Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabricage en karakterisering van de vezel Griffithsin gemodificeerde steigers voor preventie van seksueel overdraagbare infecties

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

Dit manuscript wordt de procedure beschreven om te fabriceren en karakteriseren van Griffithsin gemodificeerde poly (melkzuur-co-glycolic zuur) electrospun vezels waaruit krachtige lijm en antivirale activiteit tegen humaan immunodeficiëntie virus type 1 infectie in vitro. Methoden die worden gebruikt voor het synthetiseren, oppervlakte-wijzigen, en de resulterende morfologie, conjugatie, karakteriseren en desorptie van Griffithsin van oppervlak gemodificeerde vezels worden beschreven.

Abstract

Electrospun vezels (EFs) hebben op grote schaal gebruikt in een verscheidenheid van therapeutische toepassingen; echter hebben ze pas onlangs zijn toegepast als een technologie ter voorkoming en behandeling van seksueel overdraagbare aandoeningen (SOA's). Bovendien, vele EF technologieën gericht op encapsulating het actieve agens, ten opzichte van het gebruik van het oppervlak te geven biofunctionality. Hier beschrijven we een methode om te fabriceren en oppervlakte-poly(lactic-co-glycolic) zuur (PLGA) electrospun vezels, met de krachtige antivirale lectine Griffithsin (GRFT) te wijzigen. PLGA is een FDA-goedgekeurde polymeer dat wijd verbeid in drug delivery vanwege haar uitstekende chemische en biocompatibel eigenschappen gebruikt is. GRFT is een natuurlijke, krachtige, veilige lectine die bezit brede activiteiten tegen talrijke virussen met inbegrip van humaan immunodeficiëntie virustype 1 (HIV-1). Wanneer gecombineerd, hebben GRFT gemodificeerde vezels potente inactivatie van HIV-1 in vitroaangetoond. Dit manuscript worden de methoden beschreven om te fabriceren en karakteriseren van GRFT gemodificeerde EFs. Ten eerste, is de PLGA electrospun maken van een fiber-steiger. Vezels zijn vervolgens oppervlak-bewerkt met GRFT met 1-Ethyl - 3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) en N-hydroxysuccinimide (NHS) chemie. Scanning elektronen microscopie (SEM) werd gebruikt voor het beoordelen van de grootte en morfologie van oppervlak gemodificeerde formuleringen. Bovendien, een gp120 of hemagglutinine (HA)-gebaseerde ELISA kan worden gebruikt voor het kwantificeren van de hoeveelheid geconjugeerd met GRFT, evenals GRFT desorptie van het oppervlak van de vezel. Dit protocol kan ruimer worden toegepast om het fabriceren van vezels die oppervlakte-bewerkt met een verscheidenheid van verschillende eiwitten zijn.

Introduction

Het gebruik van EFs als een actuele levering-platform heeft de potentie om beduidend te verminderen SOA's. Momenteel zijn er meer dan 36 miljoen mensen met HIV, met meer dan twee miljoen nieuwe gevallen van gemelde in 2015 alleen1,2. Bovendien, herpes simplexvirus type 2 (HSV-2) infectie beïnvloedt honderden miljoenen mensen wereldwijd en is aangetoond dat het verbeteren van de verwerving van HIV door 2-5 voudige3. Vanwege deze relatie tussen HSV-2 infecties en HIV verwerving is er significant belang bij de ontwikkeling van nieuwe werkzame stoffen die gelijktijdige bescherming tegen meerdere SOA's bieden. Bovendien, de ontwikkeling van nieuwe voertuigen ter verbetering van de levering van deze antivirale middelen biedt de mogelijkheid om beschermende en therapeutische potentie verder te verbeteren. Richting van dit doel, zijn EFs onderzocht als een nieuwe levering platform ter vermindering van de prevalentie van HIV-1 en HSV-2 infecties.

Tijdens de afgelopen twee decennia, hebben de EFs uitgebreid op het gebied van drug delivery en weefsel engineering4is gebruikt. Vaak, worden biocompatibel polymeren geselecteerd om gemakkelijk vertalen naar therapeutische toepassingen. Om te fabriceren polymere EFs, wordt het geselecteerde polymeer opgelost in een organisch oplosmiddel of waterige oplossing, afhankelijk van de mate van polymeer hydrophobicity5. Actieve stoffen van belang worden vervolgens toegevoegd aan de oplosmiddelen of waterige oplossing vóór het electrospinning proces. De polymeeroplossing is vervolgens aanzuiging in een spuit en langzaam uitgeworpen terwijl hij onder een elektrische stroom. Dit proces resulteert meestal in polymeer vezels met blad of cilindrische macrostructures (Figuur 1) en vezel diameters variërend van de micro - naar nano-schaal6. Voor de meest therapeutische toepassingen, werkzame stoffen zijn opgenomen in de vezels tijdens het electrospinning en worden vrijgelaten uit de vezel via diffusie en aantasting van de latere vezel. Het tempo van de degradatie of release kan worden gewijzigd met behulp van verschillende soorten polymeren of polymeer combineert om een profiel van de gewenste versie, unieke chemische en fysische eigenschappen7meegeven, en het bevorderen van de inkapseling van vrijwel elk samengestelde. Als zodanig, hebben EFs bewezen gunstig zijn voor de levering van kleine molecuul drugs en biologische agentia zoals eiwitten, peptiden, oligonucleotides en groeifactoren6,8,9.

Op het gebied van STI-preventie, zijn EFs onlangs gebruikt om te nemen en te zorgen voor aanhoudende - of afleidbare-release van antivirale middelen10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19. In één van de vroegste studies, werden pH-responsieve vezels ontwikkeld om actieve agenten in reactie op veranderingen in het milieu binnen het vrouwelijke voortplantingssysteem (FRT), vrij te geven als een methode op afroep van bescherming tegen HIV-111. Sinds, hebben andere studies onderzocht polymere blends samengesteld uit polyethyleen oxide (PEO) en poly-L-lactic acid (PLLA), om te evalueren van het afstembare vrijkomen van antivirale en contraceptieve agentia voor HIV-1 preventie en contraceptie in vitro 12. aanvullende studies hebben aangetoond dat de haalbaarheid van EFs te bieden het volgende: verlengd release van klein molecuul antivirale middelen14, sterke en flexibele mechanische eigenschappen20, 3D-levering platforms21 , remming van sperma penetratie12, en de mogelijkheid om te fuseren met andere levering technologieën13. Ten slotte heeft de vorige werk polymere vezels voor de aanhoudende-levering van antivirale middelen tegen gemeenschappelijk co-infective virussen, HSV-2 en HIV-114geëvalueerd. In deze studie geleverd polymeer vezels complementaire activiteit tot antivirale levering door behoud van hun structuur voor maximaal 1 maand en het verstrekken van een fysieke barrière aan virale post. Uit deze resultaten werd naar voren gebracht dat EFs kunnen worden gebruikt voor zowel fysisch en chemisch belemmeren virusinfectie.

Terwijl afstembare release eigenschappen polymere EFs een aantrekkelijke levering platform voor microbiciden levering maken, zijn EFs in andere toepassingen om te dienen als oppervlak gemodificeerde steigers7ontwikkeld. EFs gebruikt om na te bootsen de morfologie van de extracellulaire matrix (ECM), vaak op de hoedanigheid van steigers verbeteren van cellulaire regeneratie22, en verhogen hun nut in weefsel engineering23,24. Vezels bestaat uit polymeren zoals poly-ε-caprolacton (PCL) en PLLA zijn oppervlak-bewerkt met groeifactoren en eiwitten na electrospinning naar ECM-achtige eigenschappen met inbegrip van verhoogde cellulaire hechting en proliferatie25 , 26. Daarnaast antimicrobiële oppervlak gemodificeerde EFs zijn geëvalueerd om te voorkomen dat de groei van specifieke pathogene bacteriën27,28. Door deze veelzijdigheid en de mogelijkheid voor het opwekken van biologische effecten, blijft EF technologie uitbreiden in allerlei velden multi mechanistische functionaliteit te bieden. Nog, ondanks hun nut in een verscheidenheid van toepassingen, oppervlak gemodificeerde vezels hebben pas onlangs onderzocht in het microbicide veld29.

Parallel met de ontwikkeling van nieuwe technologieën van de levering te voorkomen en behandelen van SOA's, nieuwe biologische therapeutics zijn ontwikkeld. Een van de meest veelbelovende microbicide kandidaten is de zelfklevende antivirale lectine, GRFT30. Oorspronkelijk afkomstig uit een soort van rode algen, GRFT heeft bewezen activiteit als een krachtige remmer van HIV, HSV-2, SARS, evenals het Hepatitis C virus31,32,33,34, 35 , 36. In feite onder biologisch gebaseerde remmers, GRFT heeft de meest krachtige anti-HIV-activiteit, inactiveren HIV-1 bijna onmiddellijk bij contact30, terwijl het handhaven van de stabiliteit en activiteit in aanwezigheid van de voedingsbodems van vaginale microben voor maximaal 10 dagen37. Meer recentelijk, een 0,1% GRFT gel bleek te beschermen tegen intravaginal uitdaging van de HSV-2, waardoor het een veelbelovende kandidaat voor de eerste regel van de bescherming tegen HSV-2 zowel HIV-132 muizen, 38. voor HIV specifiek, GRFT remt infectie door fysiek gp120 of terminal mannose glycan N-gebonden residuen te binden op virale envelop oppervlakken om te voorkomen dat post38,39,40,41 ,42. Deze remming is zeer krachtig, met IC50s 3 ng/mL43naderen. Naast remming van HIV-infectie, hebben studies ook aangetoond dat GRFT tegen HSV-2 infectie beschermt door remming van de cel-naar-cel verspreiding van het virus-32. In alle gevallen, heeft GRFT aangetoond dat het lijm virale deeltjes, worden terwijl de hoge weerstand tegen denaturatie demonstreren. Laatste GRFT heeft aangetoond dat synergetische activiteit met combinaties van Tenofovir (TFV) en andere antivirale middelen44, waardoor het haalbaar en waarschijnlijk gunstig zijn voor mede beheren met EFs. De krachtige eigenschappen van GRFT maken een uitstekende biologisch gebaseerde antivirale kandidaat, waarin de levering kan worden verbeterd met EF-technologie.

Gebruik makend van deze kennis van de zelfklevende en aangeboren antivirale eigenschappen van GRFT, is een polymere vezel-steiger ontworpen, die deze eigenschappen integreert zodat de eerste laag van virus vermelding remming29. Het vinden van inspiratie in de weg dat cervicovaginal slijm virus vervoer voornamelijk door middel van mucoadhesive mucin interacties belemmert, hypothetische wij die met behulp van EFs als een steiger en covalent wijzigen het oppervlak met een hoge dichtheid van GRFT, oppervlakte-geconjugeerde GRFT zou knelpunten en inactivering van virus op haar toegangspunt45,46,47. Hier werden EFs ontwikkeld als een stationaire steiger een op basis van eiwitten, virale lijm-inactiveren barrière platform te bieden. Wij willen combineren de krachtige antivirale eigenschappen van GRFT met een biocompatibele, aanpasbaar en duurzaam polymeer-platform, maak je een roman virus "val".

Om deze doelen te bereiken, werden vezels bestaat uit PLGA electrospun, en EDC-NHS Scheikunde werd gebruikt om vervolgens het wijzigen van het oppervlak van de EF met GRFT. PLGA diende als een model polymeer vanwege haar uitgebreide gebruik in electrospinning48, gecombineerd met de biocompatibiliteit en kosteneffectiviteit. Bovendien, oppervlakte modificatie exploiteert de grote oppervlakte van EFs en biedt een nuttig alternatief dat kan worden gecombineerd met inkapseling te maximaliseren vezel hulpprogramma49. In tegenstelling tot traditionele inkapseling methoden waar slechts een gedeelte van de GRFT is beschikbaar (en slechts Transient presenteren in de FRT), kunnen de oppervlakte wijziging GRFT om maximale topicale tijdens de gehele duur van de behandeling. Bovendien, de opneming van hydrofiele stoffen zoals eiwitten, door traditionele electrospinning methoden, kan resulteren in lagere inkapseling efficiëntie en verlies van eiwit activiteit50. Daarom kunnen GRFT oppervlak gemodificeerde vezels bieden een veelbelovende alternatieve leveringsmethode die alleen of in combinatie met electrospinning kan worden gebruikt ter verbetering van de bescherming tegen SOA-infectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding en fabricage van de steiger van de vezel Electrospun

Let op: alle werkzaamheden met oplosmiddelen of Polymeeroplossingen moet worden uitgevoerd in een chemische zuurkast . Verwijzen naar materiële veiligheid gegevensblad van elk reagens voordat het protocol.

  1. Naar electrospin een polymeeroplossing 3 mL 15% w/w PLGA, weeg 720 mg 50:50 poly (melkzuur-co-glycolic zuur) (PLGA; 0,55 tot 0,75 dL/g, 31-57 kDa) in een flesje van 10 mL scintillatie. Het volume van de oplossing is gebaseerd op de typische batch grootte gebruikt in huidige studies.
    Opmerking: De massa van het polymeer toe te voegen aan een bepaalde hoeveelheid oplosmiddel moet worden berekend door de eerste bepaling van de dichtheid van het oplosmiddel gebruikt te ontbinden van het polymeer. De dichtheid van het oplosmiddel Hexafluoro-2-propanol (HFIP) is 1,59 g/mL. Dus, het gewicht van het oplosmiddel, gebaseerd op een volume van 3,0 mL HFIP nodig, bedraagt 4,8 g (3,0 mL x 1,59 g / mL). Voor een 15% w/w-Fractie van PLGA naar HFIP, 720 mg PLGA moet worden toegevoegd aan 3,0 mL HFIP (0,15 x 4800 mg = 720 mg). Het voordeel van het gebruik van een % w/w/polymeeroplossing, in plaats van % w/v, is dat hierdoor een bepaald gewicht van de uiteindelijke oplossing. Deze gedefinieerde gewicht kunt nauwkeuriger oplosmiddel vervanging, in het geval van verdampend oplosmiddel tijdens stap 1.3.
  2. Aan de glazen Scintillatie ampul met PLGA (uit stap 1.1) 3.0 mL HFIP toevoegen met behulp van een precisiepipet serologische glas. Dekking van de flacon met plastic folie, dan meten en registreren van de flacon mass.
  3. Broeden de opschorting van de polymeer 's nachts bij 37 ° C om ervoor te zorgen volledige ontbinding van het polymeer. Als elk oplosmiddel verdampt, verminderen de flacon massa, HFIP toevoegen totdat de flacon bereikt haar oorspronkelijke massa in stap 1.2.
  4. Na een incubatieperiode van, het bereiden van het electrospinning apparaat ( Figuur 2). Hoewel een as van elke omvang kan worden gebruikt, hier een roterende 25 mm buitendiameter RVS as werd gebruikt als de collector.
    Opmerking: Een groter as diameter zal dalen de dikte van de vezel, gezien de dezelfde hoeveelheid electrospinning oplossing.
  5. De polymeeroplossing gecombineerd in een spuit met 3 mL.
  6. Een stomp 18-gauge, ½ inch naald tip verbinden met de spuit en afzien van de overtollige oplossing (meestal 0,25 mL) te verwijderen lege headspace de naald tip.
  7. Plaats van de spuit op een spuitpomp en het debiet instrument ingesteld op 2,0 mL/h.
    Opmerking: Dit debiet was eerder geoptimaliseerd op basis van polymeer viscositeit voor deze formulering.
  8. Verbinden met de krachtbron de naald van de spuit en electrospin de polymeeroplossing met behulp van een spanning van + 27 kV. De afstand tussen de naald en de verzamelaar moet worden ingesteld op ongeveer 25 cm ( Figuur 2 B).
    Let op: Het electrospinning-proces zorgt voor een oplosmiddel damp. Gebruik een zuurkast of een afgesloten apparaat ( Figuur 2) te verwijderen van de schadelijke damp .
  9. Zodra de hele oplossing electrospun is, uitschakelen van de krachtbron en laten van de as te draaien voor een extra 30 min te volledig verdampen oplosmiddel.
  10. Beurt uit de roterende as verzamelaar, en gebruik een scheermesje te snijden van de vezel van de as. Schil voorzichtig de vezel van de as van het mes kunt.
  11. De electrospun PLGA vezel in een gelabelde petrischaal verzamelen en plaatsen in een desiccatorovernight te verwijderen van de resterende oplosmiddel.

2. Oppervlakte-wijziging van vezels met GRFT

  1. voorbereiden oplossingen van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 2-(N-morfolino) ethanesulfonic zuur (MES buffer). PBS voor te bereiden door het oplossen van 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1,44 g nb 2 HPO 4 en 0,24 g KH 2 PO 4 in 1 L ultrazuiver water. Op dezelfde manier los 19.52 g MES (vrij zuur, MW 195,2) en 29.22 g NaCl in 1 L ultrazuiver water, te bereiden MES buffer. Zorgen voor de definitieve pH van elke oplossing is tussen 7.2-7.5 en 5.0-6.0, respectievelijk met behulp van een pH-meter.
  2. Bereiden individuele werkende oplossingen van EDC (2 mM) en NHS (5 mM).
    1. De EDG en de NHS verwijderen uit de vriezer en laten equilibreer tot kamertemperatuur voordat weging.
    2. Weeg 4 mg EDC in een tube van de microcentrifuge 1,5 mL.
    3. Weeg NHS in een ander microcentrifuge buis 6 mg.
    4. Add 1 mL MES buffer aan elke buis. Vortex beide buizen krachtig om ervoor te zorgen de reagentia worden volledig opgelost.
  3. Bereid een oplossing van hydroxylamine door weging van 70 mg in een conische centrifugebuis van 50 mL.
  4. Voeg toe 20 mL PBS aan de hydroxylamine en vortex te ontbinden.
  5. Massa uit een passend bedrag van PLGA vezel in een tube van 15 mL conische centrifuge. 75 mg van vezel wordt meestal gebruikt voor elke reactie partij.
  6. 8 mL MES buffer toevoegen aan de tube van 15 mL.
  7. Add 1 mL, elk van de oplossingen van het EDG en NHS eerder bereid om de buis. Het uiteindelijke volume van de oplossing moet 10 mL. De eindconcentraties van EDC en NHS moet 0.4 mg/mL en 0,6 mg/mL, respectievelijk.
  8. Dicht en verzegel de tube van 15 mL met plastic folie en plaats op een rotator zodat de oplossing moet voorzichtig worden omgekeerd gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur ( Figuur 3 B). Deze stap activeert de carboxylgroepen op het polymeer te voorzien van covalente modificatie met het eiwit GRFT ( Figuur 3 A).
  9. Na activering, zorgvuldig doven de reactie door 14 µL van β-mercaptoethanol toe te voegen aan de buis. Omkeren van de buis meerdere malen om ervoor te zorgen volledige mengen.
    Let op: β-mercaptoethanol is zeer giftig en mag alleen worden gebruikt in een chemische zuurkast.
  10. Verwijder het supernatant en spoel de vezel PLGA tweemaal, met 10 mL PBS, verwijderen van alle resterende β-mercaptoethanol.
  11. Toevoegen na het spoelen, een passend bedrag van de stockoplossing van GRFT aan de buis. Bijvoorbeeld, zou een 5 nmol GRFT/mg vezel 6.35 µL van GRFT stockoplossing (uit een voorraad van de 10 mg/mL) per mg vezel vereisen. Dus een steekproef van de vezel 75 mg zou vereisen 476.25 µL van 10 mg/mL stockoplossing van GRFT.
    Opmerking: GRFT vezels met theoretische belastingen van 0.05, 0.5 en 5 nmol GRFT per mg vezel werden gefabriceerd.
  12. Toevoegen van genoeg PBS om het eindvolume tot 8 mL, sluit en omkeren van de buis om ervoor te zorgen dat grondig mengen.
  13. Zegel van de buis met plastic folie en leg op een rotor opnieuw, dit keer voor 2 h.
  14. Na de 2 h incubatie, doven de reactie door toevoeging van 2 mL van hydroxylamine oplossing in de centrifugebuis 15 mL. Per de instructies van de fabrikant, dient de eindconcentratie van hydroxylamine tijdens het blussen reactie 0,7 mg/mL.
  15. Meng de oplossing goed en verwijder het supernatant. Spoel het oppervlak gemodificeerde PLGA vezel tweemaal met 10 mL ultrazuiver water te verwijderen van een unconjugated GRFT.
  16. Overbrengen in de vezel een petrischaal en de plaats in een exsiccator tot de vezel volledig droog is. De petrischaal overbrengen in 4 ° C voor opslag.

3. SEM karakterisatie van de oppervlakte van de GRFT gemodificeerde vezels

  1. plaats een strook van koolstof dubbelzijdige tape op een SEM specimen mount. De onderkant van de berg specimen van een label met de monster identificerende informatie met behulp van een permanent marker.
  2. Drie monsters uit één oppervlak gemodificeerde vezel te snijden en leg ze op aparte specimen mounts. De dikte van elk monster is ongeveer 0,5 mm.
  3. Sputter jas de monsters met behulp van elektron-geïnduceerde deeltjes depositie van een plaat van goud. Sputter jas voor 90 s, van 2,4 kV.
    Opmerking: De sputter vacht tijd kan variëren afhankelijk van de parameters van de apparatuur, met inbegrip van de spanning en stroomsterkte.
  4. Beeld van de monsters bij 8 kV met een vergroting variërend van 1.000 tot en met 5, 000 X.

4. Winning van GRFT van oppervlak gemodificeerde vezels

  1. massa uit vezels in drievoud in 1,5 mL microcentrifuge buizen 2 mg.
  2. 1 mL dimethylsulfoxide (DMSO) toevoegen aan de buis, vervolgens vortex en incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur te volledig het ontbinden van de vezel.
  3. Na incubatie, Verdun een hoeveelheid van 10 µL de oplossing van DMSO-vezel uit stap 4.2, ten minste 100-fold in Tris-EDTA (TE) buffer (pH = 8.0).
  4. Bewaren monsters bij-20 ° C tot laden karakterisering met ELISA.

5. Meten van GRFT desorptie van vezels

  1. te beoordelen van de hoeveelheid GRFT vrijgegeven of uit de vezel, gedesorbeerde Weeg 5-10 mg oppervlak gemodificeerde vezel en breng dit in een microcentrifuge buis. Opnemen van de massa van de vezels in elke buis.
  2. Voeg 1 mL van een geschikte oplossing die de fysiologische omgeving bootst (b.v., PBS, TE buffer, gesimuleerde vaginaal vocht (SVF), enz.) aan elk monster.
  3. Broeden de monsters gedurende 1 uur op een roterende shaker op 200 rpm, 37 ° C.
  4. Na incubatie, TE buffer met de gedesorbeerde GRFT uit de flacon en aliquot aan cluster verwijderen ongeveer 1 mL tubes. Opslag bij-20 ° C tot eiwit kwantificering.
  5. Overbrengen van het monster naar een nieuwe microcentrifuge-buis, voeg 1 mL verse bufferoplossing naar de fiber binnen de microcentrifuge buis en incubeer tot de volgende tijdstip.
  6. Typische tijd punten gebruikt voor het meten van release zijn onder meer: 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48, 72 h en 1 wk. te verwaarlozen desorptie in deze studies werd waargenomen na 4 h.

6. Kwantificering van GRFT extractie en desorptie via ELISA

  1. jas een 96-Wells-ELISA plaat met 0,1 mL HA (10 µg/mL) per putje zoals eerder beschreven 51. Afdichting van de plaat met plastic folie en na een nacht bebroeden bij 4 ° C ( Figuur 4).
  2. De buffer coating verwijderen en toevoegen van 0.3 mL blokkeerbuffer (2-3% bovien serumalbumine (BSA) in PBS met 0,05% Polysorbaat 20) aan elk putje. De plaat gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur incuberen.
  3. Na incubatie, spoel de plaat 3 keer met 1 x PBS met 0,1% Polysorbaat 20 (PBS-P). Na het spoelen, afzien 0,1 mL van het monster, standard of PBS als negatieve controle in de respectieve putten. De plaat opnieuw gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.
  4. Spoel de plaat weer 3 keer met PBS-P. Na het spoelen, Voeg 0,1 mL primair antilichaam (geit anti-GRFT antiserum) in elk putje en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur. Typisch, de oplossing van primair antilichaam wordt verdund door 1:10,000 in PBS.
  5. Nadat het broeden de monsters met primair antilichaam spoelen de platen weer 3 keer met PBS-P. Voeg 0,1 mL secundair antilichaam (horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd konijn anti-geit IgG) aan elk goed en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. De oplossing van secundair antilichaam wordt verdund door 1:10,000 in PBS.
  6. Wassen de plaat 3 keer. Voeg 0,1 mL TMB 2-peroxidase substraat toe aan elk putje. Monitor kleur ontwikkeling (ongeveer 2 min), dan toevoegen van 0,1 mL H 2 dus 4 (1 N) om quench de reactie. Lees plaat bij 450 nm op een afleesapparaat.
  7. Gemiddelde OD-waarden van de achtergrond (wells waaraan alleen PBS), en dit aftrekken van de experimentele groepen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Morfologie van de vezel heeft een significant effect op het vermogen van EFs oppervlak gemodificeerde bescherming te bieden tegen virussen. Hoewel electrospinning een handige en eenvoudige procedure is, niet-geoptimaliseerde polymeer formuleringen kunnen leiden tot onregelmatige vezel morfologie (Figuur 5B-C). Wijzigingen in electrospinning omstandigheden die leiden de vorming van kralen of amorfe mat-achtige morphologies tot, worden vaak veroorzaakt door oplosmiddel-polymeer onverenigbaarheid, lage polymeer viscositeit, debiet of andere voorwaarden van de electrospinning. De resulterende variaties in de structuur van de vezel kunnen resulteren in verschillende release profielen voor drug-opgenomen vezels of inconsistenties in de vervoeging werkzaamheid, veranderen de vezels kunnen fysisch of chemisch belemmeren virus penetratie. De PLGA EFs vervaardigd gebruikend de voorwaarden beschreven electrospinning moet leiden tot verschillende vezel morphologies met een diameter variërend tussen 1.5 en 2.8 µm (Figuur 6). Om te bepalen van de vezel morfologie en diameter, moeten EFs worden onderzocht met SEM vóór andere karakterisering of wijziging stappen.

SEM beelden van lege, 0,05, 0.5 en 5 nmol GRFT vezels toonde geen significante verschillen in vezel morfologie (Figuur 6A-D), die aangeeft dat GRFT wijziging geen invloed op de morfologie van de vezel heeft. Om te bepalen van de gemiddelde diameter van elke formulering van EF, een minimum van 50 willekeurige metingen werden genomen per gezichtsveld van de SEM-beelden. De gemiddelde diameter van de EF-formuleringen werden gemeten en berekend in ImageJ, zoals aangegeven in Figuur 6E. Alle EF formuleringen had soortgelijke gemiddelde diameters rond 1.9 µm, demonstreren de consistentie van ongewijzigde vezel Productie-procédé in batches.

Om te bepalen dat de hoeveelheid GRFT geconjugeerd met het EFs, werden EFs-GRFT ontbonden in DMSO, gevolgd door een 100-fold verdunning in TE de buffer, om GRFT uit de vezel. De hoeveelheid geconjugeerd per mg vezel GRFT werd gekwantificeerd aan de hand van ELISA. Voor elke wijziging dichtheid (0,05, 0.5 en 5 nmol GRFT per mg vezel), werden tien replicatieonderzoeken geëvalueerd. Voor de 5, 0,5 en 0,05 nmol GRFT/mg EF wijzigingen, had elke EF 373, 165, en 42 ng GRFT per mg EF, resulterend in vervoeging efficiëntie van 0,6, 4.2 en 6,9%, respectievelijk. Deze resultaten tonen aan dat GRFT-EFs geconjugeerd met hogere theoretische oppervlak-wijziging dichtheid, resulteren in meer GRFT geconjugeerd met de vezel (Figuur 7A). Er was echter een omgekeerde correlatie met de resulterende vervoeging efficiëntie29.

Om te beoordelen van de hoeveelheid GRFT covalent geconjugeerd met het oppervlak van de vezel ten opzichte van dat geadsorbeerd, werden GRFT-EFs geïncubeerd in SVF om te bepalen van de hoeveelheid GRFT uitgebracht. Binnen de eerste 4 uur, 113, 25 en 10 ng van GRFT per mg EF werd ontdekt in SVF voor de 5, 0,5 en 0,05 nmol theoretische wijziging concentraties, respectievelijk. Deze waarden komen overeen met 30%, 41% en 24% van de hoeveelheid GRFT geconjugeerd met 5, 0,5 en 0,05 nmol GRFT-EFs. Na 4 uur, werd te verwaarlozen GRFT ontdekt in het eluaat release voor alle drie formuleringen. GRFT vrijlating na 1, 2 en 4 uur is afgebeeld in Figuur 7B. Samen genomen, blijkt deze gegevens dat de meerderheid van GRFT covalent gebonden is aan de EFs, en dat de GRFT oppervlakte-geadsorbeerd wordt vrijgegeven binnen de eerste 4 uur.

Figure 1
Figuur 1: de morfologie van de situering van electrospun vezels. De vezels van de electrospun getoond werden vervaardigd gebruikend een 4 mm (cilinder) en 25 mm (blad) diameter as, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: apparatuur Electrospinning. (A) het verzamelen van de as waar de vloeibare jets van polymeer storten, en (B) de opstelling van volledige electrospinning. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: schematische van EF wijziging met GRFT met behulp van EDC-NHS chemie. (A) Carboxyl gegroepeerd op de PLGA EF reageren met de NHS in het bijzijn van EDC naar formulier amine-reactieve esters, zal die vervolgens stabiel amide obligaties met de primaire amines van GRFT vormen. (B) twee milligram vezel schijven of stukken zijn gesneden en geïncubeerd in 8 mL MES buffer met 2 mL EDC/NHS reagens en gedraaid voor 15 min. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Schematische illustratie van GRFT kwantificering met behulp van ELISA. Een 96-Wells-immunoplate is bekleed met gp120 of HA te vangen en te immobiliseren van GRFT. Primaire antilichamen tegen GRFT, secundaire antilichamen, gekoppeld aan mierikswortelperoxidase en ELISA substraat worden opeenvolgend toegevoegd aan het kwantificeren van de GRFT. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: effecten van oplosmiddelen keuze op PLGA EF morfologie. (A) de 15% w/w PLGA EFs in HFIP weergegeven wenselijk draad-achtige morfologie. (B) het 15% w/w PLGA EFs in chloroform en dimethylformamide, geen vorm als gevolg van niet-optimale oplosmiddel keuze of polymeer concentratie (viscositeit). (C) de 15% w/w en (D) 20% w/w PLGA EFs in TFE tonen het belang van polymeer viscositeit. Kralen gevormd in de formulering met lagere polymeer concentratie (C), terwijl de verhoging van de concentratie van polymeer (oplosmiddel viscositeit) resulteerde in welomschreven vezel morfologie (D). Opmerking, figuur 5B werd genomen bij een lagere vergroting te tonen van de mat-achtige morfologie. Schaal bars = 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: SEM beelden en vezel diameters van kale en GRFT gemodificeerde EFs. (A) kale PLGA EFs en PLGA EFs oppervlak-bewerkt met (B) 0,05 nmol, (C) 0,5 nmol, en (D) 5 nmol van GRFT per mg vezel. Schaal bars = 10 µm. (E) Diameters van ongewijzigde en GRFT-EFs. Foutbalken geven de gemiddelde ± SEM. Geen statistische verschil werd waargenomen tussen de diameters van ongewijzigde en GRFT gemodificeerde vezels. Figuur 6 E is aangepast van bruidsparen et al. 29 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 7
Figuur 7 : GRFT hoeveelheid geconjugeerd met en uit GRFT gemodificeerde EF gedesorbeerde. (A) de hoeveelheid GRFT geconjugeerd met elke mg van de verhogingen van de vezel van de EF met verhoogde GRFT reactieve concentratie. ()B) de hoeveelheid GRFT vrijgelaten uit elke vezel mg wordt weergegeven voor de 0,05, 0.5 en 5 nmol formuleringen na een incubatieperiode van 1, 2 en 4 uur in SVF. Foutbalken geven de gemiddelde ± SEM. Dit percentage is aangepast van bruidsparen et al. 29 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Als gevolg van hun poreuze structuur en een groot oppervlak, hebben EFs gevonden een scala aan toepassingen in de gezondheidszorg, waarvan er één portie als therapeutische leverende voertuigen omvat. Drugs en andere actieve stoffen kunnen worden opgenomen binnen EFs voor afstembare levering, terwijl biologics en chemische liganden kunnen worden geconjugeerd met het oppervlak van de vezel voor cel-specifieke targeting52 of biosensing53. Hier gemodificeerde de fabricage van GRFT oppervlak PLGA EFs, zoals een steiger van de levering te voorkomen van HIV-infectie, is beschreven. GRFT-EFs werden gesynthetiseerd door electrospinning, die bieden de voordelen van lage kosten en hoge productieomvang ten opzichte van andere vezels productie methoden49,53.

Kritische stappen in het Protocol
De vorming van EFs is kritisch afhankelijk van de eigenschappen van polymeeroplossing, in het bijzonder de oplossing of oplosmiddel viscositeit54. De factoren die invloed hebben op de viscositeit van een polymeeroplossing omvatten polymeer moleculair gewicht polymeer concentratie en het type oplosmiddel gebruikt. De oplossing of oplosmiddel viscositeit is meestal aangepast door het veranderen van de verhouding van het polymeer naar oplosmiddel, te verkrijgen van de gewenste polymeer-concentratie. Met elke fabricage, moet het volume worden gehandhaafd tijdens nachtelijke incubatie te handhaven van de juiste verhouding van de polymeer-naar-solvent (viscositeit). Bij voldoende hoge polymeer concentratie verstrikt de polymeermoleculen in de oplossing tijdens het electrospinning-proces voor de productie van vezels. Tijdens het electrospinning, een kraal zullen vormen aan het uiteinde van de spinneret en als er voldoende polymeer entanglement, vloeibare jets zal losbarsten vanaf dit punt met een spanning van kritische en versnellen in zweep-achtige manier naar de verzamelen as55. Verdampend oplosmiddel zal vervolgens leiden tot jet uitdunnen, draden van vezel produceren als ze op de zeefbodem as storten. Zodra gesynthetiseerd, moeten de EFs door SEM om te controleren of de juiste morfologie en consistente vezel diameter worden geanalyseerd. De aanwezigheid van beaded EFs kan het resultaat van lage oplossing viscositeit56, buitengewoon hoge toegepaste spanning57, polymeer feed tarief58, of een combinatie van alle drie factoren. Indien dit wordt waargenomen, polymeer concentratie moet worden verhoogd en de toegepaste spanning en verwerkingsdebiet moeten worden aangepast, om te bereiken vezel-achtige morfologie.

Om een conjugaat eiwitten aan het oppervlak van de EF, waren PLGA carboxylgroepen hier gereageerd met behulp van EDC-NHS carbodiimide crosslinking chemie59. Tijdens het proces van wijziging, worden de vezels kort geïncubeerd met EDC in aanwezigheid van de NHS, wat in de omzetting van carboxylates in semi-stabiele, amine-reactieve esters resulteert. Tijdens het proces van twee stappen Woordherkomst en-opbouw is het essentieel dat de buffers gebruikt tijdens elke stap de optimale pH hebben, genoteerd in de instructies van de fabrikant, maximale vervoeging efficiëntie te waarborgen. De halfwaardetijd van NHS esters varieert van vier tot vijf uur bij een neutrale pH en drastisch afneemt in de meer fundamentele voorwaarden60. Dus, de eerste reactie moet worden uitgevoerd in MES buffer met een pH van 5-6 en de geactiveerde vezels moeten vervolgens worden overgedragen naar een PBS-buffer (pH 7,2-7,5) voor latere en onmiddellijke reactie met GRFT. Het is ook belangrijk dat EDC geïnactiveerd door toevoeging van 2-mercaptoethanol en voldoende gespoeld uit de vezels na carboxylaat activeren. Dit zal helpen voorkomen dat eiwit activering door EDC en zelf-crosslinking tijdens de tweede reactie, die vervoeging efficiëntie kan verminderen.

Wijzigingen en probleemoplossing
Hoewel onze eerdere werk aangetoond de werkzaamheid van een verscheidenheid van GRFT gemodificeerde vezels tegen HIV-1 infectie, bepaalde proces aanpassingen kunnen worden beschouwd voor het aanpassen van EF morfologie of ter verbetering van de GRFT (of andere eiwit) vervoeging efficiëntie of glasvezel opbrengst29. In het bijzonder, kan de oppervlakte van de EF worden verhoogd door het verlagen van de vezel diameter, zodat een grotere oppervlakte voor Woordherkomst en-opbouw. Eerdere studies hebben aangetoond dat vermindering van de concentratie van het polymeer en viscositeit kleinere vezel diameter61,62 produceert. Deze aanpak wordt echter beperkt door de vorming van beaded vezels als de concentratie beneden de drempelwaarde. Als u wilt verkorten vezel diameter zonder te wijzigen van de viscositeit van de oplossing, dual-solvent systemen kunnen worden gebruikt ter vermindering van de oppervlaktespanning, of zouten kunnen worden toegevoegd aan het verhogen van56,57van de geleidbaarheid van de oplossing. Beide methoden kunnen grotere oprekken van de electrospinning-jets die kleinere diameter van de vezel kunnen produceren. Daarnaast kunnen lager molecuulgewicht polymeren worden gebruikt om te fabriceren van kleinere diameter vezels. Afnemende vezel diameter biedt ook het voordeel van het genereren van de kleinere poriën, potentieel doeltreffender EFs als een barrière te virus penetratie, voor microbiciden gebaseerde toepassingen63. Tot slot werd naar voren gebracht dat de vochtigheid EF opbrengst kan beïnvloeden. Bij hogere luchtvochtigheid neigt de opbrengst te verminderen door de vorming van vezels met ongewone macro-morfologie. Installatie van een controlesysteem van de vochtigheid in de vergaderzaal van de electrospinning kan daarom vergemakkelijken EFs produceren met consistente rendementen, als dit een uitdaging aan de fabricage.

Ter verbetering van GRFT vervoeging efficiëntie, kan onderzoek naar de selectie en de locatie van functionalizable groepen ook worden overwogen. Bijvoorbeeld, als de primaire amines van de proteïne van belang zich in de buurt van het interieur van de driedimensionale eiwitstructuur bevinden, sterische hinder kan verhinderen dat geactiveerde carboxylgroepen over EFs interactie met primaire amines, daardoor verminderend de waarschijnlijkheid van de reactie. Deze uitdaging kan worden overwonnen door aminozuur vervanging van het eiwit voor het genereren van een primair amine-groep dichter aan de oppervlakte van het eiwit. Echter, zoals GRFT en andere eiwitten zijn afhankelijk van de specifieke activiteit van haar bandplaatsen voor functionaliteit, wijzigingen in eiwit conformatie moeten worden grondig getest in functionele testen voorafgaand aan de vervoeging.

Beperkingen
Een belangrijke beperking van GRFT oppervlakte modificatie is het potentieel voor lage vervoeging efficiëntie met behulp van carbodiimide crosslinking chemie. Als de antivirale proteïne van belang een hoge IC50heeft een lage vervoeging efficiëntie kan niet voldoende bescherming bieden (in deze toepassingen) tegen virusbesmetting. Echter, voor GRFT (of andere bewerkt) EFs, eiwitten en actieve stoffen die niet covalent gebonden aanEFs kunnen nog adsorberen aan de oppervlakte. Deze geadsorbeerde agenten bieden mogelijkheden als aanvulling op de activiteiten van geconjugeerd GRFT, Transient doordat de gelokaliseerde concentratie beschikbaar voor de binding van het virus. In dit voorbeeld kan de gedesorbeerde GRFT binden aan HIV-1-virionen die doen geen rechtstreeks contact op met EFs, en kunnen een alternatief mechanisme van bescherming met de eerste 4 uur van administratie (pericoital). Dus kan zowel geconjugeerd en oppervlakte-geadsorbeerde GRFT bijdragen aan een uniforme bescherming tegen SOA's.

Ondanks de bescherming die wordt geboden van eiwit-vervoeging zowel desorptie, zou andere strategieën van de oppervlak-wijziging met potentieel hoger rendement worden nagestreefd. PLGA beëindigd met amines in plaats van carboxylgroepen kan bijvoorbeeld worden gebruikt om het geconjugeerde geactiveerde GRFT. Een andere strategie van de oppervlak-wijziging kan als alternatief worden gebruikt om het EF-eiwit-vervoeging efficiëntie. Nanofibrous membranen samengesteld van EFs hebben matiemaatschappij is met avidin via carbodiimide crosslinking chemie64. Biotinylation of toevoeging van een Strep-tag (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) via recombinatie kan inschakelen de gemodificeerd eiwit aan formulier sterk en uiterst stabiele niet-covalente interactie met avidin EFs. Hoewel niet-covalente, is de koppeling van de avidin-Biotine de sterkste niet-covalente binding, met femtomolar affiniteit, waarschijnlijk wat resulteert in stabiele vervoeging aan de oppervlakte van de vezel. Voor elk oppervlak-wijziging strategieën, sterische hinder moet worden beschouwd als conjugatie efficiëntie maximaliseren.

Tot slot, wij voorzien dat oppervlak gemodificeerde EFs een alternatieve strategie te actieve agens inkapseling te verstrekken aanvullende vormen van bescherming zal bieden. Een overweging met het combineren van inkapselen en oppervlakte-wijziging technologieën op een enkel EF-platform zal het verminderen van de voortijdige vrijlating van actieve stoffen tijdens het oppervlak-wijziging. Voor oppervlakte-wijziging reacties die relatief lange incubatietijd in waterige oplossing vereisen, zou een aanzienlijk percentage van de actieve stoffen geladen verloren als gevolg van polymeer hydrolyse.

Betekenis van de methode met betrekking tot bestaande en alternatieve methoden
In vorige werk vastgesteld we hebben dat ongewijzigde leeg EFs konden voor de remming van HIV-infectie met ~ 38% wanneer geplaatst in een transwell invoegen boven infectible cellen29. Deze observatie in combinatie met de biocompatibiliteit, web-achtige microstructuur en tortuosity van EFs, parallel met de waargenomen krachtige antivirale en adhesieve eigenschappen van GRFT, gevraagd of u de ontwikkeling van het oppervlak gemodificeerde EFs hier beschreven.

Ten opzichte van andere technologieën van de levering momenteel werkzaam in microbicide toepassingen, EFs hebben een breed scala van mogelijke toepassingen als gevolg van hun architectuur en de capaciteit voor aanpassing. In ander werk, de vezelige morfologie van EFs heeft hen in staat stelde om te leveren-actieve stoffen, en om na te bootsen de ECM, waardoor ze geschikt steigers voor weefselengineering. EFs geweest ook oppervlak-gewijzigd ter verbetering van de biocompatibiliteit en verbeteren van de duurzame-release65,,66.

Wilt verbeteren biocompatibiliteit of leveren van agenten die functie door middel van specifieke bindende activiteit, tal van methoden bestaan die toestaan voor de bevestiging van verbindingen op de oppervlakken van EFs zoals plasma behandelingen, natte chemische methoden en oppervlakte graft polymerisaties50. In het geval van GRFT die specifiek binden aan de virale glycoproteïnen van HIV-1, is de natte chemische methode van EDC-NHS de meest optimale als gevolg van de mogelijkheid om te penetreren vezels diep binnen het net ook behoud GRFT functionaliteit50. GRFT geïmmobiliseerd EFS kan vervolgens worden geleverd in een duurzaam formulering aan de FRT en bieden directe bescherming tegen HIV-infectie.

Covalente vervoeging biedt ten opzichte van de bestaande strategie van het encapsulating therapeutics binnen EFs voor de remming van SOA's, het verschillende voordeel van het verhogen van de potentiële avidity tussen GRFT en HIV virionen. Door immobilizing GRFT EFS door oppervlakte-wijziging, worden uiterst gelokaliseerde concentraties van GRFT bereikt, die de mogelijkheid voor multivalent binding met HIV doen toenemen. Daarnaast kan EF-geïmmobiliseerd GRFT, ten opzichte van gratis GRFT in oplossing, de uitputting van het GRFT zwembad voorkomen door het belemmeren van de internalisering van de cel. Bovendien, als gevolg van de unieke werkingsmechanisme van GRFT als een stabiele en zelfklevende post-inhibitor, covalente oppervlakte vervoeging kunt oppervlak gemodificeerde EFs te verstrekken een fysieke barrière te virus penetratie, naast krachtige antivirale eigenschappen.

Toekomstige toepassingen van deze methode
Het gebruik van oppervlakte-wijziging voor levering biedt de mogelijkheid te integreren meerdere actieve agenten binnen een enkel EF-platform. In de toekomst, streven we naar het ontwikkelen van een multifunctionele technologie (MPT) waar een scala aan actieve stoffen kan worden ingekapseld binnen en geconjugeerd met EFs. Deze MPTs kunnen worden ontworpen om het verlenen van bescherming tegen een breder scala van ziekteverwekkers door therapeutics met verschillende mechanismen van actie op te nemen. Door gebruik te maken van zowel het oppervlak en het interieur van EFs te leveren-actieve stoffen met verschillende vormen van actie, zal het potentieel van EFs te beschermen tegen virusinfectie worden gemaximaliseerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij zijn dankbaar aan het joodse erfgoed Fonds voor uitmuntendheid voor financiering van dit onderzoek. Wij danken Dr. Stuart Williams II royaal voorzien van gebruik van het electrospinning-systeem. Wij danken ook Dr. Kenneth Palmer voor ons te voorzien van Griffithsin. Daarnaast danken we Dr. Nobuyuki Matoba en zijn lab voor opleiding die ons in de GRFT ELISA werken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottlieb, S. L., et al. Toward global prevention of sexually transmitted infections (STIs): the need for STI vaccines. Vaccine. 32, 1527-1535 (2014).
  2. Fact sheet November 2016. , Available from: http://www.unaids.org/en/resources/fact-sheet (2016).
  3. Freeman, E. E., et al. Herpes simplex virus 2 infection increases HIV acquisition in men and women: systematic review and meta-analysis of longitudinal studies. AIDS. 20, 73-83 (2006).
  4. Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29, 1989-2006 (2008).
  5. Jiang, T., Carbone, E. J., Lo, K. W. H., Laurencin, C. T. Electrospinning of polymer nanofibers for tissue regeneration. Prog Polym Sci. 46, 1-24 (2015).
  6. Hu, X., et al. Electrospinning of polymeric nanofibers for drug delivery applications. J. Control. Release. 185, 12-21 (2014).
  7. Huang, Z. M., Zhang, Y. Z., Kotaki, M., Ramakrishna, S. A review on polymer nanofibers by electrospinning and their applications in nanocomposites. Compos Sci Technol. 63, 2223-2253 (2003).
  8. Son, Y. J., Kim, W. J., Yoo, H. S. Therapeutic applications of electrospun nanofibers for drug delivery systems. Arch. Pharmacal Res. 37, 69-78 (2014).
  9. Ji, W., et al. Bioactive electrospun scaffolds delivering growth factors and genes for tissue engineering applications. Pharm. Res. 28, 1259-1272 (2011).
  10. Blakney, A. K., Ball, C., Krogstad, E. A., Woodrow, K. A. Electrospun fibers for vaginal anti-HIV drug delivery. Antiviral Res. 100, Suppl 9-16 (2013).
  11. Huang, C., et al. Electrospun cellulose acetate phthalate fibers for semen induced anti-HIV vaginal drug delivery. Biomaterials. 33, 962-969 (2012).
  12. Ball, C., Krogstad, E., Chaowanachan, T., Woodrow, K. A. Drug-eluting fibers for HIV-1 inhibition and contraception. PLoS One. 7, 49792 (2012).
  13. Yohe, S. T., Colson, Y. L., Grinstaff, M. W. Superhydrophobic materials for tunable drug release: using displacement of air to control delivery rates. J. Am. Chem. Soc. 134, 2016-2019 (2012).
  14. Aniagyei, S. E., et al. Evaluation of poly(lactic-co-glycolic acid) and poly(dl-lactide-co-epsilon-caprolactone) electrospun fibers for the treatment of HSV-2 infection. Mater. Sci. Eng. C Mater. Biol. Appl. 72, 238-251 (2017).
  15. Huang, C., et al. Electrospun polystyrene fibers for HIV entrapment. Polym. Advan. Technol. 25, 827-834 (2014).
  16. Carson, D., Jiang, Y., Woodrow, K. A. Tunable Release of Multiclass Anti-HIV Drugs that are Water-Soluble and Loaded at High Drug Content in Polyester Blended Electrospun Fibers. Pharm. Res. 33, 125-136 (2016).
  17. Chou, S. F., Carson, D., Woodrow, K. A. Current strategies for sustaining drug release from electrospun nanofibers. J. Control. Release. 220, 584-591 (2015).
  18. Ball, C., Woodrow, K. A. Electrospun solid dispersions of Maraviroc for rapid intravaginal preexposure prophylaxis of HIV. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4855-4865 (2014).
  19. Blakney, A. K., Krogstad, E. A., Jiang, Y. H., Woodrow, K. A. Delivery of multipurpose prevention drug combinations from electrospun nanofibers using composite microarchitectures. Int. J. Nanomedicine. 9, 2967-2978 (2014).
  20. Li, C. M., Vepari, C., Jin, H. J., Kim, H. J., Kaplan, D. L. Electrospun silk-BMP-2 scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27, 3115-3124 (2006).
  21. Cai, S., Xu, H., Jiang, Q., Yang, Y. Novel 3D electrospun scaffolds with fibers oriented randomly and evenly in three dimensions to closely mimic the unique architectures of extracellular matrices in soft tissues: fabrication and mechanism study. Langmuir. 29, 2311-2318 (2013).
  22. Li, M. Y., et al. Electrospun protein fibers as matrices for tissue engineering. Biomaterials. 26, 5999-6008 (2005).
  23. Cui, W., Zhou, Y., Chang, J. Electrospun nanofibrous materials for tissue engineering and drug delivery. Sci. Technol. Adv. Mater. 11, 014108 (2010).
  24. Zahedi, P., Rezaeian, I., Ranaei-Siadat, S. O., Jafari, S. H., Supaphol, P. A review on wound dressings with an emphasis on electrospun nanofibrous polymeric bandages. Polym. Advan. Technol. 21, 77-95 (2010).
  25. Vaidya, P., Grove, T., Edgar, K. J., Goldstein, A. S. Surface grafting of chitosan shell, polycaprolactone core fiber meshes to confer bioactivity. J Bioact Compat Pol. 30, 258-274 (2015).
  26. Rim, N. G., et al. Mussel-inspired surface modification of poly(L-lactide) electrospun fibers for modulation of osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. Colloid Surface B. 91, 189-197 (2012).
  27. Yao, C., Li, X. S., Neoh, K. G., Shi, Z. L., Kang, E. T. Surface modification and antibacterial activity of electrospun polyurethane fibrous membranes with quaternary ammonium moieties. J Membrane Sci. 320, 259-267 (2008).
  28. Kangwansupamonkon, W., Tiewtrakoonwat, W., Supaphol, P., Kiatkamjornwong, S. Surface Modification of Electrospun Chitosan Nanofibrous Mats for Antibacterial Activity. J Appl Polym Sci. 131, (2014).
  29. Grooms, T. N., et al. Griffithsin-Modified Electrospun Fibers as a Delivery Scaffold To Prevent HIV Infection. Antimicrob. Agents Chemother. 60, 6518-6531 (2016).
  30. Emau, P., et al. Griffithsin, a potent HIV entry inhibitor, is an excellent candidate for anti-HIV microbicide. J. Med. Primatol. 36, 244-253 (2007).
  31. Meuleman, P., et al. Griffithsin has antiviral activity against hepatitis C virus. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5159-5167 (2011).
  32. Nixon, B., et al. Griffithsin protects mice from genital herpes by preventing cell-to-cell spread. J. Virol. 87, 6257-6269 (2013).
  33. O'Keefe, B. R., et al. Broad-spectrum in vitro activity and in vivo efficacy of the antiviral protein griffithsin against emerging viruses of the family Coronaviridae. J. Virol. 84, 2511-2521 (2010).
  34. Ishag, H. Z., et al. Griffithsin inhibits Japanese encephalitis virus infection in vitro and in vivo. Arch. Virol. 158, 349-358 (2013).
  35. Ferir, G., et al. Combinations of griffithsin with other carbohydrate-binding agents demonstrate superior activity against HIV Type 1, HIV Type 2, and selected carbohydrate-binding agent-resistant HIV Type 1 strains. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 28, 1513-1523 (2012).
  36. Xue, J., et al. The Griffithsin Dimer Is Required for High-Potency Inhibition of HIV-1: Evidence for Manipulation of the Structure of gp120 as Part of the Griffithsin Dimer Mechanism. Antimicrob Agents Ch. 57, 3976-3989 (2013).
  37. Kouokam, J. C., et al. Investigation of griffithsin's interactions with human cells confirms its outstanding safety and efficacy profile as a microbicide candidate. PLoS One. 6, 22635 (2011).
  38. Moulaei, T., et al. Monomerization of viral entry inhibitor griffithsin elucidates the relationship between multivalent binding to carbohydrates and anti-HIV activity. Structure. 18, 1104-1115 (2010).
  39. Barton, C., et al. Activity of and effect of subcutaneous treatment with the broad-spectrum antiviral lectin griffithsin in two laboratory rodent models. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 120-127 (2014).
  40. Mori, T., et al. Isolation and characterization of griffithsin, a novel HIV-inactivating protein, from the red alga Griffithsia sp. J. Biol. Chem. 280, 9345-9353 (2005).
  41. Ziolkowska, N. E., et al. Domain-swapped structure of the potent antiviral protein griffithsin and its mode of carbohydrate binding. Structure. 14, 1127-1135 (2006).
  42. Ziolkowska, N. E., et al. Crystallographic, thermodynamic, and molecular modeling studies of the mode of binding of oligosaccharides to the potent antiviral protein griffithsin. Proteins. 67, 661-670 (2007).
  43. O'Keefe, B. R., et al. Scaleable manufacture of HIV-1 entry inhibitor griffithsin and validation of its safety and efficacy as a topical microbicide component. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 6099-6104 (2009).
  44. Ferir, G., Palmer, K. E., Schols, D. Synergistic activity profile of griffithsin in combination with tenofovir, maraviroc and enfuvirtide against HIV-1 clade C. Virology. 417, 253-258 (2011).
  45. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hanes, J. Mucus-penetrating nanoparticles for drug and gene delivery to mucosal tissues. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 158-171 (2009).
  46. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Hida, K., Cone, R., Hanes, J. Nanoparticles reveal that human cervicovaginal mucus is riddled with pores larger than viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 598-603 (2010).
  47. Lai, S. K., Wang, Y. Y., Wirtz, D., Hanes, J. Micro- and macrorheology of mucus. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 86-100 (2009).
  48. Gentile, P., Chiono, V., Carmagnola, I., Hatton, P. V. An Overview of Poly(lactic-co-glycolic) Acid (PLGA)-Based Biomaterials for Bone Tissue Engineering. Int J Mol Sci. 15, 3640-3659 (2014).
  49. Repanas, A., Andriopoulou, S., Glasmacher, B. The significance of electrospinning as a method to create fibrous scaffolds for biomedical engineering and drug delivery applications. J Drug Deliv Sci Tec. 31, 137-146 (2016).
  50. Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 1033-1042 (2009).
  51. Barton, C., Kouokam, J. C., Hurst, H., Palmer, K. E. Pharmacokinetics of the Antiviral Lectin Griffithsin Administered by Different Routes Indicates Multiple Potential Uses. Viruses. 8, (2016).
  52. Sawicka, K., Gouma, P., Simon, S. Electrospun biocomposite nanofibers for urea biosensing. Sensor Actuat B-Chem. 108, 585-588 (2005).
  53. Ramakrishna, S., et al. Electrospun nanofibers: solving global issues. Mater Today. 9, 40-50 (2006).
  54. Liu, X., et al. Electrospinnability of Poly Lactic-co-glycolic Acid (PLGA): the Role of Solvent Type and Solvent Composition. Pharm. Res. 34, 738-749 (2017).
  55. Bhardwaj, N., Kundu, S. C. Electrospinning: A fascinating fiber fabrication technique. Biotechnol Adv. 28, 325-347 (2010).
  56. Fong, H., Chun, I., Reneker, D. H. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40, 4585-4592 (1999).
  57. Zong, X. H., et al. Structure and process relationship of electrospun bioabsorbable nanofiber membranes. Polymer. 43, 4403-4412 (2002).
  58. Rodoplu, D., Mutlu, M. Effects of Electrospinning Setup and Process Parameters on Nanofiber Morphology Intended for the Modification of Quartz Crystal Microbalance Surfaces. J Eng Fiber Fabr. 7, 118-123 (2012).
  59. Grabarek, Z., Gergely, J. Zero-Length Crosslinking Procedure with the Use of Active Esters. Anal Biochem. 185, 131-135 (1990).
  60. Staros, J. V., Wright, R. W., Swingle, D. M. Enhancement by N-Hydroxysulfosuccinimide of Water-Soluble Carbodiimide-Mediated Coupling Reactions. Anal Biochem. 156, 220-222 (1986).
  61. Tan, S. H., Inai, R., Kotaki, M., Ramakrishna, S. Systematic parameter study for ultra-fine fiber fabrication via electrospinning process. Polymer. 46, 6128-6134 (2005).
  62. Spasova, M., Stoilova, O., Manolova, N., Rashkov, I., Altankov, G. Preparation of PLLA/PEG Nanofibers by Electrospinning and Potential Applications. J Bioact Compat Pol. 22, 62-76 (2007).
  63. Boland, E. D., et al. Electrospinning polydioxanone for biomedical applications. Acta Biomater. 1, 115-123 (2005).
  64. Senecal, A., Magnone, J., Marek, P., Senecal, K. Development of functional nanofibrous membrane assemblies towards biological sensing. React Funct Polym. 68, 1429-1434 (2008).
  65. Zhang, Y. Z., Venugopal, J., Huang, Z. M., Lim, C. T., Ramakrishna, S. Characterization of the surface biocompatibility of the electrospun PCL-collagen nanofibers using fibroblasts. Biomacromolecules. 6, 2583-2589 (2005).
  66. Gupta, D., Venugopal, J., Mitra, S., Giri Dev, V. R., Ramakrishna, S. Nanostructured biocomposite substrates by electrospinning and electrospraying for the mineralization of osteoblasts. Biomaterials. 30, 2085-2094 (2009).

Tags

Bioengineering kwestie 128 Electrospun vezels seksueel overdraagbare infecties humaan immunodeficiëntie virus oppervlakte-wijziging microbiciden Griffithsin poly (melkzuur-co-glycolic zuur)
Fabricage en karakterisering van de vezel Griffithsin gemodificeerde steigers voor preventie van seksueel overdraagbare infecties
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vuong, H. R., Tyo, K. M.,… More

Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter