Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

İmalat ve Fiber Griffithsin-modified iskele karakterizasyonu önlenmesi için cinsel enfeksiyonlar iletilen

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

Bu el yazması imal ve insan immün yetmezlik virüsü tip 1 bulaşmasına karşı güçlü yapıştırıcı ve antiviral faaliyet göstermek Griffithsin-modified Poli (laktik-co-glikolik asit) electrospun lifler karakterize için yordamı açıklar vitro. Sentez için kullanılan bir yöntem yüzey-değiştirmek ve elde edilen morfolojisi, konjugasyon, karakterize ve Griffithsin desorpsiyon yüzey-modified liflerinden açıklanmıştır.

Abstract

Electrospun lifleri (EFs) çeşitli terapötik uygulamalarda yaygın olarak kullanmış; önlemek ve cinsel tedavi için bir teknoloji bulaşan enfeksiyonların (CYBE) gibi Ancak, onlar sadece son zamanlarda uygulanmış. Ayrıca, birçok EF teknolojileri kullanan biofunctionality vermek için yüzeye göre etkin aracı Kapsüllenen odak. Burada imal ve yüzey-poly(lactic-co-glycolic) asit (PLGA) electrospun lifleri, güçlü antiviral lektin Griffithsin (GRFT) ile değiştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. PLGA yaygın ilaç dağıtım onun üstün kimyasal ve Biyouyumlu özellikleri nedeniyle içinde kullanılan FDA onaylı bir polimerdir. GRFT, güçlü, doğal ve insan immün yetmezlik virüsü tip 1 (HIV-1) dahil olmak üzere çok sayıda virüslere karşı geniş faaliyet sahip güvenli lektin var. Birleştirildiğinde, GRFT-modified lifleri HIV-1 vitrogüçlü inactivation gösterdi. Bu el yazması imal ve GRFT-modified EFs karakterize yöntemleri açıklar. PLGA electrospun fiber iskele oluşturmak için ilkidir. Lifleri GRFT 1'i kullanarak daha sonra yüzey modifiye-etil - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) ve N-hydroxysuccinimide (NHS) Kimya. Elektron mikroskobu (SEM) tarama boyutu ve yüzey-modified formülasyonları morfolojisi değerlendirmek için kullanıldı. Ayrıca, bir gp120 veya hemagglutinin (HA)-tabanlı ELISA için Birleşik GRFT yanı sıra GRFT desorpsiyon fiber yüzeyinden miktarını ölçmek için kullanılan. Bu iletişim kuralı yüzey-modified farklı proteinler çeşitli ile lifleri imal etmek daha yaygın olarak uygulanabilir.

Introduction

EFs kullanımı bir topikal teslim platformu olarak önemli ölçüde cinsel yolla bulaşan hastalıklar azaltmak potansiyeline sahiptir. Şu anda içinde bildirilen 2015 yalnız1,22 milyon yeni vaka ile HIV ile yaşayan 36 milyondan fazla kişi vardır. Ayrıca, herpes simpleks virüsü 2 (HSV-2) enfeksiyon etkiler yüz milyonlarca insanın dünya çapında yazın ve HIV edinme geliştirmek için 2-5 kat3tarafından gösterilmiştir. HSV-2 enfeksiyon ve HIV edinme arasındaki bu ilişki nedeniyle, birden çok cinsel yolla bulaşan hastalıklar karşı eş zamanlı koruma sağlamak yeni active aracıları gelişmekte olan faiz önemli vardır. Ayrıca, bu antiviral ajanlar teslimini geliştirmek için yeni araçların gelişimi daha fazla koruyucu ve tedavi edici etki gücü arttırmak için potansiyel sunmaktadır. Bu hedefe doğru EFs HIV-1 ve HSV-2 enfeksiyonları yaygınlığını azaltmak için yeni bir dağıtım platformu araştırdık.

Son iki yılda, EFs yoğun ilaç dağıtım ve doku Mühendisliği4alanlarında kullanılmaktadır. Çoğu zaman, Biyouyumlu polimerler kolayca tedavi edici uygulamalara çevirmek için seçilir. Seçili polimer polimer EFs imal etmek, organik bir çözücü veya sulu çözüm, polimer hydrophobicity5derecesine bağlı olarak feshedilmiştir. Etkin faiz ajanların sonra çözelti veya sulu çözüm electrospinning işlemi önce eklenir. Polimer çözüm bir şırınga emişli ve yavaş yavaş bir elektrik akımı iken tabi atılır. Bu işlem genellikle polimer lifleri levha veya silindirik macrostructures (şekil 1) ve mikro-nano ölçekli6arasında değişen elyaf çapları ile sonuçlanır. En terapötik uygulamalarda etkin ajanlar içinde lifleri electrospinning işlemi sırasında dahil edilmiştir ve fiber Difüzyon ve sonraki lif dejenerasyonu ile serbest bırakılır. Bozulma ya da yayın oranını polimerlerin farklı türleri kullanarak değişmiş olabilir veya benzersiz kimyasal ve fiziksel özellikleri7imparting ve teşvik encapsulation hemen hemen herhangi bir istenen yayın profili kurmak için polimer karışımları bileşik. Bu nedenle, EFs küçük molekül ilaç ve biyolojik ajanlar proteinler, peptidler, oligonucleotides ve büyüme faktörleri6,8,9dahil olmak üzere teslim için yararlı kanıtlanmış.

Şti önleme alanında, EFs son zamanlarda dahil ve sürekli - veya indüklenebilir-serbest bırakmak-in antiviral ajanlar10,11,12,13,14 sağlamak için kullanılmıştır ,15,16,17,18,19. Bir ilk çalışmalar, pH-duyarlı lifler içinde kadın üreme sistemi (FRT), çevresel değişiklikler active aracıları serbest bırakmak için bir isteğe bağlı yöntemi HIV-111karşı koruma olarak geliştirilmiştir. Beri diğer çalışmaları polimer karışımları polietilen oksit (PEO) ve poli-L-laktik asit (PLLA), antiviral ve doğum kontrol maddeleri, HIV-1 önleme ve doğum kontrolü içinde in vitro için ayarlanabilir sürümü değerlendirmek için oluşan araştırdık 12. ek çalışmalar aşağıdakileri sağlamak için EFs fizibilite göstermiştir: uzun süreli yayın küçük molekül antiviral14, güçlü ve esnek mekanik özellikleri20, 3-b teslim mimarileri21 , sperm penetrasyon12ve diğer dağıtım teknolojileri13ile birleştirebilme inhibisyonu. Son olarak, daha önceki çalışma sürekli teslimat ortak co-infective virüs, HSV-2 ve HIV-114karşı antiviral ajanlar için polimerik lifler değerlendirildi. Bu çalışmada, polimer lifleri ilâ 1 ay için onların yapısını koruyarak ve viral giriş fiziksel bir engel sağlayarak tamamlayıcı faaliyet antiviral teslimat için sağlanan. Bu sonuçlar, EFs hem fiziksel hem de kimyasal olarak virüs enfeksiyonu engellemek için kullanılan görülmüştür.

Akort yayın özellikleri microbicide teslimat için bir çekici teslim platform polimer EFs yaparken, EFs diğer uygulamalarda yüzey-modified iskele7olarak hizmet etmek için geliştirilmiştir. EFs kez hücresel yenilenme22artırmak ve doku Mühendisliği23,24onların programını geliştirmek için iskele görevi gören hücre dışı Matriks (ECM), Morfoloji taklit etmek için kullanılmaktadır. Poli-ε-caprolactone (PCL) gibi polimerler oluşur lifleri ve PLLA-si olmak be yüzey-büyüme faktörleri ve proteinler ile modifiye electrospinning sonra artan hücre adezyon ve nükleer silahların yayılmasına karşı25 dahil ECM benzeri özellikleri vermek için , 26. Ayrıca, antimikrobiyal yüzey-modified EFs özel Patojen bakteriler27,28gelişimini önlemek için değerlendirilir. Bu çok yönlülük ve biyolojik etkileri ikna yeteneği nedeniyle EF teknoloji alanları çok mekanik işlevsellik sağlamak için çeşitli genişletmeye devam ediyor. Henüz, rağmen onların yardımcı programında uygulamaları bir çeşitlilik, yüzey-modified lifleri yakın zamanda microbicide alan29araştırılmalıdır.

Paralel olarak önlemek ve cinsel yolla bulaşan hastalıklar tedavi için yeni iletim teknolojileri geliştirilmesi, roman biyolojik tedavi geliştirilmiştir. En umut verici microbicide adaylar biridir yapışkanlı antiviral lektin, GRFT30. Aslında bir tür red algae türetilmiş, GRFT HIV, HSV-2, SARS, güçlü bir inhibitörü olarak faaliyet göstermiş olduğu hem de Hepatit C virüs31,32,33,34, 35 , 36. aslında, biyolojik tabanlı inhibitörleri arasında GRFT en güçlü Anti-HIV etkinlik, HIV-1 hemen ihracı kişi30, istikrar ve etkinlik vajinal kültür ortamından huzurunda koruyarak vardır En çok 10 gün37için mikroplar. Daha yakın zamanlarda, % 0,1 GRFT jel fareler intravaginal HSV-2 challenge, HSV-2 ve HIV-132 karşı koruma ilk satırı için umut verici bir aday yapmak karşı korumak için gösterildi, 38. HIV için özel olarak, fiziksel olarak giriş38,39,40,41 önlemek için viral zarf yüzeylerde gp120 veya terminal mannoz N bağlı glycan artıkları bağlayarak GRFT enfeksiyon engeller ,42. Bu inhibisyon 3 ng/mL43yaklaşan IC50s ile son derece güçlü. HIV enfeksiyonu inhibe yanı sıra, çalışmalar da GRFT virüs32hücre hücre yayılmasını engelleyerek HSV-2 enfeksiyona karşı korur göstermiştir. Her durumda, denatürasyon karşı yüksek direnç gösteren sırasında viral parçacıkların, yapıştırıcı olmak GRFT gösterilmiştir. Son, GRFT uygun ve büyük olasılıkla EFs ile birlikte yönetmek yararlı hale Tenofovir (TFV) ve diğer antiviral44, kombinasyonları ile sinerjik faaliyet göstermiştir. GRFT güçlü özelliklerini içinde teslim EF teknoloji ile geliştirilmiş bir mükemmel biyolojik tabanlı antiviral aday olun.

Bu bilgi GRFT ya da doğuştan gelen antiviral özellikleri kullanmak, bir polimer fiber iskele, virüs giriş inhibisyon29ilk katmanı sağlamak için bu özellikleri entegre dizayn edilmiştir. Bulgu Inspiration cervicovaginal mukus mucoadhesive müsin etkileşimler yoluyla öncelikle virüs ulaşım engel şekilde, biz bu EFs bir iskele kullanarak ve kovalent GRFT, yüksek yoğunluğu ile yüzey değiştirme onaylanmadığına karar yüzey Birleşik GRFT debilitate ve onun giriş noktası45,46,47virüs devre dışı bırakabilirsiniz. Burada EFs bir protein bazlı, viral yapıştırıcı ihracı bariyer platformu sağlamak için sabit bir iskele geliştirilmiştir. Biz GRFT güçlü antiviral özellikleri "tuzak" roman bir virüs oluşturmak için Biyouyumlu, değiştirilebilir ve dayanıklı polimer platform ile birleştirmek aranan

Bu hedeflere ulaşmak için electrospun PLGA oluşan lifler vardı ve EDC NHS kimya GRFT EF yüzeyle daha sonra değiştirmek için kullanılmıştır. PLGA electrospinning48Biyouyumluluk ve maliyet-etkililik ile birlikte, geniş kullanımı nedeniyle bir modeli polimer olarak görev yaptı. Ayrıca, yüzey modifikasyonu EFs büyük yüzey alanı kullanan ve lif yardımcı programı49en üst düzeye çıkarmak için kapsülleme ile kombine edilebilir yararlı bir alternatif sağlar. Nerede GRFT yalnızca bir bölümünü mevcuttur (ve yalnızca geçici FRT mevcut) geleneksel saklama yöntemlerinden farklı olarak, yüzey modifikasyonu GRFT maksimum bioactivity tedavi süresi sırasında korumak izin verebilir. Ayrıca, geleneksel electrospinning yöntemlerle proteinler gibi hidrofilik bileşikler birleşmesiyle daha düşük kapsülleme verimliliği ve protein etkinlik50kaybı neden olabilir. Bu nedenle, GRFT yüzey-modified lifleri Şti bulaşmasına karşı koruma geliştirmek için tek başına veya electrospinning birlikte kullanılabilir umut verici bir alternatif Teslimat yöntemi sunabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlanması ve Electrospun Fiber iskele imalatı

dikkat: çözücüler ya da polimer çözümleri ile tüm iş-meli var olmak kılınmak kimyasal duman mahallede . Protokol başlamadan önce her reaktif malzeme güvenlik veri sayfasına bakın.

  1. 50: 50 Poli (laktik-co-glikolik asit) 720 mg 3 mL % 15 w/w PLGA polimer çözüm electrospin için tartmak (PLGA; 0,55-0,75 dL/g, 31-57 kDa) bir 10 mL mercek şişe içine. Çözüm hacmi geçerli çalışmalarda kullanılan tipik toplu iş boyutu dayanır.
    Not: polimer çözülmeye kullanılan çözücü yoğunluğunu belirleyerek solvent belirli bir birime eklemek için polimer kitle hesaplanmalıdır. 1.59 g/mL çözelti Hexafluoro-2-propanol (HFIP) yoğunluğudur. Böylece, solvent, ağırlığı 3,0 mL HFIP gerekli bir birimde, 4.8 g (3,0 mL x 1.59 g / mL) uyarlanmıştır. Bir % 15 w/w kısmını HFIP için PLGA için 720 mg PLGA 3,0 mL HFIP (0.15 x 4800 mg = 720 mg) eklenmesi gerekir. Bir % w/w polimer/çözüm yerine % w/v, kullanmanın avantajı, bu nihai çözüm tanımlanmış ağırlığını sağlamasıdır. Tanımlanan bu ağırlık çözücü buharlaşma sırasında adım 1.3 durumunda daha doğru solvent değiştirme etkinleştirir.
  2. PLGA (adımından 1.1) içeren cam mercek şişe 3,0 mL HFIP eklemek serolojik cam pipet kullanarak. Plastik film ile şişe kapağı sonra ölçmek ve şişe kayıt Mass
  3. Gecede 37 ° C'de polimer tam çözünme sağlamak için polimer süspansiyon kuluçkaya. Herhangi bir çözücü buharlaşarak, şişe kitle, azalan ekleyerek HFIP şişe özgün kütlesiyle adım 1.2 ulaşıncaya kadar.
  4. Kuluçka sonra electrospinning aparatı ( Şekil 2 A) hazırlamak. Her boyuttaki bir mandrel kullanılabilir olmasına rağmen burada dönen bir 25 mm dış çap paslanmaz çelik mandrel toplayıcı kullanıldılar.
    Not: Electrospinning çözüm aynı hacmi verilen fiber kalınlığı daha büyük bir mandrel çapı azalır.
  5. Polimer çözüm 3 mL şırınga Aspire edin.
  6. Bir künt 18'lik, ½ inç iğne ucu şırıngaya bağlanmak ve boş headspace iğne ucunu kaldırmak için aşırı çözüm (genellikle 0.25 mL) dağıtmak.
  7. Şırınga şırınga pompa yerleştirin ve araç akış hızı 2.0 mL/h. için ayarla
    Not: Bu akış hızı daha önce bu formülasyon için polimer viskozite göre optimize edildi.
    8. Şırınga iğne ve electrospin
  8. bağlanmak güç kaynağı bir gerilim + 27 kullanarak polimer çözüm kV. İğne ve toplayıcı arasındaki mesafe yaklaşık 25 cm ( Şekil 2 B) ayarlamanız gerekir.
    Dikkat: Bir çözücü buharı electrospinning işlemi oluşturur. Zararlı buharı . kaldırmak için bir duman başlık veya kapalı bir aparat ( Şekil 2) kullanın
  9. Tüm çözüm electrospun olduğunda, güç kaynağı açmak ve bir ek 30 tam solvent buharlaşır min için dönmeye mandrel izin.
  10. Dönüş dönen mandrel toplayıcı kapalı ve jilet mandrel elyaf kesmek için kullanın. Yavaşça mandrel elyaf soymak için bıçak kullanın.
  11. Electrospun PLGA fiber etiketli bir Petri kabına toplamak ve yer kalan solvent kaldırmak için bir desiccatorovernight.

2. Yüzey-değişiklik lifleri ile GRFT

  1. hazırla çözümleri fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ve 2-(N-morpholino), ethanesulfonic asit (MES arabellek). PBS 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na 2 HPO 4 ve 0,24 g KH 2 PO 4 ' te ultrasaf su 1 litre çözülerek hazırlayın. Benzer şekilde, 19.52 g MES (serbest asit, MW 195.2) dağıtılması ve 29.22 g NaCl MES arabellek hazırlamak için 1 L ultrasaf su, içinde. Her çözüm son pH 7.2-7.5 ve 5.0-6.0, arasında sırasıyla, pH metre kullanarak sağlamak.
  2. NHS (5 mM) ve EDC (2 mM) bireysel çalışma çözümleri hazırlayın.
    1. EDC ve NHS dondurucudan kaldırmak ve tartma önce oda sıcaklığına equilibrate etmelerine izin.
    2. EDC 4 mg 1.5 mL microcentrifuge tüp içine tartmak.
    3. NHS 6 mg başka bir microcentrifuge tüp içine tartmak.
      4. Her tüpün arabelleğe
    4. ekleyin 1 mL MES. Girdap şiddetle reaktifleri emin olmak için her iki tüpler tam çözünmüş.
  3. 70 mg 50 mL konik santrifüj tüpüne ağırlığında tarafından hydroxylamine çözeltisi hazırlamak.
  4. 20 mL PBS hydroxylamine ve çözülmeye girdap ekleyin.
  5. PLGA fiber uygun bir miktar dışarı kitle içine 15 mL konik santrifüj tüpü. Genellikle, fiber 75 mg her reaksiyon toplu işlem için kullanılır.
  6. 15 mL tüp MES arabellek 8 mL ekleyin.
  7. Ekleyin 1 mL her tüp daha önceden hazırlanmış EDC ve NHS çözümleri. Çözüm son hacmi 10 mL olmalıdır. EDC ve NHS son konsantrasyonları 0.4 mg/mL ve 0.6 mg/mL, sırasıyla olmalıdır.
  8. Yakın ve plastik film ve çözüm 15 dakika oda sıcaklığında ( şekil 3 B) yavaşça ters için izin vermek için bir rotator üzerinde yer ile 15 mL tüp mühür. Bu adımı GRFT protein ( şekil 3 A) ile kovalent değişiklik için izin vermek için polimer karboksil grupları etkinleştirir.
  9. Harekete geçirmek sonra dikkatli bir şekilde gidermek tepki tüp β-mercaptoethanol 14 µL ekleyerek. Tüp birkaç kez tam karıştırma sağlamak için ters çevir'i.
    Dikkat: β-mercaptoethanol çok zehirli ve yalnızca bir kimyasal duman mahallede kullanılmalıdır.
  10. Süpernatant atmak ve PLGA fiber iki kez, 10 mL ile kalan herhangi bir β-mercaptoethanol kaldırmak için PBS, durulama.
  11. Sonra durulama, GRFT hisse senedi çözüm uygun bir miktarda tüp ekleyin. Örneğin, 5 nmol GRFT/mg fiber GRFT mg fiber başına (Stoktan 10 mg/mL) hisse senedi çözüm 6,35 µL gerektirecektir. Böylece bir 75 mg lif örneği 10 mg/mL GRFT hisse senedi çözüm 476.25 µL gerektirecektir.
    Not: GRFT lifleri 0,05, 0.5 ve 5 nmol GRFT mg fiber başına teorik yükleri ile fabrikasyon.
  12. Son hacim 8 mL için getirmek için yeterli PBS eklemek kapatın ve ayrıntılı karıştırma sağlamak için tüp ters.
  13. Plastik film ile tüp mühür ve bir rotor üzerinde tekrar, burası 2 h. süre
  14. Sonra 2 s kuluçka, 2 mL hydroxylamine çözeltisi 15 mL santrifüj tüpüne ekleyerek tepki gidermek. Üreticinin yönergelerini hydroxylamine son konsantrasyonu su verme reaksiyon sırasında 0.7 mg/mL olmalıdır.
  15. Çözüm karıştırın ve süpernatant atın. Yüzey-modified PLGA fiber herhangi bir çekimsiz GRFT kaldırmak için iki kez 10 mL ultrasaf su ile durulama.
    16. Lif tamamen kuru olana
  16. fiber bir Petri kabına ve yer bir desiccator içine aktarın. Depolama için 4 ° C Petri kabına aktarın.

3. SEM GRFT yüzey karakterizasyonu-modified lifleri

  1. yer bir SEM üzerinde çift taraflı karbon bandın bir şerit numune Dağı. Numune mount dibinde kalıcı bir kalem kullanarak örnek tanıtıcı bilgiler ile etiketleyin.
  2. Üç örnek bir yüzey-modified fiber keser ve onları ayrı örnek bağlar yerleştirir. Her örnek kalınlığı yaklaşık 0.5 mm olan.
  3. Sputter bir altın plaka elektron kaynaklı partikül ifade kullanarak örnekleri kat. Kat 90 için şaplatın s, 2.4 kV.
    Not: Sputter kat zaman gerilim ve amperaj dahil olmak üzere donanım parametreleri bağlı olarak değişebilir.
  4. Örnekleri resim 8 kV 1000 5'e kadar bir büyütme ile 000 X.

4. GRFT ayıklama yüzey-modified liflerinden

  1. kitle dışarı nüsha 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine lif 2 mg.
  2. Tüp, sonra girdap 1 mL Dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin ve lif tamamen erimesi için oda sıcaklığında 1 dk. için kuluçkaya.
  3. Kuluçka sonra 10 µL aliquot, seyreltik Tris-EDTA (TE) arabellek 4.2, en az 100-fold adımda DMSO lifli çözümden (pH = 8.0).
  4. Karakterizasyonu ELISA ile yükleme kadar örnekleri-20 ° C'de depolayın.

5. GRFT desorpsiyon liflerinden ölçme

  1. GRFT serbest miktarını değerlendirmek veya fiber desorbed 5-10 mg lif yüzeyi değiştirilme tarihi ve yeri bir microcentrifuge tüp tartmak için. Fiber kitle her tüpte kaydetmek.
  2. 1 mL fizyolojik ortamı taklit eden uygun bir çözüm ekleyin (örneğin, PBS, TE arabellek, benzetimli vajinal sıvı (SVF), vb) her bir örneği için.
  3. Örnekleri üzerinde dönen bir shaker 200 devirde, 37 1 h için kuluçkaya ° C.
    4. Kuluçka, küme için şişe ve aliquot GRFT desorbed içeren TE arabellek Kaldır yaklaşık 1 mL tüpler sonra
  4. . -20 ° c protein miktar kadar mağaza.
  5. , Örnek için yeni bir microcentrifuge tüp transfer fiber microcentrifuge tüp içinde 1 mL taze tampon çözeltisi ekleyin ve sonraki zaman noktasına kadar kuluçkaya.
  6. Yayın ölçmek için kullanılan tipik süresi noktalar şunlardır: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, ihmal edilebilir desorpsiyon sonra 4 h bu çalışmalarda gözlenen 72 s ve 1 wk.

6. Miktar GRFT ayıklama ve desorpsiyon ELISA ile

  1. kat bir 96-Peki ELISA plaka ile ha 0.1 mL (10 µg/mL) iyi daha önce 51 açıklandığı gibi. Plastik film ile plaka mühür ve bir gecede kuluçkaya 4 ° C'de ( şekil 4).
  2. Kaplama arabellek kaldırın ve 0.3 mL arabelleğe her şey (% 2-3 sığır serum albumin (BSA) PBS içinde % 0.05 polysorbate 20 ile) engelleme ekleyin. Oda sıcaklığında en az 2 h plaka kuluçkaya.
  3. 3 kez ile 1 x PBS % 0,1 polysorbate 20 (PBS-P) ile plaka kuluçka sonra durulayın. Durulama sonra örnek, standart veya PBS 0.1 mL negatif kontrol ilgili kuyu dağıtmak. Oda sıcaklığında 1 h için tekrar plaka kuluçkaya.
  4. Plaka PBS-s. 3 kez tekrar durulama Durulama sonra birincil antikor (keçi anti-GRFT anti-serum) her kuyuya 0.1 mL ekleyin ve oda sıcaklığında en az 1 h için kuluçkaya. Tipik olarak, birincil antikor çözüm tarafından PBS 1:10,000 sulandırılmış.
    5. Sonra birincil antikor durulama örnekleriyle plakalar tekrar 3 kez PBS-s. ile kuluçka
  5. İkincil antikor 0.1 mL ekleyin (horseradish peroksidaz (HRP)-konjüge tavşan Anti-keçi IgG) her şey ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. İkincil antikor çözüm tarafından PBS 1:10,000 sulandırılmış.
  6. Plaka 3 kez yıkayın. 0.1 mL TMB 2-peroksidaz substrat her şey için ekleyin. Monitör renk geliştirme (yaklaşık 2 dk), sonra 0.1 mL H 2 Yani ekleyin tepki gidermek için 4 (1 N). 450 plaka okumak plaka okuyucu üzerinde nm.
  7. Arka plan OD değerleri (kuyu) sadece PBS almak ortalama ve bu deneysel gruptan çıkarın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Lif morfolojisi EFs yüzeyi değiştirilen virüslere karşı koruma sağlama yeteneği üzerinde önemli bir etkisi vardır. Her ne kadar electrospinning uygun ve kolay anlaşılan bir işlemdir, polimer olmayan optimize formülasyonları düzensiz lif morfolojisi (şekil 5B-C) neden olabilir. Boncuklu veya amorf mat gibi türleri Morfoloji oluşumuna neden electrospinning koşullarında değişiklikler genellikle solvent-polimer uyumsuzluk, düşük polimer viskozite, akış hızı veya diğer electrospinning koşullar tarafından neden. Lif yapısı ortaya çıkan değişimler farklı yayın profilleri uyuşturucu dahil lifler veya konjugasyon yeterlik, fiziksel veya kimyasal olarak virüs penetrasyonu engellemek için lifleri yetenek değiştirme tutarsızlıklarına neden olabilir. PLGA tarif electrospinning koşul kullanma fabrikasyon EFs ayrı lif türleri içinde Morfoloji 1,5 ve 2.8 µm (şekil 6) arasında değişen fan çapı sonuçlanmalıdır. Lif morfolojisi ve çapı belirlemek için EFs SEM ile diğer karakterizasyonu veya değiştirme adımları önce incelenmesi gerekir.

SEM görüntüleri boş, 0,05, 0.5 ve 5 nmol GRFT lifler lif morfolojisi (şekil 6A-D), GRFT değişiklik lif morfolojisi üzerinde hiçbir etkisi gösteren hiçbir önemli farklılıklar gösterdi. Her EF formülasyonu ortalama çapını belirlemek için en az 50 rasgele ölçümler alınmıştır SEM görüntüleri görüş alanı başına. EF formülasyonları ortalama çapı ölçülür ve şekil 6'Egösterildiği gibi ImageJ hesaplanır. Tüm EF formülasyonları çevresinde 1.9 µm arasında toplu işlemleri değiştirilmemiş lif imalat süreci tutarlılığını gösteren, benzer ortalama çapları vardı.

GRFT miktarı EFs için Birleşik belirlemek için GRFT-EFs GRFT elyaf ayıklamak için 100-fold bir seyreltme TE arabelleği, ardından DMSO içinde çözünmüş. Mg-fiber Birleşik GRFT miktarı ELISA kullanarak sayısal. Her değişiklik yoğunluğu (0,05, 0.5 ve 5 nmol GRFT mg fiber başı) için on çoğaltır değerlendirildi. 5, 0.5 ve 0,05 nmol GRFT/mg EF değişiklikler için her EF 373, 165 ve 42 vardı ng EF, 0.6, 4.2 ve % 6.9, konjugasyon verimliliği sırasıyla kaynaklanan mg GRFT. Bu sonuçlar GRFT-EFs ile yüksek teorik yüzey değişikliği yoğunluk, sonucu daha fazla GRFT fiber (Şekil 7A) Birleşik Birleşik gösterilmektedir. Ancak, elde edilen fiil verim29ile ters bir ilişki oldu.

Kovalent lif yüzeyine göre bu adsorbe Birleşik GRFT miktarını değerlendirmek için GRFT-EFs serbest GRFT miktarını belirlemek için SVF içinde inkübe. İlk 4 h içinde 113, 25 ve 10 GRFT ng başına mg EF algılandığı SVF içinde 5, 0.5 ve 0,05 nmol teorik değişiklik konsantrasyonları, anılan sıraya göre. Bu değerler % 30, % 41 ve %24 5, 0.5 ve 0,05 nmol GRFT-EFs için Birleşik GRFT miktarda karşılık gelir. 4 h sonra önemsiz GRFT yayın eluate için tüm üç formülasyonları tespit edildi. GRFT serbest kaldıktan sonra 1, 2 ve 4 h Şekil 7' deBgösterilir. Birlikte ele alındığında, bu veri GRFT çoğunluğu için EFs kovalent bağlı ve yüzeye adsorbe GRFT ilk 4 h içinde yayımlanır gösterir.

Figure 1
Resim 1: electrospun lifleri macroscale morfolojisi. Gösterilen electrospun lifleri bir 4 mm (silindir) ve 25 mm (levha) çapı mandrel, sırasıyla kullanarak fabrikasyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Electrospinning aparatı. (Atoplama) mandrel nerede polimer sıvı jetleri mevduat ve (B) tam electrospinning Kur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: EDC NHS kimya kullanarak GRFT ile şematik EF değişiklik. (A)karboksil grupları üzerinde PLGA EF tepki formu Amin-reaktif esterler için EDC huzurunda NHS ile hangi daha sonra istikrarlı Amid bağı ile GRFT Birincil aminler oluşturacak. (B) iki miligram fiber diskleri veya parçalar kesmek ve MES arabellek 8 ml EDC/NHS reaktif 2 mL ile inkübe ve 15 dk. için döndürülmüş Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: GRFT miktar ELISA kullanarak gösteren şematik. 96-şey immunoplate gp120 veya yakalama ve GRFT hareketsiz HA ile kaplanır. GRFT, horseradish peroksidaz ve ELISA substrat bağlantılı ikincil antikorlar karşı birincil antikor sırayla GRFT ölçmek için eklenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: PLGA EF morfolojisi üzerine çözelti seçim etkileri. (A) % 15 w/w PLGA EFs görüntülenen HFIP arzu içinde iplik benzeri morfolojisi. (B) % 15 w/w PLGA EFs kloroform ve dimethylformamide, forma uygun olmayan solvent seçim veya polimer konsantrasyonu (viskozite) nedeniyle başarısız oldu. (C) % 15 w/w ve (D) % 20 w/w PLGA EFs TFE içinde polimer viskozite önemini göstermek. Polimer konsantrasyonu (solvent viskozite) artan sonuçlandı iyi tanımlanmış lif morfolojisi (D) iken boncuk formülasyon daha düşük polimer konsantrasyon (C) ile oluşan. Not şekil 5B mat benzeri Morfoloji göstermek için daha düşük bir büyütme oranında çekildi. Ölçek çubukları 10 µm =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: SEM görüntüleri ve elyaf çapları çıplak ve GRFT-modified EFS'nin. (A)çıplak PLGA EFs ve PLGA EFs yüzey-modified (B) 0,05 ile nmol, (C) 0.5 nmol ve (D) 5 GRFT nmol mg fiber başına. Ölçek çubukları 10 µm. (E) çap, değiştirilmemiş ve GRFT-EFs =. Hata çubukları temsil ortalama ± SEM İstatistiksel fark unmodified ve GRFT-modified liflerinin çapları arasında gözlendi. Şekil 6 E mamülleri ve ark. adapte edilmiş 29 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7 : GRFT miktarı için Birleşik ve GRFT-modified EF desorbed. GRFT miktarı(a)Birleşik EF fiber arttıkça artan GRFT kapatsınlar konsantrasyon ile her mg. ()B) fiber her mg serbest GRFT miktarı SVF 1, 2 ve 4 h kuluçka sonra 0,05, 0.5 ve 5 nmol formülasyonları için gösterilir. Hata çubukları temsil ortalama ± SEM Bu rakam mamülleri ve ark. adapte edilmiş 29 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Onların gözenekli yapıları ve geniş yüzey alanları nedeniyle, EFs sağlık, hangi birini tedavi teslim araç olarak hizmet içeren çeşitli uygulamalar bulduk. Destekte ve kimyasal ligandlar lif yüzeyine hücre özel hedefleme52 veya biosensing53için Birleşik iken EFs içinde uyuşturucu ve diğer active aracıları tunable teslimat için dahil edilebilir. Burada GRFT imalatı yüzey-PLGA EFs, HIV enfeksiyonu önlemek için bir teslimat iskele anlatılan biçimde değiştirilmiş. GRFT-EFs tarafından electrospinning, düşük maliyetli ve yüksek üretim hızı diğer elyaf üretim yöntemleri49,53göre avantajları sağlayan sentez.

İletişim kuralı kritik adımlar
EFs oluşumu, özellikle de çözüm veya solvent viskozite54polimer çözüm özelliklerini eleştirel bağlıdır. Bir polimer çözüm viskozite etkileyen faktörleri polimer molekül ağırlığı, polimer konsantrasyon ve kullanılan çözücü türünü içerir. Çözüm veya solvent viskozite istenen polimer konsantrasyonu elde etmek için çözücü için polimer oranını değiştirerek tipik olarak ayarlanır. Her üretim ile birim gecede kuluçka sırasında uygun polimer solvent oranı (viskozite) korumak için muhafaza edilmelidir. Yeterince yüksek polimer konsantrasyonu, polimer molekülleri lifleri üretmek için electrospinning işlemi sırasında çözüm içinde dolaştırmak. Electrospinning işlemi sırasında bir boncuk spinneret ucunda oluşturacak ve yeterli polimer Dolaşıklık ise, sıvı jetleri kritik bir gerilim, bu noktadan patlak ve kırbaç gibi moda toplama mandrel55doğru hızlandırmak. Çözücü buharlaşma sonra jet inceltme, onlar üzerinde toplama mandrel depozito konu fiber üreten yol açar. Bir kez sentez, EFs uygun morfoloji ve tutarlı lif çapı doğrulamak için SEM tarafından analiz edilmelidir. Boncuklu EFs varlığı düşük çözüm viskozite56, son derece yüksek uygulanan gerilim57sonucu olabilir, polimer besleme oranı58veya tüm üç faktörlerin birleşimi. Bu gözlem yapılırsa, polimer konsantrasyonu artar ve uygulanan gerilim ve ilerleme hızı, elyaf benzeri Morfoloji ulaşmak için ayarlanmalıdır.

Proteinler EF yüzeye eşlenik, burada PLGA karboksil grupları EDC NHS carbodiimide crosslinking kimya59kullanarak tepki. Değişiklik işlemi sırasında lifleri kısaca NHS hangi yarı kararlı, amin reaktif esterleri carboxylates dönüşüm sonuçları huzurunda EDC ile inkübe. İki adım konjugasyon işlemi sırasında her adımı sırasında kullanılan arabellekleri maksimum konjugasyon verimliliği sağlamak için üretici talimatlarında kaydetti optimum pH var önemlidir. NHS esterleri half-life dört beş saat nötr pH aralıkları ve daha temel koşulları60yılında önemli ölçüde azalır. Böylece, ilk tepki-meli var olmak kılınmak içinde MES tampon pH 5-6 ve aktif lifler sonra PBS arabellek (pH 7.2-7,5) GRFT ile sonraki ve anında tepki için aktarılmalıdır. EDC 2-mercaptoethanol ek tarafından inaktive ve yeterince lifleri karboksilat etkinleştirmeden sonra durulanır ayrıca önemlidir. Bu EDC ve öz-crosslinking protein etkinleştirme konjugasyon etkinliğini azaltmak ikinci reaksiyon sırasında önlemeye yardımcı olur.

Değişiklikler ve sorun giderme
Önceki çalışmalarımız GRFT-modified lifleri HIV-1 bulaşmasına karşı çeşitli etkinliğini göstermiştir rağmen belirli işlem değişiklikler EF Morfoloji özelleştirmek için veya GRFT (ya da diğer protein) geliştirmek için düşünülebilir konjugasyon verimlilik veya fiber 29verim. Özellikle, EF yüzey alanı konjugasyon için büyük bir yüzey alanını etkinleştirmek için lif çapı, azaltarak artırılabilir. Önceki çalışmalar polimer konsantrasyon ve viskozite azaltarak daha küçük lif çapı61,62ürettiğini göstermiştir. Ancak, bu yaklaşım konsantrasyonu eşik değerin altında olduğunda boncuklu lifleri oluşumu ile sınırlıdır. Çözüm viskozite değiştirmeden lif çapı azaltmak için çift-solvent sistemleri yüzey gerilimi azaltmak için kullanılması gereken veya tuzları çözüm iletkenlik56,57artırmak için eklenebilir. Her iki yöntem daha büyük daha küçük lif çapı üretebilir electrospinning jetleri germe sağlayacaktır. Ayrıca, daha düşük moleküler ağırlıklı polimerler daha küçük çaplı lifleri imal için kullanılabilir. Azalan lif çapı daha küçük gözenekleri, potansiyel olarak EFs daha etkili bir bariyer olarak microbicide tabanlı uygulamalar63virüs penetrasyon için hale getirici avantajı sağlamaktadır. Son olarak, nem EF verim etkileyebilir gözlendi. Yüksek Nem verim lifleri ile olağandışı makro-Morfoloji oluşumu nedeniyle azalma eğilimindedir. Bu üretim için bir meydan okuma sunuyor eğer bir nem kontrol sistemi electrospinning odası içinde yükleme bu nedenle tutarlı verimleri ile EFs üreten kolaylaştırabilir.

GRFT konjugasyon verimliliği artırmak için araştırma seçimi ve functionalizable grupları konumunu da düşünülebilir. Birincil aminler ilgi proteinin üç boyutlu protein yapısı iç iseniz, örneğin, steric engel aktif karboksil grupları EFs üzerinde böylece azalan Birincil aminler ile etkileşim engelleyebilir reaksiyon olasılığı. Bu meydan okuma protein yüzeye daha yakın birincil Amin grubu oluşturmak için proteinin amino asit ikame tarafından üstesinden. İşlevselliği için onun bağlama sitelerin belirli faaliyet GRFT ve başka proteinlere bağlı olarak, ancak, protein biçimsel değişiklik iyice konjugasyon önce işlevsel deneyleri içinde test edilmelidir.

Sınırlamaları
Bir büyük GRFT yüzey modifikasyonu carbodiimide crosslinking kimya kullanarak düşük fiil verim potansiyeli kısıtlamasıdır. İlgi antiviral protein yüksek bir IC50varsa, düşük konjugasyon verimliliği (bu uygulamalarda) virüs bulaşmasına karşı yeterli koruma sağlamayabilir. Ancak, GRFT (ya da diğer modifiye) için EFs, proteinler ve kovalent bağlı değildir aktif ajanlarEFs hala yüzeye absorbe. Bu adsorbed ajanlar geçici lokalize konsantrasyon virüs bağlama için kullanılabilir artırma tarafından konjuge GRFT, etkinliği tamamlamak için potansiyel sunmaktadır. Örneğin, doğrudan EFs ile değil ve koruma alternatif bir mekanizma ile ilk 4 h (pericoital) yönetim sağlayabilir HIV-1 virions desorbed GRFT bağlamak. Böylece, konjuge ve yüzeye adsorbe GRFT cinsel yolla bulaşan hastalıklar karşı tek tip koruma sağlamaya katkıda bulunabilir.

Protein konjugasyon hem desorpsiyon haiz koruma rağmen potansiyel olarak daha yüksek verimlilik ile diğer yüzey değişikliği stratejileri takip. Örneğin, aminler karboksil grupları yerine ile sona PLGA aktif GRFT çekimlerine kullanılabilir. Alternatif olarak, farklı bir yüzey değişikliği strateji EF-protein konjugasyon etkinliğini artırmak için yararlı. EFs oluşan Nanofibrous membranlar avidin carbodiimide crosslinking kimya64ile ile functionalized. Biotinylation veya bir Strep-etiket (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) aracılığıyla rekombinasyon ilavesi formuna güçlü değiştirilmiş protein etkinleştirin ve son derece kararlı avidin EFs ile kovalent olmayan etkileşim. Kovalent olmayan, avidin-biotin bağlantı en güçlü olmayan-kovalent bağ, büyük olasılıkla lif yüzeyine istikrarlı konjugasyon sonucunda femtomolar benzeşimli iken. Herhangi bir yüzey değişikliği stratejileri için steric engel konjugasyon verimliliği maksimize etmek için düşünülmelidir.

Son olarak, biz yüzey-modified EFs tamamlayıcı mod koruma sağlamak için aktif kapsülleme için alternatif bir strateji sunacaktır öngörülüyor. Tek bir EF platformda kapsülleme ve yüzey modifikasyonu teknolojileri birleştirerek ile bir dikkate ürün, etkin ajanların erken yüzey değişikliği işlemi sırasında azaltılması. Nispeten uzun kuluçka süresi içinde sulu çözüm gerektiren yüzey değişikliği reaksiyonlar için yüklenen active aracıları önemli bir yüzdesini polimer hidroliz nedeniyle kaybolabilir.

Yöntemi mevcut ve alternatif yöntemleri açısından önemi
Önceki çalışmalarda, değiştirilmemiş boş EFs HIV enfeksiyonu transwell Ekle infectible hücreleri29yukarıda yerleştirildiğinde % ~ 38 tarafından inhibe başardık görülmektedir. Bu gözlem Biyouyumluluk, web benzeri mikroyapı ve EFs, tortuosity GRFT, gözlenen güçlü antiviral ve yapışkanlı özellikleri ile paralel olarak birlikte burada açıklanan yüzey-modified EFs kalkınma istenir.

Şu anda istihdam diğer iletim teknolojileri için göreli microbicide uygulamalarda, EFs mimarisi ve özelleştirme için kapasitesi nedeniyle potansiyel uygulamalar geniş bir aralığı vardır. Diğer çalışmalarda, EFs fibröz morfolojisi onları etkin ajanları teslim etmek ve doku mühendisliği için uygun iskele geliştirmelerde ECM, taklit etmek için sağlamıştır. EFs Ayrıca yüzey-Biyouyumluluk geliştirmek ve sürekli yayın65,66geliştirmek için modifiye edilmiştir.

Biyouyumluluk geliştirmek veya aracılarının bu işlev belirli bağlama faaliyetleri ile göndermek için çok sayıda yöntem mevcut bileşikler ek EFs yüzeyler plazma tedaviler, ıslak kimyasal yöntemler ve yüzey greft gibi için için izin polymerizations50. Özellikle HIV-1 viral glikoproteinlerin için bağlamak GRFT söz konusu olduğunda ıslak kimyasal EDC NHS da GRFT işlevselliği50koruyarak lifleri kafesin içindeki derin nüfuz yeteneği nedeniyle en uygun yöntemdir. EFs için immobilize GRFT sonra dayanıklı bir formülasyon FRT için teslim edilebilir ve HIV enfeksiyonu karşı acil koruma sağlamak.

Tedavi cinsel yolla bulaşan hastalıklar etkisizleştirmek için EFs içinde kapsüllemenin mevcut strateji karşılaştırıldığında, kovalent konjugasyon potansiyel hırs GRFT ve HIV virions arasında artan ayrı bir avantaj sağlar. Yüzey-değişiklik GRFT EFs için immobilizing tarafından son derece lokalize GRFT konsantrasyonları, HIV ile multivalent bağlama için fırsat artış elde edilebilir. Buna ek olarak, çözüm, ücretsiz GRFT göre EF immobilize GRFT GRFT havuzun tükenmesi hücre içselleştirilmesi engelleyen tarafından engel olabilir. Ayrıca, istikrarlı ve yapışkanlı giriş inhibitörü olarak GRFT eylem benzersiz mekanizması nedeniyle, kovalent yüzey konjugasyon yüzey-modified EFs güçlü antiviral özellikleri yanı sıra virüs penetrasyon için fiziksel bir bariyer sağlamak sağlar.

Bu yöntemin gelecekte uygulamaları
Yüzey-değişiklik'dır kullanımı etkin aracılarına birden çok tek bir EF platform entegre etmek için fırsat sunuyor. Gelecekte, nerede etkin ajanlar çeşitli içinde kapsüllü olabilir ve EFs için Birleşik bir çok amaçlı teknoloji (MPT) geliştirmeyi amaçlıyoruz. Bu MPTs çok çeşitli patojenler karşı koruma eylem farklı mekanizmaları ile therapeutics dahil ederek görüşmek için tasarlanmış olabilir. Yüzey ve iç active aracıları eylem farklı mekanizmaları ile teslim etmek için EFs kullanarak, virüs enfeksiyonu karşı korumak için EFs potansiyelini maksimize.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu araştırma fonu için mükemmellik için Yahudi miras Fonu için minnettarız. Dr. Stuart Williams II cömertçe electrospinning sisteminin kullanımı sağlamak için teşekkür ederiz. Biz de Dr. Kenneth Palmer bize Griffithsin ile verdiğiniz için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr Nobuyuki Matoba ve laboratuarını GRFT ELISA içimizde iş eğitim için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792 (2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108 (2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635 (2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Tags

Biyomühendislik sorunu 128 Electrospun lifleri cinsel bulaşan enfeksiyonlar insan immün yetmezlik virüsü yüzey değiştirme microbicide Griffithsin Poli (laktik-co-glikolik asit)
İmalat ve Fiber Griffithsin-modified iskele karakterizasyonu önlenmesi için cinsel enfeksiyonlar iletilen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vuong, H. R., Tyo, K. M.,… More

Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter