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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

作製と評価 Griffithsin 変更繊維足場の防止のため性的感染

Published: October 31, 2017 doi: 10.3791/56492
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3,4,5
1Department of Chemistry, University of Louisville, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Louisville, 3Center for Predictive Medicine, University of Louisville, 4Department of Microbiology and Immunology, University of Louisville, 5Department of Bioengineering, University of Louisville
* These authors contributed equally

Summary

この原稿を作製し、ひと免疫不全ウイルス 1 型感染に対して強力な接着剤や抗ウイルス活性を示す Griffithsin 変更ポリ (乳酸グリコール酸) 電極として繊維を特徴付けるプロシージャを記述します。生体外で。合成に使用するメソッド表面変更、共役, 結果として得られる形態の特徴し、繊維の表面改質から Griffithsin の脱離が記載されています。

Abstract

エレクトロスピニング繊維 (EFs) は、様々 な治療上のアプリケーションで広く使用されています。しかし、彼らが感染症 (性感染症) の予防と性的治療技術として適用ばかりされています。さらに、EF の多くの技術は、biofunctionality を付与する表面を基準にして、アクティブなエージェントをカプセル化に焦点を当てます。ここを作製し、表面 - poly(lactic-co-glycolic) 酸 (PLGA) エレクトロスピニング繊維、強力な抗ウイルス レクチン Griffithsin (GRFT) を変更する方法を記述します。PLGA は、その優れた化学と生体適合性の特性のための薬剤投与で広く使用されている FDA が承認したポリマーです。GRFT は、強力な自然とひと免疫不全ウイルス タイプ 1 (HIV-1) を含む多数のウィルスに対して広範な活動を所有している安全なレクチンです。組み合わせることで、繊維の GRFT 変更は体外の HIV-1 の強力な不活化を実証しています。この原稿は、製造するために、EFs の GRFT 変更を特徴付ける方法を説明します。まず、PLGA はエレクトロスピニング繊維足場を作成します。繊維は、その後表面改質 1 を使用して GRFT-エチル - 3-(3-dimethylaminopropyl) カルボジイミド (EDC) と N ヒドロキシスクシンイミド (NHS) 化学。走査電子顕微鏡 (SEM) は、サイズと表面改質した製剤の形態を評価するために使用されました。また、gp120 やヘマグルチニン (HA)-ベース ELISA は、共役 GRFT として GRFT 脱繊維表面の量を定量化するされることがあります。このプロトコルは、異なった蛋白質の様々 な表面改質は、ファイバーを作製するより広く適用できます。

Introduction

局所配信プラットフォームとして EFs の使用には、性感染症を大幅に削減する可能性があります。現在、hiv 感染者の報告された 2015年だけ1,2の以上 200 万の新しい症例以上 3600 万の人々 があります。さらに、単純ヘルペス ウイルス 2 (HSV-2) 感染影響何百もの世界中の人々 の何百万人を入力し、2-5 倍3によって HIV の買収を強化するのに示されています。HSV-2 感染症および HIV 取得の関係、ため複数性感染症に対する保護を同時新規の活性剤の開発に重要な関心があります。さらに、これらの抗ウイルス剤の配信を改善するために新しい車の開発は、予防・治療の効力を強化する可能性を提供しています。この目標に向かって HIV 1 と hsv-2 感染症の有病率を削減する新しい配信プラットフォームとして EFs を調べた。

過去 20 年間、EFs は薬剤配達および組織エンジニア リングの4分野で広く使用されています。多くの場合、簡単に治療への応用に翻訳する生体適合性ポリマーが選択されます。高分子 EFs を作製するには、有機溶剤、水性溶液、高分子の疎水性5の程度に応じてに選択したポリマーを溶解しています。関心の活性剤、静電紡糸プロセスの前に溶剤または水のソリューションに追加されます。高分子溶液は、注射器に吸引、電気電流を受ける一方ゆっくりと放出されます。このプロセスは通常ポリマー繊維シートまたは円筒状の破面観察 (図 1)、繊維径マイクロ ・ ナノスケール6に至るとの結果します。最も治療用活性剤は紡糸プロセス中に繊維内に組み込まれているし、拡散とその後繊維分解を介して繊維から解放されます。ポリマーの種類を使用しての劣化や解放の率を変更ことがありますまたはポリマーのユニークな化学的および物理的特性7を授受し、事実上すべてのカプセル化を推進、望ましいリリース プロファイルを確立するブレンド化合物。など、EFs は小分子薬および生物学的製剤のタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、成長因子6,8,9などの配信に有益な証明しています。

EFs は、STI 予防のフィールドに組み込む、または誘引可能な - の徐放性抗ウイルス剤10、11,12,13,14 を提供する最近使用されてしまった ,,1516,17,18,19。初期の研究のひとつで、pH 応答性繊維は HIV 111に対する保護のオンデマンド方式として (FRT)、女性の生殖器官内で環境の変化に対応した活性剤を解放するために開発されました。以来、他の研究は、ポリエチレンオキシド (PEO) とポリ-L-乳酸 (PLLA)、抗ウイルス、避妊剤、HIV 1 予防や避妊体外用の可変のリリースを評価するから成るポリマー ブレンドを検討しました。12. 追加の研究は、次を提供するために EFs の可能性を実証した: 低分子抗ウイルス剤14, 強力なリリースと柔軟な機械的性質20、3 D 配信アーキテクチャ21 を延長、精子侵入12と他配信技術13とをマージする機能の抑制。最後に、前作は、HIV-114や HSV-2 一般的な co-infective ウイルスに対する抗ウイルス剤の持続的な配達のための高分子繊維を評価しています。本研究ではポリマー繊維は、1 ヶ月のために構造を維持し、ウイルス エントリへの物理的な障壁を提供することによって抗ウイルス配信を補完する活動を提供しました。これらの結果から両方の物理的および化学的にウイルス感染を妨げるに EFs を使用できるということがわかった。

可変リリース プロパティする高分子 EFs が殺菌剤の配達のための魅力的な配信プラットフォーム、EFs は表面改質した足場7として機能する他のアプリケーションで開発されています。EFs は、しばしば細胞再生22を向上させ、組織工学23,24でのユーティリティを足場として細胞外のマトリックス (ECM) の形態を模倣するために使用されています。ポリ-ε-カプロラクトン (PCL) 等の高分子から成る繊維とポリ乳酸をされている成長因子および蛋白質の表面修飾エレクトロスピニング後増加の細胞接着と増殖の25を含む ECM のような性質を与える,26します。 特定の病原細菌27,28の成長を防ぐために抗菌表面改質した EFs が評価されたさらに。この汎用性と生物学的作用を誘導する能力のため EF 技術はさまざまな多機械論的機能を提供するフィールドを展開し続けます。そのユーティリティ アプリケーションの多様性にもかかわらずまだ、殺菌剤フィールド29で繊維の表面改質が最近検討されています。

予防し、感染症を治療する新しい配信技術の開発と並行して、生物学的治療薬が開発されています。殺菌剤の最も有望な候補者は、接着剤の抗レクチン、GRFT30があります。紅藻の種から派生した当初、GRFT は HIV、HSV-2、SARS の強力な阻害剤としての活性を示しているだけでなく、C 型肝炎ウイルス31,32,33,34,35,36します実際には、生物学に基づいた阻害剤の間で GRFT は最も強力な抗 HIV 活性安定性と腟から文化メディアの存在下で活性を維持しながら接触30、時にほとんどすぐに HIV 1 を不活性。最大 10 日間37微生物。最近では、0.1 %grft ゲルは、HSV-2 や HIV-1 の32の両方に対する保護の最初のラインのための有望な候補内の HSV-2 のチャレンジに対してマウスを保護するために示されていた,38. の HIV GRFT が物理的にエントリ38,39,40,41 を防ぐためにウイルスの封筒表面の gp120 またはターミナル マンノースの N 型糖鎖の残基をバインドすることによって感染を阻害する具体的には、 ,42。この阻害は、3 の ng/mL43に近づいて IC50s で非常に強力です。研究の HIV 感染を阻害する、に加えてウイルス32細胞-細胞拡散を抑制することによって、GRFT が HSV-2 の感染症から保護することが示されています。すべてのケースで GRFT を変性高抵抗性を発揮しながら、ウイルス粒子を接着剤に示されています。最後に、GRFT は、実現可能であり可能性が有益なこと EFs で共同管理するテノホビル (TFV) とその他の抗ウイルス剤の44の組み合わせで相乗的な活性を実証しています。GRFT の強力な特性では、優秀な生物学に基づく抗ウイルス候補で配信は、EF 技術と高められるかもしれない。

GRFT の接着および生来抗ウイルス プロパティは、この知識を利用して、高分子繊維足場設計されました、ウイルス エントリ抑制29の最初の層を提供するこれらのプロパティを統合します。腟粘液が主に mucoadhesive ムチン相互作用を介してウイルスの輸送を妨げる方法のインスピレーションを見つけること、私たちと仮定足場として EFs を使用し共有 GRFT の高密度と表面の変更表面共役 GRFT は消耗し、そのエントリ ポイント45,46,47でウイルスを不活性化します。ここで EFs は、タンパク質ベース、バイラルマーケティング接着剤不活性バリア プラットフォームを提供する固定足場として開発されました。我々 は GRFT の強力な抗ウイルス特性「トラップ」新しいウイルスを作成には、生体適合性、変更可能で、耐久性のあるポリマー プラットフォームと組み合わせるしよう

これらの目標を達成するために PLGA から成る繊維エレクトロスピニングと EDC NHS 化学だった GRFT EF 表面を後で変更するために使用します。PLGA はエレクトロスピニング48、生体適合性と費用対効果での広範な使用のためのモデル ポリマーとして提供しています。また、表面改質、EFs の大きな表面積を悪用、繊維ユーティリティ49を最大限にカプセル化と組み合わせることができます便利な代替手段を提供します。異なり、伝統的なカプセル化方法 GRFT の部分のみ利用可能です (とのみ一過性、FRT で提示)、表面改質処理の全体の期間中最大の生物活性を維持するために GRFT を有効に。さらに、伝統的なエレクトロスピニング法によるタンパク質など親水性化合物の取り込み低カプセル化効率とタンパク質活性50の損失可能性があります。したがって、GRFT、繊維表面改質した STI 感染に対する保護を強化する単独またはエレクトロスピニングとの組み合わせで使用できる有望な代替配信方法があります。

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Protocol

1 準備とエレクトロスピニング繊維足場の作製

注意: 化学の発煙のフード 。 溶媒と高分子溶液のすべての作業を行わなければならない。プロトコルを開始する前に各試薬の化学物質等安全データシートを参照してください

。
  1. Electrospin 3 mL 15%/w PLGA ポリマー溶液に 50: 50 ポリ (乳酸グリコール酸) の 720 mg の重量を量る (PLGA; 0.55 に 0.75 dL/g、31 57 kDa) シンチレーション、10 mL のバイアルに。溶液の量は、現在の研究で使用される典型的なバッチ サイズに基づいています
    。 注: 最初にポリマーを溶解する溶媒の密度を決定することにより溶媒を指定したボリュームに追加する高分子の質量を計算する必要があります。溶剤ヘキサフルオロ-2-プロパノール (HFIP) の密度は、1.59 g/mL です。したがって、溶媒、重量 4.8 g (3.0 mL x 1.59 g/mL) は 3.0 mL HFIP 必要の量に基づきます。HFIP に PLGA の 15%/w 分数 720 mg PLGA は 3.0 mL HFIP (0.15 × 4,800 mg = 720 mg) に追加されていなければなりません。W/v % ではなく、%/w、ポリマー溶液を使用しての利点は、最終的な解決の定義された重量は、これです。この定義された重量 1.3 のステップの間に溶媒の蒸発の場合より正確な溶媒交換が可能です
    2. 。
  2. を加える (ステップ 1.1) から PLGA を含むバイアル シンチレーション 3.0 mL HFIP 血清学的ガラス ピペットを使用しています。プラスチック フィルムでカバーし、測定し、バイアルを記録マサチューセッツ州
  3. では、ポリマーの分解を確保するための 37 ° C で一晩高分子懸濁液を孵化させなさい。溶剤が蒸発する場合は、バイアルのオリジナル ステップ 1.2 質量に達するまで HFIP を追加バイアル質量を減少します
    4. 。
  4. インキュベーション後、準備エレクトロスピニング装置 ( 図 2 A)。任意のサイズのマンドレルを使用できますが、ここで回転 25 mm 外径ステンレス マンドレル コレクターとして使用された
    。 注: 大きいマンドレル径のエレクトロスピニング ソリューションの同じ量を考えると、繊維の太さが減少します
    5. 。
  5. 高分子溶液を 3 mL 注射器に吸引します
    6. 。
  6. 注射器に鈍 18 ゲージ、1/2 インチの針の先端を接続し、針の先端で空のヘッド スペースを削除する余分なソリューション (通常 0.25 mL) を分配します
    7. 。
  7. シリンジ ポンプの注射器を配置し、2.0 mL/h 計測器の流量を設定
    注: この流量以前に最適化されたこの定式化の樹脂の粘度に基づいています
    8. 。
  8. 注射針と electrospin する電源ソースに接続 +27 の電圧を用いた高分子溶液 kV。針とコレクター間の距離約 25 cm ( 図 2 B) に設定してください
    。 注意: 静電紡糸プロセスは、溶剤蒸気を作成します。密閉装置 ( 図 2) ヒューム フードを使用して有害な蒸気 . を削除して
  9. ソリューション全体はエレクトロスピニング、一度電源をオフにし、溶媒を完全に蒸発させるためさらに 30 分間回転するマンドレルを許可します
    10. 。
  10. ターン回転マンドレル コレクターとマンドレルから繊維をカットするかみそりの刃を使用しています。優しくマンドレルから繊維の皮をむく、ブレードを使用します
    11. 。
  11. ラベル付きシャーレにエレクトロスピニング PLGA 繊維を収集し、残留溶媒を除去する desiccatorovernight を配置します
    12. 。

2。GRFT 繊維の表面改質

  1. リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) と 2-(N morpholino) 準備ソリューション ethanesulfonic 酸 (MES バッファー)。8 g 塩化ナトリウム、KCl 0.2 g、1.44 g Na 2 HPO 4 と 0.24 g KH 2 PO 4 純水 1 L に溶解して PBS を準備します。同様に、19.52 g MES (遊離酸、MW 195.2) を溶解し、29.22 g MES バッファーを準備、純水 1 L に塩化ナトリウム。各ソリューションの最終 pH が 7.2 7.5 と 5.0-6.0, pH メーターを使用することを確認します
    2. 。
  2. EDC (2 mM) と NHS (5 mM) の個々 の作業ソリューションを準備します。
    1. 冷凍庫から EDC と NHS を取り外し、計量する前に室温に釣り合うようにします
      2. 。
    2. 1.5 mL 遠心チューブに EDC の 4 mg の重量を量ます
      3. 。
    3. 別の遠心管に NHS の 6 mg の重量を量ます
      4. 。 各管に
    4. 追加 1 mL MES バッファー。試薬を確実に、積極的に両方のチューブは完全に解散した渦
      5. 。
  3. 50 mL の円錐形遠心チューブに 70 mg を秤量することによりヒドロキシルアミン溶液を準備します
    4. 。
  4. ヒドロキシルアミンと溶解する渦に 20 mL の PBS を追加します
    5. 。
  5. 15 mL の円錐形遠心管に PLGA 繊維の適切な量を質量。反応バッチごとに通常、繊維の 75 mg を使用します
    6. 。
  6. 15 mL チューブに 8 mL の MES バッファーを追加します
    7. 。
  7. 追加 1 mL チューブ覚悟以前 EDC と NHS のソリューションの。ソリューションの最終巻は 10 mL をする必要があります。EDC および NHS の最終濃度が 0.4 mg/mL と 0.6 mg/mL をそれぞれする必要があります
    8. 。
  8. すぐとプラスチック フィルムと室温 ( 図 3 B) で 15 分間ゆっくり反転するソリューションを許可するように回転の場所 15 mL チューブをシールします。この手順を可能にする GRFT 蛋白質 ( 図 3 A) と共有結合修飾、高分子カルボキシルをアクティブにします
    9. 。
  9. 、アクティブ化後慎重にチューブに β-メルカプトエタノールの 14 μ L を追加することによって反応を抑制します。完全な混合を確実にチューブを数回反転します
    。 注意: β-メルカプトエタノール、毒性と化学の発煙のフードでのみ使用する必要があります
    10. 。
  10. 上澄みを廃棄し、10 mL の PBS は、任意の残りの β-メルカプトエタノールを削除すると PLGA 繊維を 2 回、リンスします
    11. 。
  11. 洗浄した後、チューブに GRFT 原液の適切な量を追加します。たとえば、5 nmol GRFT/mg 繊維は繊維の mg あたり (10 mg/mL 在庫) から GRFT 原液の 6.35 μ L を必要があります。10 mg/mL GRFT 原液の 476.25 μ L 75 mg 繊維サンプル必要になりします
    。 注: 0.05、0.5、および 5 nmol GRFT mg ファイバーあたりの理論的荷重 GRFT 繊維を作製します
    12. 。
  12. 8 mL に最終巻を持って十分な PBS を追加を閉じるし、徹底的な混合を確実にチューブを反転します
    13. 。
  13. プラスチック フィルムでチューブを封印し、再び、このロータの場所のため 2 時間
  14. の後の 2 時間インキュベーションは、ヒドロキシルアミン溶液 2 mL を 15 mL 遠心管に加えることによって反応を癒します。製造元の指示に従って急冷反応中にヒドロキシルアミンの最終濃度が 0.7 mg/mL をする必要があります
    15. 。
  15. も溶液を混ぜて、上澄みを廃棄します。任意の非 GRFT を削除する 10 mL の純水で 2 回表面改質した PLGA 繊維をすすいでください
    16. 。
  16. は、繊維が完全に乾燥するまで、デシケータ中ペトリ皿に繊維を転送します。ストレージのための 4 ° C にペトリ皿を転送します
    17. 。

3。SEM GRFT 表面特性改質繊維

  1. 場所、SEM の炭素の両面テープのストリップ試料マウント。永久的なマーカーを使用してサンプルの識別情報と標本マウント下部のラベルします
    2. 。
  2. 表面改質の 1 つの繊維からの 3 つのサンプルを切り取って別標本マウントの上に置きます。各サンプルの厚さは約 0.5 mm
    3. 。
  3. スパッタ コート ゴールド プレートからの電子励起粒子沈着を使用したサンプルです。90 のためのコートをスパッタ s 2.4 kV
    。 注: スパッタ コート時間電圧およびアンペア数を含む機器のパラメーターに応じて異なる場合があります
    4. 。
  4. 8 でサンプルのイメージ 1000 5 に至るまでの倍率で kV X. 000

4。繊維の表面改質から GRFT の抽出

  1. 2 mg 1.5 mL 遠心チューブに 3 通で繊維のうち質量
    2. 。
  2. 、渦管に 1 mL ジメチルスルホキシド (DMSO) を追加し、繊維を完全に溶解して室温で 1 分間インキュベートします
    3. 。
  3. インキュベーション後、希釈の 10 μ 因数トリス-EDTA (TE) バッファーの 4.2、100 倍以上のステップから DMSO ファイバー ソリューション (pH 8.0 を =).
  4. Elisa 法によるキャラクタリゼーションの読み込みまで-20 ° C でサンプルを格納します
    5. 。

5。GRFT 脱繊維を測定

  1. リリース GRFT の量を評価、または繊維の表面改質と遠心管の場所の 5-10 mg の重さ、繊維から脱着します。各管に繊維の質量を記録します
    2. 。
  2. 生理的環境を模倣した適切なソリューションの 1 つの mL を追加 (例えば PBS、TE バッファー、シミュレートされた膣分泌液 (SVF) 等) 各サンプルにします
    3. 。
  3. 37 200 rpm で回転シェーカーで 1 h のサンプルをインキュベート ° C
  4. インキュベーション、クラスターにバイアル、そして因数から脱着 GRFT を含む TE バッファーの削除約 1 mL 管後。プロテインの定量まで-20 ° C でストア
    5. 。
  5. 新しい微量遠心チューブにサンプルを転送、遠心チューブ内のファイバーに新鮮な緩衝液の 1 mL を追加し、次の時点までインキュベートします
    6. 。
  6. 典型的な時点でリリースを測定するために使用が含まれます: 1、2、4、6、8、24、48、72 h、および 1 wk. のごくわずかな脱着は 4 h 後これらの研究で観察された

6。GRFT の抽出と elisa 法による脱離の定量化

HA の 0.1 ml
  1. コート 96 ウェル ELISA プレート (10 μ G/ml) ウェルあたり 51 前述しました。プラスチック フィルムとプレートをシールし、4 ° C ( 図 4) で一晩インキュベートします
    2. 。
  2. は、コーティング バッファーを削除し、0.3 mL の各ウェルにバッファー (2-3% ウシ血清アルブミン (BSA) PBS で 0.05% ポリソルベート 20 を持つ) をブロックを追加します。少なくとも 2 時間室温でプレートをインキュベートします
    3. 。
  3. インキュベーション後、すすぎ 3 回で 0.1% ポリソルベート 20 (PBS-P) で 1 × PBS プレート。洗浄した後、それぞれの井戸にネガティブ コントロールとしてサンプル、標準、または PBS の 0.1 mL を分配します。室温で 1 時間を再びプレートをインキュベートします
    4. 。
  4. リンス PBS P で 3 回再びプレート洗浄した後、一次抗体 (ヤギ抗 GRFT 抗血清) を各ウェルに 0.1 mL を追加し、少なくとも 1 時間室温でインキュベートします。通常、一次抗体のソリューションは、PBS で 1: 10,000 によって希釈される
    5. 。
  5. インキュベート一次抗体リンス サンプル プレート 3 回再び PBS P で後二次抗体の 0.1 mL を追加 (西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)-共役ウサギの反やぎ IgG) それぞれにも、室温で 1 時間インキュベートします。PBS の 1: 10,000 によって二次抗体溶液を希釈します
    6. 。
  6. 洗浄 3 回。各ウェルに 0.1 mL TMB 2 ペルオキシダーゼ基質を追加します。発色 (約 2 分) を監視し、追加し、0.1 mL H 2 4 (1 N) 反応を抑制します。450 でプレートを読むプレート リーダーに nm
    7. 。
  7. 背景 OD 値 (PBS の受信のみをウェルズ) を平均し、実験群からこれを引いています
    8. 。

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Representative Results

繊維形態ウイルスに対する保護を提供するために表面改質した EFs の機能に大きな影響があります。エレクトロスピニングは便利で簡単なプロシージャが、最適化されていないポリマー配合の不規則な繊維形態 (図 5B C) 可能性があります。ビーズや非晶質のマットのような形態の形成で発生する静電紡糸条件の変更について多くの場合、溶媒-高分子の非互換性、低樹脂の粘度、流量、その他静電紡糸条件によって引き起こされます。繊維構造の結果の変化は、薬物で設立された繊維の活用効果、ウイルスの侵入を妨げる物理的にまたは化学的に繊維機能を変更することの矛盾異なるリリース プロフィールで起因できます。記載されている静電紡糸条件を用いて作製した PLGA EFs は 1.5 と 2.8 μ m (図 6) の間の直径の異なる繊維形態になります。繊維形態と直径を決定するには、他の特性や修正手順を実行する前に、SEM で EFs を検討すべき。

空白の SEM 画像から、0.05、0.5、および 5 nmol GRFT 繊維を示さなかった GRFT 変更に繊維形態に及ぼす影響がないことを示す繊維形態 (図 6A ~ D) で有意差。各 EF 製剤の平均粒径を決定するには、50 のランダムな測定値の最小値は、SEM 画像からの視野あたり撮影されました。EF 製剤の平均直径の測定し、図 6Eに示すように、ImageJ で計算。すべての EF 製剤は 1.9 μ m、バッチ間で変更されていないファイバー製造プロセスの一貫性を示すの周りと同様の平均直径を持っていた。

EFs に共役系 GRFT の量を決定するには、GRFT EFs は、DMSO、TE バッファーで 100 希釈が続く繊維から GRFT を抽出するために溶解しました。GRFT 繊維の mg あたり共役量 ELISA を用いて定量化。それぞれの変更の密度 (0.05、0.5、および 5 nmol GRFT mg 繊維ごと)、10 複製評価でした。5、0.5、および 0.05 nmol GRFT/mg EF 変更、各 EF いた 373、165、および 42 ng GRFT それぞれ 0.6、4.2、6.9% の活用効率に終って、EF の mg 当たり。これらの結果は、GRFT EFs 共役高い理論的表面改質密度、繊維 (図 7A) に活用されるより多くの GRFT の結果ことを示します。しかし、結果の活用効率29と逆相関があった。

吸着したそれと比較して繊維表面に共役した GRFT の量を評価するためにリリースされた GRFT の量を決定する SVF GRFT EFs が培養しました。最初の 4 h 以内 113、25 日、10 mg EF あたり GRFT の ng がそれぞれ、5、0.5、および 0.05 nmol 理論変更濃度の SVF で検出されました。これらの値は、GRFT 5、0.5、および 0.05 nmol GRFT EFs に共役量の 24%、41%、30% に対応します。4 h 後無視の GRFT がすべての 3 製剤のリリース溶出液で検出されました。図 7Bに 1、2、および 4 h 後 GRFT リリースを示します。一緒に取られて、これらのデータは、GRFT の大半は、EFs に共有結合して表面に吸着した GRFT が最初の 4 時間以内解放されたことを示します。

Figure 1
図 1:電極として繊維のマクロ形態。表示電極として繊維をそれぞれ 4 mm (シリンダー) と 25 mm (シート) 径マンドレルを使用して作製しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 2
図 2:エレクトロスピニング装置。(A) 収集マンドレル高分子液体のジェット機が入金と (B) におけるエレクトロスピニング セットアップ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 3
図 3: EDC NHS 化学を用いた GRFT と回路図の EF 変更します。(A) カルボキシル基が PLGA EF 反応でグループ化フォーム アミン反応性エステルに EDC の存在下で NHS とその後 GRFT の第一級アミンと安定したアミド結合を形作る。(B) 2 ミリグラム繊維ディスクまたは部分がカット、8 mL の MES バッファー 2 ml EDC/NHS 試薬の培養し、15 分の回転この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 4
図 4: ELISA を用いた GRFT 数量を示す模式。96 ウェル immunoplate は、gp120 とキャプチャし、GRFT を固定する HA コーティングされています。GRFT、西洋わさびペルオキシダーゼおよび ELISA 基板にリンクされた二次抗体を一次抗体は、GRFT を定量化に順番に追加されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 5
図 5: PLGA EF 形態に及ぼす溶媒選択します。(A)、15%/w PLGA EFs HFIP 表示が望ましいのスレッドのような形態。(B) 15 %w/w PLGA EFs クロロホルム、ジメチルホルムアミド、溶剤最適またはポリマー濃度 (粘度) のため、フォームに失敗しました。(C) 15%/w、(D) 20%/w TFE の PLGA EFs は樹脂の粘度の重要性を示します。ビーズは、明確に定義された繊維形態 (D) の結果が生じ高分子濃度 (溶媒の粘性) を増加させる高分子濃度 (C) の定式化に形成されました。図 5Bは、マットのような形態を示す低い倍率で撮影されたことに注意してください。スケール バー = 10 μ m。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 6
図 6: SEM 像と裸と GRFT 修正 EFs の繊維径。(A) 裸 PLGA および PLGA EFs (B) 0.05 の表面修飾 nmol、(C) 0.5 nmol、および (D) 5 繊維の mg あたり GRFT の nmol。スケール バー = 10 μ m. (E) 直径の変更されていないと GRFT EFs。誤差範囲を表す平均 ± SEM.GRFT 変更変更されていない繊維の直径間統計の差は認められなかった。図 6Eは新郎らから適応されています。29 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: GRFT の量に共役し、GRFT 変更 EF から脱着します。(A) 各 mg に GRFT 反応物濃度の増加と EF 繊維増加の共役系 GRFT の量。(B) SVF で 1、2、および 4 時間培養後、0.05、0.5、および 5 nmol 製剤に繊維の各 mg からリリースされた GRFT の数量が表示されます。誤差範囲を表す平均 ± SEM.この図は、新郎らから適応されています。29 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

それらの多孔質構造と大きな表面積のため EFs は医療、治療薬デリバリー車として、さまざまなアプリケーションを発見しました。一方、生物学的製剤と化学リガンドを細胞特異ターゲット52またはバイオセンシング53繊維表面に共役することができます、薬やその他のアクティブなエージェントを可変配信のため EFs 内組み込むことできます。ここで GRFT の作製表面改質した PLGA EFs では、HIV 感染を防ぐため配信足場のよう。GRFT EFs エレクトロスピニング、他繊維生産方法49,53の相対的な低コスト ・高生産率の利点を提供する合成されました。

プロトコルの重要なステップ
EFs の形成が特にソリューションまたは溶媒の粘度54の高分子溶液の性質に大きく依存します。高分子溶液の粘度に影響を与える要因には、ポリマーの分子量、ポリマー濃度、溶媒使用のタイプが含まれます。ソリューションまたは溶媒の粘性は通常取得目的高分子濃度の溶剤に高分子の比率を変更することによって調整されます。各製造を持つボリュームを適切な高分子-溶媒比 (粘性) を維持するために夜通しの孵化中に維持されなければなりません。十分に高分子濃度ポリマー分子を静電紡糸過程で繊維を生成ソリューションで紛糾します。静電紡糸プロセス中にスピナレット先端にビーズを形成して液体噴流が臨界電圧でこの点から噴火し、収集マンドレル55に向かってムチのようなファッションで加速、十分な高分子の絡み合いがある場合。溶媒蒸発、間伐、収集のマンドレルに預金として光ファイバーのスレッドを生産をジェットにご案内します。合成、一度 EFs を適切な形態と一貫した繊維径を確認する SEM によって分析する必要があります。ビーズの EFs の存在可能性がありますソリューション低粘度56, 非常に高い電圧57のポリマー供給率58、またはすべての 3 つの要因の組み合わせ。これが発生した場合は、ポリマー濃度を増やす必要があり、印加電圧と送り速度は、繊維状の形態を達成するために調整する必要があります。

EF 表面に蛋白質を共役、ここ PLGA カルボキシル基が反応した EDC NHS カルボジイミド架橋化学59を使用しています。変更プロセス中に繊維は簡単に石鹸の準安定なアミン反応性エステルへの変換に起因する NHS の存在下での EDC と孵化させます。2 段階接合過程における各段階で使用されるバッファーする最適 pH は、最大活用効率を確保するための製造元の指示に記載されていることが重要です。NHS エステルの半減期は 4 中性 pH で 5 時間からの範囲より基本的な条件60を大幅に削減します。したがって、最初の反応は pH 5 〜 6 で MES バッファーに実行するか、GRFT でその後、すぐに反応の活性化されたファイバーを PBS バッファー (pH 7.2 7.5) に転送し必要があります。また、EDC は 2-メルカプトエタノールの添加による不活化し、カルボン酸の活性化後の繊維から十分にすすぎが重要です。これは活用の効率を減らすことができる 2 番目の反応の中に EDC と自己架橋によるタンパク質活性化を防ぐを助けます。

変更とトラブルシューティング
EF 形態をカスタマイズする、または GRFT (または他の蛋白質) を改善するために特定のプロセスの変更が考慮されるかもしれないが我々 の以前の仕事は、様々 な HIV-1 感染に対する繊維の GRFT 変更の有効性を実証, 活用効率またはファイバー29をが得られます。特に、活用のための大きい表面領域を有効にする、繊維の直径を減少させることによって EF 表面積を増加可能性があります。以前の研究では、ポリマー濃度と粘度を減らす小さい繊維直径61,62を生成することを示しています。ただし、濃度が閾値以下の場合、このアプローチはビーズ線維の形成によって制限されます。溶液粘度を変更することがなく、繊維径を減少するデュアル溶媒システムに表面張力を減らすために利用できるまたはソリューション伝導率56,57を増加する塩を追加可能性があります。両方の方法は、小さい繊維径が生じるエレクトロスピニング ジェット機の大きい伸張可能になります。また、低分子量のポリマーは、小さい径のファイバーを作製する使えます。減少ファイバー径も小さい毛穴、潜在的、EFs は、殺菌剤ベースのアプリケーション63ウイルスの侵入をバリアとしてより効果的なを生成する追加の利点を提供します。最後に、湿度が EF 収量に影響を与えることができますが観察されました。高い湿度で収量は珍しいマクロ形態と繊維の形成により減少傾向にあります。エレクトロスピニング チャンバー内の湿度コントロール システムをインストールすることができるしたがって制作支援 EFs 一定の収穫量をこれ作製に課題を提示する場合。

GRFT 活用の効率を改善するために、選択と functionalizable グループの場所を調査してまた考慮されるかもしれない。たとえば、興味の蛋白質の第一級アミンは、三次元蛋白質の構造の内部の近くにある、立体障害防止できる EFs でアクティブ化されたカルボキシルを減らす、第一級アミンとの相互作用、反応の可能性。蛋白質の表面に近い第一次アミン グループを生成するタンパク質のアミノ酸置換によるこの課題を克服することがあります。ただし、GRFT および他の蛋白質の機能のための結合部位の特定のアクティビティに依存、共役前機能アッセイで、タンパク質の立体構造の変化を徹底的にテストする必要があります。

制限
GRFT 表面改質の主要な制限は、カルボジイミド架橋化学を用いた低活用効率の可能性です。興味の抗ウイルス蛋白質が高い IC50低活用効率は (これらのアプリケーション) にウイルス感染に対する十分な保護を提供しないかもしれません。GRFT (またはその他の変更) のただし、EFs、タンパク質と共有結合にバインドされていない活性剤EFs は可能性がありますまだ表面に吸着。これらの吸着剤は、一時的ウイルス バインドに利用可能なのローカライズされた濃度を増やすことによって共役 GRFT の活動を補完するために可能性を提供しています。この例では、脱着 GRFT は、EFs が直接接触しないと管理 (pericoital) の最初の 4 時間で保護の代替メカニズムを提供することが HIV-1 ウイルス粒子にバインドできます。したがって、共役と表面に吸着した GRFT 性感染症に対して均一な保護を提供することに貢献するかもしれない。

タンパク質共役と脱離の両方から与えられた保護、にもかかわらず潜在的に高い効率と他の表面改質の戦略を追求する可能性があります。たとえば、PLGA カルボキシル基のグループの代わりにアミンで終了して活性化 GRFT が共役される可能性があります。また、異なる表面改質戦略は、EF タンパク質共役効率を改善するために利用されるかもしれない。EFs から成るナノ膜を介してカルボジイミド架橋化学64アビジン修飾されて持っています。ビオチン化または再結合を介して連鎖球菌-タグ (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) の追加可能性があります強力なフォームに変更されたタンパク質を有効にしてアビジン EFs と非共有結合相互作用を非常に安定しました。一方、非共有結合性アビジン-ビオチンのリンケージは、最強非共有結合、フェムトモルの親和性、繊維表面に安定的な活用の可能性が高い結果をいます。任意の表面改質の戦略活用の効率を最大化する立体障害を考慮しなければ。

最後に、我々 は表面改質した EFs 保護の相補的なモードを提供するアクティブなエージェント カプセル化する代替方法を提供することを想像します。単一の EF プラットフォーム上のカプセル化および表面改質技術を組み合わせることで 1 つ注意の活性剤の早期解放削減に表面改質処理中になります。水溶液中で比較的長い培養時間を必要とする表面改質反応、読み込まれてアクティブなエージェントのかなりの割合高分子加水分解により失われた可能性があります。

既存で代わりの方法について法の意義
前作 〜 38 %infectible セル29transwell 挿入に置かれた HIV 感染を阻害する変更されていない空白 EFs ができたが見られました。生体適合性、web のような微細構造、GRFT の観測強力な抗ウイルスと接着特性と並行して、EFs の蛇行と組み合わせるこの観測は、ここで説明した表面改質した EFs の発達をうながした。

現在、採用その他の配信技術に相対的な殺菌剤では、EFs がある彼らのアーキテクチャとカスタマイズのための容量のための潜在的なアプリケーションの広い範囲他の仕事で EFs の繊維状の形態が有効になってそれらの活性剤を提供し、それらの組織工学用の適切な足場を作る、ECM を模倣します。EFs では、生体適合性を向上させ、徐放性65,66に表面改質されているも。

生体適合性を高めるため、エージェントの特定の結合活性を介して関数を提供する多数の方法が存在する EFs のプラズマ治療法、湿式化学メソッド、および表面移植などの表面に化合物の添付ファイルは、重合50。Hiv-1 ウイルスの糖蛋白質にとりわけ結合する GRFT、場合 EDC NHS の湿式化学法は GRFT 機能50を維持しながら繊維メッシュの奥深くに侵入する能力が最適。EFs に固定化した GRFT は、耐久性のある製剤で frt 社に配信でき、HIV 感染に対して即座の保護を提供します。

性感染症を抑制する EFs 内治療をカプセル化する既存の戦略と比較して、共有結合の共役は GRFT と HIV のウイルス粒子の間の潜在的な親和を増やすことの明確な利点を提供しています。表面改質による EFs に GRFT を固定化して、HIV に多価の結合のための機会を増加する、GRFT の局所高濃度を実現できます。さらに、ソリューションでは、無料の GRFT を基準にして、EF 固定化 GRFT は GRFT プールの枯渇を防ぐため、セル内面化を妨げることで可能性があります。さらに、安定性と接着性の侵入阻害剤として GRFT のアクションのユニークな機構により共有結合表面活用強力な抗ウイルス作用に加えて、ウイルスの侵入を物理的な障壁を提供するために表面改質した EFs を有効に。

このメソッドの将来のアプリケーション
配信のための表面改質の使用率は、単一の EF プラットフォーム内で複数のアクティブなエージェントを統合する機会を提示します。今後、多目的技術 (MPT) 活性剤のさまざまな可能性があります内でカプセル化され、EFs に共役どこの開発を目指しています。これら MPTs と作用メカニズムの異なる治療を組み込むことによって病原体のより広い範囲から保護を付与するように設計します。表面と作用メカニズムの異なると活性剤を提供する EFs の内部の両方を活用することによりウイルス感染から保護するために EFs の可能性を最大化されます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

この研究を資金調達のための卓越性のためユダヤ人の遺産基金に感謝しております。ありがとう博士スチュアート ・ ウィリアムズ II 寛大エレクトロスピニング システムの使用法を提供します。我々 はまた、Griffithsin と私たちを提供するため博士ケネス ・ パーマーを感謝します。また、的場信幸と GRFT ELISA で私たちが仕事の訓練のための彼の実験室を感謝いたします。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(Lactide-co-Glycolide) (PLGA) 50:50 Lactel B6013-2P
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Thermo Scientific  147541000
Blunt Dispensing Needle 18g X 1/2 Brico Medical Supplies BN1815
BD 3mL Syringe Luer-lok tip VWR 309657
Parafilm (plastic film) Sigma Aldrich P7793
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES Buffer) Sigma Aldrich M3671 
Sodium Chloride Sigma Aldrich S7653
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9333
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S7907
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P0662
Hydroxysuccinimide (NHS) Thermo Scientific  24500
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC) Thermo Scientific  22980
2-Mercaptoethanol Fisher BP176
Griffithsin (GRFT) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Dimethyl Sulfoxide Milipore 317275
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Polysorbate, Tween 20) Sigma Aldrich P9416 
Tris EDTA Buffer Sigma Aldrich 93283
Flat-Bottom Immuno Nonsterile 96-Well Plates Thermo Scientific  3355
Influenza Hemagglutinin (HA) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Goat Anti-GRFT (Primary Antibody) Kentucky Bioprocessing NA custom made, no product number
Rabbit anti-goat IgG-HRP (Secondary Antibody) Santa Cruz 2056
Sure Blue TMB Microwell Peroxidase Substrate KPL 52-00-00

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バイオ エンジニア リング、問題 128 エレクトロスピニング繊維、性感、殺菌剤、Griffithsin、表面改質、ひと免疫不全ウイルス感染症 (乳酸グリコール酸)
作製と評価 Griffithsin 変更繊維足場の防止のため性的感染
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Vuong, H. R., Tyo, K. M.,… More

Vuong, H. R., Tyo, K. M., Steinbach-Rankins, J. M. Fabrication and Characterization of Griffithsin-modified Fiber Scaffolds for Prevention of Sexually Transmitted Infections. J. Vis. Exp. (128), e56492, doi:10.3791/56492 (2017).

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