conseguente coniugazione stabile sulla superficie della fibra. Per eventuali strategie di modificazione della superficie, sterico dovrebbe essere considerata per massimizzare l'efficienza di coniugazione.

Infine, immaginiamo che la modificazione superficiale EFs offrirà una strategia alternativa all'incapsulamento di agente attivo per fornire modalità complementari di protezione. Una considerazione con la combinazione di tecnologie di incapsulamento e modificazione della superficie su un'unica piattaforma EF sarà una riduzione del rilascio prematuro di agenti attivi durante il processo di modificazione della superficie. Per reazioni di modificazione della superficie che richiedono relativamente lunghi tempi di incubazione in soluzione acquosa, una percentuale significativa di agenti attivi caricato potrebbe essere persa a causa di idrolisi del polimero.

Significato del metodo per quanto riguarda i metodi esistenti e alternativi
Nel precedente lavoro, abbiamo osservato che non modificato in bianco EFs erano in grado di inibire l'infezione da HIV da ~ 38% quando sono immessi in un inserto di transwell sopra cellule infectible29. Questa osservazione combinata con la biocompatibilità, web-come microstruttura e tortuosità di EFs, in parallelo con il potente antivirale e adesivo proprietà osservate GRFT, richiesto lo sviluppo di EFs modificate in superficie descritta qui.

Relativo ad altre tecnologie di consegna attualmente impiegati in applicazioni di microbicida, EFs hanno una vasta gamma di potenziali applicazioni grazie alla loro architettura e la capacità di personalizzazione. In altri lavori, la morfologia fibrosa di EFs ha permesso loro di consegnare agenti attivi e per imitare la ECM, che li rende adatte impalcature per l'ingegneria tissutale. EFs sono state modificate in superficie per migliorare la biocompatibilità e rilascio prolungato65,66.

Per migliorare la biocompatibilità o consegnare gli agenti che funzionano attraverso l'attività di legame specifico, esistono numerosi metodi che consentono il fissaggio di composti per le superfici di EFs come trattamenti al plasma, metodi chimici bagnati e superficie dell'innesto polimerizzazioni50. Nel caso di GRFT che legano specificamente per le glicoproteine virali di HIV-1, il metodo chimico bagnato di EDC-NHS è la più ottimale grazie alla capacità di penetrare le fibre profonde all'interno della mesh preservando anche GRFT funzionalità50. GRFT immobilizzato per EFs quindi può essere trasportato in una formulazione durevole per la FRT e fornire una protezione immediata contro l'infezione da HIV.

Rispetto alla strategia esistente di incapsulare terapeutica all'interno di EFs per inibire le malattie sessualmente trasmissibili, coniugazione covalente offre il vantaggio di aumentare il potenziale avidità tra i virions GRFT e HIV. Da immobilizzare GRFT per EFs attraverso la modificazione della superficie, possono essere raggiunto concentrazioni altamente localizzate di GRFT, che aumentano la possibilità per l'associazione multivalente con HIV. Inoltre, GRFT EF-immobilizzata, relativo GRFT libero in soluzione, possono impedire lo svuotamento della piscina GRFT ostacolando internalizzazione cellulare. Inoltre, a causa del meccanismo unico di azione di GRFT come un inibitore di entrata stabile e adesivo, coniugazione covalente di superficie consente EFs modificate in superficie fornire una barriera fisica alla penetrazione del virus, oltre a potenti proprietà antivirali.

Applicazioni future di questo metodo.
L'utilizzo di superficie-modifica per consegna presenta la possibilità di integrare più agenti attivi all'interno di un'unica piattaforma EF. In futuro, cerchiamo di sviluppare una tecnologia multiuso (MPT) dove una varietà di agenti attivi può essere incapsulata all'interno e coniugata di EFs. Questi MPTs possono essere progettati per conferire protezione contro una vasta gamma di agenti patogeni incorporando terapeutica con diversi meccanismi d'azione. Utilizzando sia la superficie e l'interno di EFs per fornire attivi agenti con differenti meccanismi d'azione, sarà massimizzato il potenziale di EFs per proteggere contro l'infezione del virus.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Siamo grati al fondo patrimonio ebraico per eccellenza per la ricerca di finanziamenti. Ringraziamo il Dr. Stuart Williams II per generosamente fornendo l'utilizzo del sistema di elettrofilatura. Ringraziamo anche il Dr. Kenneth Palmer per averci fornito con Griffithsin. Ringraziamo inoltre Dr. Nobuyuki Matoba e suo laboratorio per la formazione di che noi nell'ELISA GRFT lavorare.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

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Bioingegneria problema 128 fibre elettrofilate sessualmente trasmesse infezioni virus dell'immunodeficienza umana modificazione della superficie microbicida Griffithsin poli (acido lattico-co-glicolico)
Fabbricazione e caratterizzazione di fibra Griffithsin-modificato ponteggi per la prevenzione delle infezioni sessualmente trasmesse
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Vuong, H. R., Tyo, K. M.,… More

Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).

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