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Bioengineering

Fabrication et caractérisation des échafaudages de fibre Griffithsin modifiés pour la prévention des Infections sexuellement transmissibles

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

Cet article décrit la procédure pour fabriquer et caractériser les fibres électrofilées Griffithsin-modified poly (acide lactique-co-glycolique) qui démontrent une activité adhésive et antivirale puissante contre l’infection à virus de l’immunodéficience humaine de type 1 in vitro. Méthodes utilisées pour synthétiser, surface-modifier et de caractériser la morphologie qui en résulte, conjugaison, et désorption de Griffithsin de surface-modifiée en fibres sont décrites.

Abstract

Fibres électrofilées (EFs) ont été largement utilisées dans une variété d’applications thérapeutiques ; Toutefois, elles ont récemment été appliquées comme une technologie pour prévenir et traiter sexuellement transmissibles (IST). En outre, beaucoup de technologies EF se consacrée sur encapsulant l’agent actif, par rapport à utilisant la surface pour donner biofunctionality. Nous décrivons ici une méthode pour fabriquer et surface-modifier poly(lactic-co-glycolic) acide (PLGA) électrofilées fibres, avec la lectine antivirale puissante Griffithsin (GRFT). PLGA est un polymère approuvé par la FDA qui a été largement utilisé dans l’administration de médicaments en raison de ses excellentes propriétés chimiques et biocompatibles. GRFT est un naturel, puissant, lectine sécuritaire qui possède une activité large contre de nombreux virus, y compris le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1). Lorsqu’il est combiné, fibres GRFT modifiés ont montré puissante inactivation du VIH-1 in vitro. Ce manuscrit décrit les méthodes permettant de fabriquer et de caractériser les EFs GRFT modifiés. Tout d’abord, PLGA est électrofilées pour créer un échafaudage de fibre. Les fibres ont été modifiés par la suite surface avec GRFT à l’aide de 1-éthyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et la chimie de N-hydroxysuccinimide (NHS). Microscopie électronique (MEB) a été utilisé pour évaluer la taille et la morphologie des formulations à surface modifiée. En outre, une gp120 ou l’hémagglutinine (HA)-fonction ELISA peut être utilisée pour quantifier la quantité de GRFT conjugué à, ainsi que la désorption GRFT de la surface de la fibre. Ce protocole peut être plus largement appliqué pour fabriquer des fibres qui ont été modifiés par surface avec une variété de protéines différentes.

Introduction

L’utilisation d’EFs comme une plate-forme de livraison topique a le potentiel de réduire considérablement les IST. Actuellement, il y a plus 36 millions de personnes vivant avec le VIH, plus 2 millions de nouveaux cas signalés en 2015 seulement1,2. En outre, le virus de l’herpès simplex de type 2 (HSV-2) infection affecte des centaines de millions de personnes dans le monde entier et a été montré pour améliorer l’acquisition du VIH par 2-5 fois3. En raison de cette relation entre l’infection par HSV-2 et le VIH, il y a intérêt significatif dans le développement de nouveaux agents actifs qui assurent la protection simultanée contre plusieurs ist. En outre, le développement de nouveaux véhicules pour améliorer la prestation de ces agents antiviraux offre la possibilité de renforcer la puissance protectrice et thérapeutique. Pour atteindre ce but, l’EFs ont été étudiés comme une nouvelle plate-forme de livraison afin de réduire la prévalence des infections à VIH-1 et HSV-2.

Durant les deux dernières décennies, EFs ont été largement utilisés dans les domaines de l’administration de médicaments et ingénierie tissulaire4. Souvent, les polymères biocompatibles sont sélectionnés à traduire facilement aux applications thérapeutiques. Pour fabriquer des polymères EFs, le polymère sélectionné est dissoute dans une solution organique de solvant ou aqueuse, selon le degré de polymère hydrophobicité5. Principes actifs d’intérêt sont ensuite ajoutés à la solution de solvant ou aqueuse avant le processus d’électrofilage. La solution de polymère est ensuite aspirée dans une seringue et lentement éjectée tandis que soumis à un courant électrique. Ce processus entraîne généralement des fibres de polymère avec feuille ou cylindrique macrostructures (Figure 1) et fibre diamètres allant de l' échelle micro à nano6. Pour des applications plus thérapeutiques, principes actifs sont incorporés dans les fibres au cours du processus d’électrofilage et sont libérés de la fibre par diffusion et de la dégradation de la fibre ultérieures. Le taux de dégradation ou de libération peut-être être modifié à l’aide de différents types de polymères ou de mélanges de polymères afin d’établir un profil de sortie désirée, conférant des propriétés chimiques et physiques uniques7et la promotion de l’encapsulation de n’importe quel composé. À ce titre, EFs sont révélés bénéfiques pour la livraison de médicaments à petites molécules et des agents biologiques, y compris les protéines, peptides, oligonucléotides et facteurs de croissance6,8,9.

Dans le domaine de la prévention des ITS, EFs ont été utilisés récemment d’intégrer et de fournir ou inductible-libération prolongée d’agents antiviraux10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. Dans l’une des premières études, les fibres sensibles aux pH ont été développés pour libérer les principes actifs en réponse aux changements environnementaux au sein de l’appareil reproducteur féminin (FRT), comme une méthode de demande de protection contre le VIH-1,11. Depuis, d’autres études ont enquêté sur les mélanges de polymères composés d’oxyde de polyéthylène (PEO) et acide L-polylactique (PLLA), afin d’évaluer la libération accordable d’agents antiviraux et contraceptifs pour le VIH-1 prévention et contraception in vitro 12. d’autres études ont démontré la faisabilité de l’EFs pour fournir ce qui suit : prolonge la libération de petites molécules antiviraux14, forte et flexible de propriétés mécaniques20, livraison 3-d architectures21 , inhibition de sperme pénétration12et la capacité de fusionner avec d’autres technologies de livraison13. Enfin, les travaux précédents a évalué des fibres polymères pour la prestation soutenue d’agents antiviraux contre le virus co-contagieux communs, HSV-2 et le VIH-1,14. Dans cette étude, fibres de polymère fourni une activité complémentaire aux antiviraux livraison en conservant leur structure pendant environ 1 mois et en fournissant une barrière physique à l’entrée virale. D’après ces résultats, il a été observé qu’EFs peuvent être utilisés pour physiquement et chimiquement entraver d’infection par le virus.

Alors que libération accordable propriétés EFs polymériques une plateforme de livraison attractifs pour la livraison de microbicide, EFs ont été développés dans d’autres applications pour servir d’échafaudages à surface modifiée7. EFs ont été utilisées pour imiter la morphologie de la matrice extracellulaire (ECM), souvent en qualité d’échafaudages, d’améliorer la régénération cellulaire,22et leur utilité en tissu technique23,24. Les fibres composés de polymères tels que poly-ε-caprolactone (PCL) et PLLA ont été modifiés avec facteurs de croissance et de protéines de surface après électrofilage à conférer des propriétés de type ECM dont accrue adhérence et prolifération cellulaire25 , 26. en outre, EFs de surface-modifiée antimicrobiens ont été évaluées pour empêcher la croissance des bactéries pathogènes spécifiques27,28. En raison de cette polyvalence et la capacité d’induire des effets biologiques, technologie EF poursuit son expansion à travers une variété de domaines pour fournir des fonctionnalités multiples mécaniste. Pourtant, malgré leur utilité dans une diversité d’applications, fibres de surface-modifiée récemment ont été explorées dans le champ de microbicide29.

En parallèle avec le développement des nouvelles technologies de livraison pour prévenir et traiter les IST, nouvelles thérapies biologiques ont été développés. Un des candidats plus prometteurs de microbicides est l’adhésif lectine antivirale, GRFT30. À l’origine d’une espèce d’algues rouges, GRFT a démontré l’activité comme un puissant inhibiteur du HSV-2, le VIH, le SRAS, ainsi que de l’hépatite C virus31,32,33,34, 35 , 36. en effet, parmi les inhibiteurs à base de biologiquement, GRFT a la plus puissante activité anti-VIH, inactiver le VIH-1 presque immédiatement contact30, tout en maintenant la stabilité et l’activité en présence de milieux de culture de vaginale microbes pour jusqu'à 10 jours37. Plus récemment, un gel GRFT 0,1 % s’est avéré protéger les souris contre le HSV-2 intravaginaux, ce qui en fait un candidat prometteur pour la première ligne de protection contre l’HSV-2 et le VIH-1,32, 38. pour le VIH en particulier, GRFT inhibe l’infection en liant physiquement gp120 ou terminal résidus de N-liés glycane de mannose sur surfaces enveloppe virale pour empêcher l’entrée38,39,40,41 ,,42. Cette inhibition est très puissante, avec IC50s approchant de 3 ng/mL43. En plus d’inhiber l’infection par le VIH, les études ont également montré que GRFT protège contre l’infection à HSV-2 en inhibant la prolifération de cellule à cellule du virus32. Dans tous les cas, GRFT s’est avéré être l’adhésif des particules virales, tout en faisant preuve d’une résistance élevée à la dénaturation. Enfin, GRFT a démontré une activité synergique avec combinaisons de ténofovir (FPV) et autres antiviraux44, rend possible et probablement bénéfique d’administrer avec EFs. Les puissantes propriétés de GRFT rendent un excellent biologiquement basé antiviral candidat, dans laquelle la livraison peut être améliorée par technologie EF.

Grâce à cette connaissance des propriétés antivirales adhésives et innées de GRFT, un échafaudage de fibre polymère a été conçu, qui intègre ces propriétés pour fournir la première couche de virus entrée inhibition29. S’inspirer de la manière que cervicovaginales mucus empêche transport virus principalement grâce à des interactions de mucine muco, nous avons émis l’hypothèse qu’en utilisant EFs comme un échafaudage et modification par liaison covalente de la surface avec GRFT, une forte densité de GRFT surface conjugué s’affaiblissent et inactiver le virus à son point d’entrée45,46,47. Ici, EFs ont été élaborés comme un échafaudage fixe pour fournir une protéine virale inactivant adhésif barrière plateforme. Nous avons cherché à combiner les propriétés antivirales puissantes de GRFT avec une plate-forme de polymère biocompatible, modifiable et durables, pour créer un nouveau virus « piège ».

Pour atteindre ces objectifs, les fibres composés de PLGA étaient électrofilées et chimie EDC-NHS a été utilisé pour modifier ultérieurement la surface EF avec GRFT. PLGA a servi un polymère de modèle en raison de son utilisation étendue dans électrofilage48, combiné avec sa biocompatibilité et la rentabilité. En outre, la modification de surface exploite la grande surface du système EFs et offre une alternative intéressante qui peut être combinée avec l’encapsulation pour maximiser la fibre utilitaire49. Contrairement aux méthodes traditionnelles d’encapsulation où seulement une partie des GRFT est disponible (et seulement transitoirement présents dans le FRT), modification de surface peut permettre GRFT maintenir une bioactivité maximale pendant toute la durée du traitement. En outre, l’incorporation de composés hydrophiles comme les protéines, par des méthodes traditionnelles électrofilage risquez efficacité encapsulation inférieure et perte de protéine activité50. Par conséquent, fibres de surface-modifiée GRFT peuvent offrir une méthode de livraison alternative prometteuse utilisable seul ou en combinaison avec électrofilage pour augmenter la protection contre l’infection de la STI.

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Protocol

1. préparation et Fabrication de l’échafaudage de fibre électrofilées

attention : tous les travaux avec des solvants ou des solutions de polymères doivent être effectués sous une hotte chimique . Se reporter à la fiche signalétique de chaque réactif avant de commencer le protocole.

  1. à electrospin une solution de polymère de 3 mL 15 % w/w PLGA, pèse 720 mg de 50/50 poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA ; 0,55 à 0,75 dL/g, 31-57 kDa) dans un flacon de 10 mL à scintillation. Le volume de la solution est basé sur la taille des lots typiques utilisée dans les études en cours.
    Remarque : La masse du polymère à ajouter à un volume donné de solvant doit être calculée par la première détermination de la densité du solvant utilisé pour dissoudre le polymère. La densité de la Hexafluoro-2-propanol (HFIP) solvant est 1,59 g/mL. Ainsi, le poids du solvant, basés sur un volume de 3,0 mL HFIP nécessaire, est de 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). Pour une fraction de p/p de 15 % de PLGA à HFIP, 720 mg PLGA s’ajoutent à 3,0 mL HFIP (0,15 x 4 800 mg = 720 mg). L’avantage d’utiliser un % w/w/solution de polymère, plutôt que % p/v, est que cela donne un poids défini de la solution finale. Ce poids donnée permet le remplacement de solvant plus précis, dans le cas de l’évaporation des solvants au cours de l’étape 1.3.
  2. Ajouter 3,0 mL HFIP le flacon en verre à scintillation contenant PLGA (à l’étape 1.1) à l’aide d’une pipette de verre sérologique. Couvrir le flacon d’un film plastique, puis de mesurer et de noter le flacon au Massachusetts
  3. Incuber la suspension de polymère pendant une nuit à 37 ° C pour assurer une dissolution totale du polymère. Si n’importe quel solvant s’évapore, diminuant la masse de flacon, ajouter HFIP jusqu'à ce que le flacon atteigne sa masse originale à l’étape 1.2.
  4. Après l’incubation, préparer l’appareil électrofilage ( Figure 2 A). Bien qu’un mandrin de toute taille peut-être être utilisé, ici un mandrin de diamètre extérieur inox 25 mm tournante a été utilisé comme le collecteur de.
    Remarque : Un plus grand diamètre de mandrin va diminuer l’épaisseur de la fibre, étant donné le même volume de solution électrofilage.
  5. Aspirer la solution de polymère dans une seringue de 3 mL.
  6. Connecter une pointe de l’aiguille émoussée calibre 18, ½ pouce à la seringue et répartir l’excédent de solution (généralement 0,25 mL) pour supprimer l’espace de tête vide dans la pointe de l’aiguille.
  7. Placer la seringue sur un pousse-seringue et régler le débit d’instrument à 2,0 mL/h.
    Remarque : Ce débit a été optimisé précédemment basé sur la viscosité des polymères pour cette formulation.
  8. Connecter la source d’alimentation à l’aiguille de la seringue et electrospin la solution de polymère à l’aide d’une tension de + 27 kV. La distance entre l’aiguille et le collecteur doit être définie sur environ 25 cm ( Figure 2 B).
    ATTENTION : Le processus électrofilage crée une vapeur de solvant. Utiliser une hotte ou un appareil fermé ( Figure 2) pour éliminer les vapeurs nocives .
  9. Une fois l’ensemble de la solution électrofilées, éteignez la source d’alimentation et laisser le mandrin à tourner pendant un 30 min supplémentaire s’évapore entièrement solvant.
  10. Turn off le collecteur de mandrin rotatif et utilise une lame de rasoir pour couper la fibre du mandrin. Utilisez la lame pour éplucher délicatement la fibre du mandrin.
  11. Recueillir la fibre PLGA électrofilées dans une boîte de Pétri étiquetés et placer dans un desiccatorovernight pour enlever le solvant résiduel.

2. Modification de surface des fibres avec GRFT

  1. des solutions de préparation d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et 2-(N-morpholino) ethanesulfonic acide (tampon MES). Préparer les PBS de dissoudre 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 et 0,24 g KH 2 PO 4 dans 1 L d’eau ultrapure. De même, dissoudre 19,52 g MES (acide libre, 195,2 MW) et 29,22 g de NaCl dans 1 L d’eau ultrapure, pour préparer le tampon MES. S’assurer que le pH final de chaque solution est entre 7,2 et 7,5 et 5.0 ou 6.0, respectivement, à l’aide d’un pH-mètre.
  2. Préparer des solutions de travail individuelles d’EDC (2 mM) et le NHS (5 mM).
    1. Enlever l’EDC et le NHS du congélateur et les laisser s’équilibrer à température ambiante avant la pesée.
    2. Peser 4 mg d’EDC dans un tube de microtubes de 1,5 mL.
    3. Peser 6 mg de NHS dans un autre tube de microcentrifuge.
    4. Ajouter 1 mL MES tampons dans chaque tube. Vortex les deux tubes vigoureusement pour s’assurer que les réactifs sont entièrement dissous.
  3. Préparer une solution de l’hydroxylamine en pesant 70 mg dans un tube à centrifuger conique 50 mL.
  4. Ajouter 20 mL de PBS à l’hydroxylamine et vortex pour dissoudre.
  5. Masse une quantité appropriée de fibre PLGA dans un tube à centrifuger conique 15 mL. En général, 75 mg de fibres est utilisé pour chaque lot de réaction.
  6. Ajouter 8 mL de tampon MES dans le tube de 15 mL.
  7. Ajouter 1 mL chacune des solutions EDC et NHS établis antérieurement au tube. Le dernier volume de la solution devrait être de 10 mL. Les concentrations finales d’EDC et NHS soit 0,4 mg/mL et 0,6 mg/mL, respectivement.
  8. Fermer et sceller le tube de 15 mL avec film plastique et les placer sur un agitateur pour permettre à la solution pour inverser doucement pendant 15 min à température ambiante ( Figure 3 B). Cette étape active les groupes carboxyles sur le polymère pour permettre la modification covalente à la protéine GRFT ( Figure 3 A).
  9. Après l’activation, soigneusement étancher la réaction en ajoutant 14 µL de β-mercaptoéthanol au tube. Inverser le tube plusieurs fois pour assurer le mélange complet.
    ATTENTION : β-mercaptoéthanol est hautement toxique et ne doit être utilisé dans une hotte chimique.
  10. Jeter le surnageant et rincer la fibre PLGA deux fois, avec 10 mL de PBS, pour éliminer tout reste de β-mercaptoéthanol.
  11. Après le rinçage, ajouter une quantité convenable de solution-mère GRFT dans le tube. Par exemple, un 5 nmol fibre GRFT/mg nécessiterait 6,35 µL de solution mère GRFT (provenant d’un stock de 10 mg/mL) par mg de fibres. Ainsi, un échantillon de fibre 75 mg nécessiterait 476.25 µL de solution étalon de 10 mg/mL GRFT.
    Remarque : Les fibres GRFT avec des charges théoriques de 0,05, 0,5 et 5 nmol GRFT par fibre mg ont été fabriqués.
  12. Ajouter assez PBS pour porter le volume final à 8 mL, fermer et retourner le tube pour assurer un mélange complet.
  13. Joint le tube avec un film plastique et placer sur un rotor, encore une fois, ce temps pendant 2 h.
  14. Après les 2 h d’incubation, étancher la réaction en ajoutant 2 mL de solution d’hydroxylamine dans le tube à centrifuger 15 mL. Selon les instructions du fabricant, la concentration finale de l’hydroxylamine au cours de la réaction d’extinction doit être 0,7 mg/mL.
  15. Bien mélanger la solution et éliminer le surnageant. Rincer la fibre PLGA surface modifiée deux fois avec 10 mL d’eau ultrapure pour supprimer toute GRFT non-conjugué.
  16. Transférer la fibre dans une boîte de Pétri et la place à l’intérieur d’un dessiccateur jusqu'à ce que la fibre est complètement sec. La boîte de Pétri de transfert à 4 ° C pour le stockage.

3. SEM caractérisation de Surface GRFT-modifiée en fibres

  1. Place du ruban double-face carbone sur une SEM Mont de spécimen. L’étiquette de la partie inférieure de la monture de spécimen des informations d’identification de l’échantillon à l’aide d’un marqueur permanent.
  2. Couper trois échantillons d’une fibre à surface modifiée et placez-les sur des montures de spécimen séparé. L’épaisseur de chaque échantillon est d’environ 0,5 mm.
  3. Par pulvérisation cathodique enduire les échantillons en utilisant le dépôt des particules induite par l’électron d’une plaque d’or. Bredouiller manteau pour 90 s, à 2,4 kV.
    Remarque : Le temps de couche par pulvérisation cathodique peut varier selon les paramètres de l’appareil, y compris la tension et l’ampérage.
  4. Les échantillons d’images à 8 kV avec un grossissement allant de 1 000 à 5 000 x.

4. Extraction de GRFT de Surface-modifiée en fibres

  1. masse à 2 mg de fibres en trois exemplaires dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL.
  2. Ajouter 1 mL le diméthylsulfoxyde (DMSO) dans le tube, puis de vortex et incuber pendant 1 min à température ambiante jusqu'à dissolution complète de la fibre.
  3. Après l’incubation, diluer une aliquote de 10 µL la solution de DMSO-fibre à l’étape 4.2, au moins 100 fois dans un tampon Tris-EDTA (TE) (pH = 8,0).
  4. Conserver les échantillons à-20 ° C jusqu’au chargement de caractérisation avec ELISA.

5. Mesure GRFT désorption de fibres

  1. pour évaluer la quantité de GRFT libéré ou désorbé de la fibre, pèse 5 à 10 mg de surface-modifiée en fibre et le placer dans un tube de microcentrifuge. Noter la masse de fibres dans chaque tube.
  2. Ajouter 1 mL d’une solution appropriée qui imite l’environnement physiologique (p. ex., PBS, tampon TE, simulé des sécrétions vaginales (SVF), etc.) pour chaque échantillon.
  3. Incuber les échantillons pendant 1 heure sur un agitateur rotatif à 200 tr/mn, 37 ° C.
  4. Après que l’incubation, enlever environ 1 mL de tampon TE contenant la GRFT désorbé du flacon et partie aliquote à cluster tubes. Conserver à-20 ° C jusqu’au dosage de la protéine.
  5. Transférer l’échantillon dans un nouveau tube de microcentrifuge, ajouter 1 mL de solution tampon fraîche à la fibre à l’intérieur du tube de microcentrifuge et incuber jusqu’au prochain point de temps.
  6. Moments typiques utilisés pour mesurer les rejets comprennent : 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h et 1 par semaine : désorption négligeable a été observée dans ces études après 4 h.

6. Quantification des GRFT Extraction et désorption par ELISA

  1. manteau un ELISA 96 puits plaque 0,1 ml d’HA (10 µg/mL) / puits décrite précédemment 51. Sceller la plaque avec un film plastique et laisser incuber pendant la nuit à 4 ° C ( Figure 4).
  2. Enlever le revêtement de tampon et ajouter 0,3 mL bloquant un tampon (2-3 % sérum albumine bovine (BSA) dans du PBS avec 0,05 % de polysorbate 20) dans chaque puits. Incuber la plaque pendant au moins 2 h à température ambiante.
  3. Après l’incubation, rincez la plaque 3 fois avec du PBS 1 x avec 0,1 % de polysorbate 20 (PBS-P). Après le rinçage, Pipeter 0,1 mL d’échantillon, standard ou PBS comme contrôle négatif dans leurs puits respectifs. Incuber les plaques à nouveau pendant 1 h à température ambiante.
  4. Rincer la plaque 3 fois à nouveau avec PBS.-P. Après le rinçage, ajouter 0,1 mL d’anticorps primaire (antisérum de chèvre anti-GRFT) dans chaque puits et incuber pendant au moins 1 heure à température ambiante. En général, la solution d’anticorps primaire est diluée par 1/10 000 dans du PBS.
  5. Après incubation les échantillons avec rinçage de l’anticorps primaire les plaques à 3 reprises avec PBS.-P. Ajouter 0,1 mL d’anticorps secondaire (peroxydase de raifort (HRP)-anti-chèvre lapin Conjugué IgG) à chaque puits et incuber pendant 1 heure à température ambiante. La solution d’anticorps secondaire est diluée par 1/10 000 dans du PBS.
  6. Laver la plaque 3 fois. Ajouter 0,1 mL TMB 2-peroxydase substrat dans chaque puits. Surveiller le développement de la couleur (environ 2 min), puis ajouter 0,1 mL H 2 SO 4 (1 N) pour étancher la réaction. Lire la plaque à 450 nm sur un lecteur de plaque.
  7. Les valeurs d’OD de fond (puits qui ne reçoivent que PBS) en moyenne et cela en soustraire les groupes expérimentaux.

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Representative Results

Morphologie de la fibre a un effet significatif sur la capacité du système EFs à surface modifiée pour fournir une protection contre les virus. Bien électrofilage est une procédure simple et pratique, des formulations de polymère non optimisé peuvent provoquer dans la morphologie des fibres irrégulières (Figure 5B-C). Altérations électrofilage conditions qui entraînent la formation de morphologies de tapis perlées ou amorphes, sont souvent causés par polymère-solvant incompatibilité, polymère de faible viscosité, débit ou autres conditions électrofilage. Communiqué de différents profils pour drogue-constituée de fibres ou des incohérences d’efficacité de conjugaison, altérer la capacité des fibres physiquement ou chimiquement entraver la pénétration du virus peuvent entraîner les variations résultantes dans la structure des fibres. L’EFs de PLGA fabriqués en utilisant les conditions décrites électrofilage devrait se traduire par morphologies distinctes de fibres d’un diamètre variant entre 1,5 et 2,8 µm (Figure 6). Pour déterminer le diamètre et la morphologie de la fibre, EFs doivent être examinées avec SEM avant d’autres étapes de la caractérisation ou la modification.

Images de SEM de vierge, 0,05, 0,5 et 5 fibres GRFT nmol a montré aucune différence significative dans la morphologie des fibres (Figure 6A-D), indiquant que la modification GRFT est sans effet sur la morphologie de la fibre. Pour déterminer le diamètre moyen de chaque formulation d’EF, un minimum de 50 mesures aléatoires ont été prises par le champ de vision depuis les images de SEM. Le diamètre moyen des formulations EF ont été mesuré et calculé dans ImageJ, comme illustré à la Figure 6E. Toutes les préparations de EF avaient des diamètres moyens similaires autour de 1,9 µm, démontrant la cohérence du processus de fabrication de fibres non modifiée à travers de lots.

Pour déterminer que la quantité de GRFT conjugué à l’EFs, EFs-GRFT ont été dissous dans le DMSO, suivie d’une dilution de 100 fois dans un tampon TE GRFT extraire de la fibre. La quantité de GRFT conjugué par mg de fibres a été quantifiée à l’aide d’ELISA. Pour chaque densité de modification (0,05, 0,5 et 5 nmol GRFT par fibre mg), dix répétitions ont été évaluées. Pour la 5, 0,5 et 0,05 nmol GRFT/mg EF modifications, chaque EF eu 373, 165 et 42 ng GRFT par mg des expressions du folklore, résultant dans l’efficacité de la conjugaison de 0,6, 4.2 et 6,9 %, respectivement. Ces résultats démontrent que la GRFT-EFs conjugué à densité plus élevée de surface-modification théorique, résultat en plus GRFT conjugué à la fibre (Figure 7A). Cependant, il y avait une corrélation inverse avec la résultante conjugaison efficacité29.

Afin d’évaluer la quantité de GRFT conjugué par liaison covalente à la surface de la fibre par rapport à celle adsorbée, GRFT-EFs ont été incubées dans SVF pour déterminer la quantité de GRFT libéré. Au cours des 4 premières heures, 113, 25 et 10 ng de GRFT par mg EF a été détecté dans SVF pour le 5, 0,5 et 0,05 nmol modification théorique des concentrations, respectivement. Ces valeurs correspondent à 30 %, 41 % et 24 % du montant de GRFT conjugué à 5, 0,5 et 0,05 nmol GRFT-EFs. Après 4 h, GRFT négligeable a été détectée dans l’éluat de libération pour tous les trois formulations. Communiqué de GRFT après 1, 2 et 4 h est montré dans la Figure 7B. Pris ensemble, ces résultats indiquent que la majorité des GRFT est liée par covalence à l’EFs, et que la GRFT adsorbé à la surface est libéré au cours des 4 premières heures.

Figure 1
Figure 1: la morphologie de l’échelle macroscopique des fibres électrofilées. Les fibres électrofilées montrés ont été fabriquées en utilisant un (cylindre) de 4 mm et un mandrin de diamètre 25 mm (feuille), respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: appareil électrofilage. (A) la collecte mandrin où déposent les jets de liquides du polymère et (B) le programme d’installation complet électrofilage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3: modification schématique d’EF avec GRFT chimie EDC-NHS. Les groupes carboxyle (A) sur la réaction de PLGA EF avec NHS en présence d’EDC aux esters réagissant à l’amine de forme, qui formeront par la suite liaisons amide stable avec les amines primaires de GRFT. (B) milligramme deux disques de fibre ou des morceaux est coupés et incubés dans 8 mL de tampon MES avec 2 mL de réactif EDC/NHS et tourné pendant 15 min. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: schématique illustrant la quantification GRFT utilisant ELISA. Un immunoplate de 96 puits est recouvert de gp120 ou HA pour capturer et immobiliser GRFT. Anticorps primaires contre GRFT, Anticorps secondaires liés à la peroxydase de raifort et ELISA substrat sont successivement ajoutés à quantifier GRFT. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5: effets de solvant sur la morphologie de PLGA EF. (A), le 15 % w/w PLGA EFs dans souhaitable HFIP affichée filiformes morphologie. (B) le 15 % w/w PLGA EFs dans le chloroforme et le diméthylformamide, n’a pas à se former en raison de choix de solvant non optimale ou concentration de polymère (viscosité). (C) les 15 % w/w et (D) 20 % w/w PLGA EFs dans le TFE démontrent l’importance de la viscosité des polymères. Perles forment dans la formulation avec la plus faible concentration de polymère (C), tandis que l’augmentation de la concentration de polymère (viscosité du solvant) a abouti à la morphologie des fibres bien définis (D). Notez, Figure 5 b a été prise à un grossissement inférieur pour montrer la morphologie du tapis. Barreaux de l’échelle = 10 µm.Figure 6
Figure 6: images de SEM et le diamètre de la fibre de EFs nus et modifiés GRFT. (A) nus PLGA EFs et EFs PLGA surface modifiée avec (B) 0,05 nmol, (C) 0,5 nmol et (D) 5 nmol de GRFT par mg de fibres. Barreaux de l’échelle = 10 µm. (E) diamètres du non modifiés et GRFT-EFs. Barres d’erreur représentent la moyenne ± SEM A observé aucune différence statistique entre les diamètres des fibres non modifiés et modifiés GRFT. Figure 6 E a été adaptée de palefreniers et al. 29 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Quantité de GRFT conjugué à et désorbée de EF modifiés GRFT. (A) la quantité de GRFT conjugué à chaque mg de EF fibres augmente avec l’augmentation de la concentration des réactifs GRFT. ()B) la quantité de GRFT libéré par mg de fibres est indiquée pour le 0,05, 0,5 et 5 nmol formulations après une incubation de 1, 2 et 4 h en SVF. Barres d’erreur représentent la moyenne ± SEM Ce chiffre a été adapté de palefreniers et al. 29 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

En raison de leurs structures poreuses et les grandes surfaces, EFs ont trouvé un large éventail d’applications en soins de santé, dont inclut la portion comme vecteurs thérapeutiques. Médicaments et autres principes actifs peuvent être incorporés au sein de l’EFs pour livraison accordable, tandis que des produits biologiques et chimiques ligands peuvent être conjugués à la surface de la fibre pour cellule spécifique ciblant52 ou biodétection53. Ici la fabrication de GRFT surface-modifiée PLGA EFs, telle qu’un échafaudage de livraison pour prévenir l’infection par le VIH, est décrite. GRFT-EFs ont été synthétisés par électrofilage, offrant les avantages de faible coût et haute cadence par rapport à d’autres fibres production méthodes49,53.

Étapes cruciales dans le protocole
La formation de l’EFs est critique dépendent des propriétés des solutions de polymères, en particulier la solution ou solvant viscosité54. Les facteurs qui affectent la viscosité d’une solution de polymère comprennent la masse moléculaire de polymères, concentration de polymère et le type de solvant utilisé. La solution ou la viscosité du solvant est généralement réglée en changeant le ratio de polymère à solvant, afin d’obtenir la concentration désirée de polymère. Avec chaque fabrication, le volume doit être maintenu durant l’incubation durant la nuit pour maintenir le ratio de polymère-à-solvant approprié (viscosité). À une concentration suffisamment élevée de polymère, les molécules de polymère s’empêtrer dans la solution pendant le processus d’électrofilage pour produire des fibres. Au cours du processus d’électrofilage, une perle se forme à la pointe de la filière et s’il y a suffisamment enchevêtrement de polymère, jets de liquides seront éclatent à partir de ce point à une tension critique et accélérer en mode fouet vers le collecteur de mandrin55. Évaporation des solvants se traduira ensuite jet amincissement, produisant des fils de fibre qu’ils déposent sur le mandrin de collecte. Une fois synthétisées, EFs doivent être analysées par SEM pour vérifier la bonne morphologie et diamètre de fibre cohérente. La présence de perles EFs peut être le résultat de la solution faible viscosité56, extrêmement haute tension appliquée57, polymère aliments taux58, ou une combinaison de trois facteurs. Si c’est observé, concentration de polymère doit être augmentée et la tension appliquée et le taux d’alimentation doivent être ajustées, pour atteindre la morphologie fibre.

Pour conjuguer les protéines à la surface de l’EF, ici des groupes carboxyle PLGA réagissent à l’aide d’EDC-NHS carbodiimide réticulation chimie59. Pendant le processus de modification, les fibres sont brièvement incubés avec EDC en présence du NHS qui se traduit par la conversion des carboxylates en esters semi-stables, réagissant à l’amine. Au cours du processus de conjugaison en deux étapes, il est essentiel que les tampons utilisés au cours de chaque étape ont le pH optimal, il est indiqué dans les instructions du fabricant, pour assurer une efficacité maximale de la conjugaison. La demi-vie des esters de NHS varie de quatre à cinq heures à un pH neutre et diminue considérablement dans la plus basique des conditions60. Ainsi, la première réaction doit être effectuée dans un tampon MES à pH 5-6 et les fibres activées puis devraient être transférées vers un tampon PBS (pH 7,2 à 7,5) de réaction ultérieure et immédiate avec les GRFT. Il est également important qu’EDC est inactivé par l’ajout du 2-mercaptoéthanol et suffisamment rincé fibres après l’activation de carboxylate. Cela aidera à prévenir l’activation de la protéine par EDC et auto-réticulation au cours de la seconde réaction, ce qui peut réduire l’efficacité de la conjugaison.

Modifications et dépannage
Bien que nos travaux antérieurs ont démontré l’efficacité d’une variété de fibres GRFT modifiés contre l’infection à VIH-1, certaines modifications de processus peuvent être considérées pour personnaliser la morphologie EF ou pour améliorer la GRFT (ou autres protéines) efficacité de conjugaison ou fibre rendement de29. En particulier, la surface EF peut être augmentée en diminuant le diamètre de la fibre, afin de permettre une plus grande surface pour la conjugaison. Des études antérieures ont montré que réduire la viscosité et la concentration de polymère produit des petites fibres diamètre61,62. Toutefois, cette approche est limitée par la formation de fibres perlées lorsque la concentration est inférieure au seuil. Pour diminuer le diamètre de la fibre sans changer la viscosité de la solution, les systèmes dual-solvant peuvent être utilisés pour réduire la tension superficielle, ou sels peuvent être ajoutés pour augmenter la conductivité de solution56,57. Les deux méthodes permettra une plus grande qui s’étend des jets électrofilage qui peuvent produire de plus petits diamètres de fibre. En outre, plus faible poids moléculaire polymères peuvent être utilisés pour fabriquer des fibres de diamètre plus petits. Diamètre de fibre décroissante fournit également l’avantage supplémentaire de produire de plus petits pores, potentiellement rendre EFs plus efficace comme un obstacle à la pénétration du virus, pour les applications basées sur les microbicides,63. Enfin, il a observé que l’humidité peut affecter rendement EF. À une humidité plus élevée, le rendement tend à diminuer en raison de la formation de fibres avec macro-morphologie inhabituelle. Installation d’un système de contrôle d’humidité au sein de la chambre électrofilage pourrait donc faciliter produisant EFs avec des rendements conformes, si cela représente un défi pour la fabrication.

Pour améliorer l’efficacité de conjugaison GRFT, enquête sur la sélection et l’emplacement des groupes fonctionnalisable peut également être envisagée. Par exemple, si les amines primaires de la protéine d’intérêt sont trouvent à l’intérieur de la structure tridimensionnelle de protéine, empêchement stérique peut empêcher groupes carboxyle activé sur EFs d’interagir avec des amines primaires, ce qui diminue le probabilité de la réaction. Ce défi peut être surmonté par la substitution d’acide aminé de la protéine pour générer un groupe amine primaire plus près de la surface de la protéine. Cependant, comme GRFT et autres protéines dépendent de l’activité spécifique de ses sites de liaison pour la fonctionnalité, des altérations dans la conformation des protéines doivent être testées soigneusement dans des essais fonctionnels avant la conjugaison.

Limites
Une limitation majeure de modification de surface GRFT est le potentiel de rendement de conjugaison faible combinant carbodiimide réticulation chimie. Si la protéine antivirale d’intérêt a un haut IC50, une efficacité de conjugaison faible ne peut pas fournir une protection suffisante contre le virus (dans ces applications). Toutefois, pourles GRFT (ou autre modification) EFs, les protéines et les agents actifs qui ne sont pas liées par covalence àEFs peuvent encore s’adsorber sur la surface. Ces agents adsorbés offrent la possibilité de compléter l’activité de GRFT conjugué, en augmentant temporairement la concentration localisée disponible pour la liaison du virus. Dans cet exemple, GRFT désorbé peut lier à virions HIV-1 qui ne touchent pas directement l’EFs et peuvent fournir un autre mécanisme de protection avec les 4 premières heures d’administration (pericoital). Ainsi, GRFT conjugué et adsorbés à la surface peut-être contribuer à fournir une protection uniforme contre les IST.

Malgré la protection conférée de conjugaison de protéine et de la désorption, autres stratégies de modification de surface avec un rendement potentiellement plus élevé pourraient être poursuivis. Par exemple, PLGA terminé avec les amines au lieu de groupes carboxyle pourrait servir à conjuguer GRFT activé. Par ailleurs, une stratégie différente de la modification de surface peut être utilisée pour améliorer l’efficacité de conjugaison EF-protéine. Membranes de Nanofibrous composés de EFs ont été fonctionnalisés avec avidine via carbodiimide réticulation chimie64. Biotinylation ou ajout d’une balise Strep (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) par le biais de recombinaison peut-être activer la protéine modifiée à forme forte et extrêmement stable des interactions non covalentes avec avidine EFs. Bien que non covalents, le couplage avidine-biotine est la plus forte non - liaison covalente, avec une affinité femtomolar, probablement résultant en conjugaison stable à la surface de la fibre. Pour toute surface-modification des stratégies, empêchement stérique envisagera pour maximiser l’efficacité de la conjugaison.

Enfin, nous envisageons qu’EFs à surface modifiée offrira une autre stratégie d’encapsulation d’agent actif de fournir des modes complémentaires de protection. Un examen avec combinant technologies encapsulation et surface-modification sur une seule plateforme EF réduiront la sortie prématurée de principes actifs au cours du processus de modification de surface. Pour les réactions de surface-modification nécessitant relativement longue des temps d’incubation dans une solution aqueuse, un pourcentage important des agents actifs chargés pourrait être perdu en raison de l’hydrolyse du polymère.

Importance de la méthode en ce qui concerne les méthodes existantes
Dans un travail antérieur, nous avons observé qu’EFs vides non modifiées ont été capables d’inhiber l’infection par le VIH par ~ 38 % lorsqu’il est placé dans un insert de transwell au-dessus de l’infection de cellules29. Cette observation combinée à la biocompatibilité et la microstructure de type web tortuosité de l’EFs, en parallèle avec les propriétés antivirales et adhésives puissantes observées de GRFT, a incité le développement de l’EFs à surface modifiée décrite ici.

Par rapport à d’autres technologies de livraison actuellement utilisées dans des applications de microbicide, EFs ont un large éventail d’applications potentielles en raison de leur architecture et leur capacité de personnalisation. Dans d’autres œuvres, la morphologie fibreuse de l’EFs a permis aux agents actifs et pour imiter l’ECM, rendant les échafaudages appropriés pour l’ingénierie tissulaire. EFs ont également été modifiés afin d’améliorer la biocompatibilité et de renforcer à libération65,66surface.

Pour améliorer la biocompatibilité ou livrer des agents qui fonctionnent grâce à l’activité de liaison spécifique, il existe des nombreuses méthodes qui permettent la saisie des composés aux surfaces des EFs comme traitements de plasma, des méthodes chimiques humides et greffon surface polymérisations par50. Dans le cas de GRFT qui se lient spécifiquement à des glycoprotéines virales du VIH-1, la méthode chimique humide d’EDC-NHS est la plus optimale en raison de la capacité de pénétrer profondément dans le maillage de fibres tout en préservant la fonctionnalité GRFT50. GRFT immobilisé au système EFs peut ensuite être livrée dans une formulation durable à FRT et assurent une protection immédiate contre l’infection par le VIH.

Par rapport à la stratégie actuelle d’encapsulation thérapeutique au sein de l’EFs pour inhiber les IST, conjugaison covalente offre l’avantage d’accroître l’avidité potentielle entre des virions GRFT et le VIH. Par immobilisation GRFT au système EFs par modification de la surface, des concentrations très localisées de GRFT peuvent être atteint, qui augmentent la possibilité pour la liaison multivalente avec le VIH. En outre, GRFT EF-immobilisé, par rapport à GRFT libre en solution, peut empêcher l’épuisement du pool GRFT en entravant l’internalisation cellulaire. En outre, en raison de l’unique mécanisme d’action des GRFT comme un inhibiteur d’entrée stable et adhésif, covalente conjugaison surface permet EFs surface modifiée fournir une barrière physique à la pénétration du virus, en plus des propriétés antivirales puissantes.

Applications futures de cette méthode
L’utilisation de surface-modification pour livraison présente la possibilité d’intégrer de multiples principes actifs au sein d’une plate-forme unique de EF. À l’avenir, nous cherchons à développer une technologie polyvalente (MPT), où une variété de principes actifs peut-être être encapsulée au sein et conjuguée à l’EFs. Ces MPTs peuvent être conçus pour conférer une protection contre un large éventail d’agents pathogènes par l’incorporation de produits thérapeutiques avec différents mécanismes d’action. En utilisant la surface et l’intérieur du système EFs pour livrer des principes actifs avec des mécanismes d’action différents, le potentiel de l’EFs pour protéger contre l’infection par le virus sera maximisé.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants au Fonds du patrimoine juif d’Excellence pour le financement de cette recherche. Nous remercions le Dr Stuart Williams II offrant généreusement son utilisation du système électrofilage. Nous remercions également m. Kenneth Palmer pour nous avoir fourni Griffithsin. En outre, nous remercions m. Nobuyuki Matoba et son laboratoire pour la formation que nous dans la GRFT ELISA fonctionne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

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Bio-ingénierie numéro 128 fibres électrofilées infections transmissibles sexuellement virus de l’immunodéficience humaine modification de surface microbicide Griffithsin poly (acide lactique-co-glycolique)
Fabrication et caractérisation des échafaudages de fibre Griffithsin modifiés pour la prévention des Infections sexuellement transmissibles
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Vuong, H. R., Tyo, K. M.,… More

Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).

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