Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fremstilling og karakterisering af Griffithsin-ændret Fiber stilladser til forebyggelse af seksuelt overførte infektioner

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

Dette manuskript beskriver proceduren, at fabrikere og karakterisere Griffithsin modificerede poly (mælkesyre-co-glycolic acid) electrospun fibre, der demonstrerer potent klæbende og antiviral aktivitet mod human immundefekt virus type 1-infektion i vitro. Metoder, der anvendes til at syntetisere, overflade-redigere, karakteriserer den resulterende morfologi, konjugering, og desorption for Griffithsin fra overfladen-modificerede fibre er beskrevet.

Abstract

Electrospun fibre (EFs) har været meget anvendt i en række terapeutiske applikationer; men de er først for nylig blevet anvendt som en teknologi til forebyggelse og behandling af seksuelt overførte infektioner (Soi). Desuden, mange elementærfilen teknologier fokusere på indkapsling det aktive stof, i forhold til udnytte overflade for at give biofunctionality. Her beskriver vi en metode til at fabrikere og overflade-ændre poly(lactic-co-glycolic) syre (PLGA) electrospun fibre, med den potente antiviral lektin Griffithsin (GRFT). PLGA er en FDA-godkendt polymer, der har været meget anvendt i medicinafgivelse på grund af sin fremragende kemiske og biokompatible egenskaber. GRFT er en naturlig, potent, sikker lektin, som besidder bred aktivitet mod mange vira herunder human immundefekt virustype 1 (HIV-1). Når de kombineres, har GRFT-ændret fibre vist potent inaktivering af HIV-1 i vitro. Dette manuskript beskriver metoder til at fremstille og karakterisere GRFT modificerede EFs. Første er PLGA electrospun til at oprette en fiber stillads. Fibre er efterfølgende overflade-modificeret med GRFT ved hjælp af 1-Ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) og N-hydroxysuccinimide (NHS) kemi. Scanning elektronmikroskopi (SEM) blev brugt til at vurdere, hvilken størrelse og morfologi af overflade-ændrede formuleringer. Derudover en gp120 eller hemagglutinin (HA)-baseret ELISA kan bruges til at kvantificere mængden af GRFT konjugeret med, samt GRFT desorption fra fiber overflade. Denne protokol kan anvendes mere bredt til at fabrikere fibre, der er overfladen-modificeret med en bred vifte af forskellige proteiner.

Introduction

Brugen af EFs som en aktuel leveringsplatform har potentiale til at reducere seksuelt overførte sygdomme. I øjeblikket, er der mere end 36 millioner mennesker lever med HIV, med over to millioner nye tilfælde rapporteret i 2015 alene1,2. Derudover herpes simplex virus type 2 (HSV-2) infektion påvirker hundredvis af millioner af mennesker verden over og har vist sig at forbedre erhvervelse af HIV af 2-5 fold3. På grund af dette forhold mellem HSV-2 infektion og HIV erhvervelse er der betydelig interesse i at udvikle nye aktive agenter, der samtidig beskytter mod flere sexsygdomme. Desuden giver udviklingen af nye køretøjer til at forbedre leveringen af disse antivirale stoffer potentiale til yderligere at styrke beskyttende og terapeutiske styrken. Mod dette mål, er EFs blevet undersøgt som en ny leveringsplatform til at reducere forekomsten af HIV-1 og HSV-2 infektioner.

I løbet af de seneste to årtier, har EFs været flittigt brugt inden for drug delivery og tissue engineering4. Ofte, er biokompatible polymerer udvalgt til at nemt oversætte til terapeutiske anvendelsesmuligheder. For at fabrikere polymere EFs, er valgte polymeren opløst i et organisk opløsningsmiddel eller vandige løsning, afhængigt af graden af polymer hydrophobicity5. Aktive agenter for renter føjes derefter til de opløsningsmiddel eller vandige løsning inden electrospinning processen. Polymer løsning er derefter indsugning i en sprøjte og langsomt skubbet ud under en elektrisk strøm. Denne proces resulterer typisk i polymer fibre med ark eller cylindrisk macrostructures (figur 1) og fiber diametre spænder fra mikro-nano-skala6. Til mest terapeutisk anvendelse, overfladeaktive stoffer er indarbejdet i fibrene under electrospinning processen og er frigivet fra fiber via diffusion og efterfølgende fiber nedbrydning. Sats for nedbrydning eller frigivelse kan ændres ved hjælp af forskellige typer af polymerer eller polymer blander for at etablere en ønskede release profil, bibringe unikke kemiske og fysiske egenskaber7, og at fremme indkapsling af praktisk talt alle sammensatte. Som sådan, EFs har vist sig gavnlig for levering af små molekyle narkotika og biologiske agenser herunder proteiner, peptider, oligonukleotider og vækstfaktorer6,8,9.

I feltet STI forebyggelse, har EFs været brugt for nylig at indarbejde og give vedvarende - eller inducerbar-frigivelse af antivirale stoffer10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. I en af de tidligste undersøgelser, blev pH-responderende fibre udviklet for at frigive overfladeaktive stoffer i reaktion på miljømæssige ændringer inden for den kvindelige forplantningsorganerne (FRT), som en oven på-anfordring metode til beskyttelse mod HIV-111. Siden, har andre undersøgelser undersøgt blandinger af polymere består af polyethylen oxid (PEO) og poly-L-mælkesyre (PLLA), at evaluere afstemmelige udgivelsen af antivirale og svangerskabsforebyggende agenter for HIV-1 forebyggelse og prævention in vitro 12. yderligere undersøgelser har påvist muligheden for EFs at give følgende: forlænget frigivelse af lille molekyle antivirale lægemidler14, stærk og fleksibel mekaniske egenskaber20, 3D-levering arkitekturer21 , hæmning af sperm penetration12, og evnen til at fusionere med andre levering teknologier13. Tidligere arbejde har endelig vurderet polymere fibre for vedvarende levering af antivirale midler mod fælles co-infective virus, HSV-2 og HIV-114. I denne undersøgelse fastsat polymer fibre supplerende aktivitet til antiviral levering af bibeholder deres struktur for op til 1 måned og giver en fysisk viral adgangsbarriere. Fra disse resultater, blev det observeret, at EFs kan bruges til både fysisk og kemisk hindre virusinfektion.

Mens afstemmelige release egenskaber gør polymere EFs en attraktiv leveringsplatform for microbicide levering, er EFs udviklet i andre programmer til at tjene som overflade-modificerede stilladser7. EFs har været brugt til at efterligne morfologi af den ekstracellulære matrix (ECM), ofte optræder som stilladser til at forbedre cellulære regeneration22, og deres nytte i tissue engineering23,24. Fibre består af polymerer såsom poly-ε-caprolactone (PCL) og PLLA har været overflade-modificeret med vækstfaktorer og proteiner efter electrospinning at give ECM-lignende egenskaber, herunder øget cellulær vedhæftning og spredning25 , 26. Derudover antimikrobiel overflade-modificerede EFs er blevet evalueret for at forhindre vækst af bestemte sygdomsfremkaldende bakterier27,28. Denne alsidighed og evnen til at inducere biologiske effekter, EF teknologi fortsætter med at udvide på tværs af en række forskellige områder til at give multi mekanistiske funktionalitet. Endnu, trods deres nytte i en mangfoldighed af applikationer, overflade-modificerede fibre har først for nylig blevet udforsket i microbicide felt29.

Parallelt med udviklingen af nye levering teknologier til forebyggelse og behandling af seksuelt overførte sygdomme er blevet udviklet nye biologiske lægemidler. En af de mest lovende microbicide kandidater er selvklæbende antiviral lektin, GRFT30. Oprindeligt stammer fra en art af rødalger, GRFT har påvist aktivitet som en potent hæmmer af HIV, HSV-2, SARS, og Hepatitis C virus31,32,33,34, 35 , 36. I virkeligheden blandt biologisk baseret hæmmere, GRFT har den mest potente anti-HIV aktivitet, inaktivere HIV-1 næsten umiddelbart efter kontakt30, samtidig opretholde stabilitet og aktivitet i nærværelse af kultur medier fra vaginal mikrober for op til 10 dage37. For nylig, en 0.1% GRFT gel var vist sig at beskytte mus mod intravaginal HSV-2 udfordring, hvilket gør det en lovende kandidat til den første linje af beskyttelse mod både HSV-2 og HIV-132, 38. for HIV specifikt, GRFT hæmmer infektion ved fysisk bindende gp120 eller terminal mannose N-linked glycan rester på virale kuvert overflader til at forhindre indrejse38,39,40,41 ,42. Denne hæmning er yderst potent, med IC50s nærmer sig 3 ng/mL43. Ud over hæmme HIV-infektion, har undersøgelser også vist, at GRFT beskytter mod HSV-2 infektion ved at hæmme celle til celle spredningen af virus32. I alle tilfælde, har GRFT vist sig at være klæbemiddel til viruspartikler, mens demonstrere høj modstand til denaturering. Sidst, GRFT har påvist synergistisk aktivitet med kombinationer af Tenofovir (TFV) og andre antivirale lægemidler44, gør det muligt og sandsynligvis til gavn for Co administrere med EFs. GRFT potente egenskaber gør det en fremragende biologisk baseret antiviral kandidat, hvor levering kan blive styrket med elementærfilen teknologi.

Udnytte denne viden om de klæbende og medfødte antivirale egenskaber af GRFT, var et polymert fiber stillads designet, der integrerer disse egenskaber for at give det første lag af virus løsning hæmning29. Finde inspiration i den måde, at cervicovaginal Slim hæmmer virus transport primært gennem mucoadhesive mucin interaktioner, hypotese vi, der ved hjælp af EFs som et stillads og kovalent ændre overflade med GRFT, en høj tæthed af overflade-konjugeret GRFT ville svække og inaktivere virus på sin entrypoint45,46,47. Her blev EFs udviklet som et stationært stillads til at tilvejebringe en protein-baseret, viral lim-uvirksomme barriere. Vi forsøgte at kombinere de potente antiviral ejendomme af GRFT med en biokompatible, kan ændres og holdbar polymer platform til at skabe en roman virus "fælde."

For at nå disse mål, fibre består af PLGA var electrospun, og EDC-NHS kemi blev brugt til efterfølgende ændre elementærfilen overfladen med GRFT. PLGA fungerede som en model polymer på grund af dens omfattende anvendelse i electrospinning48, kombineret med dens biokompatibilitet og omkostningseffektivitet. Derudover overflade ændring udnytter den store overflade af EFs, og giver et nyttigt alternativ, som kan kombineres med indkapsling at maksimere fiber nytte49. I modsætning til traditionelle indkapsling metoder hvor kun en del af GRFT er tilgængelige (og kun forbigående til stede i FRT), kan overfladen ændring aktiverer GRFT at opretholde maksimal bioactivity under hele varigheden af behandling. Derudover kan indarbejdelse af hydrofile forbindelser såsom proteiner, ved anvendelse af traditionelle electrospinning metoder resultere i lavere indkapsling effektivitet og tab af protein aktivitet50. Derfor, GRFT overflade-modificerede fibre kan tilbyde en lovende alternativ leveringsmetode, der kan bruges alene eller i kombination med electrospinning til at øge beskyttelsen mod STI infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse og fabrikation af Electrospun Fiber stillads

forsigtighed: alt arbejde med opløsningsmidler eller polymer løsninger bør udføres i en kemisk stinkskab . Henvise til materielle sikkerhed dataark hver reagens før du starter protokollen.

  1. Til electrospin en 3 mL 15% w/w PLGA polymer løsning, vejer 720 mg af 50/50 poly (mælkesyre-co-glycolic acid) (PLGA; 0,55 til 0,75 dL/g, 31-57 kDa) i et 10 mL scintillation hætteglas. Volumen af løsningen er baseret på den typiske batchstørrelse bruges i igangværende undersøgelser.
    Bemærk: Polymer massen til at tilføje til en given mængde opløsningsmiddel, der skal beregnes af første bestemmelse af tætheden af opløsningsmidlet anvendes til at opløse polymeren. Tætheden af opløsningsmiddel Hexafluoro-2-propanol (HFIP) er 1,59 g/mL. Således er vægten af opløsningsmiddel, baseret på en volumen på 3,0 mL HFIP behov for, er 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). For en 15% w/w brøkdel af PLGA til HFIP, 720 mg PLGA skal føjes til 3,0 mL HFIP (0,15 x 4.800 mg = 720 mg). Fordelen ved at bruge en % w/w polymer/løsning i stedet for % w/v, er, at dette giver en defineret vægten af den endelige løsning. Denne definerede vægt giver mulighed for mere præcis opløsningsmiddel erstatning i tilfælde af opløsningsmiddel fordampning under trin 1.3.
  2. Tilføje 3,0 mL HFIP til glas scintillation hætteglas indeholdende PLGA (fra trin 1.1) ved hjælp af serologiske glas pipette. Dække hætteglas med plastfolie, så måle og registrere hætteglasset Mass
  3. Ruger polymer suspension natten over ved 37 ° C til at sikre fuldstændig opløsning af polymeren. Hvis opløsningsmidler fordamper, faldende hætteglas massen, tilføje HFIP indtil hætteglasset når dens oprindelige masse i trin 1.2.
  4. Efter inkubation, forberede electrospinning apparatet ( fig. 2 A). Selv om en Dorn af enhver størrelse kan anvendes, her en roterende 25 mm ydre diameter rustfrit stål Dorn blev brugt som Samleren.
    Bemærk: En større dornen diameter vil falde fiber tykkelse, givet den samme mængde af electrospinning løsning.
  5. Opsug polymer løsning i en 3 mL sprøjten.
  6. Tilsluttes sprøjten en stump 18-gauge, ½ tomme nål tip og give afkald på den overskydende løsning (typisk 0,25 mL) for at fjerne tomme headspace i nål-spids.
  7. Placere sprøjten på en sprøjten pumpe og angive strømningshastighed instrument til 2,0 mL/h.
    Bemærk: Denne strømningshastighed var tidligere optimeret baseret på polymer viskositet for denne formulering.
  8. Tilslutte strømkilden til sprøjte nål og electrospin polymer løsning ved hjælp af en spænding på 27 kV. Afstanden mellem nål og samler skal indstilles til ca. 25 cm ( figur 2 B).
    Advarsel: Electrospinning processen skaber en opløsningsmidlets dampe. Brug et stinkskab eller en lukket apparater ( figur 2) til at fjerne den skadelige dampe .
  9. Når hele løsningen er electrospun, slå fra strømkilden og tillade dornen at spinde i en yderligere 30 min til fuldt fordampe opløsningsmiddel.
  10. Turn off den roterende dornen collector, og bruge et barberblad til at skære fiber fra dornen. Bruge bladet til forsigtigt skræl fiber fra dornen.
  11. Indsamle electrospun PLGA fiber ind i en mærket petriskål, og sted i en desiccatorovernight at fjerne resterende opløsningsmiddel.

2. Overflade-ændring af fibre med GRFT

  1. Forbered løsninger fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES buffer). Forberede PBS ved at opløse 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1.44 g Na 2 HPO 4 og 0,24 g KH 2 PO 4 i 1 L i ultrarent vand. På samme måde opløses 19.52 g MES (fri syre, MW 195.2) og 29.22 g NaCl i 1 L ultrarent vand, til at forberede MES buffer. Sikre den endelige pH af hver opløsning er mellem 7,2-7,5 og 5,0-6,0, henholdsvis ved hjælp af et pH-meter.
  2. Fremstilles individuelt arbejde af EDC (2 mM) og NHS (5 mM).
    1. Fjern EDC og NHS fra fryseren og lad dem til Reagensglasset stuetemperatur før vejning.
    2. Vejer 4 mg af EDC til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
    3. Vejer 6 mg af NHS ind i en anden microcentrifuge tube.
    4. Tilføje 1 mL MES buffer til hver tube. Vortex begge rør kraftigt til at sikre reagenserne, der er helt opløst.
  3. Forberede en opløsning af hydroxylamin af vejer 70 mg i en 50 mL konisk centrifugeglas.
  4. Tilsættes 20 mL PBS hydroxylamin og vortex krystallerne.
  5. Masse ud en passende mængde PLGA fiber ind i en 15 mL konisk centrifugeglas. Typisk 75 mg af fiber bruges for hver reaktion batch.
  6. Tilsættes 8 mL MES buffer til 15 mL tube.
  7. Tilføje 1 mL hver af EDC og NHS løsninger udarbejdet tidligere til røret. Den endelige mængden af løsningen bør være 10 mL. De endelige koncentrationen af EDC og NHS bør være 0,4 mg/mL og 0,6 mg/mL, henholdsvis.
  8. Tæt og forsegle 15 mL tube med plastfolie og sted på en rotator til at tillade løsning til vendes forsigtigt i 15 min. ved stuetemperatur ( fig. 3 B). Dette trin aktiverer carboxyl grupper på polymeren at tillade kovalente modifikation med GRFT protein ( fig. 3 A).
  9. Efter aktivering, omhyggeligt dæmpning reaktion ved at tilføje 14 µL af β-mercaptoethanol til røret. Vend røret flere gange for at sikre fuldstændig opblanding.
    Forsigtig: β-mercaptoethanol er meget giftigt og bør kun bruges i en kemisk stinkskab.
  10. Supernatanten og skyl PLGA fiber to gange, med 10 mL PBS, at fjerne enhver resterende β-mercaptoethanol.
  11. Efter skylning, tilsættes en passende mængde GRFT stamopløsning til røret. For eksempel, ville en 5 nmol GRFT/mg fiber kræve 6,35 µL af GRFT stamopløsning (fra en 10 mg/mL bestand) pr. mg af fiber. Således en 75 mg fiber prøve ville kræve 476.25 µL af 10 mg/mL GRFT stamopløsning.
    Bemærk: GRFT fibre med teoretisk belastning af 0,05, 0,5 og 5 nmol GRFT pr. mg fiber blev fabrikeret.
  12. Tilføje nok PBS for at bringe det endelige rumfang på 8 mL, Luk og vend røret for at sikre grundig blanding.
  13. Forsegling røret med plastfolie og placere på en rotor igen, denne gang for 2 h.
  14. Efter 2 h inkubation, slukke reaktionen ved tilsætning 2 mL af hydroxylamin løsning i 15 mL-centrifugerør. Per producentens instruktioner, bør den endelige koncentration af hydroxylamin under quenching reaktionen 0,7 mg/mL.
  15. Bland opløsningen godt og supernatanten. Skyl overflade-modificerede PLGA fiber to gange med 10 mL ultrarent vand for at fjerne enhver ukonjugeret GRFT.
  16. Overføre fiber til en petriskål og sted inde i en ekssikkator indtil fiber er helt tørt. Overføre petriskålen til 4 ° C for oplagring.

3. SEM karakterisering af GRFT overflade-modificerede fibre

  1. sted en stribe af dobbeltsidet carbon bånd på en SEM modellen mount. Etiket i bunden af modellen mount med prøven identificerende oplysninger ved hjælp af en permanent markør.
  2. Skære tre prøver fra en overflade-modificerede fiber og placere dem på separate modellen mounts. Tykkelsen af hver prøve er ca 0.5 mm.
  3. Sputter pels prøver ved hjælp af elektron-induceret partikel deposition fra en guldplade. Sputter frakke til 90 s, på 2.4 kV.
    Bemærk: Sputter frakke tid kan variere afhængigt af udstyr parametre, herunder spænding og strømstyrke.
  4. Billede prøverne på 8 kV med forstørrelse spænder fra 1.000 til 5, 000 X.

4. Ekstraktion af GRFT fra overfladen-modificerede fibre

  1. masse ud 2 mg af fiber i tre eksemplarer i 1,5 mL microcentrifuge rør.
  2. Tilsæt 1 mL dimethylsulfoxid (DMSO) til rør, så vortex og inkuberes i 1 min. ved stuetemperatur til at opløse fiber.
  3. Efter inkubation, fortynde en 10 µL alikvot af DMSO-fiber løsning fra trin 4.2, i det mindste 100-fold i Tris-EDTA (TE) buffer (pH = 8.0).
  4. Gemme prøver på-20 ° C indtil lastning karakterisering med ELISA.

5. Måling GRFT Desorption fra fibre

  1. at vurdere mængden af GRFT frigivet eller desorberet fra fiber, vejer 5-10 mg af overflade-modificerede fiber og sted i et microcentrifuge rør. Optage fiber massen i hver tube.
  2. Tilsættes 1 mL af en passende løsning, der efterligner den fysiologiske miljø (fx PBS, TE buffer, simulerede vaginal væske (SVF), osv.) til hver prøve.
  3. Ruger prøver i 1 time på en roterende shaker på 200 rpm, 37 ° C.
  4. Efter inkubation, Fjern ca. 1 mL af TE buffer indeholdende den desorberede GRFT fra hætteglasset, og prøve at klynge rør. Opbevares ved-20 ° C indtil protein kvantificering.
  5. Overføre prøven til et nyt microcentrifuge-rør, tilsættes 1 mL frisk stødpudeopløsning til fiber i microcentrifuge røret, og der inkuberes indtil næste gang.
  6. Typiske tid point bruges til at måle udgivelse omfatter: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h, og 1 uge ubetydelig desorption blev observeret i disse undersøgelser efter 4 h.

6. Kvantificering af GRFT udvinding og Desorption via ELISA

  1. frakke en 96-vel ELISA plade med 0,1 mL af HA (10 µg/mL) pr. brønd som tidligere beskrevet 51. Forsegle pladen med plastfolie og inkuberes natten over ved 4 ° C ( figur 4).
  2. Fjerne belægning buffer, og der tilsættes 0,3 mL blokerende buffer (2-3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS med 0,05% Polysorbat 20) til hver brønd. Inkuber plade i mindst 2 timer ved stuetemperatur.
  3. Efter inkubation, skyl plade 3 gange med 1 x PBS med 0,1% Polysorbat 20 (PBS-P). Efter skylning, se bort fra 0,1 mL prøve, standard eller PBS som negativ kontrol i de respektive brønde. Inkuber plade igen i 1 time ved stuetemperatur.
  4. Skylles plade 3 gange igen med PBS-P. Efter skylning, tilsættes 0,1 mL af primære antistof (ged anti-GRFT antiserum) i hver brønd og Inkuber i mindst 1 time ved stuetemperatur. Typisk, den primære antistof fortyndingen af 1:10,000 i PBS.
  5. Efter inkubere prøver med primær antistof skyl pladerne igen 3 gange med PBS-P. Der tilsættes 0,1 mL sekundær antistof (peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret kanin anti-ged IgG) til hver godt og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur. Sekundær antistof fortyndingen af 1:10,000 i PBS.
  6. Vask pladen 3 gange. Tilføje 0,1 mL TMB 2-peroxidase substrat til hver brønd. Overvåge farveudviklingen (ca. 2 min.), hvorefter der tilsættes 0,1 mL H 2 så 4 (1 N) til at slukke reaktionen. Læs plade ved 450 nm på en pladelæseren.
  7. Gennemsnitlig OD baggrundsværdierne (brønde, som kun modtager PBS), og trække dette fra de eksperimentelle grupper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fiber morfologi har en betydelig effekt på overfladen-modificerede EFs evne til at yde beskyttelse mod virus. Selv om electrospinning er en bekvem og ukompliceret procedure, kan ikke-optimerede polymer formuleringer medføre uregelmæssig fiber morfologi (figur 5B-C). Ændringer i electrospinning vilkår, der resulterer i dannelsen af beaded eller amorf måttelignende morfologier, er ofte forårsaget af opløsningsmiddel-polymer uforenelighed, lave polymer viskositet, strømningshastighed eller andre electrospinning betingelser. De deraf følgende variationer i fiber struktur kan resultere i forskellige release profiler for narkotika-indarbejdet fibre eller uoverensstemmelser i konjugation effektivitet, at ændre fibre evnen til fysisk eller kemisk hindre virus indtrængen. PLGA EFs opdigtet benytter beskrevet electrospinning betingelser bør resultere i forskellige fiber morfologier diametre spænder mellem 1,5 og 2,8 µm (figur 6). For at bestemme fiber morfologi og diameter, bør EFs undersøges med SEM før andre skridt, karakterisering eller modifikation.

SEM billeder af tom, 0,05, 0,5 og 5 nmol GRFT fibre viste ingen væsentlige forskelle i fiber morfologi (figur 6A-D), der angiver, at GRFT ændring har ingen effekt på fiber morfologi. Bestem den gennemsnitlige diameter af hver EF formulering ved et minimum af 50 tilfældige målinger blev taget per synsfelt fra SEM-billeder. De gennemsnitlige diameter af EF-formuleringer var målt og beregnet i ImageJ, som vist i figur 6E. Alle EF formuleringer havde lignende gennemsnitlig diameter omkring 1,9 µm, demonstrerer sammenhængen i umodificeret fiber fabrikationsproces på tværs af partier.

For at bestemme mængden af GRFT konjugeret til EFs, blev GRFT-EFs opløst i DMSO, efterfulgt af en 100-fold fortynding i TE-buffer til at udtrække GRFT fra fiber. Mængden af GRFT konjugeret pr. mg af fiber var kvantificeres ved hjælp af ELISA. For hver ændring tæthed (0,05, 0,5 og 5 nmol GRFT pr. mg fiber), blev ti replikater evalueret. For 5, 0,5 og 0,05 nmol GRFT/mg elementærfilen ændringer hver elementærfilen havde 373, 165 og 42 ng GRFT pr. mg af EF, hvilket resulterer i konjugation effektivitetsgevinster af 0,6, 4.2 og 6,9%, henholdsvis. Disse resultater viser, at GRFT-EFs konjugeret med højere teoretisk overflade-modifikation tæthed, resulterer i flere GRFT konjugeret med fiber (figur 7A). Der var dog en invers korrelation med den deraf følgende konjugation effektivitet29.

For at vurdere mængden af GRFT kovalent konjugeret med fiber overflade i forhold til adsorberet, blev GRFT-EFs udruget i SVF til stoerrelsen af GRFT frigives. Inden for de første 4 h, 113, 25 og 10 ng af GRFT pr. mg EF blev opdaget i SVF for 5, 0,5 og 0,05 nmol teoretiske ændring koncentrationer, henholdsvis. Disse værdier svarer til 30%, 41% og 24% i mængden af GRFT konjugeret med 5, 0,5 og 0,05 nmol GRFT-EFs. Efter 4 h, blev ubetydelige GRFT opdaget i release eluatet for alle tre formuleringer. GRFT frigivelse efter 1, 2 og 4 h er vist i figur 7B. Taget sammen, viser disse data, at størstedelen af GRFT er kovalent bundet til EFs, og at den overflade adsorberet GRFT er udgivet inden for de første 4 h.

Figure 1
Figur 1: overordnet morfologi af electrospun fibre. Electrospun fibrene vist var opdigtet benytter en 4 mm (cylinder) og 25 mm (ark) diameter dornen, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Electrospinning apparater. (A) indsamling dornen hvor de flydende jetfly af polymer depositum, og (B) den fulde electrospinning setup. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: skematisk af EF modifikation med GRFT ved hjælp af EDC-NHS kemi. (A) Carboxyl grupper på PLGA elementærfilen reagerer med NHS i overværelse af EDC til form Amin-reaktiv estere, der efterfølgende danner stabilt akrylamid obligationer med de primære aminer af GRFT. (B) to milligram fiber diske eller stykker er skåret og inkuberes i 8 mL af MES buffer med 2 mL af EDC/NHS reagens og roteret i 15 min. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: skematiske illustrerer GRFT kvantificering ved hjælp af ELISA. En 96-brønd immunoplate er belagt med gp120 eller HA til fange og immobilisere GRFT. Primære antistoffer mod GRFT, sekundære antistoffer knyttet til peberrodsperoxidase og ELISA substrat er sekventielt føjet til at kvantificere GRFT. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: effekter af opløsningsmiddel valg på PLGA elementærfilen morfologi. (A) 15% w/w PLGA EFs i HFIP vises ønskeligt tråd-lignende morfologi. (B) 15% w/w PLGA EFs i chloroform og dimethylformamid, undladt at form på grund af ikke-optimal opløsningsmiddel valg eller polymer koncentration (viskositet). (C) 15% w/w og (D) 20% w/w PLGA EFs i TFE demonstrere vigtigheden af polymer viskositet. Perler dannes i formuleringen med lavere polymer koncentration (C), mens stigende polymer koncentration (solvent viskositet) resulterede i veldefinerede fiber morfologi (D). Bemærk, figur 5B blev taget ved lavere forstørrelse at vise måttelignende morfologi. Skalere barer = 10 µm. Klik venligst her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: SEM billeder og fiber diametre af nøgne og GRFT-ændret EFs. (A) nøgne PLGA EFs og PLGA EFs overflade-modificeret med (B) 0,05 nmol, (C) 0,5 nmol, og (D) 5 nmol af GRFT pr. mg af fiber. Skalere barer = 10 µm. (E) diameter af uændrede og GRFT-EFs. Fejllinjer udgør i gennemsnit ± SEM. Ingen statistisk forskel var observeret mellem diameteren af uforandret og GRFT-ændret fibre. Figur 6 E er blevet tilpasset fra brudgomme et al. 29 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7 : Mængden af GRFT konjugeret til og desorberet fra GRFT-ændret elementærfil. (A) antallet GRFT konjugeret til hver mg af EF fiber stiger med øget GRFT reaktant koncentration. ()B) mængden af GRFT frigives fra hver mg af fiber er vist for 0,05, 0,5 og 5 nmol formuleringer efter 1, 2 og 4 h inkubation i SVF. Fejllinjer udgør i gennemsnit ± SEM. Dette tal er blevet tilpasset fra brudgomme et al. 29 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grund af deres porøse strukturer og store arealer, har EFs fundet en lang række applikationer inden for sundhedssektoren, hvoraf den ene indeholder servering som terapeutisk levering køretøjer. Narkotika og andre stoffer kan være indarbejdet i EFs afstemmelige levering, mens biologics og kemiske ligander kan være konjugeret med fiber overflade for celle-specifikke målretning52 eller biosensing53. Her modificerede fabrikation af GRFT overflade-PLGA EFs, som en levering stillads til at forebygge HIV-infektion, er beskrevet. GRFT-EFs blev syntetiseret af electrospinning, giver fordelene ved lave omkostninger og høj produktion sats i forhold til andre fiber produktion metoder49,53.

Kritiske trin i protokollen
Dannelsen af EFs er kritisk afhængige egenskaber af polymer løsning, navnlig løsning eller opløsningsmiddel viskositet54. De faktorer, der påvirker viskositet af en polymer løsning omfatter polymer molekylvægt, polymer koncentration og typen af opløsningsmidlet anvendes. Den løsning eller opløsningsmiddel viskositet reguleres typisk ved at ændre forholdet mellem polymer til opløsningsmiddel, at opnå den ønskede polymer koncentration. Med hver fabrikation, skal volumen opretholdes i natten inkubation at opretholde ordentlig polymer til opløsningsmiddel forholdet (viskositet). Ved tilstrækkelig høj polymer koncentration vikle polymer molekyler i løsningen under electrospinning proces til at producere fibre. Under electrospinning processen, en perle vil danne på spindedyse spids og hvis der er tilstrækkelig polymer entanglement, flydende jetfly vil bryde ud fra dette punkt på en kritisk spænding og fremskynde i pisk-lignende mode mod indsamling dornen55. Opløsningsmiddel fordampning vil så føre til jet udtynding, producerer tråde af fiber, som de indbetaler på indsamling dornen. Når syntetiserede, bør EFs analyseres af SEM at kontrollere ordentlig morfologi og konsekvent fiber diameter. Tilstedeværelsen af beaded EFs kan være resultatet af lavt løsning viskositet56, overordentlig høj anvendt spænding57, polymer feed rate58, eller en kombination af alle tre faktorer. Hvis dette er observeret, polymer koncentration bør øges og den anvendte spænding og tilførselshastigheden bør tilpasses for at opnå fiber-lignende morfologi.

For at konjugat proteiner til elementærfilen overfladen, blev PLGA carboxyl grupper her reagerede, ved hjælp af EDC-NHS carbodiimide crosslinking kemi59. Undervejs ændring inkuberes fibre kortvarigt med EDC i overværelse af NHS, hvilket resulterer i omdannelse af carboxylates til semi-stabil, Amin-reaktiv estere. Under konjugation totrinsproces er det kritisk, at buffere anvendes under hvert trin har den optimale pH, bemærkede i producentens instruktioner, til at sikre maksimal konjugation effektivitet. Halveringstiden for NHS estere spænder fra fire til fem timer på neutral pH og fald dramatisk i mere grundlæggende betingelser60. Således er den første reaktion bør udføres i MES buffer pH-værdi på 5-6 og aktiveret fibrene skal derefter overføres til en PBS buffer (pH 7,2-7,5) for efterfølgende og øjeblikkelig reaktion med GRFT. Det er også vigtigt, at EDC er inaktiveret ved tilsætning af 2-mercaptoethanol og tilstrækkeligt skylles fra fibrene efter carboxylat aktivering. Dette vil hjælpe med at forhindre protein aktivering af EDC og self-crosslinking under den anden reaktion, hvilket kan reducere konjugation effektivitet.

Ændringer og fejlfinding
Selv om vores tidligere arbejde påvist effekten af en række GRFT-ændret fibre mod HIV-1 infektion, visse proces ændringer kan betragtes som Tilpas elementærfilen morfologi eller forbedre GRFT (eller andre protein) konjugation effektivitet eller fiber udbytte29. Især kan EF areal forhøjes med faldende fiber diameter, hvis du vil aktivere et større areal til konjugering. Tidligere undersøgelser har vist, at reducere polymer koncentration og viskositet producerer mindre fiber diameter61,62. Dog, denne fremgangsmåde er begrænset af dannelsen af beaded fibre når koncentrationen er under grænseværdien. For at mindske fiber diameter uden at ændre løsning viskositet, dual-opløsningsmiddel systemer kan udnyttes til at reducere overfladespænding, eller salte kan tilføjes for at øge løsning ledningsevne56,57. Begge metoder vil give større udspænding af electrospinning dyser, som kan producere mindre fiber diametre. Derudover kan lavere molekylvægt polymerer bruges til at fremstille mindre diameter fibers. Faldende fiber diameter giver også den fordel at generere mindre porer, potentielt gør EFs mere effektiv som en barriere for virus indtrængen, for microbicide-baserede programmer63. Endelig blev det observeret at fugtighed kan påvirke EF udbytte. Ved højere luftfugtighed, udbyttet har tendens til at falde på grund af dannelsen af fibre med usædvanlige makro-morfologi. Installere en fugtighed kontrolsystem inden for electrospinning kammer kunne derfor lette producerer EFs med ensartet udbytte, hvis dette er en udfordring at fabrikation.

For at forbedre GRFT konjugation effektivitet, kan undersøge valg og placering af functionalizable grupper også overvejes. For eksempel, hvis de primære aminer protein af interesse er i nærheden af indre af tre-dimensionelle protein struktur, sterisk hindring kan forhindre aktiveret carboxyl grupper på EFS-i samspil med primære aminer, dermed mindske den sandsynligheden for reaktionen. Denne udfordring kan løses af aminosyre udskiftning af protein til at generere en primær Amin gruppe tættere til protein overflade. Men som GRFT og andre proteiner afhænger af den specifikke aktivitet af dens bindingssteder for funktionalitet, ændringer i protein kropsbygning bør dog gennemteste retningslinjerne i funktionelle assays før konjugering.

Begrænsninger
En stor begrænsning af GRFT overflade ændring er potentialet for lav konjugation effektivitet ved hjælp af carbodiimide crosslinking kemi. Hvis den antivirale proteiner af interesse har en høj IC50, kan en lav konjugation effektivitet ikke giver tilstrækkelig beskyttelse (i disse programmer) mod virusinfektion. Men for GRFT (eller anden modificeret) EFs, proteiner og aktive stoffer, der ikke er kovalent bundet tilEFs kan stadig adsorberes på overfladen. Disse adsorberet konsulenten tilbyde potentiale til at supplere aktiviteten af konjugeret GRFT, af forbigående øger lokaliserede koncentrationen tilgængelige for virus bindende. I dette eksempel desorberet GRFT kan bindes til HIV-1 virioner, der ikke direkte kontakte EFs, og kan give en alternativ mekanisme for beskyttelse med de første 4 h (pericoital) administration. Således kan både konjugeret og overflade adsorberet GRFT bidrage til en ensartet beskyttelse mod seksuelt overførte sygdomme.

Trods beskyttelsen fra både protein konjugering og desorption, kan andre overflade-modifikation strategier med potentielt højere effektivitet forfølges. For eksempel, kan PLGA afsluttet med aminer i stedet for carboxyl grupper bruges til at konjugat aktiveret GRFT. Alternativt, en anden overflade-modifikation strategi kan udnyttes til at forbedre EF-protein konjugation effektivitet. Nanofibrous membraner består af EFs har været functionalized med avidin via carbodiimide crosslinking kemi64. Biotinylation eller tilføjelse af en Strep-tag (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) gennem rekombination kan aktiverer den modificerede proteiner til at danne stærke og yderst stabil non-kovalente interaktion med begærlighed EFs. Mens non-kovalente, er tilknytningen af begærlighed-biotin den stærkeste ikke-kovalente bånd, med femtomolar affinitet, sandsynligvis resulterer i stabil konjugation fiber overflade. For enhver overflade-modifikation strategier, bør sterisk hindring overvejes at maksimere konjugation effektivitet.

Endelig, vi forestiller at overflade-modificerede EFs vil tilbyde en alternativ strategi til aktiv agent indkapsling at yde supplerende former for beskyttelse. En overvejelse med kombinerer indkapsling og overflade-modifikation teknologier på en enkelt EF-platform vil reducere for tidlige frigivelse af overfladeaktive stoffer under overfladen-ændring proces. For overflade-modifikation reaktioner, der kræver relativt lange inkubationstiden i vandig opløsning, kunne en betydelig procentdel af de aktive agenter indlæst være tabt på grund af polymer hydrolyse.

Betydningen af metoden med hensyn til eksisterende og Alternative metoder
I tidligere arbejde konstaterede vi, at umodificeret Tom EFs var i stand til at hæmme hivinfektion af ~ 38% når de placeres i en transwell Indsæt ovenfor infectible celler29. Denne observation kombineret med biokompatibilitet, web-lignende mikrostruktur og tortuosity af EFs, parallelt med de observerede potent antiviral og klæbende egenskaber ved GRFT, bedt om udviklingen af de overflade-modificerede EFs beskrevet her.

I forhold til andre levering teknologier i øjeblikket ansat i microbicide applikationer, EFs har en bred vifte af potentielle anvendelser på grund af deres arkitektur og evne til tilpasning. I andet arbejde, har fibrøst morfologi af EFs gjort dem til at levere aktive agenter og efterligne ECM, hvilket gør dem egnede stilladser for vævsmanipulering. EFs har også været overflade-ændret for at forbedre biokompatibilitet og forbedre vedvarende-release65,66.

For at forbedre biokompatibilitet eller levere agenter der fungerer gennem specifikke bindende aktivitet, findes talrige metoder, der giver mulighed for fastgørelse af forbindelser til overflader af EFs som plasma behandlinger, våde kemiske metoder og overflade transplantat polymerizations50. I tilfælde af GRFT, der specifikt binder til de virale glykoproteiner af HIV-1, er den våde kemiske metode til EDC-NHS den mest optimale på grund af evnen til at trænge fibre dybt i trådnet samtidig også bevare GRFT funktionalitet50. GRFT immobiliseret til EFs kan derefter leveres i en holdbar formulering til FRT og yde øjeblikkelig beskyttelse mod HIV-smitte.

I forhold til den eksisterende strategi af indkapsling therapeutics inden for EFs at hæmme sexsygdomme, tilbyder kovalente konjugation en klar fordel for at øge den potentielle aviditet mellem GRFT og HIV virioner. Af immobilisere GRFT til EFs via overflade-ændring, kan meget lokaliserede koncentrationer af GRFT opnås, som øger muligheden for multivalent bindende med HIV. Derudover kan EF-ubevaegeligt GRFT, i forhold til gratis GRFT i løsning, forebygge nedbrydningen af GRFT swimmingpoolen ved hindrer celle internalisering. Desuden, på grund af unik virkningsmekanisme af GRFT som en stabil og klæbende post hæmmer, kovalente overflade konjugation muliggør overflade-modificerede EFs til at give en fysisk barriere for virus indtrængen, ud over potent antiviral ejendomme.

Fremtidige anvendelser af denne metode
Udnyttelsen af overflade-modifikation for levering præsenterer mulighed for at integrere flere aktive agenter inden for en enkelt EF-platform. I fremtiden vil forsøge vi at udvikle en multipurpose teknologi (MPT) hvor en række aktive agenter kan indkapslet i og konjugeret med EFs. Disse MPTs kan være designet til at give beskyttelse mod en bredere vifte af patogener ved at indarbejde therapeutics med forskellige virkningsmekanismer. Ved at udnytte både overflade og indre af EFs til at levere overfladeaktive stoffer med forskellige virkningsmekanismer, vil EFs potentiale til at beskytte mod virusinfektion være maksimeret.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for den jødiske arv fonden Excellence til finansiering af denne forskning. Vi takker Dr. Stuart Williams II for generøst giver brugen af electrospinning system. Vi takker også Dr. Kenneth Palmer for at forsyne os med Griffithsin. Vi takker desuden Dr. Nobuyuki Matoba og hans lab for uddannelse os i GRFT ELISA arbejde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792 (2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108 (2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635 (2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 128 Electrospun fibre seksuelt overførte infektioner human immundefekt virus overflade-ændring microbicider Griffithsin poly (mælkesyre-co-glycolic acid)
Fremstilling og karakterisering af Griffithsin-ændret Fiber stilladser til forebyggelse af seksuelt overførte infektioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vuong, H. R., Tyo, K. M.,… More

Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter