Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikasjon og karakterisering av Griffithsin endret Fiber stillaser for forebygging av seksuelt overførbare infeksjoner

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

Dette manuskriptet beskriver fremgangsmåten for å dikte og karakterisere Griffithsin endret poly (lactic-co-glycolic acid) electrospun fiber som demonstrerer potente klebende og antivirale aktivitet mot humant immunsviktvirus type 1 infeksjon i vitro. Metoder for å syntetisere, overflate-endre, karakteriserer den resulterende morfologi, Bøyning, og desorpsjon av Griffithsin av overflaten endret fiber er beskrevet.

Abstract

Electrospun fiber (EFs) har vært mye brukt i en rekke terapeutiske programmer. men har de nylig blitt brukt som en teknologi for å forebygge og behandle seksuelt overførte infeksjoner (Soi). Dessuten fokus mange EF teknologier på innkapsle aktive agent, i forhold til utnytte overflaten for å formidle biofunctionality. Her beskriver vi en metode for å dikte og overflaten-endre poly(lactic-co-glycolic) syre (PLGA) electrospun fiber, med den potente antiviral Lektiner Griffithsin (GRFT). PLGA er en FDA-godkjent polymer som har vært mye brukt i narkotika-leveranser på grunn av sin enestående kjemisk og biokompatible egenskaper. GRFT er en naturlig, potent, og trygg Lektiner som har bred aktivitet mot mange virus inkludert humant immunsviktvirus type 1 (HIV-1). Kombinert, har GRFT endret fiber vist potente inaktivering av HIV-1 i vitro. Dette manuskriptet beskriver metodene for å dikte og karakterisere GRFT endret EFs. Først er PLGA electrospun å lage en fiber stillaset. Fibrene er senere overflaten endret med GRFT bruker 1-etyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) og N-hydroxysuccinimide (NHS) kjemi. Skanning elektronmikroskop (SEM) ble brukt til å vurdere størrelsen og morfologi av overflaten endret formuleringer. I tillegg en gp120 eller hemagglutinin (HA)-basert ELISA kan brukes å kvantifisere mengden GRFT konjugert til, i tillegg til GRFT desorpsjon fra fiber overflaten. Denne protokollen kan brukes mer allment for å utvikle fiber som er overflaten endret med en rekke ulike proteiner.

Introduction

Bruk av EFs som en aktuell levering plattform har potensial til å redusere STIs. Foreløpig er det over 36 millioner mennesker lever med HIV, med over to millioner nye tilfeller rapportert i 2015 alene1,2. I tillegg herpes simplex virus type 2 (HSV-2) infeksjon påvirker hundrevis av millioner av mennesker over hele verden og har vist seg å forbedre oppkjøpet av HIV av 2-5 fold3. På grunn av dette forholdet mellom HSV-2 smitte og HIV oppkjøpet er det betydelig interesse for å utvikle nye aktive agenter som beskytter samtidig mot flere STIs. Videre tilbyr utvikling av nye biler å forbedre levering av disse antivirale midler potensial til å forbedre beskyttende og terapeutiske potens. Mot dette målet, har EFs blitt undersøkt som en ny levering plattform å redusere utbredelsen av HIV-1 og HSV-2.

I løpet av de siste to tiårene, har EFs vært mye brukt i narkotika-leveranser og vev engineering4. Ofte velges biokompatible polymerer lett oversette til terapeutiske programmer. For å utvikle polymere EFs, er den valgte polymer oppløst i en organisk løsemiddel eller vandig løsning, avhengig av polymer hydrophobicity5. Aktive agenter rundt legges deretter til løsemiddel eller vandig løsning før electrospinning prosessen. Polymer løsningen er deretter aspirated inn en sprøyte og sakte utløst mens underlagt en elektrisk strøm. Denne prosessen resulterer vanligvis i polymer fiber med ark eller sylindrisk macrostructures (figur 1) og fiber diameter fra mikro - til nano-skala6. For mest terapeutiske programmer, aktive agenter er innlemmet i fibrene under electrospinning prosessen og utgis av fiber via diffusjon og påfølgende fiber degradering. Frekvensen av nedbrytning eller løslate kan endres ved hjelp av ulike polymerer eller polymer blander for å etablere en ønsket utgivelsen profil, formidle unike kjemiske og fysiske egenskaper7, og fremme innkapsling av nesten alle sammensatte. Som sådan, har EFs vist gunstig for levering av små molekyl narkotika og biologiske midler inkludert proteiner, peptider, oligonucleotides og vekstfaktorer6,8,9.

I feltet STI forebygging har EFs nylig brukt å innlemme og gi vedvarende - eller induserbart-release antivirale midler10,11,12,13,14 ,,15,,16,,17,,18,,19. I en av de tidligste studiene, ble pH-responsive fibre utviklet for å frigjøre aktive agenter svar på miljøendringer i den kvinnelige skjede (FRT), som en behovsbetinget metode for beskyttelse mot HIV-1-11. Siden har andre studier undersøkt polymer blander består av polyetylen oksid (PEO) og poly-L-lactic acid (PLLA), for å evaluere tunable utgivelsen av antivirale og prevensjon agenter for HIV-1 forebygging og prevensjon i vitro 12. flere studier har vist muligheten for EFs å gi følgende: langvarig utgivelsen av små molekyl antivirale14, sterk og fleksibel mekaniske egenskaper20, 3D distribusjonsarkitekturer21 , hemming av sæd penetrasjon12og denne muligheten med andre levering teknologi13. Til slutt, tidligere arbeid har vurdert polymere fiber for vedvarende-levering av antivirale midler mot vanlige co-infective virus, HSV-2 og HIV-1-14. I denne studien gitt polymer fiber komplementære aktivitet antiviral levering av beholder strukturen i opptil 1 måned og gir en fysisk barriere viral posten. Fra disse resultatene ble det observert at EFs kan brukes til både fysisk og kjemisk hindre smitte.

Mens tunable utgivelsen egenskaper gjør polymere EFs en attraktiv levering plattform for mikrobicid levering, er EFs utviklet i andre programmer som overflaten endret stillaser7. EFs har blitt brukt til å etterligne morfologi av ekstracellulær matrix (EFM), ofte opptre som stillaser å forbedre mobilnettet fornyelse22, og forbedre deres nytte i vev engineering23,24. Fiber består av polymerer som poly-ε-caprolactone (PCL) og PLLA har vært overflaten endret vekstfaktorer og proteiner etter electrospinning å formidle ECM-lignende egenskaper inkludert økt mobilnettet vedheft og spredning25 , 26. i tillegg antimikrobielle overflaten endret EFs har blitt evaluert for å hindre vekst av bestemte patogene bakterier27,28. Denne allsidigheten og evnen til å indusere biologiske effekter, fortsetter EF-teknologi å utvide over en rekke felt å tilby flere mekanistisk funksjonalitet. Ennå, til tross for sin nytteverdi i et mangfold av programmer, overflate endret fiber har nylig vært utforsket i mikrobicid feltet29.

Parallelt med utviklingen av nye leveringsteknologier for å forebygge og behandle STIs, romanen biologiske therapeutics er utviklet. En av de mest lovende mikrobicid kandidatene er den selvklebende antiviral Lektiner, GRFT30. Opprinnelig stammer fra en art av Rødalger, GRFT har vist aktivitet som en potent inhibitor HIV, HSV-2, SARS, og hepatitt C virus31,32,33,34, 35 , 36. blant biologisk basert hemmere, GRFT har faktisk mest potente anti-HIV aktiviteten, inaktivere HIV-1 nesten umiddelbart etter kontakt30, samtidig opprettholde stabilitet og aktivitet i nærvær av kultur medier fra vaginal mikrober for opptil 10 dager37. Nylig ble en 0,1% GRFT gel vist å beskytte mus mot intravaginal HSV-2 utfordring, gjør det en lovende kandidat for første linje av beskyttelse mot både HSV-2 og HIV-1-32, 38. for HIV GRFT hemmer spesifikt, infeksjon av fysisk bindende gp120 eller terminal mannose N knyttet glycan rester viral konvolutten flater for å unngå oppføring38,39,40,41 ,42. Denne hemming er svært potente, IC50s seg 3 ng/mL43. I tillegg til hemme HIV-smitte, har studier også vist at GRFT beskytter mot HSV-2 infeksjon begrenser celle til celle spredning av virus32. I alle tilfeller har GRFT vist seg å være limet å virus partikler, mens demonstrere høy motstand mot rødsprit. Sist, har GRFT vist samvirkningen med kombinasjoner av Tenofovir (TFV) og andre antivirale44, gjør det mulig og trolig fordelaktig co administrere med EFs. Potent egenskapene for GRFT gjør det en utmerket biologisk basert antiviral kandidat, der levering kan bli styrket med EF-teknologi.

Utnytte denne kunnskapen klebende og medfødte antiviral egenskapene for GRFT, ble en polymere fiber stillaset designet, som integrerer disse egenskaper for å angi det første laget av virus oppføring hemming29. Finne inspirasjon i måten at cervicovaginal Slim hindrer virus transport primært gjennom mucoadhesive mucin vekselsvirkningene, hypotesen vi at ved å bruke EFs som et stillas og covalently endre overflaten med GRFT, en høy tetthet av overflate-konjugerte GRFT ville debilitate og deaktivere virus på sin entrypoint45,46,47. Her ble EFs utviklet som en stasjonær stillaset å gi en protein-basert, viral lim-inaktivere barriere plattform. Vi søkt å kombinere potente antivirale egenskaper for GRFT med en biokompatible modifiserbare og slitesterk polymer plattform, å skape en roman virus "felle".

For å oppnå disse målene, fiber består av PLGA var electrospun, og EDC-NHS kjemi ble brukt senere endre EF overflaten med GRFT. PLGA var en modell polymer sin omfattende bruk i electrospinning48, kombinert med biocompatibility og kostnadseffektivitet. I tillegg overflate endring utnytter den store overflaten av EFs, og gir et nyttig alternativ som kan kombineres med innkapsling å maksimere fiber verktøyet49. I motsetning til tradisjonelle innkapsling metoder hvor bare en del av GRFT er tilgjengelig (og bare transiently tilstede i FRT), kan overflate endring aktivere GRFT å opprettholde maksimal bioactivity under hele varigheten av behandlingen. Videre kan inkorporering av hydrofile forbindelser som proteiner, tradisjonelle electrospinning metoder, resultere i lavere innkapsling effektivitet og tap av protein aktivitet50. Derfor kan GRFT overflaten endret fibre tilby en lovende alternativ leveringsmetode som kan brukes alene eller i kombinasjon med electrospinning for å forbedre beskyttelse mot STI infeksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse og fabrikasjon av Electrospun Fiber stillaset

Advarsel: alle arbeider med løsemidler eller polymer løsninger skal utføres i kjemisk avtrekksvifte . Se HMS-dataark av hver reagensen før protokollen.

  1. Til electrospin en 3 mL 15% w/w PLGA polymer løsning, veie 720 mg av 50/50 poly (lactic-co-glycolic acid) (PLGA; 0,55 til 0,75 dL/g, 31-57 kDa) i 10 mL scintillation ampuller. Volumet av løsningen er basert på den typiske gruppestørrelse brukes i aktuelle studier.
    Merk: Polymer massen å legge til et gitt volum løsemiddel må beregnes ved først å bestemme tettheten av løsemiddelet brukes å oppløse polymer. Tettheten av den løsemiddel Hexafluoro-2-propanol (HFIP) er 1,59 g/mL. Dermed vekten av løsemiddel, basert på et antall 3.0 mL HFIP nødvendig, er 4,8 g (3.0 mL x 1,59 g / mL). For en 15% w/w brøkdel av PLGA til HFIP, 720 mg PLGA må legges til 3.0 mL HFIP (0,15 x 4800 mg = 720 mg). Fordelen med å bruke en % w/w polymer/løsning, snarere enn % w/v, er at det gir en definert vekt på den endelige løsningen. Denne definerte vekten gjør mer nøyaktig løsemiddel erstatning, ved løsemiddel fordampning under trinn 1.3.
  2. Legge til 3.0 mL HFIP hetteglass for scintillation som inneholder PLGA (fra trinn 1.1) bruker en serologisk glass pipette. Dekke ampullen med plastfolie, deretter måle og registrere ampullen Mass
  3. Ruge polymer suspensjon overnatting på 37 ° C å sikre fullstendig oppløsningen av polymer. Hvis løsemidler fordamper, redusere medisinglass masse, legger HFIP til ampullen når sin opprinnelige masse i trinn 1.2.
  4. Etter inkubasjon forberede electrospinning apparatet ( figur 2 A). Selv om en mandrel av alle størrelser kan brukes, her en roterende 25 mm ytre diameter rustfritt stål mandrel ble brukt som collector.
    Merk: Større mandrel diameter reduseres fiber tykkelsen, gitt den samme mengden electrospinning løsning.
  5. Sug opp den polymer løsningen 3 mL sprøyter til.
  6. Koble en stump 18-gauge, ½ tommers pinne-spissen til sprøyten og dispensere overflødig løsningen (vanligvis 0,25 mL) Hvis du vil fjerne tomme headspace pinne-spissen.
  7. Plassere sprøyten på en sprøytepumpe og angi infusjonshastigheten instrument 2.0 mL/t.
    Merk: Denne strømningshastighet var tidligere optimalisert basert på polymer viskositet til denne formuleringen.
  8. Koble strømforsyningen til sprøyte nål og electrospin polymer løsningen med en spenning på +27 kV. Avstanden mellom nål og samler bør settes til ca 25 cm ( figur 2 B).
    FORSIKTIG: Electrospinning prosessen oppretter et løsemiddel damp. Bruke avtrekksvifte eller et lukket apparat ( figur 2) for å fjerne skadelig damp .
  9. Når hele løsningen er electrospun, deaktivere strømkilden og la mandrel å spinne for en ytterligere 30 min til å fordampe fullt løsemiddel.
  10. Slå av roterende mandrel kollektoren, og bruker et barberblad til å kutte fiber fra mandrel. Bruke bladet forsiktig Peel fiber fra mandrel.
  11. Samler electrospun PLGA fiber i en merket Petriskål, og plasser i en desiccatorovernight å fjerne gjenværende løsemiddel.

2. Overflate-endring av fibre med GRFT

  1. forberede løsninger fosfat-bufret saltvann (PBS) og 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES buffer). Klargjør PBS ved oppløsning 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 og 0,24 g KH 2 PO 4 i 1 L ultrapure vann. Tilsvarende oppløse 19.52 g MES (gratis acid, MW 195.2) og 29.22 g NaCl 1 l ultrapure vann, å forberede MES buffer. Siste pH i hver løsning er mellom 7.2 7.5 og 5.0-6.0, henholdsvis, med en pH-meter.
  2. Forberede personlige arbeider løsninger av EDC (2 mM) og NHS (5 mM).
    1. Fjerne EDC og NHS fra fryseren og tillate dem å equilibrate til romtemperatur før veiing.
    2. Veie 4 mg av EDC i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
    3. Veier 6 mg NHS inn i en annen microcentrifuge rør.
    4. Legge til 1 mL MES buffer til hver tube. Vortex både rør kraftig slik reagensene er fullstendig oppløst.
  3. Forberede en løsning av hydroksylamin ved veiing 70 mg til en 50 mL konisk sentrifuge tube.
  4. Legg til 20 mL PBS hydroksylamin og vortex å oppløse.
  5. Masse ut en passende mengde PLGA fiber inn i et 15 mL konisk sentrifuge rør. 75 mg fiber brukes vanligvis for hvert reaksjon parti.
  6. Legge til 8 mL MES bufferen til 15 mL røret.
  7. Legge til 1 mL hver EDC og NHS løsninger utarbeidet tidligere til røret. Det siste bindet av løsningen skal 10 mL. De endelige konsentrasjonene av EDC og NHS bør være 0,4 mg/mL og 0.6 mg/mL, henholdsvis.
  8. Nær og forsegle den 15 mL tuben med plastfolie og sted på et rotator å tillate løsningen inverteres forsiktig i 15 min ved romtemperatur ( Figur 3 B). Dette trinnet aktiverer carboxyl gruppene i polymer å tillate kovalente modifisering med GRFT protein ( Figur 3 A).
  9. Etter aktivisering, nøye slukke reaksjonen ved å legge til 14 µL av β-mercaptoethanol til røret. Invertere røret flere ganger for å sikre fullstendig blande.
    FORSIKTIG: β-mercaptoethanol er svært giftig og bør bare brukes på kjemiske avtrekksvifte.
  10. Forkaste nedbryting og skyll PLGA fiber to ganger, med 10 mL PBS, fjerne eventuelle gjenværende β-mercaptoethanol.
  11. Etter rense, legger du til en passende mengde GRFT lagerløsning til røret. For eksempel ville en 5 nmol GRFT/mg fiber kreve 6,35 µL GRFT lager løsning (fra en 10 mg/mL lager) per mg fiber. Dermed en 75 mg fiber prøve ville kreve 476.25 µL av 10 mg/mL GRFT lagerløsning.
    Merk: GRFT fiber med teoretisk belastninger 0,05, 0,5 og 5 nmol GRFT per mg fiber ble fabrikkert.
  12. Legge nok PBS å ta det siste bindet til 8 mL, lukke og invertere røret slik grundig blande.
  13. Forsegle røret med plastfolie og Legg på en rotor igjen, denne gangen for 2 h.
  14. Etter 2 h inkubasjon slukke reaksjonen av tilføyer 2 mL hydroksylamin løsning i 15 mL sentrifuge røret. Per instruksjonene fra produsenten, siste konsentrasjonen av hydroksylamin under slukke reaksjonen skal 0,7 mg/mL.
  15. Blandingen løsningen og kast nedbryting. Skyll overflaten endret PLGA fiber to ganger med 10 mL ultrapure vann for å fjerne alle unconjugated GRFT.
  16. Overføre fiber til en Petriskål og sted i en desiccator til fiber er helt tørt. Overføre Petriskål til 4 ° C for lagring.

3. SEM karakterisering av GRFT overflaten endret fiber

  1. sted en stripe av tosidige karbon-tape på en SEM prøven mount. Etikett nederst prøven fjellet med eksempel identifiserende informasjon med et permanent markør.
  2. Kutte tre prøvene fra en overflate-endret fiber og plassere dem på separate prøven mounts. Tykkelsen på hvert utvalg er ca 0,5 mm.
  3. Frese coat eksemplene bruker elektron-indusert particle deponering fra en gull plate. Spraking pels for 90 s, på 2,4 kV.
    Merk: Frese pels tiden kan variere avhengig av utstyr parametere, inkludert spenning og strømstyrke.
  4. Image prøvene 8 kV med en forstørrelse spenner fra 1000 til 5 000 X.

4. Utvinning av GRFT fra overflaten endret fiber

  1. masse ut 2 mg fiber i tre eksemplarer i 1,5 mL microcentrifuge rør.
  2. Legge til 1 mL dimethyl sulfoxide (DMSO) til røret, deretter vortex og ruge for 1 min ved romtemperatur å løse fiber.
  3. Etter inkubasjon fortynne en 10 µL aliquot av DMSO-fiber løsningen fra trinn 4.2 minst 100 ganger Tris-EDTA (TE) buffer (pH = 8.0).
  4. Lagre prøver på 20 ° C til lasting karakterisering med ELISA.

5. Måle GRFT desorpsjon av fiber

  1. å vurdere mengden GRFT utgitt eller desorbed fra fiber, veie 5-10 mg overflaten endret fiber og sted i et microcentrifuge rør. Registrere fiber massen i hver retning.
  2. Legge til 1 mL av en hensiktsmessig løsning som etterligner fysiologiske miljøet (f.eks PBS, TE buffer, simulert vaginal væske (sendinger), etc.) til hvert utvalg.
  3. Ruge prøvene 1t på en roterende shaker på 200 rpm, 37 ° C.
  4. Etter inkubasjon Fjern ca 1 mL av TE bufferen som inneholder den desorbed GRFT fra medisinglass og aliquot til cluster rør. Butikken på 20 ° C til protein kvantifisering.
  5. Overføre prøven til en ny microcentrifuge tube, Legg til 1 mL av fersk buffer løsning fiber innen microcentrifuge røret, og ruge før neste tidspunkt.
  6. Typisk tid brukes til å måle utgivelsen inkluderer: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h og 1 wk. ubetydelig desorpsjon ble observert i disse studiene etter 4 h.

6. Kvantifisering av GRFT utvinning og desorpsjon via ELISA

  1. Coat en 96-brønns ELISA plate med 0,1 mL HA (10 µg/mL) per brønn som tidligere beskrevet 51. Seal platen med plastfolie og ruge over natten ved 4 ° C ( Figur 4).
  2. Fjerne belegg bufferen og legge 0,3 mL blokkerer buffer (2-3% bovin serum albumin (BSA) i PBS med 0,05% polysorbat 20) i hver brønn. Inkuber platen i minst 2 timer ved romtemperatur.
  3. Etter inkubasjon skyll platen 3 ganger med 1 x PBS med 0,1% polysorbat 20 (PBS-P). Etter rense, dispensere 0,1 mL av prøven, standard eller PBS som negativ kontroll i de respektive brønnene. Inkuber platen igjen i 1 time ved romtemperatur.
  4. Skyll platen 3 ganger igjen med PBS-P. Etter rense, Legg 0,1 mL primære antistoff (geit anti-GRFT antiserum) i hver brønn og ruge minst 1t ved romtemperatur. Vanligvis den primære antistoff løsningen er utvannet av 1:10,000 i PBS.
  5. Etter rugende prøvene med primære antistoff skyll platene igjen 3 ganger med PBS-P. Legge til 0,1 mL sekundære antistoff (pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert kanin anti-geit IgG) til hver godt og ruge 1t ved romtemperatur. Sekundær antistoff løsningen er utvannet av 1:10,000 i PBS.
  6. Vask platen 3 ganger. Legge til 0,1 mL TMB 2-peroxidase underlaget i hver brønn. Overvåke farge utvikling (ca 2 min), så legge til 0,1 mL H 2 så 4 (1 N) å slukke reaksjonen. Lese platen ved 450 nm på en plate leser.
  7. Gjennomsnittlig bakgrunn OD verdiene (brønner som bare motta PBS) og trekke dette fra experimental gruppene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fiber morfologi har en betydelig effekt på evnen til overflaten-endret EFs å gi beskyttelse mot virus. Selv om electrospinning er en praktisk og enkel prosedyre, kan ikke-optimalisert polymer formuleringer føre til uregelmessig fiber morfologi (figur 5ABC). Endringer i electrospinning forhold som resulterer i dannelsen av beaded eller amorf mat-lignende morphologies, er ofte forårsaket av løsemiddel-polymer uforlikelighet, lave polymer viskositet, flyt eller andre electrospinning forhold. De resulterende variasjonene i fiber strukturen kan resultere i annen utgivelse profiler for narkotika-innlemmet fiber eller inkonsekvenser i Bøyning effekt, endre Fibre kan fysisk eller kjemisk hindre virus penetrasjon. PLGA EFs fabrikasjon benytter beskrevet electrospinning betingelsene skal resultere i forskjellige fiber morphologies med diameter varierer mellom 1,5 og 2,8 µm (figur 6). For å bestemme fiber morfologi og diameter, undersøkes EFs med SEM før andre karakteristikk eller endring trinn.

SEM bilder av Tom, 0,05, 0,5 og 5 nmol GRFT fiber viste ingen betydelige forskjeller i fiber morfologi (figur 6A-D), som angir at GRFT endring har ingen innvirkning på fiber morfologi. For å bestemme gjennomsnittlig diameter på hver EF formulering, minimum 50 tilfeldig målinger ble tatt per synsfelt fra SEM bilder. De gjennomsnittlige diameter av EF formuleringer ble målt og beregnet i ImageJ, som vist i figur 6E. Alle EF formuleringer hadde lignende gjennomsnittlig diameter rundt 1,9 µm, demonstrere konsistensen av uforandret fiber fabrikasjon prosessen over bunker.

For å bestemme mengden av GRFT konjugert til EFs, ble GRFT-EFs oppløst i DMSO, etterfulgt av en 100-fold fortynning i TE buffer, for å hente GRFT fra fiber. Antall GRFT konjugert per mg fiber ble kvantifisert bruker ELISA. For hver endring tetthet (0,05, 0,5 og 5 nmol GRFT per mg fiber), ble ti gjentak evaluert. For 5, 0,5 og 0,05 nmol GRFT/mg EF modifikasjoner, hver EF hadde 373, 165 og 42 ng GRFT per mg av EF, noe som resulterer i Bøyning effektiviteten av 0,6 4.2 og 6,9%, henholdsvis. Disse resultatene viser at GRFT-EFs konjugert med høyere teoretisk overflaten-endring tetthet, resultere i mer GRFT konjugert til fiber (figur 7et). Det var imidlertid en invers korrelasjon med de resulterende Bøyning effektivitet29.

For å vurdere hvor mye GRFT covalently bøyd på fiber overflaten i forhold adsorbert, var GRFT-EFs ruges i sendinger å bestemme mengden av GRFT utgitt. I den første 4 h, 113, 25 og 10 ng av GRFT per mg EF ble oppdaget i sendinger for 5, 0,5 og 0,05 nmol teoretisk endring konsentrasjoner, henholdsvis. Disse verdiene samsvarer med 30% og 41% 24% av mengden GRFT konjugert til 5, 0,5 og 0,05 nmol GRFT-EFs. Etter 4 h, ble ubetydelig GRFT oppdaget i utgivelsen eluate for alle tre formuleringer. GRFT løslate etter 1, 2 og 4 h er vist i figur 7B. Sammen viser disse dataene at flertallet av GRFT er covalently bundet til EFs, og at overflaten adsorbert GRFT er utgitt i første 4 h.

Figure 1
Figur 1: macroscale morfologi av electrospun fiber. Electrospun fiber vist ble laget med en 4 mm (sylindere) og 25 mm (ark) diameter mandrel, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Electrospinning apparat. (A) innsamling mandrel der flytende jets av polymer innskudd, og (B) full electrospinning oppsettet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: skjematisk av EF modifisering med GRFT bruker EDC-NHS kjemi. (A) Carboxyl grupper på PLGA EF reagerer med NHS i nærvær av EDC til skjemaet Amin-reaktive estere, vil som deretter danner stabile amid obligasjoner med de primære aminer av GRFT. (B) to mg fiber disker eller biter er kuttet og ruges i 8 mL MES bufferen med 2 mL EDC/NHS reagens og roteres i 15 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: skjematisk illustrerer GRFT kvantifisering med ELISA. En 96-brønnen immunoplate er belagt med gp120 eller HA å fange og nakkens GRFT. Primære antistoffer mot GRFT, sekundær antistoffer koblet til pepperrotperoksidase og ELISA substrat legges sekvensielt for å kvantifisere GRFT. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: effekter av løsemiddel valg på PLGA EF morfologi. (A) 15% w/w PLGA EFs HFIP vises ønskelig tråd-lignende morfologi. (B) 15% w/w PLGA EFs kloroform og vannistedenfor, ikke form på grunn av ikke-optimale løsemiddel valg eller polymer konsentrasjon (viskositet). (C) 15% w/w og (D) 20% w/w PLGA EFs i TFE demonstrere viktigheten av polymer viskositet. Perler dannet i utformingen med lavere polymer konsentrasjon (C), mens økende polymer konsentrasjonen (løsemiddel viskositet) resulterte i veldefinerte fiber morfologi (D). Merk figuren 5B ble tatt på forstørring vise mat-lignende morfologi. Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: SEM bilder og fiber diameter av nakne og GRFT endret EFs. (A) Bare PLGA EFs og PLGA EFs overflaten endret med (B) 0,05 nmol, (C) 0,5 nmol, og (D) 5 nmol av GRFT per mg fiber. Skalere barer = 10 µm. (E) diameter av uforandret og GRFT-EFs. Feilfelt representerer den gjennomsnittlig ± SEM. Ingen statistisk forskjell ble observert mellom diameter uforandret og GRFT endret fibre. Figur 6 E har blitt tilpasset fra brudgom et al. 29 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Antallet GRFT konjugert til og desorbed fra GRFT-modifisert EF. (A) antallet GRFT konjugert til hver mg av EF fiber øker med økt GRFT reactant konsentrasjon. (B) antallet GRFT fra hver mg fiber vises for 0,05, 0,5 og 5 nmol formuleringer etter 1, 2 og 4 h inkubasjon i sendinger. Feilfelt representerer den gjennomsnittlig ± SEM. Dette tallet er tilpasset fra brudgom et al. 29 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deres porøse strukturer og store flater, har EFs funnet en rekke programmer i helsevesen, hvorav inkluderer som terapeutiske levering biler. Narkotika og andre aktive agenter kan innlemmes i EFs tunable levering, mens biologiske og kjemiske ligander kan bli bøyd på fiber overflaten for celle-spesifikke målretting52 eller biosensing53. Her endret fabrikasjon av GRFT overflaten PLGA EFs, som en levering stillaset å hindre HIV-smitte, er beskrevet. GRFT-EFs ble syntetisert av electrospinning, gir fordelene med lav pris og høy hastighet i forhold til andre fiber produksjon metoder49,53.

Avgjørende skritt i protokollen
Dannelsen av EFs er kritisk avhengig av egenskapene til polymer løsning, spesielt løsning eller løsemiddel viskositet54. Faktorene som påvirker viskositeten av en polymer løsning inkluderer polymer molekylvekt, polymer konsentrasjon og typen løsningsmiddel brukes. Oppløsningen eller løsemiddel viskositet justeres vanligvis ved å endre forholdet mellom polymer løsemiddel, å få ønsket polymer konsentrasjonen. Med hver fabrikasjon, må volumet opprettholdes under overnatting inkubasjonen å opprettholde riktig polymer-til-betalingsevne forholdet (viskositet). På tilstrekkelig høy polymer konsentrasjon, polymer molekyler vikle inn i løsningen under electrospinning prosessen å produsere fiber. Under electrospinning prosessen, en perle vil danne på spinneret spissen og hvis det er tilstrekkelig polymer forviklinger, flytende jets vil bryte ut fra dette punktet på et kritisk spenning og akselerere i pisk-lignende måte mot de samle mandrel55. Løsemiddel fordampning vil da føre til jet tynning, produsere tråder fiber som de innskudd på samle mandrel. Når syntetisert, bør EFs analyseres av SEM å bekrefte riktig morfologi og konsekvent fiber diameter. Tilstedeværelsen av beaded EFs kan være et resultat av lav løsning viskositet56, overmåte høyspenning anvendt57, polymer mate rate58, eller en kombinasjon av alle tre faktorer. Hvis dette er observert, polymer konsentrasjon bør økes og anvendt spenningen og fôr rente skal justeres for å oppnå fiber-lignende morfologi.

For å bøy proteiner til EF overflaten, ble her PLGA carboxyl grupper reagert med EDC-NHS carbodiimide crosslinking kjemi59. Under endring prosessen, er fiber kort inkubert med EDC i nærvær av NHS som resulterer i konvertering av carboxylates i halv-stabil, Amin-reaktive estere. I two-step Bøyning prosessen er det avgjørende at bufferne brukes på hvert trinn har optimal pH, i produsentens instruksjoner, for å sikre maksimal Bøyning effektivitet. Halveringstiden av NHS estere verdiområder fra fire til fem timer på nøytral pH og senker i mer grunnleggende forhold60. Dermed den første reaksjonen skal utføres i MES buffer ved pH 5-6 og aktivert fibrene skal deretter overføres til en PBS buffer (pH 7.2-7,5) for påfølgende og umiddelbar reaksjon med GRFT. Det er også viktig at EDC er inaktivert ved tilsetning av 2-mercaptoethanol og tilstrekkelig skylles fra papirfibrene etter carboxylate aktivisering. Dette vil forhindre protein aktivering av EDC og selv-crosslinking under andre reaksjonen, noe som kan redusere Bøyning effektivitet.

Endringer og feilsøking
Selv om våre tidligere arbeid vist effekten av en rekke GRFT-modifisert fibrene mot HIV-1 smitte, visse prosessen endringer kan anses å tilpasse EF morfologi eller forbedre GRFT (eller andre protein) Bøyning effektivitet eller fiber gi29. Spesielt kan EF arealet økes ved å redusere fiber diameteren, for å aktivere en større overflate område for Bøyning. Tidligere studier har vist at å redusere polymer konsentrasjon og viskositet produserer mindre fiber diameter61,62. Men er denne tilnærmingen begrenset av dannelsen av beaded fiber når konsentrasjonen er under terskelverdien. Du kan redusere fiber diameter uten å endre løsning viskositet, dobbel løsningsmiddel systemer kan benyttes for å redusere overflatespenningen eller salter legges til øke løsning ledningsevne56,57. Begge metodene gir større strekking av electrospinning jets som kan produsere mindre fiber diameter. Lavere molekylvekt polymerer kan i tillegg brukes til å dikte opp mindre diameter fiber. Synkende fiber diameter gir også den ekstra fordelen av genererer mindre porer, potensielt gjør EFs mer effektiv som en barriere til virus penetrering, mikrobicid-baserte programmer63. Til slutt ble det observert at fuktighet kan påvirke EF avkastning. Ved høyere fuktighet, avkastningen tendens til å redusere grunnet dannelsen av fibre med uvanlig makro-morfologi. Installere en fuktighet kontrollsystem innenfor electrospinning kammeret kan derfor legge til rette produsere EFs med konsistent avkastning, hvis dette utgjør en utfordring til fabrikasjon.

For å forbedre GRFT Bøyning effektivitet, kan undersøke valg og plassering av functionalizable grupper også bli vurdert. For eksempel hvis de primære aminer av protein av interesse ligger i nærheten av indre av tredimensjonale protein, steric hinder hindre aktivert carboxyl grupper på EFs samarbeidsstil primære aminer, og dermed redusere den sannsynligheten for reaksjonen. Denne utfordringen kan overvinnes ved aminosyre substitusjon av protein for å generere en primær Amin gruppen nærmere til protein overflaten. Men som GRFT og andre proteiner avhenger til aktiviteten av sin bindende områder for funksjonalitet, bør endringer i protein konformasjon testes grundig i funksjonelle analyser før Bøyning.

Begrensninger
En stor begrensning av GRFT overflate modifisering er potensialet for lav Bøyning effektivitet ved hjelp carbodiimide crosslinking kjemi. Hvis antiviral protein rundt har en høy IC50, kan en lav Bøyning effektivitet ikke gir tilstrekkelig beskyttelse (i disse programmene) mot virusinfeksjon. Men for GRFT (eller annet modifisert) EFs, proteiner og aktive agenter som ikke er bundet til covalentlyEFs kan fortsatt adsorberes til overflaten. Disse adsorbert agenter har potensial til å utfylle aktiviteten til konjugert GRFT, av transiently øker lokaliserte konsentrasjonen tilgjengelig for virus bindende. I dette eksemplet desorbed GRFT kan binde til HIV-1-virions som ikke direkte kontakt EFs, og kan gi en alternativ mekanisme for beskyttelse med første 4 h (pericoital) administrasjon. Dermed kan både konjugert og overflaten adsorbert GRFT bidra til gir enhetlig beskyttelse mot Soi.

Til tross for beskyttelse overdratt fra protein bøyning og desorpsjon, kan andre overflaten-endring strategier med potensielt høyere effektivitet gjennomføres. PLGA ble avsluttet med aminer stedet for carboxyl grupper kan for eksempel brukes til å bøy aktivert GRFT. En annen overflate-endring strategi kan også brukes til å forbedre EF-protein Bøyning effektiviteten. Nanofibrous membraner består av EFs har blitt functionalized med avidin via carbodiimide crosslinking kjemi64. Biotinylation eller tillegg av en Strep-tag (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) gjennom rekombinasjon kan aktivere endret protein skjemaet sterk og svært stabil ikke-kovalente interaksjon med avidin EFs. Mens ikke-Kovalente, er avidin-biotin sammenhengen den sterkeste ikke-kovalent bindingen, med femtomolar affinitet, sannsynligvis resulterer i stabil Bøyning fiber overflate. For enhver overflate-endring strategier anses steric hindring å maksimere Bøyning effektivitet.

Til slutt, vi ser at overflaten endret EFs vil tilby en alternativ strategi å aktiv agent innkapsling å gi supplerende moduser av beskyttelse. En vurdering med å kombinere innkapsling og overflaten-endring teknologier på en enkelt EF plattform vil være å redusere tidlig utgivelsen av aktive agenter under overflaten-endring prosessen. For overflate-endring reaksjoner som krever relativt lange inkubasjonstiden tid i vandig løsning, kan en betydelig andel av den aktive agenter lastet være tapt på grunn av polymer hydrolyse.

Betydningen av metoden med hensyn til eksisterende og Alternative metoder
I tidligere arbeid observerte vi at uforandret tom EFs kunne hindre HIV-smitte med ~ 38% når den plasseres i en transwell setter over infectible celler29. Denne observasjonen kombinert med biocompatibility, web-lignende mikrostruktur og tortuosity av EFs, parallelt med observert potente antiviral selvklebende egenskapene og GRFT, bedt om utviklingen av overflaten endret EFs beskrevet her.

Forhold til andre leveringsteknologier for tiden ansatt i mikrobicid programmer, EFs har en rekke potensielle programmer på grunn av deres arkitektur og kapasitet for tilpasning. I annet arbeid, har fibrøs morfologi av EFs aktivert dem å levere aktive agenter, og å etterligne ECM, noe som gjør dem egnet stillaser tissue engineering. EFs har også vært overflaten-endret å forbedre biocompatibility og forbedre vedvarende-release65,66.

For å forbedre biocompatibility eller levere agenter som fungerer gjennom bestemte binding aktivitet, finnes mange metoder som tillater feste forbindelser til overflaten av EFs som plasma behandlinger, våt kjemiske metoder og overflate pode polymerizations50. Ved GRFT som spesifikt bindes til de virus glykoproteiner av HIV-1, er våt kjemiske EDC-NHS den mest optimale på grunn av muligheten til å trenge fiber dypt i nettet samtidig bevare GRFT funksjonalitet50. GRFT immobilisert til EFs kan bli levert i en Holdbar utforming til FRT og gir umiddelbart beskyttelse mot HIV-smitte.

Kovalente Bøyning sammenlignet med eksisterende strategi innkapsle therapeutics i EFs å hemme STIs, og tilbyr klar fordel av å øke potensielle avidity mellom GRFT og HIV virions. Av immobilizing GRFT til EFs gjennom overflaten-endring, kan svært lokaliserte konsentrasjoner av GRFT oppnås, og som øker muligheten for multivalent bindende med HIV. I tillegg kan EF-immobilisert GRFT, i forhold til gratis GRFT i løsningen forhindre uttømming av GRFT ved å hindre celle internalisering. Videre på grunn av unike virkningsmekanismen av GRFT som en stabil og lim inhibitor kan kovalente overflaten Bøyning overflaten endret EFs å gi en fysisk barriere mot virus penetrasjon, i tillegg til potente antiviral egenskaper.

Fremtidige anvendelser av denne metoden
Bruken av overflaten-modifikasjon for levering presenterer muligheten til å integrere flere aktive agenter i en enkelt EF-plattform. I fremtiden, ønsker vi å utvikle en multipurpose teknologi (MPT) der en rekke aktive agenter kan være innkapslet i og konjugert til EFs. Disse MPTs kan være utformet for å gi beskyttelse mot et bredere spekter av patogener ved å innlemme therapeutics med forskjellige virkningsmekanismer. Ved å benytte både overflaten og indre av EFs å levere aktive agenter med forskjellige virkningsmekanismer, skal potensialet i EFs å beskytte mot virusinfeksjon maksimeres.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige til jødiske Heritage fondet for Excellence for finansiering denne forskningen. Vi takker Dr. Stuart Williams II for sjenerøst gir bruk av electrospinning systemet. Vi takker også Dr. Kenneth Palmer for å gi oss Griffithsin. Vi takker i tillegg Dr. Nobuyuki Matoba og hans lab for trening oss i GRFT ELISA arbeide.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792 (2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108 (2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635 (2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Tags

Bioteknologi problemet 128 Electrospun fiber seksuelt overførbare infeksjoner humant immunsviktvirus overflate-endring mikrobicid Griffithsin poly (lactic-co-glycolic acid)
Fabrikasjon og karakterisering av Griffithsin endret Fiber stillaser for forebygging av seksuelt overførbare infeksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vuong, H. R., Tyo, K. M.,… More

Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter