Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Tillverkning och karakterisering av Griffithsin modifierade Fiber ställningar för Prevention av sexuellt överförbara infektioner

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

Detta manuskript beskriver förfarandet för att fabricera och karaktärisera Griffithsin-modifierad poly (mjölksyra-co-glykolsyra) electrospun fibrer som visar potent självhäftande och antivirala aktivitet mot humant immunbristvirus typ 1 infektion in vitro. Metoder som används för att syntetisera, surface-ändra, och karakterisera den resulterande morfologin, konjugation, och desorption av Griffithsin från ytan-modifierade fibrer beskrivs.

Abstract

Electrospun fibrer (EFs) har använts i en mängd olika terapeutiska tillämpningar; de har dock nyligen tillämpats som en teknik för att förebygga och behandla sexuellt överförbara infektioner (STI). Dessutom fokuserar många EF teknologier på att kapsla in den aktiva agenten, i förhållande till utnyttja ytan för att förmedla biofunctionality. Här beskriver vi en metod för att fabricera och surface-ändra poly(lactic-co-glycolic) syra (PLGA) electrospun fibrer, med den potenta antivirala lektin Griffithsin (GRFT). PLGA är en FDA-godkända polymer som allmänt har använts i drogen leverans på grund av dess enastående kemiska och biokompatibla egenskaper. GRFT är en naturlig, potenta, och säker lektin som besitter bred aktivitet mot många virus inklusive humant immunbristvirus typ 1 (HIV-1). Kombination, har GRFT-modifierade fibrer visade potent inaktivering av HIV-1 i vitro. Detta manuskript beskrivs metoderna för att fabricera och karaktärisera GRFT-modifierade EFs. Första är PLGA electrospun att skapa en fiber byggnadsställning. Fibrerna är därefter ytan modifierade med GRFT hjälp 1-etyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) och N-hydroxysuccinimide (NHS) kemi. Svepelektronmikroskopi (SEM) användes för att bedöma storlek och morfologi av surface-modifierade formuleringar. Dessutom en gp120 eller hemagglutinin (HA)-baserade ELISA kan användas för att kvantifiera mängden GRFT konjugerat till, liksom GRFT desorption från fiber yta. Detta protokoll kan tillämpas mer allmänt för att fabricera fibrer som är ytan-modifierad med en mängd olika proteiner.

Introduction

Användningen av EFs som en aktuell leveransplattform har potential att avsevärt minska könssjukdomar. För närvarande finns det över 36 miljoner människor lever med HIV, med över två miljoner nya fall av rapporterade i 2015 ensam1,2. Dessutom, herpes simplex virus typ 2 (HSV-2) infektion drabbar hundratals miljoner människor över hela världen och har visat sig förbättra förvärvet av HIV av 2-5 gånger3. På grund av detta förhållande mellan HSV-2 infektion och HIV förvärv finns det betydande intresse i utvecklingen av nya verksamma ämnen som ger samtidigt skydd mot flera sexuellt överförbara sjukdomar. Utvecklingen av nya fordon att förbättra leveransen av dessa antivirala medel ger dessutom potential att ytterligare förbättra skyddande och terapeutiska potens. Mot detta mål, har EFs undersökts som en ny leveransplattform för att minska prevalensen av HIV-1 och HSV-2 infektion.

Under de senaste två decennierna, EFs har i stor utsträckning används i fälten av drogen leverans och tissue engineering4. Ofta, är biokompatibla polymerer valda för att enkelt översätta till terapeutiska tillämpningar. För att fabricera polymera EFs, löses valda polymeren i ett organiskt lösningsmedel eller vattenbaserad lösning, beroende på graden av polymer vattenavvisande egenskaper5. Ämnen av intresse läggs sedan till lösningsmedel eller aqueous lösningen före den electrospinning processen. Polymer lösningen är sedan aspirerade i en spruta och långsamt matas ut medan omfattas av en elektrisk ström. Denna process resulterar vanligtvis i polymer fibrer med blad eller cylindriska macrostructures (figur 1) och fiber diametrar alltifrån mikro - till nano-skala6. För mest terapeutiska tillämpningar, aktiva agenter införlivas inom fibrerna under processen electrospinning och frigörs från fiber via diffusion och efterföljande fiber nedbrytning. Graden av nedbrytning eller release kan ändras med hjälp av olika typer av polymerer eller polymera blandningar för att upprätta en önskad release profil, förmedla unika kemiska och fysikaliska egenskaper7, och att främja inkapsling av praktiskt taget alla sammansatta. Som sådan, har EFs visat positiva till leverans av småmolekylära läkemedel och biologiska agens inklusive proteiner, peptider, oligonukleotider och tillväxtfaktorer6,8,9.

I fältet för STI prevention, har EFs nyligen använts att införliva och ge eller inducerbara-frisättning av antivirala medel10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. I en av de tidigaste studierna utvecklades pH-lyhörd fibrer för att frigöra ämnen som svar på förändringar i miljön inom den kvinnliga fortplantningsorganen (FRT), som på begäran en metod för skydd mot HIV-1-11. Sedan, har andra studier undersökt polymerblandningar består av polyeten oxid (PEO) och poly-L-mjölksyra (PLLA), för att utvärdera avstämbara frisläppandet av antivirala och preventivmedel agenter för HIV-1 förebyggande och preventivmedel i vitro 12. ytterligare studier har påvisat genomförbarheten av EFs att tillhandahålla följande: förlängd frisättning av liten molekyl antiviraler14, stark och flexibel mekaniska egenskaper20, 3D-leverans arkitekturer21 , hämning av spermier penetration12och förmågan att gå samman med andra leverans teknik13. Slutligen har tidigare arbete utvärderat polymera fibrer för ihållande-leverans av antivirala medel mot gemensamma co-infective virus, HSV-2 och HIV-1-14. I denna studie som polymer fibrer kompletterande verksamhet till antivirala leverans behålla sin struktur för upp till 1 månad och tillhandahålla en fysisk viral inträdeshinder. Från dessa resultat konstaterades det att EFs kan användas till både fysiskt och kemiskt hindra virusinfektion.

Medan avstämbara release egenskaper gör polymera EFs en attraktiv plattform för mikrobicid leverans, har EFs utvecklats i andra program att fungera som surface-modifierade ställningar7. EFs har använts för att efterlikna morfologi av den extracellulära matrixen (ECM), ofta egenskap ställningar att förbättra cellulär förnyelse22och förbättra deras användbarhet i tissue engineering23,24. Fibrer som består av polymerer, såsom poly-ε-kaprolakton (PCL) och PLLA har ändrats av ytan med tillväxtfaktorer och proteiner efter electrospinning att ge ECM-liknande egenskaper inklusive ökad cellulär adhesion och spridning25 , 26. Dessutom antimikrobiell yta-modifierade EFs har utvärderats för att förhindra tillväxt av specifika patogena bakterier27,28. På grund av denna mångsidighet och förmåga att inducera biologiska effekter, fortsätter EF tekniken att expandera i en mängd olika fält att tillhandahålla flera mekanistiska funktioner. Trots deras nytta av en mångfald av program, har ännu, surface-modifierade fibrer endast nyligen undersökts i mikrobicid fält29.

Parallellt med utvecklingen av nya delivery-teknologier för att förebygga och behandla sexuellt överförbara sjukdomar, nya biologiska behandlingar har utvecklats. En av de mest lovande mikrobicid kandidaterna är den självhäftande antivirala lektin, GRFT30. Ursprungligen härstammar från en art av röda alger, GRFT har visat aktivitet som en potent hämmare av HSV-2, HIV, SARS, samt hepatit C virus31,32,33,34, 35 , 36. I själva verket bland biologiskt-baserade hämmare, GRFT har den mest potenta anti-HIV-aktiviteten, inactivating HIV-1 nästan omedelbart vid kontakt30, bibehållen stabilitet och aktivitet i närvaro av kultur media från vaginal mikrober för upp till 10 dagar37. Mer nyligen, en 0,1% GRFT gel visades att skydda möss mot intravaginal HSV-2 utmaning, vilket gör det en lovande kandidat för den första raden av skydd mot både HSV-2 och HIV-132, 38. för HIV specifikt GRFT hämmar infektion genom fysiskt bindande gp120 eller terminal mannos N-länkade glycan rester på virala kuvert ytor att förhindra inträde38,39,40,41 ,42. Denna hämning är mycket potent och med IC50s närmar sig 3 ng/mL43. Förutom att hämma HIV-infektion, har studier också visat att GRFT skyddar mot HSV-2 infektion genom att hämma cell till cell spridning av virus32. I alla fall, har GRFT visat sig vara självhäftande viruspartiklar, samtidigt som vi visar hög motståndskraft mot denaturering. Senast, har GRFT visat synergistisk aktivitet med kombinationer av Tenofovir (TFV) och andra antivirala medel44, gör det möjligt och sannolikt fördelaktigt att administrera tillsammans med EFs. GRFT potent egenskaper gör det en utmärkt biologiskt-baserade antivirala kandidat, där leverans kan förstärkas med EF-teknik.

Utnyttja denna kunskap för självhäftande och medfödda antivirala egenskaperna för GRFT, utformades en polymera fiber byggnadsställning som integrerar dessa egenskaper för att ge det första lagret av viruset inträde hämning29. Att hitta inspiration i det sättet att cervicovaginal slem hindrar virus transport främst genom mucoadhesive mucin interaktioner, hypotesen vi som genom att använda EFs som en byggnadsställning och kovalent ändra ytan med GRFT, en hög täthet av Surface-konjugerad GRFT skulle försvaga och inaktivera virus på dess entrypoint45,46,47. Här utvecklades EFs som en stationär byggnadsställning tillhandahålla en protein-baserade, viral lim-inactivating barriär plattform. Vi försökt kombinera potenta antivirala egenskaperna för GRFT med en biokompatibel, modifierbara och slitstark polymer plattform, att skapa en nya viruset ”fälla”.

För att uppnå dessa mål, fibrer består av PLGA var electrospun och EDC-NHS kemi användes för att därefter ändra EF ytan med GRFT. PLGA tjänade som en modell polymer på grund av dess omfattande användning i electrospinning48, kombinerat med dess biokompatibilitet och kostnadseffektivitet. Dessutom ytmodifiering utnyttjar den stora ytan av EFs och ger ett användbart alternativ som kan kombineras med inkapsling att maximera fiber verktyget49. Till skillnad från traditionella inkapsling metoder där endast en del av GRFT är tillgängliga (och endast övergående presentera i FRT), kan ytmodifiering aktivera GRFT att upprätthålla maximal bioaktivitet under hela behandlingen. Dessutom kan införlivandet av hydrofil föreningar såsom proteiner, av traditionella electrospinning metoder, resultera i lägre inkapsling effektivitetsvinster och förlust av protein aktivitet50. GRFT yta-modifierade fibrer kan därför erbjuda en lovande alternativa leveranssätt som kan användas ensamt eller i kombination med electrospinning för att förbättra skyddet mot STI infektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning och tillverkning av Electrospun Fiber ställningen

försiktighet: allt arbete med lösningsmedel eller polymerlösningar bör utföras i dragskåp kemisk . Hänvisa till material säkerhetsdatablad av varje reagens innan protokollet.

  1. Att electrospin en 3 mL 15% w/w PLGA polymer lösningen, väger 720 mg 50: 50 poly (mjölksyra-co-glykolsyra) (PLGA; 0,55 till 0,75 dL/g, 31-57 kDa) i en 10 mL injektionsflaska av scintillation. Volymen av lösningen baseras på typiska batchstorleken används i strömstudier.
    Obs: Polymer massan att lägga till en viss volym vätska måste beräknas genom att först fastställa tätheten av lösningsmedel används att upplösa polymeren. Tätheten av de lösningsmedel Hexafluoro-2-propanol (Bovallstrand) är 1,59 g/mL. Således, vikten av lösningsmedel, baserat på en volym av 3,0 mL Bovallstrand behövs, är 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). För en 15% w/w bråkdel av PLGA till Bovallstrand, 720 mg PLGA måste läggas till 3,0 mL Bovallstrand (0,15 x 4,800 mg = 720 mg). Fördelen med att använda en % viktprocent polymer/lösning, snarare än % w/v, är att detta ger en definierad vikt på den slutliga lösningen. Denna definierade vikt möjliggör mer exakt lösningsmedel ersättare, när det gäller lösningsmedel avdunstning under steg 1.3.
  2. Lägga till 3,0 mL Bovallstrand i glas scintillation injektionsflaskan med PLGA (från steg 1.1) med serologiska glas pipett. Täcka injektionsflaskan med plastfilm, och sedan mäta och registrera injektionsflaskan mass.
  3. Inkubera polymer suspensionen över natten vid 37 ° C att säkerställa fullständig upplösning av polymeren. Om eventuella lösningsmedel avdunstar, minskande injektionsflaskan massan, lägga till Bovallstrand tills flaskan når sin ursprungliga massa i steg 1.2.
  4. Efter inkubation, förbereda electrospinning apparaten ( figur 2 A). Även ett dorn av valfri storlek kan användas, här ett roterande 25 mm ytterdiameter rostfritt stål Dorn användes som collector.
    Obs: Större Dorn diameter minskar fiber tjockleken, ges samma volym av electrospinning lösning.
  5. Aspirera polymer lösningen i en 3 mL injektionsspruta.
  6. Anslut en trubbig 18 gauge, ½ tum nål spets till sprutan och fördela den överflödig lösningen (vanligtvis 0,25 mL) för att ta bort tomma headspace i nålspetsen.
  7. Placera sprutan på en sprutpumpen och ställa instrumentet flödeshastigheten till 2,0 mL/h.
    Obs: Detta flöde var tidigare optimerad baserat på polymer viskositet för denna formulering.
  8. Anslut strömkällan till sprutans nål och electrospin polymer lösningen med en spänning på + 27 kV. Avståndet mellan nålen och samlare bör sättas till ca 25 cm ( bild 2 B).
    Varning: Electrospinning processen skapar en lösningsmedel ånga. Använda ett dragskåp eller en sluten apparat ( figur 2) att ta bort skadliga ånga .
  9. När hela lösningen är electrospun, Stäng av strömkällan och tillåta dornen att snurra för en ytterligare 30 min till fullt avdunsta lösningsmedlet.
  10. Turn off roterande Dorn faktureringspartnern, och Använd ett rakblad för att skära fiber från dornen. Använda bladet försiktigt skala fiber från dornen.
  11. Samla electrospun PLGA fibern i en märkt petriskål och placera i en desiccatorovernight att ta bort kvarvarande vätska.

2. Surface-ändring av fibrer med GRFT

  1. Förbered lösningar av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syra (MES buffert). Förbereda PBS genom upplösning 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 och 0.24 g KH 2 PO 4 i 1 L ultrarent vatten. Likaså lös 19,52 g MES (fri syra, MW 195,2) och 29.22 g NaCl i 1 L ultrarent vatten, att förbereda MES buffert. Kontrollera varje lösning slutliga pH är mellan 7,2-7,5 och 5.0-6.0, respektive, med hjälp av en pH-mätare.
  2. Förbereda enskilda fungerande lösningar av EDC (2 mM) och NHS (5 mM).
    1. Bort EDC och NHS från frysen och tillåta dem att temperera vid rumstemperatur före vägning.
    2. Väger 4 mg av EDC i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
    3. Väger 6 mg av NHS i en annan mikrocentrifug rör.
    4. Add 1 mL MES buffert till varje rör. Vortex båda rör kraftigt för att säkerställa reagenserna är helt upplöst.
  3. Bereda en lösning av hydroxylamin genom vägning 70 mg i en 50 mL konisk centrifugrör.
  4. Tillsätt 20 mL PBS till hydroxylamin och vortex att upplösa.
  5. Massan ut en lämplig mängd PLGA fiber i en 15 mL koniskt centrifugrör. 75 mg fiber används vanligen för varje reaktion.
  6. Tillsätt 8 mL MES buffert till 15 mL röret.
  7. Add 1 mL vardera av EDC och NHS lösningar förberett tidigare till röret. Den slutliga volymen av lösningen bör vara 10 mL. De slutliga koncentrationerna av EDC och NHS bör vara 0,4 mg/mL och 0,6 mg/mL, respektive.
  8. Nära och täta 15 mL röret med plastfilm och placera på en rotator till att lösningen vara vänd försiktigt under 15 minuter vid rumstemperatur ( figur 3 B). Detta steg aktiverar carboxyl grupperna på polymeren att tillåta för kovalent modifiering med proteinet GRFT ( figur 3 A).
  9. Efter aktiveringen, noggrant släcka reaktionen genom att lägga till 14 µL av β-merkaptoetanol till röret. Vänd röret flera gånger för att säkerställa fullständig blandning.
    FÖRSIKTIGHET: β-merkaptoetanol är mycket giftigt och bör endast användas i kemiska dragskåp.
  10. Avlägsna supernatanten och skölj PLGA fibern två gånger med 10 mL PBS, ta bort alla återstående β-merkaptoetanol.
  11. Efter sköljning, tillsätt en lämplig mängd GRFT stamlösning till röret. Exempelvis skulle en 5 nmol GRFT/mg fiber kräver 6,35 µL av GRFT stamlösning (lagervara en 10 mg/mL) per mg fiber. Således ett 75 mg fiber prov skulle kräva 476.25 µL av 10 mg/mL stamlösning GRFT.
    Obs: GRFT fibrer med teoretiska axelbelastningar för 0,05, 0,5 och 5 nmol GRFT per mg fiber var fabricerade.
  12. Lägga till tillräckligt PBS för att få den slutliga volymen till 8 mL, Stäng och Invertera röret för att säkerställa omsorgsfull blandning.
  13. Tätning röret med plastfilm och placera på en rotor igen, denna gång för 2 h.
  14. Efter the 2 h inkubation, släcka reaktionen genom att lägga till 2 mL hydroxylamin lösning i de 15 mL centrifugröret. Per tillverkarens anvisningar, hydroxylamin slutliga koncentration under släcka reaktionen bör vara 0,7 mg/mL.
  15. Blanda lösningen väl och kasta bort supernatanten. Skölj ytan modifierade PLGA fibern två gånger med 10 mL ultrarent vatten för att avlägsna eventuella okonjugerat GRFT.
  16. Överföring fibern till en petriskål och plats inne i exsickator tills fibern är helt torr. Överföra petriskål till 4 ° C för lagring.

3. SEM karakterisering av GRFT yta-modifierade fibrer

  1. plats en remsa av dubbelsidig kol tejp på en SEM preparatet mount. Etikett längst ned på preparatet fästet med den prov identifierande information med en permanent markörpenna.
  2. Skär tre prover från en yta-modifierade fiber och placera dem på separata provexemplar fästen. Tjockleken på varje prov är ungefär 0,5 mm.
  3. Fräsande coat proverna med elektron-inducerad partikel nedfall från en guld-platta. Sputter kappa för 90 s, 2,4 kV.
    Obs: Den fräsande coat tiden kan variera beroende på utrustning parametrar, inklusive spänning och strömstyrka.
  4. Bild proverna på 8 kV med en förstoring som sträcker sig från 1 000 till 5 000 X.

4. Utvinning av GRFT från ytan-modifierade fibrer

  1. massa ut 2 mg av fiber i tre exemplar i 1,5 mL mikrocentrifugrör.
  2. Tillsätt 1 mL dimetyl sulfoxid (DMSO) till röret, sedan vortex och inkubera i 1 minut vid rumstemperatur att helt upplösa fibern.
  3. Efter inkubation, späd en 10 µL alikvot av DMSO-fiber lösningen från steg 4,2, minst 100 gånger i Tris-EDTA (TE) buffert (pH = 8.0).
  4. Lagra prover vid-20 ° C tills lastning karakterisering med ELISA.

5. Mäta GRFT Desorption från fibrer

  1. att bedöma mängden GRFT släppt eller desorberats ur fiber, väga 5-10 mg av surface-modifierade fiber och plats i en mikrocentrifug rör. Spela in fiber massan i varje rör.
  2. Tillsätt 1 mL av en lämplig lösning som härmar fysiologiska miljön (t.ex., PBS, TE buffert, simulerade vaginalsekret (SVF), etc.) till varje prov.
  3. Inkubera proverna för 1 h på en roterande skakapparat på 200 rpm, 37 ° C.
  4. Efter inkubation, ta bort cirka 1 mL TE buffert innehållande den desorberat GRFT från injektionsflaskan och alikvot till kluster rör. Förvaras vid-20 ° C tills protein kvantifiering.
  5. Överför provet till en ny mikrocentrifug rör, tillsätt 1 mL färsk buffertlösning till fibern inom mikrocentrifug röret och inkubera tills nästa tidpunkt.
  6. Typiska punkter används för att mäta release inkludera: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h och 1 veckor försumbar desorption observerades i dessa studier efter 4 h.

6. Kvantifiering av GRFT utvinning och Desorption via ELISA

  1. Coat en 96 brunnar ELISA tallrik med 0,1 mL av HA (10 µg/mL) per brunn som tidigare beskrivs 51. Försegla plattan med plastfilm och inkubera över natten vid 4 ° C ( figur 4).
  2. Ta bort beläggning bufferten, och lägga till 0,3 mL blockerande buffert (2-3% bovint serumalbumin (BSA) i PBS med 0,05% polysorbat 20) till varje brunn. Inkubera plattan för minst 2 tim i rumstemperatur.
  3. Efter inkubation, skölj plattan 3 gånger med 1 x PBS med 0,1% polysorbat 20 (PBS-P). Efter sköljning, avstå från 0,1 mL av provet, standard eller PBS som negativ kontroll i respektive brunnar. Inkubera plattan igen för 1 h i rumstemperatur.
  4. Skölj plattan 3 gånger igen med PBS-P. Efter sköljning, tillsätt 0,1 mL av primär antikropp (get anti-GRFT antiserum) i varje brunn och inkubera i minst 1 tim i rumstemperatur. Typiskt, primär antikropp lösningen späds av 1:10,000 i PBS.
  5. Efter inkubation av prov med primär antikropp skölj plåtarna igen 3 gånger med PBS-P. Tillsätt 0,1 mL av sekundär antikropp (pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerade kanin anti get IgG) till varje brunn och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur. Sekundära antikroppar lösningen späds av 1:10,000 i PBS.
  6. Tvätta plattan 3 gånger. Tillsätt 0,1 mL TMB 2-peroxidas substrat till varje brunn. Övervaka färgutveckling (ca 2 min), Lägg 0,1 mL H 2 så sedan 4 (1 N) att släcka reaktionen. Läs plattan vid 450 nm på en Plattläsare.
  7. Genomsnittliga bakgrund OD-värdena (brunnar som får endast PBS) och subtrahera detta från de experimentella grupperna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fiber morfologi har en betydande effekt på ytan-modifierade EFs förmåga att ge skydd mot virus. Även om electrospinning är en bekväm och okomplicerad procedur, kan icke-optimerade polymer formuleringar resultera i oregelbunden fiber morfologi (figur 5B-C). Förändringar i electrospinning tillstånd som resulterar i bildandet av pärlstav eller amorfa morfologier matta-liknande, orsakas ofta av lösningsmedel-polymer oförenlighet, låg polymer viskositet, flöde eller andra electrospinning villkor. De resulterande variationerna i fiberstruktur kan resultera i olika release profiler för drog-ingår fibrer eller inkonsekvenser i konjugation effekt, att ändra fibrer förmåga att fysiskt eller kemiskt hindra virus penetration. Den PLGA EFs dikta ihop användande beskrivs electrospinning villkoren bör resultera i distinkta fiber morfologier med diametrar mellan 1,5 och 2,8 µm (figur 6). För att avgöra fiber morfologi och diameter, bör EFs undersökas med SEM före andra karakterisering eller modifiering steg.

SEM-bilder av tomt, 0,05, 0,5 och 5 nmol GRFT fibrer visade inga signifikanta skillnader i fiber morfologi (figur 6A-D), vilket indikerar att GRFT modifiering har ingen effekt på fiber morfologi. För att avgöra den genomsnittliga diametern av varje EF formulering, togs minst 50 slumpmässiga mätningar per synfält från SEM bilder. De genomsnittliga diametrarna av EF formuleringar var mäts och beräknas i ImageJ, som visas i figur 6E. Alla EF formuleringar hade liknande genomsnittliga diametrar runt 1,9 µm, visar konsekvens av oförändrad fiber tillverkningsprocessen över batchar.

För att avgöra mängden GRFT konjugerat till EFs, upplöstes GRFT-EFs i DMSO, följt av en 100-faldig utspädning i TE buffert, att extrahera GRFT från fiber. Mängden GRFT konjugerat per mg fiber kvantifierades med hjälp av ELISA. För varje ändring densitet (0,05, 0,5 och 5 nmol GRFT per mg fiber) utvärderades tio replikat. För 5, 0,5 och 0,05 nmol GRFT/mg EF modifieringar, varje EF hade 373, 165 och 42 ng GRFT per mg EF, vilket resulterar i konjugation effektivitetsvinsterna av 0,6 4.2 och 6,9%, respektive. Dessa resultat visar att GRFT-EFs konjugerat med högre teoretiska ytan-modifiering densitet, resulterar i mer GRFT konjugerat till fibern(figur 7). Dock fanns det en omvänd korrelation med den resulterande konjugation effektivitet29.

För att bedöma mängden GRFT kovalent konjugerad till fiber ytan klimatuppvärmningspotential adsorberat, inkuberades GRFT-EFs i SVF att fastställa beloppet för GRFT släppt. Inom de första 4 h, 113, 25 och 10 ng av GRFT per mg EF upptäcktes i SVF för 5 och 0,5 0,05 nmol teoretiska modifiering koncentrationer, respektive. Dessa värden motsvarar 30%, 41% och 24% av mängden GRFT konjugerat till 5 och 0,5 0,05 nmol GRFT-EFs. Efter 4 h upptäcktes försumbar GRFT i release eluatet för alla tre beredningar. GRFT release efter 1, 2 och 4 h visas i figur 7B. Sammantaget tyder dessa data på att majoriteten av GRFT är kovalent bundna till EFs, och att den ytan-adsorberat GRFT släpps inom de första 4 h.

Figure 1
Figur 1: macroscale morfologi av electrospun fibrer. Electrospun fibrerna visas var fabricerade med en 4 mm (cylindern) och 25 mm (blad) diameter Dorn, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Electrospinning apparatur. (A) samla Dorn där flytande jets av polymer deponera, och (B), inställningen för full electrospinning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Schematisk av EF modifiering med GRFT med hjälp av EDC-NHS kemi. (A) Karboxylgrupper på den PLGA EF reagerar med NHS i närvaro av EDC till formuläret amine-reaktivt estrar, som därefter kommer att utgöra stabila amide obligationer med de primära aminesna av GRFT. (B) två milligram fiber diskar eller bitar skär och inkuberas i 8 mL MES buffert med 2 mL av EDC/NHS reagens och roteras för 15 min. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Schematisk illustrerar GRFT kvantifiering med hjälp av ELISA. En 96-väl immunoplate är belagd med gp120 eller HA att fånga och immobilisera GRFT. Primära antikroppar mot GRFT, sekundära antikroppar kopplade till pepparrotsperoxidas och ELISA substrat tillsätts sekventiellt kvantifiera GRFT. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: effekter av lösningsmedel val på PLGA EF morfologi. (A), 15% w/w PLGA EFs i Bovallstrand visas önskvärt tråd-liknande morfologi. (B) 15% w/w PLGA EFs i kloroform och dimetylformamid, inte form på grund av icke-optimala lösningsmedel val eller polymer koncentrationen (viskositet). (C) den 15% w/w och (D) 20% w/w PLGA EFs i TFE visar vikten av polymer viskositet. Pärlor bildas i formuleringen med lägre polymer koncentrationen (C), medan öka polymer koncentrationen (lösningsmedel viskositet) resulterade i väl definierade fiber morfologi (D). Observera, figur 5B togs vid lägre förstoring Visa matta-liknande morfologi. Skala barer = 10 µm.Figure 6
Figur 6: SEM-bilder och fiber diametrar av kala och GRFT-modified EFs. (A) Bare PLGA EFs och PLGA EFs yta-modifierad med (B) 0,05 nmol, (C) 0,5 nmol och (D), 5 nmol av GRFT per mg fiber. Skala barer = 10 µm. (E) diametrar av oförändrad och GRFT-EFs. Felstaplar representera den genomsnittliga ± SEM. Ingen statistisk skillnad observerades mellan diametrarna av oförändrad och GRFT-modifierade fibrer. Figur 6 E har anpassats från hästskötare o.a. 29 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Mängden GRFT konjugerat till och desorberats ur GRFT-modifierade EF. (A) mängden GRFT konjugerat till varje mg EF fiber ökar med ökad GRFT reaktant koncentration. ()B) mängden GRFT frigörs från varje mg av fiber visas för 0,05, 0,5 och 5 nmol formuleringar efter 1, 2 och 4 h inkubation i SVF. Felstaplar representera den genomsnittliga ± SEM. Denna siffra har anpassats från hästskötare o.a. 29 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

På grund av sin porösa strukturer och stora ytor, har EFs funnit en mängd olika applikationer inom vården, varav den ena innehåller servering som terapeutiska leveransfordon. Narkotika och andra ämnen kan införlivas inom EFs för avstämbara leverans, medan biologiska och kemiska ligander kan vara konjugerat till fiber ytan för cell-specifika inriktning52 eller biosensing53. Här modifierade tillverkning av GRFT yta PLGA EFs, som en leverans byggnadsställning att förhindra HIV-infektion, beskrivs. GRFT-EFs var syntetiseras av electrospinning, som ger fördelarna med låga kostnader och hög produktionstakt i förhållande till andra fiber produktion metoder49,53.

Kritiska steg i protokollet
Bildandet av EFs är kritiskt beroende av egenskaperna hos polymera lösning, i synnerhet den lösning eller lösningsmedel viskositet54. De faktorer som påverkar viskositeten hos en polymer lösning inkluderar polymer molekylvikt, polymer koncentrationen och typ av lösningsmedel som används. Den lösningen eller lösningsmedel viskositet justeras vanligtvis genom att ändra förhållandet mellan polymer till lösningsmedel, att erhålla önskad polymer koncentrationen. Med varje tillverkning, måste volymen upprätthållas under natten inkubation att upprätthålla rätt polymer-till-lösningsmedel förhållande (viskositet). Vid tillräckligt hög polymer koncentration trassla polymermolekylerna i lösningen under electrospinning för att producera fibrer. Under electrospinning, en pärla kommer att bilda spinndysor spets och om det finns tillräcklig polymer entanglement, flytande jets kommer att bryta ut från denna punkt vid kritiska spänning och påskynda i piska-liknande sätt mot den samlande Dorn55. Lösningsmedel avdunstning kommer då leda till jet gallring, producera trådar av fiber som de sätter in på samlande dornen. När syntetiseras, bör EFs analyseras av SEM att verifiera korrekt morfologi och konsekvent fiber diameter. Förekomsten av pärlstav EFs kan vara resultatet av låg lösning viskositet56, ytterst hög tillämpad spänning57, polymer flöde klassar58, eller en kombination av alla tre faktorer. Om detta beaktas, polymer koncentrationen ökas och den tillämpad spänning och matningshastigheten justeras, för att uppnå fiber-liknande morfologi.

För att böja proteiner till EF ytan, var PLGA carboxyl grupper här reagerade med EDC-NHS carbodiimide crosslinking kemi59. Under modifiering processen inkuberas kort fibrer med EDC i närvaro av NHS vilket resulterar i omvandlingen av karboxylater till halvstabila, amine-reaktivt estrar. Under tvåstegsverifiering konjugation processen är det viktigt att buffertar används under varje steg har den optimala pH, noterade i tillverkarens instruktioner, att garantera maximal konjugation effektivitet. Halveringstiden för NHS estrar varierar från fyra till fem timmar vid neutralt pH och minskar dramatiskt i mer grundläggande villkor60. Således den första reaktionen bör utföras i MES buffert vid pH 5-6 och aktiveras fibrerna ska sedan överföras till en PBS-bufferten (pH 7,2-7,5) för efterföljande och omedelbar reaktion med GRFT. Det är också viktigt att EDC är inaktiverat genom tillsats av 2-merkaptoetanol och tillräckligt sköljda från fibrerna efter bildas aktivering. Detta kommer att förhindra protein aktivering av EDC och self-crosslinking under den andra reaktionen, som kan minska konjugation effektivitet.

Modifieringar och felsökning
Även om vårt tidigare arbete visat effekten av en mängd GRFT-modifierade fibrer mot HIV-1 infektion, vissa processen ändringar kan anses att anpassa EF morfologi eller förbättra GRFT (eller andra protein) konjugation effektivitet eller fiber avkastning29. I synnerhet ökas EF ytan genom att minska fiber diameter, för att möjliggöra en större yta för konjugation. Tidigare studier har visat att minska polymer koncentrationen och viskositet ger mindre fiber diameter61,62. Detta tillvägagångssätt är dock begränsad av bildandet av pärlstav fibrer när koncentrationen är under tröskelvärdet. För att minska fiber diameter utan att ändra lösning viskositet, dubbla lösningsmedels system kan utnyttjas för att minska ytspänningen, eller salter kan läggas för att öka lösning ledningsförmåga56,57. Båda metoderna kommer att möjliggöra större stretching av electrospinning jets som kan producera mindre fiber diameter. Dessutom kan lägre molekylvikt polymerer användas för att tillverka mindre diameter fibrer. Minskande fiber diameter ger också fördelen av genererar mindre porer, potentiellt effektivare EFs som en barriär mot virus penetration, för mikrobicid-baserade program63. Slutligen konstaterades det att luftfuktighet kan påverka EF avkastning. Vid högre luftfuktighet tenderar avkastningen att minska på grund av bildandet av fibrer med ovanliga makro-morfologi. Installera ett system för kontroll av luftfuktighet i electrospinning kammaren kunde därför underlätta producerar EFs med konsekvent avkastning, om detta utgör en utmaning till tillverkning.

För att effektivisera GRFT konjugation, kan undersöker urval och placering av functionalizable grupper också övervägas. Till exempel om de primära aminesna av proteinet sevärdheter ligger nära inre av den tredimensionella proteinstrukturen, sterisk hinder kan hindra aktiverade carboxyl grupper på EFs från att interagera med primära aminer, därmed minskar den sannolikheten för reaktionen. Denna utmaning kan övervinnas genom aminosyra substitution av proteinet att generera en primär Amin-grupp närmare till protein ytan. Emellertid, som GRFT och andra proteiner beror på den specifika aktiviteten av dess bindande platser för funktioner, förändringar i protein konformation bör testas noggrant i funktionella analyser före konjugation.

Begränsningar
En stor begränsning av GRFT ytmodifiering är potentialen för låg konjugation effektivitet med hjälp av carbodiimide crosslinking kemi. Om antivirala proteinet av intresse har en hög IC50, kan en låg konjugation effektivitet inte ger tillräckligt skydd (i dessa program) mot virusinfektion. Men för GRFT (eller annan modified) EFs, proteiner och ämnen som inte är kovalent bundna tillEFs kan fortfarande adsorbera till ytan. Dessa adsorberade agenter erbjuder möjligheten att komplettera aktiviteten av konjugerade GRFT, genom att tillfälligt öka lokaliserade koncentrationen tillgängliga för virus bindning. I det här exemplet desorberat GRFT kan binda till HIV-1 virioner som inte direkt kontakta EFs, och kan ge en alternativ mekanism för skydd med första 4 h (pericoital) administration. Således kan både konjugerade och surface-adsorberat GRFT bidra till att ge enhetligt skydd mot könssjukdomar.

Trots det skydd från både protein konjugering och desorption, skulle andra surface-modifiering strategier med potentiellt högre effektivitet eftersträvas. Till exempel skulle PLGA avslutas med aminer i stället för carboxyl grupper kunna användas till konjugat aktiverade GRFT. Alternativt kan en annan surface-ändring strategi användas för att förbättra EF-protein konjugation effektivitet. Nanofibrous membran består av EFs har varit functionalized med avidinen via carbodiimide crosslinking kemi64. Biotinylation eller tillägg av en Strep-tagg (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) genom rekombination kan aktivera modifierade proteinet att bilda starka och extremt stabil icke-kovalenta interaktioner med metoden EFs. Medan icke-kovalenta, är avidinen-biotin länkaget den starkaste icke-kovalent bindning, med femtomolar affinitet, sannolikt resulterar i stabil konjugation till fiber ytan. För alla surface-modifiering strategier övervägas sterisk hinder att maximera konjugation effektiviteten.

Slutligen, föreställer vi att ytan modifierade EFs kommer att erbjuda en alternativ strategi till aktiva agenten inkapsling att tillhandahålla kompletterande former av skydd. Ett övervägande med att kombinera inkapsling och surface-ändring teknik på en enda EF-plattform kommer att minska förtida frisläppandet av aktiva agenter under ytan-modifiering processen. För surface-modifiering reaktioner som kräver relativt långa inkubationstiden i vattenlösning, förloras en betydande andel av de aktiva agenter laddad på grund av polymer hydrolys.

Betydelsen av metoden avseende befintliga och alternativa metoder
I tidigare arbete observerade vi att omodifierad tom EFs kunde hämma HIV-infektion med ~ 38% när den placeras i en transwell infoga ovanför infectible celler29. Denna observation kombinerat med biokompatibilitet, webbliknande mikrostruktur och tortuosity för EFs, parallellt med den observerade potenta antivirala och självhäftande egenskaper för GRFT, snabb utveckling av den modifierade ytan EFs beskrivs här.

I förhållande till andra delivery-teknologier för närvarande anställda i mikrobicid applikationer, EFs har ett brett utbud av potentiella tillämpningar på grund av sin arkitektur och förmåga till anpassning. I annat arbete, har fibrösa morfologi av EFs aktiverat dem att leverera aktiva agenter och att efterlikna ECM, vilket gör dem lämpliga ställningar för vävnadsteknik. EFs har också ändrats av ytan att förbättra biokompatibilitet och förbättra sustained release65,66.

För att förbättra biokompatibilitet eller leverera agenter som fungerar genom specifik bindning aktivitet, det finns många metoder som möjliggör fastsättning av föreningar till EFs ytor såsom plasma behandlingar, våtkemiska metoder och ytan transplantat polymerisationer50. När det gäller GRFT som specifikt binder till de virala glykoproteiner för HIV-1, är våta kemiska metoden för EDC-NHS det mest optimala på grund av förmågan att penetrera fibrer djupt inom mesh samtidigt bevara GRFT funktionalitet50. GRFT immobiliserats till EFs kan sedan levereras i en tålig formulering till FRT och ger omedelbart skydd mot HIV-infektion.

Jämfört med den befintliga strategin för encapsulating therapeutics inom EFs att hämma könssjukdomar, erbjuder kovalent konjugation den klara fördelen att öka den potentiella aviditet mellan GRFT och HIV virioner. Genom att immobilisera GRFT till EFs genom ytan-modifiering, kan starkt lokaliserad koncentrationer av GRFT uppnås, som ökar möjligheten för multivalenta bindning med HIV. Dessutom kan EF-orörlig GRFT, i förhållande till gratis GRFT i lösning, förhindra utarmning av GRFT poolen genom att hindra cell internalisering. Dessutom på grund av den unika verkningsmekanismen för GRFT som en stabil och självhäftande entry inhibitor kan kovalent ytan konjugation ytan modifierade EFs att tillhandahålla en fysisk barriär mot virus penetration, förutom potenta antivirala egenskaper.

Framtida tillämpningar av denna metod
Utnyttjande av ytan-modifiering för leverans presenterar möjlighet att integrera flera aktiva agenter inom en enda EF-plattform. I framtiden, försöker vi utveckla en multipurpose teknik (MPT) där en mängd aktiva agenter kan vara inkapslade i och konjugerat till EFs. Dessa MPTs kan utformas för att ge skydd mot ett större antal patogener genom att införliva therapeutics med olika verkningsmekanismer. Genom att utnyttja både ytan och inre av EFs att leverera aktiva medel med olika verkningsmekanismer, kommer att EFs potential att skydda mot virusinfektion maximeras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi är tacksamma mot den judiska Heritage Fund for Excellence för att finansiera denna forskning. Vi tackar Dr. Stuart Williams II för generöst ger användning av electrospinning systemet. Vi tackar också Dr Kenneth Palmer för att förse oss med Griffithsin. Vi tackar dessutom Dr. Nobuyuki Matoba och hans labb för utbildning oss i GRFT ELISA fungerar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792 (2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108 (2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635 (2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Tags

Bioteknik fråga 128 Electrospun fibrer sexuellt överförbara infektioner humant immunbristvirus surface-modifiering mikrobicid Griffithsin poly (mjölksyra-co-glykolsyra)
Tillverkning och karakterisering av Griffithsin modifierade Fiber ställningar för Prevention av sexuellt överförbara infektioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vuong, H. R., Tyo, K. M.,… More

Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter