Summary
在果蝇第三龄幼虫神经肌肉交界处, 可从可视化突触 boutons 局部记录突触电流。这种技术可以监测单个突触溥的活动。
Abstract
果蝇神经肌肉结 (NMJ) 是研究谷氨酸突触传递的一个很好的模型系统。我们描述了从可视化 boutons 在果蝇幼虫 NMJ 的突触电流的焦 macropatch 记录技术。这项技术需要定制制作记录 micropipettes, 以及一个复合显微镜, 配备了高倍率, 长距离水浸泡物镜, 差分干扰对比 (DIC) 光学, 和荧光附件.记录电极定位在选定的突触溥的顶部, 与 DIC 光学, epi 荧光, 或两者。这种技术的优点是它允许监测有限数量的释放点的突触活动。该记录电极的直径为几微米, 而位于电极外缘外的释放位置不会对记录的电流产生显著影响。记录的突触电流具有快速的动力学, 可以很容易地解决。这些优势是特别重要的研究突变飞线与增强自发或异步突触活动。
Introduction
果蝇是研究控制突触传递的分子机制的一个很好的模型系统。在果蝇的神经肌肉系统是谷氨酸, 因此,果蝇神经肌肉结 (NMJ) 可以用来研究谷氨酸释放的保守特征。自1月和1月的研究1, 第三龄幼虫已广泛用于研究诱发和自发突触传播通过监测兴奋性结电位 (EJPs) 或电流 (EJCs)。EJPs 通常记录细胞与一个尖锐的玻璃微电极, 它们反映了整个 NMJ 的活动, 包括所有的 boutons 在给定的肌肉纤维的突触。
相比之下, 通过在神经元终端或突触静脉曲张附近定位一个微尖端, 可以记录局部的少量释放点的活动。这项技术最初受聘于 Katz 和 Miledi2, 并成功地使用了一些 NMJ 准备, 包括青蛙3,4,5, 鼠标6,7,8, 甲壳动物9,10,11,12,13,14,15,16, 和果蝇17,18,19,20,21,22,23。这一方法进一步开发了 Dudel, 谁优化 macropatch 重新编码电极24,25。在 Dudel 的实现中, 此技术与松散膜片钳方法26紧密匹配。
果蝇幼虫 NMJ 已明确定义突触 boutons, 和基因编码的神经荧光标记的转基因品系 (见材料表) 是现成的。这些优势使我们能够记录 EJCs 和 mEJCs 从一个选定的突触溥20,21,22。在这里, 我们详细描述这一技术。
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Protocol
1. 制作记录电极
- 拉动玻璃电极
- 使用以下协议为微电极拉出器 (参见 材料表 ):
- 1 行: 热510拉速30时间 250;2行: 热490拉速30时间 250.
注: 时间单位对应于每单位0.5 毫秒;其他单位是相对的。在进行坡道试验后, 应调整每根灯丝的热量值.
- 1 行: 热510拉速30时间 250;2行: 热490拉速30时间 250.
- 使用显微镜 (35x 放大倍数) 来确保所拉电极的内径在 7-10 和 #181 的范围内; m ( 图 1A )。将毛细血管储存在密闭的容器内, 防止尘埃积聚.
- 使用以下协议为微电极拉出器 (参见 材料表 ):
- 火抛光
- 火波兰毛细管 (80-90% 的最大热值为 1-2 s) 使用微锻 (见 材料表 )。确保抛光电极的最终内径为5和 #181; m ( 图 1A ) 27 .
- 弯曲
注: 两个弯曲是为了将电极放置在高放大目标下的肌肉顶部。- 使用 图 1B 中显示的设备。将电极固定在机械手上, 并将刀尖放在灯丝上, 而不是触摸它.
- 将热值设置为最大值的 60-70%, 然后按下微锻的踏板进行 1-2 秒 (请参阅 材料表 ) 来加热灯丝。使用 L 形针轻轻地拉下电极的尖端 ( 图 1B 放大)。使折弯在大约 90 o ( 图 1C ) 上.
- 用镊子将电极用手握住火炬的火焰, 并使第二个弯曲距离第一个弯曲处 7-10 mm, 并以大约 120 o ( 图 1C ) 的角度进行.
图1。微制作的最后步骤. ( A ) 在拉和火抛光后的电极提示。( B. 1 ) 用于尖端弯曲的设置。( B. 2 ) 在右边显示了已装箱区域的放大。电极和灯丝是固定的, 这样电极尖端就会稍稍在导线上方, 而不接触。( C. 1 ) 记录电极。( C. 2 ) 在右边显示了已装箱区域的放大。第一个折弯有大约90和 #176 的角度; 和第一个弯曲和电极尖端之间的距离大约是1毫米. 刻度条 = 3 mm. 请单击此处查看此图的较大版本.
2. 其他准备步骤
- 准备 heamolymph 样 (HL3) 解决方案 (mM):70 氯化钠, 5 氯化钾, 20 氯化镁 2 , 10 NaHCO 3 , 5 海藻糖, 115 蔗糖, 5 HEPES, 1 mM CaCl 2 ; 调整 pH 值为 7.3-7.4. 把溶液放在冰箱里, 每周都要新鲜.
- 使刺激吸管与记录玻璃吸管的方式相同, 但不需要对其进行弯曲.
注: 在 28 和 27 中详细介绍了刺激电极的制备方法。火焰抛光后的最终直径应在 5-7 和 #181 的范围内; m. - 在连接到注射器的微电极支架上插入刺激吸管.
- 从小的培养皿 (35 x 10 mm) 上涂覆硅橡胶环氧树脂 (请参阅 材料表 ), 如 28 中所述。 注: 硅橡胶应在使用前完全硬化.
- 选取一个游荡的三龄幼虫并将其分解为 27 、 28 、 29 、 30 。
注: 要可视化 boutons, 使用飞应变 CD8-GFP (参见 材料表 )
- 使用镊子 (参见 材料表 ), 从一个小瓶中选取 3 rd 的幼虫.
- 引脚幼虫, 放置第一针后部和另一针前 (接近口钩).
- 添加 HL3 解决方案
- 使用弹簧剪刀进行剪切 (请参见 材料表 ) 从顶部针脚到幼虫背侧的底部.
- 引脚幼虫圆角, 在幼虫的左右两侧放置2额外的针.
- 使用镊子清除内脏和气管.
- 用弹簧剪刀切断腹神经线外的神经.
3。EJCs 的电子录音
图2。录制设置. 样品 NMJ 固定在硅涂层培养皿 (箭头) 位于直立式复合显微镜的活动阶段, 具有荧光能力, 高放大物镜, 和两个动。显微镜被放在一个防振台上。 请单击此处查看此图的较大版本.
- 录制
- 在显微镜阶段 ( 图 2 ) 中放置培养皿和准备。在浴缸中插入参考电极.
- 用 HL3 溶液填充记录电极。在10x 目标之下 (参见材料目录 ), 浸洗电极入浴并且安置它在腹部片断 2, 3 或4的肌肉6和7使用微 (参见 材料目录 ) ( 图 3 1 和 2 ).
- 将目标切换到 60x (请参阅 材料表 )。使用 epi-荧光或 DIC 光学来关注感兴趣的领域。将电极尖端放在突触溥 ( 图 3 B. 1-3 ) 上.
- 将电极轻轻地压在肌肉上。过度的压力可能会损害 NMJ 或诱发自发突触活动的增加。确保电极的尖端没有堵塞-如果是的话, 更换它.
- 在放大器、a/d 板和计算机上切换.
- 选择放大器上的电压钳模式
- 启动购置软件并选择 #39; 无间隙和 #39; 模式.
- 在计算机屏幕上观察 mEJCs 的外观.
- 确保 mEJCs 的振幅在 0.2-0.7 nA 的范围内.
注: 较小的 EJCs 表示记录电极有缺陷或未正确定位.
图3。突触 boutons 的可视化. ( a ) 在10x 缩放 ( 1 ) 下的半段半明图像, 以及显示肌肉6和 7 ( a. 2 , 箭头标记记录电极) 的扩大的盒装区域。缩放条形图 = 50 和 #181; m. ( B ) 突触 boutons 在 果蝇 线上可视化, 使用免疫荧光成像 ( b. 1 ) 或 DIC 光学 ( b. 2 ) 进行基因编码的神经元标记 (CD8-GFP)。图像是采用60x 目标和过滤器立方体的 GFP 成像 (请参阅 材料表 )。Synaptiboutons 用箭头标记, 在 B. 3 中显示了荧光和 DIC 图像的叠加。标尺 = 10 和 #181; m. 请单击此处查看此图的较大版本.
- 刺激
- 使用微, 在视觉控制下, 将刺激电极放在轴突支配腹段 2-4.
- 通过拉动连接到电极托架的注射器活塞来施加负压, 以便轴突被拉入电极 ( 图 2 ).
- 打开刺激器。打开隔离装置上的旋钮 (请参见 材料表 ) 以设置零电流, 然后轻轻地将其增大, 直到 EJCs 出现 (或达到阈值为止).
- 在阈的状态下进行刺激, 与 EJCs 观察的阈值相比, 刺激电流增加了大约两倍.
注意: 在我们的经验中, 这种刺激强度是最佳的, 以避免动作电位的失败和动作电位的激发。例如, 如果 EJCs 出现在0.2 毫安的刺激电流中, 则在整个实验中使用 0.4 ma 的电流.
- 密封电阻
- 通过将放大器的电极电阻开关转换为和 #34 来测量记录 macropatch 电极的密封电阻; 密封测试和 #34; 位置。观察 G 和 #937 中的密封电阻值将显示在 #34; 当前和 #34; 窗口.
- 确保密封电阻在 0.5-2 米和 #8486 范围内;。此范围之外的值表示电极未正确抛光或未正确定位.
- 监视整个记录中的密封电阻, 确保在整个实验过程中保持不变.
4。分析
- 分析使用自定义软件进行解析的记录 (请参见 材料列表 )。 注: 我们的实验室使用 in-house 软件 Quantan 31 , 它是为检测 EJCs 和 mEJCs 记录的局部 ( 图 4 ) 而定制的。该软件包括一个高斯数字滤波器, 允许在重叠的 multi-quantal 事件中检测量子峰值 ( 图 4A )。其他方法在 17 中进行了描述.
图4。量子分析。 通过 Quantan 软件检测 mEJCs ( A ) 和 EJCs ( B )。事件区域以绿色标记, 峰值由红色箭头标记。 请单击此处查看此图的较大版本.
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Representative Results
焦点 macropatch 录音可以监视所选突触 boutons 的突触活动 (图 5)。当电极位于突触溥 (图 5A, 站点 1) 的顶部时, 记录的 mEJCs (图 5C, 站点 1) 的振幅明显超过噪音水平和尖锐的上升阶段 (在毫秒范围内)。当记录电极被移离突触溥的几微米 (图 5A, 站点 2) 时, 记录的 mEJCs 的振幅几乎下降到噪音水平 (图 5B, 站点 2)。记录的 EJCs 几乎不能区别于噪音, 他们有延长的上升阶段 (图 5C, 站点2与站点 1)。
EJCs 和 mEJCs 记录的释放点数量有限, 以及局部突触电流的快速动力学, 使得突触活动的突变体能够准确检测出释放事件。这可以通过从 complexin null 突变体 (图 6A) 的 mEJCs 记录来清楚地说明。自发活动在这个突变的32中急剧升高, 因此 mEJPs 记录的细胞重叠, 不能从彼此清楚地区分 (图 6B), 而焦点录音22启用精确检测自发释放事件 (图 4A)。
图5。EJCs 和 mEJCs 的录音从选定的溥.(A) 将电极置于选定的溥 (站点 1) 上, 并将其移离溥 (站点 2)。图像显示 CD8-GFP 标记 NMJ 可视化与 epi 荧光 (A. 1), 在肌纤维 (2) 上记录电极, 并覆盖 (a. 3, a. 4), 电极位于站点 1 (a. 3) 或站点 2 (4). 缩放条 = 10 µm (B) 从溥 (站点 1) 中记录的 mEJCs 与录音噪声有明显区别, 并有快速上升的阶段。相比之下, 从现场2记录的 mEJCs 不能可靠地区别于记录噪声, 其振幅降低 several-fold, 他们有一个较慢的时效。(C) 从溥 (站点 1) 记录的 EJCs 的振幅超过了从站点2记录的 EJCs 的振幅, 并且它们的动力学速度也更快。请单击此处查看此图的较大版本.
图6。局灶 macropatch 与细胞内记录.焦点录音使 complexin 空突变体 (A) 中的 mEJCs 精确检测, 而来自此变种的胞内记录 (B) 显示出重叠且无法可靠检测的释放事件。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
果蝇代表了研究突触传递的一个有利的模型有机体。在幼体 NMJ 使用了几种记录配置, 包括突触电位的胞内记录、两个电极电压钳33、34和焦点 macropatch 的突触电流记录。在这里描述的突触电流的录音。后一种技术允许精确定量的突触传输在可视化的 boutons。
所描述的协议的成功与否, 关键取决于是否有能力清楚地直观地显示感兴趣的区域, 并定制记录电极的准备工作。因此, 高质量的 DIC 光学, 高倍率的水浸泡物镜, 具有很长的工作距离, 和定制的设备, 用于火焰抛光和弯曲的记录电极是至关重要的。
这种方法的优点是, 它允许监视在记录电极下定位的几个突触的活动。应该注意的是, 然而, 位于电极边缘附近的 boutons 也可能有助于记录活动。因此, 电极的位置以及密封电阻在实验过程中不会发生变化, 这一点至关重要。
监测单个溥的活动的能力可能与最近的成像技术相结合。例如, 在单个活动区域35上的活动的光学检测可以与 EJCs 和 mEJC 的焦点录音相结合, 这可以与电子记录的时间分辨率的光学探测的空间分辨率进行耦合。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
由 NIH 资助 R01 MH 099557
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sutter P-97 | Sutter instrument | P-97 | Microelectrode puller |
| Narishige MF-830 | Narishige | MF-830 | Microforge |
| WPI MF200 | WPI | MF200 | Microforge |
| Glass capilaries | WPI | B150-86-10 | Glass capilaries |
| Microtorch 1WG61 | Grainer | 1WG61 | Microtorch |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | SYLGARD 184 | Silicone for dissection plates preparation |
| Dissection pins | Amazon | B00J5PMPJA | Pins for larvae positioning |
| Tweezers | WPIINC | 500342 | Tweezers for placing pins, removing the guts and tracheas. |
| Scissors | WPIINC | 501778 | Scissors for cutting the cuticula of the larvae and nerves. |
| Olympus BX61WI | Olympus | BX61WI | Upright microscope |
| Olympus Lumplan FL N 60x | Olympus | UPLFLN 60X | Microscope objective 60X |
| Olympus UPlan FL N 10x | Olympus | Uplanfl N 10X | Microscope objective 10X |
| Narishige Micromanipulator | Narishige | MHW-3 | Three-axis Water Hydraulic Micromanipulator |
| npi Electronic GmbH ELC-03XS | npi Electronic GmbH | ELC-03XS | Electrophysiological amplifier |
| A.M.P.I Master 8 | A.M.P.I. | Master 8 | Electrical stimulator |
| A.M.P.I Iso-Flex | A.M.P.I. | Iso-Flex | Stimulus isolator |
| TMC antivibration table | TMC | 63-9090 | Antivibration table |
| TMC Faraday cage | TMC | 81-333-90 | Faraday cage |
| Digidata 1322A | Axon Instruments | Digidata 1322A | Digidata |
| Computer | Dell | Dell Dimension 5150 | Computer with Win XP OS |
| Electrode holder | WPI | MEH3SW | Electrode holder |
| Optical filter | Omega optical | XF 115-2 | Filter cube for Green Fluorescent Protein (GFP) detection |
| pCLAMP 8 | Axon Instruments | 8.0.0.81 | Software for signal recording |
| Quantan | In-house software | - | Software for signal processing |
| Canton-S (Wildtype) | Bloomington Stock Center | 64349 | Control fly line |
| cpx SH1 | Generous Gift of J.T. Littleton | - | Complexin knock-out fly line with increased spontaneous exocytosis |
| CD8-GFP | Bloomington Stock Center | 5137 | Fly line with neuronal fluorescent (GFP) Tag |
References
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