Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من الوصلات العصبية العضلية اليرقات المورفولوجية

Published: September 25, 2017 doi: 10.3791/56493
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Neurology, School of Medicine, Wayne State University, 2Department of Anatomy and Cell Biology, School of Medicine, Wayne State University

Summary

يمكن تسجيل التيارات متشابك فوكالي من تصور boutons متشابك في الوصلات العصبية العضلية يرقات الطور المورفولوجية الثالثة. هذا الأسلوب يتيح رصد نشاط بوتون واحد متشابك.

Abstract

الوصلات العصبية العضلية المورفولوجية (NMJ) نظام نموذجا ممتازا لدراسة انتقال متشابك جلوتاماتيرجيك. يصف لنا هذا أسلوب تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من تصور بتونس في NMJ اليرقات المورفولوجية . يتطلب هذا الأسلوب تلفيق مخصصة لتسجيل ميكروبيبيتيس، فضلا عن مجهر المجمع مجهزة بتكبير عالية والهدف غمر المياه البعيدة المدى والبصريات التباين (DIC) التدخل التفاضلية ونيون مرفق. يتم وضع مسرى التسجيل على رأس بوتون متشابك محدد تصور مع DIC البصريات، وبرنامج التحصين الموسع-الأسفار، أو كليهما. وميزة هذا الأسلوب أنه يتيح رصد النشاط متشابك لعدد محدود من المواقع للإفراج. مسرى التسجيل التي يبلغ قطرها عدة ميكرون، والإفراج عن المواقع المتمركزة خارج حافة القطب لا تؤثر كثيرا على التيارات المسجلة. التيارات متشابك مسجل حركية سريعة ويمكن حلها بسهولة. هذه المزايا ذات أهمية خاصة لدراسات المسخ خطوط الطيران مع تعزيز النشاط متشابك عفوية أو غير متزامن.

Introduction

المورفولوجية نظام نموذجا ممتازا دراسة الآليات الجزيئية السيطرة على انتقال متشابك. النظام العصبي العضلي في المورفولوجية جلوتاماتيرجيك، وذلك يمكن استخدام الوصلات العصبية العضلية المورفولوجية (NMJ) لدراسة ملامح مصانة من الإصدار جلوتاماتيرجيك. منذ يان وجان الدراسة1، استخدمت يرقات الطور الثالث على نطاق واسع لدراسة انتقال متشابك مقولة والعفوية عن طريق رصد إمكانات مفرق ضادات (ايبس) أو التيارات (إيكس). عادة يتم تسجيل ايبس إينتراسيلولارلي مع مايكرو زجاج حادة-قطب كهربائي، وأنها تعكس نشاط NMJ كاملة، بما في ذلك جميع boutons جعل نقاط الاشتباك العصبي في الألياف العضلية معين.

على النقيض من ذلك، يمكن تسجيل النشاط على عدد محدود من المواقع لإطلاق سراح فوكالي عن طريق وضع تلميح ميكروبيبيتي قرب المحطات العصبية أو varicosities متشابك. واستخدمت هذا الأسلوب أصلاً كاتز وميليدي2، والتسجيلات خارج الخلية المحورية قد استخدمت بنجاح في الأعمال التحضيرية NMJ عدة، بما في ذلك الضفدع3،،من45، الماوس6 , 7 , 8و القشريات9،10،11،،من1213،،من1415،16 المورفولوجية17،،من1819،20،21،،من2223. كذلك وضع هذا النهج دوديل، الذين الأمثل إعادة ترميز أقطاب24،25ماكروباتش. في التنفيذ دوديل، تتطابق هذه التقنية طريقة فضفاضة-التصحيح-المشبك26.

NMJ اليرقات المورفولوجية حددت بوضوح boutons متشابك، وخطوط المحورة وراثيا مع العلامات الفلورية العصبية المشفرة جينياً (انظر الجدول للمواد) متوفرة بسهولة. هذه المزايا مكنتنا من تسجيل اجكس وميجكس من21،20،بوتون متشابك محدد22. هنا، يمكننا وصف هذا الأسلوب بالتفصيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-"تصنيع أقطاب تسجيل"

بروتوكول
  1. سحب أقطاب الزجاج
    1. استخدام ما يلي ساحبة ميكرويليكترودي (انظر الجدول للمواد):
      1. 1 خط: الحرارة سحب 510-السرعة 30 مرة 250؛ السطر 2: الحرارة سحب 490-السرعة 30 مرة 250-
        ملاحظة: وحدات الوقت تناظر 0.5 مللي ثانية كل وحدة؛ وحدات أخرى النسبية. وينبغي تعديل قيمة الحرارة لكل خيوط بعد إجراء اختبار الانحدار.
    2. استخدام مجهر (35 x التكبير) للتأكد من أن القطر الداخلي لمسرى سحبت في حدود 7-10 ميكرون ( الشكل 1A). تخزين الشعيرات الدموية في حاويات مغلقة بأحكام لمنع تراكم الغبار.
  2. النار لتلميع
    1. النار البولندية الشعيرات الدموية (80-90% قيمة الحد الأقصى من الحرارة s 1-2) استخدام الصغرى-فورج (انظر الجدول للمواد). تأكد من القطر الداخلي النهائي القطب مصقول 5 ميكرومتر ( الشكل 1A) 27-
  3. الانحناء
    ملاحظة: الانحناءات اثنين مصنوعة من أجل موقف مسرى أعلى عضلة تحت هدف تكبير عالية.
    1. استخدام الجهاز المبين في الشكل 1 باء. الإصلاح الكهربائي في المناور وضع الطرف الخيط، لمس عدم إجرائه.
    2. مجموعة الحرارة القيمة إلى 60-70 في المائة من الحد الأقصى، واضغط على دواسة الصغرى-فورج ل s 1-2 (انظر الجدول للمواد) لتسخين الشعيرة. استخدام إبرة على شكل L لهدم بلطف غيض من قطب كهربائي ( الشكل 1B الموسع). جعل منعطف في حوالي 90 س ( الشكل 1).
    3. عقد مسرى على لهب الشعلة باليد باستخدام الملقط وجعل منحنى الثانية على مسافة 7-10 ملم من أول منعطف وزاوية حوالي 120 o ( الشكل 1).

Figure 1
الرقم 1. الخطوات النهائية لتصنيع ميكروبيبيتي. نصائح القطب (A) بعد سحب والتلميع النار. (باء-1) الإعداد لنصيحة الانحناء. ويرد (باء-2) منطقة محاصر الموسع على الحق. مسرى والشعيرة ثابتة حيث يكون تلميح القطب وضعه أعلى قليلاً من الأسلاك وعدم لمس. (جيم 1) مسرى التسجيل. ويرد (جيم 2) منطقة محاصر الموسع على الحق. أول منعطف بزاوية 90 درجة تقريبا، والمسافة بين أول منعطف وتلميح القطب حوالي 1 مم-مقياس بار = 3 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

2-"خطوات تحضيرية إضافية"

  1. تحضير مثل هياموليمف (HL3) الحل (مم): كلوريد الصوديوم 70, 5 بوكل و 20 مجكل 2، 10 NaHCO 3، 5 تريهالوسي، السكروز 115، هيبيس 5 و 1 مم كاكل 2؛ ضبط درجة الحموضة إلى 7.3- 7.4. يبقى الحل في الثلاجة وجعلها جديدة كل أسبوع.
    2. جعل
  2. بيبيتس التحفيز نفس الطريقة كتسجيل الزجاج بيبيتس، إلا أن هناك لا ضرورة ينحني لهم.
    ملاحظة: إعداد أقطاب التحفيز يرد بالتفصيل في 28 و 27. قطر نهائي بعد التلميع النار ينبغي أن تكون في حدود 5-7 ميكرون.
  3. إدراج متصلاً ماصة تحفيز في حامل ميكروليكترودي حقنه.
  4. تصنيع لوحات التشريح من أطباق بيتري صغيرة (35 × 10 مم) مغلفة بالمطاط سيليكون الإيبوكسي (انظر الجدول للمواد) كما هو موضح في 28-
    ملاحظة: يجب أن يكون تصلب تماما قبل استخدام المطاط سيليكون.
  5. بيك يرقات الطور الثالث تجول وتشريح كما هو موضح في 27 ، ، من 28 29 ، 30-
    ملاحظة: لتصور بوتونس، استخدام سلالة يطير CD8-التجارة والنقل (انظر الجدول للمواد)
    1. استخدام الملقط (انظر الجدول للمواد)، اختيار يرقات الطور rd 3 من قنينة.
    2. دبوس اليرقات، وضع دبوس الأول الخلفي وآخر دبوس الأمامي (قريبة من خطاطيف الفم)-
    3. الحل إضافة HL3-
    4. جعل خفض استخدام مقص الربيع (انظر الجدول للمواد) على طول الطريق من دبوس أعلى إلى أسفل أحد في الجهة الظهرية من اليرقات.
    5. دبوس فيليه اليرقات، وضع دبابيس إضافية 2 على الجانبين الأيمن والأيسر من اليرقات.
    6. إزالة الشجاعة واستخدام الملقط تراتشياس.
    7. قص الأعصاب خارج الحبل البطني العصب باستخدام مقص الربيع-

3. التسجيلات الكهربائية من إيكس

Figure 2
الرقم 2. إعداد تسجيل. نموذج NMJ المثبتة السيليكون وضع طبق بتري المغلفة (السهم) عبر المرحلة منقولة من المجهر مجمع تستقيم مزودة بقدرات ابيفلوريسسينسي وهدفا تضخم عالية، وهما ميكرومانيبولاتورس. وتتمركز المجهر على طاولة المضادة اهتزاز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تسجيل
    1. مكان طبق بيتري مع إعداد على المسرح المجهر ( الشكل 2). إدراج مرجع مسرى في الحمام-
    2. ملء مسرى التسجيل مع الحل HL3. تحت الهدف 10 x (انظر الجدول للمواد)، تزج قطب كهربائي في الحمام ووضعه على عضلات 6 و 7 من شرائح البطن 2 أو 3 أو 4 باستخدام ميكرومانيبولاتور ((انظر الجدول للمواد) الشكل 3 ألف-1 وألف-2)-
    3. التبديل الهدف إلى 60 x (انظر الجدول للمواد). التركيز على مجال الاهتمام باستخدام برنامج التحصين الموسع-الأسفار أو البصريات DIC. ضع طرف القطب على رأس بوتون متشابك ( الشكل 3 باء-1-3)-
      4. اضغط
    4. الكهربائي بلطف جداً على العضلات. قد تلحق الضرر NMJ الضغط المفرط أو الحث على زيادة في نشاط متشابك عفوية. تأكد من غيض مسرى ليس انسداد--إذا كان، يستعاض عن ذلك
    5. التبديل على مكبر للصوت والمجلس A/D، والكمبيوتر-
    6. اختيار وضع المشبك الجهد على مكبر للصوت.
    7. بدء تشغيل البرنامج اقتناء واختيار ' خالية من الفجوة ' الوضع.
    8. مراقبة مظهر ميكس على شاشة الكمبيوتر.
    9. التأكد من أن السعة ميكس في حدود 0.2-0.7 na.
      ملاحظة: تشير إلى أصغر إيكس أن مسرى تسجيل العيوب أو أن عدم وضعها بشكل صحيح.

Figure 3
الرقم 3. تصور boutons متشابك. صورة برايتفيلد (A) A قطعة هيمي تحت 10 x التكبير (أ-1) ومنطقة محاصر الموسع عرض عضلات 6 و 7 (ألف-2، يمثل السهم مسرى التسجيل). شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ب) boutons متشابك هي تصور في خط المورفولوجية مع علامة العصبية مشفرة جينياً (CD8-التجارة والنقل) باستخدام برنامج التحصين الموسع-الأسفار التصوير (باء-1) أو DIC البصريات (باء-2). يتم أخذ صور مع 60 × الهدف والمكعب تصفية للتصوير بالتجارة والنقل (انظر الجدول للمواد). سينابتييتم وضع علامة بتونس ج مع الأسهم، ويظهر تراكب الفلورسنت والصور DIC في باء-3. شريط المقياس = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. التحفيز
    1. باستخدام ميكرومانيبولاتور، تحت عنصر تحكم visual، ضع التحفيز الكهربائي قرب إكسون إينيرفاتينج شرائح البطن 2-4-
    2. تطبيق ضغط سلبي عن طريق سحب المكبس للمحاقن متصلاً بصاحب القطب، بحيث أن يتم سحبها في إكسون داخل قطب كهربائي ( الشكل 2).
    3. بدوره على مشجعا. أدر في وحدة العزل (انظر الجدول للمواد) لتعيين صفر الحالي، وثم بلطف زيادة، حتى تظهر إيكس (أو حتى يتم التوصل إلى العتبة).
    4. إجراء التحفيز في نظام سوبراثريشولد، مع تحفيز الحالي ازدادت حوالي مرتين، مقارنة بالحد الأدنى لمراقبة اجكس.
      ملاحظة: في تجربتنا، مثل كثافة التحفيز الأمثل لتجنب فشل إمكانات العمل وإمكانات عمل إطلاق النار. على سبيل المثال، إذا اجكس تظهر في التحفيز الحالية 0.2 mA، استخدام تيار 0.4 mA طوال التجربة.
  2. ختم المقاومة
    1. قياس المقاومة ختم القطب ماكروباتش التسجيل قبل تشغيل التبديل المقاومة الكهربائي من مكبر للصوت إلى " ختم اختبار " الموقف. ملاحظة أنه سيتم عرض قيمة ختم المقاومة في GΩ في " الحالية " النافذة.
      2. تأكد من ختم المقاومة في حدود 0.5-2 م
    2. Ω. قيم خارج هذا النطاق تشير إلى أن مسرى مصقول غير صحيح أو غير صحيح المتمركزة.
    3. رصد المقاومة الختم خلال التسجيل، والتأكد من أنها تظل ثابتة طوال التجربة.

4. تحليل

  1. تحليل تسجيلات توظيف تخصيص برامج لتحليل (انظر الجدول للمواد)-
    ملاحظة: لدينا مختبر يستخدم برامج داخلية كوانتان 31، التي يتم تخصيصها للكشف عن إيكس وسجلت فوكالي ميكس ( الشكل 4). هذا البرنامج يتضمن عامل تصفية رقمية ضبابي ويتيح الكشف عن قمم كانتال في تداخل الأحداث المتعددة كانتال ( الشكل 4 أ). نهوج أخرى موصوفة في 17-

Figure 4
الرقم 4. تحليل كانتال. الكشف عن ميكس (A) وايكس (ب) بالبرمجيات كوانتان. منطقة الحدث يتسم باللون الأخضر، وتميزت قمم رؤوس الأسهم الحمراء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تسجيلات ماكروباتش المحورية تمكين رصد النشاط متشابك من boutons متشابك مختارة (الشكل 5). عندما يتم وضع مسرى على الجزء العلوي بوتون متشابك (الشكل 5A، موقع 1)، ميكس مسجل (الشكل 5، موقع 1) الاتساع إلى حد كبير يتجاوز مستوى الضوضاء وحادة ارتفاع مراحل (في مجموعة فرعية ميلي ثانية واحدة). عندما مسرى التسجيل هو ابتعد عن بوتون متشابك من عدة ميكرون (الشكل 5A، الموقع 2)، ستريك الانخفاض ميكس مسجل تقريبا إلى مستوى الضوضاء (الشكل 5B، الموقع 2). بالكاد يمكن تمييز إيكس مسجل من الضوضاء، وأنها طويلة ارتفاع مراحل (الشكل 5، موقع 2 مقابل موقع 1).

سجلت فوكالي العدد المحدود من الإفراج عن مواقع المساهمة اجكس مسجل وميجكس، فضلا عن سرعة حركية التيارات متشابك، تمكن من كشف دقيق للإفراج عن الأحداث في طفرات مع النشاط متشابك مرتفعة. يمكن توضيح الواضح بتسجيلات ميكس من كومبليكسين المسخ فارغة (الشكل 6A). النشاط العفوي هو ارتفاع كبير في هذا المسخ32، وبالتالي تداخل ميجبس سجلت إينتراسيلولارلي ولا يمكن التمييز بوضوح بين بعضها البعض (الشكل 6B)، بينما تمكن تسجيلات المحورية22 دقيقة الكشف عن أحداث الإفراج عفوية (الشكل 4 أ).

Figure 5
الرقم 5. تسجيلات إيكس وميكس من بوتون محدد. (أ) وضع مسرى بوتون مختارة (موقع 1) وأنها تتحرك بعيداً عن بوتون (الموقع 2). إظهار الصور CD8-بروتينات فلورية خضراء NMJ الموسومة تصور مع برنامج التحصين الموسع-الأسفار (أ-1)، تسجيل القطب عبر الألياف العضلات (أ-2)، ووضع تراكبات (ألف-3، ألف-4)، مع مسرى عبر موقع 1 (ألف-3) أو (الموقع 2 ألف-4)-شريط مقياس = 10 ميكرون. (ب) ميكس مسجل من بوتون (موقع 1) يتم التمييز بوضوح بين ضجيج تسجيل ومراحل ارتفاع سريع. على النقيض من ذلك، ميكس المسجلة من موقع 2 لا يمكن تمييزها موثوق الضوضاء تسجيل وخفضت ستريك إضعاف، ولديهم دورة وقت أبطأ. ستريك إيكس (ج) مسجل من بوتون (موقع 1) تتجاوز بالاتساع إيكس المسجلة من موقع 2 مرات عديدة، ولديهم أيضا حركية أكثر سرعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الشكل 6. ماكروباتش المحورية مقابل تسجيلات داخل الخلايا. تسجيلات تنسيق تمكين الكشف دقيقة من ميجكس في المسخ فارغة كومبليكسين (A)، بينما التسجيلات داخل الخلايا (ب) من هذا المعرض المسخ الإفراج عن الأحداث التي تتداخل ولا يمكن الكشف عنها موثوق بها. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

المورفولوجية يمثل كائن نموذج مفيد لدراسة انتقال متشابك. وقد استخدمت العديد من تكوينات التسجيل في NMJ اليرقات، بما في ذلك تسجيلات داخل الخلايا من إمكانات متشابك، تسجيلات تيارات متشابك مع قطب هما الجهد المشبك33،34، والتنسيق ماكروباتش تسجيلات متشابك التيارات الموصوفة هنا. يسمح هذا الأسلوب الأخير القياس الكمي الدقيق لانتقال متشابك في تصور بتونس.

نجاح البروتوكول وصف نقديا يعتمد على القدرة على تصور وضوح مجال الاهتمام وتخصيص إعداد تسجيل كهربائي. وهكذا، نوعية DIC البصريات، هدفا غمر مياه عالية تكبير مع فترة طويلة من العمل عن بعد، والمعدات المخصصة للحرائق التلميع والانحناء لتسجيل أقطاب ذات أهمية حاسمة.

وميزة هذا النهج هو أنه يتيح رصد نشاط بضع نقاط الاشتباك العصبي المتوضعة تحت مسرى التسجيل. ينبغي أن يلاحظ، بيد بوتونس المتمركزة بالقرب من حافة القطب قد تسهم أيضا في نشاط مسجل. ولذلك، من الأهمية بمكان، أن موقف الكهربائي، فضلا عن مقاومة الختم، لا تتغير أثناء التجربة.

يمكن الجمع بين القدرة على رصد نشاط بوتون واحدة محتملة مع تقنيات التصوير الحديثة. على سبيل المثال، الكشف البصري للنشاط في المناطق النشطة الفردية35 يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع تسجيلات التنسيق اجكس وميجك، وهذا يمكن أن الزوجين القرار المكانية للكشف البصري مع الأزمنة التسجيلات الكهربائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

تدعمه المنحة R01 MH 099557 المعاهد الوطنية للصحة

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sutter P-97 Sutter instrument P-97 Microelectrode puller
Narishige MF-830 Narishige MF-830 Microforge
WPI MF200 WPI MF200 Microforge
Glass capilaries WPI B150-86-10 Glass capilaries
Microtorch 1WG61 Grainer 1WG61 Microtorch
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning SYLGARD 184 Silicone for dissection plates preparation
Dissection pins Amazon B00J5PMPJA Pins for larvae positioning
Tweezers WPIINC 500342 Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas.
Scissors WPIINC 501778 Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves.
Olympus BX61WI Olympus BX61WI Upright microscope
Olympus Lumplan FL N 60x Olympus UPLFLN 60X Microscope objective 60X
Olympus UPlan FL N 10x Olympus Uplanfl N 10X Microscope objective 10X
Narishige Micromanipulator Narishige MHW-3 Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator
npi Electronic GmbH ELC-03XS npi Electronic GmbH ELC-03XS Electrophysiological amplifier
A.M.P.I Master 8 A.M.P.I. Master 8 Electrical stimulator
A.M.P.I Iso-Flex A.M.P.I. Iso-Flex Stimulus isolator
TMC antivibration table TMC 63-9090 Antivibration table
TMC Faraday cage TMC 81-333-90 Faraday cage
Digidata 1322A Axon Instruments Digidata 1322A Digidata
Computer Dell Dell Dimension 5150 Computer with Win XP OS
Electrode holder WPI MEH3SW Electrode holder
Optical filter Omega optical XF 115-2 Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection
pCLAMP 8 Axon Instruments 8.0.0.81 Software for signal recording
Quantan In-house software - Software for signal processing
Canton-S (Wildtype) Bloomington Stock Center 64349 Control fly line
cpx SH1 Generous Gift of J.T. Littleton - Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis
CD8-GFP Bloomington Stock Center 5137 Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. J Physiol. 262 (1), 189-214 (1976).
  2. Katz, B., Miledi, R. The effect of temperature on the synaptic delay at the neuromuscular junction. J Physiol. 181 (3), 656-670 (1965).
  3. Macleod, G. T., Gan, J., Bennett, M. R. Vesicle-associated proteins and quantal release at single active zones of amphibian (Bufo marinus) motor-nerve terminals. J Neurophysiol. 82 (3), 1133-1146 (1999).
  4. Macleod, G. T., Farnell, L., Gibson, W. G., Bennett, M. R. Quantal secretion and nerve-terminal cable properties at neuromuscular junctions in an amphibian (Bufo marinus). J Neurophysiol. 81 (3), 1135-1146 (1999).
  5. Zefirov, A., Benish, T., Fatkullin, N., Cheranov, S., Khazipov, R. Localization of active zones. Nature. 376 (6539), 393-394 (1995).
  6. Macleod, G. T., Lavidis, N. A., Bennett, M. R. Calcium dependence of quantal secretion from visualized sympathetic nerve varicosities on the mouse vas deferens. J Physiol. 480 (Pt 1), 61-70 (1994).
  7. Samigullin, D., Bill, C. A., Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Regulation of transmitter release by synapsin II in mouse motor terminals. J Physiol. 561 (Pt 1), 149-158 (2004).
  8. Coleman, W. L., Bykhovskaia, M. Rab3a-mediated vesicle recruitment regulates short-term plasticity at the mouse diaphragm synapse. Mol Cell Neurosci. 41 (2), 286-296 (2009).
  9. Atwood, H. L., Parnas, H., Parnas, I., Wojtowicz, J. M. Quantal currents evoked by graded intracellular depolarization of crayfish motor axon terminals. J Physiol. 383, 587-599 (1987).
  10. Parnas, H., Dudel, J., Parnas, I. Neurotransmitter release and its facilitation in crayfish. I. Saturation kinetics of release, and of entry and removal of calcium. Pflugers Arch. 393 (1), 1-14 (1982).
  11. Wojtowicz, J. M., Marin, L., Atwood, H. L. Activity-induced changes in synaptic release sites at the crayfish neuromuscular junction. J Neurosci. 14 (6), 3688-3703 (1994).
  12. Zucker, R. S. Crayfish neuromuscular facilitation activated by constant presynaptic action potentials and depolarizing pulses. J Physiol. 241 (1), 69-89 (1974).
  13. Zucker, R. S. Changes in the statistics of transmitter release during facilitation. J Physiol. 229 (3), 787-810 (1973).
  14. Worden, M. K., Bykhovskaia, M., Hackett, J. T. Facilitation at the lobster neuromuscular junction: a stimulus-dependent mobilization model. J Neurophysiol. 78 (1), 417-428 (1997).
  15. Bykhovskaia, M., Hackett, J. T., Worden, M. K. Asynchrony of quantal events in evoked multiquantal responses indicates presynaptic quantal interaction. J Neurophysiol. 81 (5), 2234-2242 (1999).
  16. Bykhovskaia, M., Polagaeva, E., Hackett, J. T. Mechnisms underlying different facilitation forms at the lobster neuromuscular synapse. Brain Res. 1019 (1-2), 10-21 (2004).
  17. Cooper, R. L., Stewart, B. A., Wojtowicz, J. M., Wang, S., Atwood, H. L. Quantal measurement and analysis methods compared for crayfish and Drosophila neuromuscular junctions, and rat hippocampus. J Neurosci Methods. 61 (1-2), 67-78 (1995).
  18. Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions. J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).
  19. Pawlu, C., DiAntonio, A., Heckmann, M. Postfusional control of quantal current shape. Neuron. 42 (4), 607-618 (2004).
  20. Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Synapsin maintains the reserve vesicle pool and spatial segregation of the recycling pool in Drosophila presynaptic boutons. Brain Res. 1178, 52-64 (2007).
  21. Akbergenova, Y., Bykhovskaia, M. Enhancement of the endosomal endocytic pathway increases quantal size. Mol Cell Neurosci. 40 (2), 199-206 (2009).
  22. Vasin, A., Volfson, D., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Interaction of the Complexin Accessory Helix with Synaptobrevin Regulates Spontaneous Fusion. Biophys J. 111 (9), 1954-1964 (2016).
  23. Wong, K., Karunanithi, S., Atwood, H. L. Quantal unit populations at the Drosophila larval neuromuscular junction. J Neurophysiol. 82 (3), 1497-1511 (1999).
  24. Dudel, J. The effect of reduced calcium on quantal unit current and release at the crayfish neuromuscular junction. Pflugers Arch. 391 (1), 35-40 (1981).
  25. Dudel, J. Contribution of Ca2+ inflow to quantal, phasic transmitter release from nerve terminals of frog muscle. Pflugers Arch. 422 (2), 129-142 (1992).
  26. Marrero, H. G., Lemos, J. R. Loose-Patch-Clamp method. , 2 ed, Humana Press. (2007).
  27. Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological recordings of high and low output NMJs on the crayfish leg extensor muscle. J Vis Exp. (45), (2010).
  28. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  29. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
  30. Imlach, W., McCabe, B. D. Electrophysiological methods for recording synaptic potentials from the NMJ of Drosophila larvae. J Vis Exp. (24), (2009).
  31. Bykhovskaia, M. Making quantal analysis more convenient, fast, and accurate: user-friendly software QUANTAN. J Neurosci Methods. 168 (2), 500-513 (2008).
  32. Huntwork, S., Littleton, J. T. A complexin fusion clamp regulates spontaneous neurotransmitter release and synaptic growth. Nat Neurosci. 10 (10), 1235-1237 (2007).
  33. Zhong, Y., Wu, C. F. Altered synaptic plasticity in Drosophila memory mutants with a defective cyclic AMP cascade. Science. 251 (4990), 198-201 (1991).
  34. Delgado, R., Maureira, C., Oliva, C., Kidokoro, Y., Labarca, P. Size of vesicle pools, rates of mobilization, and recycling at neuromuscular synapses of a Drosophila mutant, shibire. Neuron. 28 (3), 941-953 (2000).
  35. Melom, J. E., Akbergenova, Y., Gavornik, J. P., Littleton, J. T. Spontaneous and evoked release are independently regulated at individual active zones. J Neurosci. 33 (44), 17253-17263 (2013).

Tags

علم الأعصاب، ومسألة 127، boutons متشابك، الكهربية، EJC، ميك، الأعصاب الطرفية، والتيارات خارج الخلية، متشابك، التسجيلات الكهربائية
تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من الوصلات العصبية العضلية اليرقات <em>المورفولوجية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vasin, A., Bykhovskaia, M. Focal… More

Vasin, A., Bykhovskaia, M. Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (127), e56493, doi:10.3791/56493 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter